Summary
אנו מציגים פרוטוקול עבור הבידוד, התרבות, והאינדוקציה האדיגנית של הרכס העצבי (NCADSCs) מתוך רקמת השומן של ה-Wnt-1 יצורים+/-; Rosa26Rfp/+ עכברים. NCADSCs יכול להיות מקור נגיש בקלות של ADSCs עבור מידול אדיפוגנזה או ליפוגנזה ב מבחנה.
Abstract
כמות מוגזמת של רקמת אדיפוז מסביב לכלי הדם (רקמת השומן הפריקולרית, המוכרת גם כ-PVAT), קשורה לסיכון גבוה למחלות לב וכלי דם. ADSCs שמקורם ברקמות שונות מציגות תכונות נפרדות, ואלה מ-PVAT מ לא התאפיין היטב. במחקר שנערך לאחרונה, דיווחו כי חלק ADSCs ברקמת השומן של האבי העורקים (PAAT) לרדת מן התאים ציצה עצבית (NCCs '), אוכלוסייה ארעית של תאים נודדים שמקורם האקטועור.
במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול עבור בידוד חלבון פלורסנט אדום (RFP) מתויג NCCs מ PAAT של Wnt-1 היצורים+/-; Rosa26Rfp/+ עכברים וגרימת בידול האדיגניים שלהם בתוך מבחנה. בקצרה, שבר כלי הדם סטרומה (SVF) הוא הושעה אנזימטי של PAAT, ו-RFP+ ציצה עצבית הנגזרת ADSCs (NCADSCs) מבודדים על ידי מיון תא המופעל על ידי הזריחה (facs). NCADSCs להבדיל לתוך שניהם adipocytes חום ולבן, יכול להיות cryopreserved, ולשמור על פוטנציאל האדיגניים שלהם עבור ~ 3 – 5 מעברים. הפרוטוקול שלנו יכול ליצור ADSCs שופע מתוך PVAT ל עבור דוגמנות PVAT ע או ליפוגנזה בתוך מבחנה. לפיכך, NCADSCs אלה יכולים לספק מערכת רבת-ערך לחקר המתגים המולקולריים המעורבים בבידול PVAT מ.
Introduction
השכיחות של השמנת יתר היא גוברת ברחבי העולם, אשר מגביר את הסיכון של מחלות כרוניות קשורות, כולל מחלות לב וכלי דם, סוכרת1. PVAT מ המקיף כלי דם הוא מקור עיקרי של גורמים האנדוקריניים האנדוקרינית המעורבים בפונקציה vascuלטורה. מחקרים קליניים מראים כי תוכן ה-pvat הגבוה הוא גורם סיכון עצמאי של מחלות לב וכלי דם2,3, והפונקציה הפתולוגית שלו תלויה בפנוטיפ של בתאי הגזע שנגזר האדיפוז (ADSCs)4.
למרות הקווים של התאים ADSC כמו murine 3T3-L1, 3T3-F442A, ו OP9 הם מודלים סלולריים שימושיים כדי ללמוד adipogenesis או ליפוגנזה5, מנגנוני הרגולציה של אדיפוגנזה שונים בין קווי התא תאים ראשוניים. ADSCs ב סטרומה תא כלי דם (SVF) מבודד ישירות מרקמות אדיפוז והמושרה להבדיל לתוך adipocytes סביר להניח ביותר בשנת vivo אדיפוגנזה וליפוגנזה6. עם זאת, שבריאת, ציפה, ואת הווריאציות גודל וimmunophenotypes של ADSCs להפוך את הבידוד הישיר שלהם מאתגרת. בנוסף, הליכי הבידוד השונים יכולים גם להשפיע באופן משמעותי על היכולת הפוטנציאלית שלהתאים האלה, ובכךמדגישים את הצורך בפרוטוקול השומר על תקינות adsc.
רקמת אדיפוז מסווגת בדרך כלל כרקמת השומן הלבנה המורפולוגית והפונקציונלית (וואט), או רקמת השומן החום (BAT)8, אשר מנמלים בנפרד ADSCs9. בעוד ADSCs בודד מן הואגונאדאל ומוואטים תת עורית התאפיין במחקרים קודמים9,10,11,12, פחות ידוע לגבי ADSCs מ-pvat כי מורכב בעיקר מבת13.
במחקר שנערך לאחרונה, מצאנו שחלק מADSCs התושב ברקמת השומן של אבי העורקים (paat) נגזרים מתאי ציצה עצבית (nccs ק), אוכלוסייה ארעית של תאים של מהגרים מהגרים שמקורם בעור של14,15. Wnt1-עכברים טרנסגניים שימשו למעקב של מעקב העצבים העצבי תא16,17. חצינו Wnt1-היצורים+ עכברים עם Rosa26rfp/+ עכברים ליצור Wnt-1 היצורים+/-; Rosa26rfp/+ עכברים, שבו nccs ו צאצאיהם מסומנים עם חלבון פלורסנט אדום (rfp) ומסומנים בקלות בvivo ובמבחנה15. כאן, אנו מתארים שיטה לבידוד ציצה עצבית הנגזרת ADSCs (NC-נגזר ADSCs, או NCADSCs) מהעכבר PAAT ולגרום NCADSCs להבדיל לתוך adipocytes לבן או adipocytes חום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול בעלי החיים נבדק ואושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת ג'יאו טונג שנגחאי.
1. הדור של Wnt-1 היצורים+/-; Rosa26Rfp/+ עכברים
- הצלב Wnt-1 היצורים+/- עכברים16 עם Rosa26rfp/+ עכברים18 כדי ליצור wnt-1 יצורים+/-; Rosa26Rfp/+ עכברים. עכברים הבית תחת 12 h מחזור אור/כהה במתקן ללא פתוגן ב 25 ° צ' ו 45% לחות עד שהם 4 – 8 שבועות.
2. חיתוך הפביט
הערה: ראה איור 1.
- לחטא את כל כלי הניתוח (למשל, מספריים כירורגי, מלקחיים סטנדרטיים, מספריים יקרוכירורגית ומלקחיים) על ידי אוטוקלינג ב 121 ° c עבור 30 דקות.
- להכין את העיכול בינונית (גלוקוז גבוה בינוני הנשר השונה של Dulbecco [HDמאמ] המכיל 2 מ"ג/mL קולגן סוג I). הכן את מדיום התרבות (HDMEM המכיל 10% סרום בקר עוברי [FBS] ו 1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין [PS]). לחטא באמצעות מסנן מזרק 0.22 יקרומטר לפני השימוש.
- לחטא את התרבות התאית באמצעות UV, אתנול, סינון, או קיטור, לפי הצורך.
- הכינו צלחת פטרי עם תמיסת מלוחים מאוזנת של הנקס (HBSS) ו-15 מ"ל שפופרת חרוטי עם 10 מ ל של HBSS שיושלם עם 1% v/v של פתרון PS. . שמור על שניהם בקרח
- . והקריבו על ידינקע בצוואר הרחם לטבול את הגופים בגביע מלא 75% אלכוהול (200 mL) עבור 5 דקות כדי לעקר את פני העור.
- חותכים ומפרידים את העור על הבטן וחותכים לאורך קו האמצע הגחוני מהאגן אל הצוואר. לפתוח את הבטן ולהזיז את הכבד כדי לחשוף את הסרעפת19.
- חותכים את הסרעפת ואת הצלעות משני צדי קו האמצע וחושפים את הלב ואת הריאות באמצעות קילוף הצלעות לאחור.
- הסר את הריאה בלוטת התימוס ולחלץ את PAAT יחד עם העורקים והלב.
- לחתוך את אבי העורקים בשורש אבי העורקים. כדי להסיר את הלב בצע חתך בין קשת אבי העורקים לבין עורק האבי הראש והפרד בזהירות את רקמת השומן שמסביב לשני המבנים והעורקים השמאליים והימניים המשותפים מהקיר האחורי של החזה. העבירו את הרקמה למאגר הקרח הקר של HBSS בצלחת פטרי.
- באמצעות מלקחיים סטריליים, להסיר את החלק הגדול של ואצלב (למשל, העורקים, עורקים העורק המשותף, ועוד ועוד ועוד) והfascia ככל האפשר, ולהעביר את הרקמה האדיפוז לתוך 2 מ"ל Eppendorf צינורות מכילים 0.5 mL קר ice-HBSS מאגר על הקרח.
3. בידוד של ה-SVF
לאסוף את PAAT של 5-6 עכברים לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה אחד 2 mL המכיל 1 mL העיכול טרי מדיום בינונית ומיץ את הרקמה באמצעות מספריים כירורגי בצינור Eppendorf בטמפרטורת החדר (RT).
- העבר את המיקס לצינורות 50 mL המכילים 9 מ ל של מדיום העיכול. הומוגון לסדר את הרקמות על ידי ליטוף למעלה ולמטה עם הצינורות 1 מ"ל.
- מודדקת את הצינורות ב 37 ° צ' עם טלטול קבוע ב 100 rpm עבור 30-45 דקות ולבדוק כל 5 – 10 דקות כדי למנוע עיכול יתר. זה קריטי לשיפור הכדאיות התאית והתשואה.
הערה: העיכול הטוב של רקמת הרקמה יביא לרקמה הומוגנית והצהובה הנראית לעין בלתי על התערכה בעדינות בצינור. - להפסיק את העיכול על ידי הוספת 5 מ ל HDמאמ המכיל 10% FBS ו 1% v/v PS ב RT ולערבב היטב על ידי ליטוף.
- צנטריפוגה את ההשעיה התא ב 500 x g עבור 5 דקות ב-RT. ה-SVF יהיה גלוי כגלולה חומה. בזהירות מרעיף את adipocytes צף decant את supernatant הנותרים מבלי להפריע SVF. מפזר את הגלולה svf ב 10 מ ל של תרבות בינונית ולסנן דרך מסננת תא 70 יקרומטר.
- צנטריפוגה את ההשעיה התא ב 500 x g עבור 5 דקות, להסיר את supernatant, ולהשהות בעדינות את הגלולה ב 5 מ ל של מאגר הליזה אריתרופואריציט ב 15 מ"ל שפופרת חרוטי עבור 10 דקות ב RT.
- להפסיק את התגובה על ידי הוספת 10 mL של 1 x PBS המכיל 1% FBS. צנטריפוגה את ההשעיה התא ב 500 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c, להסיר את supernatant, ולהשעות מחדש את הגלולה ב 10 מ ל של 1 x PBS המכיל 1% fbs.
- צנטריפוגה את התאים שוב ב 500 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה ב-5 מ ל של מדיום התרבות ב-15 מ ל בשפופרת חרוט ב-4 ° c.
- לאחר סיבוב הסופי של צנטריפוגה (500 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c), להשהות מחדש את התאים הפלטאד ב 5 מ ל של מאגר facs (PBS המכיל 10% fbs, 100 יחידות/ML-DNA אני, ו 1% v/v PS) על הקרח, ולספור את התאים עם הומוציטומטר
4. בידוד של NCADSCs על ידי FACS
- הגדר ומטב את סדרן התא בהתאם למדריך ההדרכה. בחר את זרבובית 100 יקרומטר, עקר את צינורות הגבייה, התקן את התקן הגבייה הנדרש והגדר את הזרמים הצדדיים20.
- 561 ננומטר צהוב/ירוק לייזר ומסנן אופטי 579/16 מומלצים למיון RFP+ תאים. בצע את הפיצוי באמצעות הפקד השלילי והפקדים החיוביים המוכתמים בודדים. ראה איור 2א עבור הערכה של התוכנית.
- לסנן את התאים באמצעות מסננת 40 יקרומטר, צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות, ולהשעות מחדש את התאים 2 מ ל של מאגר facs בצפיפות של 0.5 – 1 x 107/ml. העבר את התאים באופן ברור בתווית 5 מ ל קלקר בתחתית הצינורות, ו לטעון לתוך סדרן.
- הפעל את הצינורית לדוגמה הניסיונית ב-4 ° c, הפעל את לוחות הטיה, ומיין לתוך שפופרת של 15 מ"ל מראש עם RPMI המכיל 1% FBS ו-1% v/v PS.
הערה: להגן על דגימות מפני אור חזק כדי למזער את מקושה RFP.
5. תרבות הNCADSCs
- צלחת התאים הממוינים בצפיפות של 5,000 תאים/cm2 ב 12 לוחית התרבות היטב בינונית תרבות מלאה ו דגירה ב 37 ° c באווירה לח עם 5% CO2 עבור 20 – 24 h.
- הסר את מדיום התרבות, לשטוף את התאים עם טרום מחומם (37 ° c) PBS להסרת פסולת התא ולהוסיף מדיום התרבות הטרייה.
- כאשר התאים הם 80-90% מאגד, לעכל את המונאולייר באמצעות 0.25% טריפסין הפתרון EDTA ב 37 ° c בחממה עבור 3-5 דקות, ולנטרל עם 2 מ ל של מדיום התרבות.
- צנטריפוגה את התאים שנקטפו עבור 15 דקות ב 250 x g ב RT, הסר את הסופרנטאנט, והשהה מחדש את התאים ב 1 mL של מדיום התרבות. . תספור את התאים באמצעות הומוטומטר
- זרע את התאים בצלחת 12 היטב התרבות בצפיפות של 5,000 תאים/cm2.
- השהה מחדש את התאים הנותרים במדיום התרבותי המכיל 10% DMSO, להקפיא ולאחסן בחנקן נוזלי.
6. השראה אדיגנית של NCADSCs
- לגרום הבחנה אדיפוגניים של NCADSCs בשנת 80 – 90% שליטה ותנאים התרבות הסטנדרטית21.
- עבור השראה חום האינדוקציה, תחילה לטפל בתאים מתורבתים עם מדיום אינדוקציה חום אדיפוגניים (HDMEM 10% FBS, 1% v/v PS, 0.5 מ"מ/L IBMX, 0.1 μM/L dexamethone, 1 μM/L rosiglitazone, 10 nmol/L triiodothyronine, ו 1 μg/mL אינסולין) במשך יומיים. לשטוף את התאים עם PBS 2x ולהחליף עם בינוני טרי (HDMEM 10% FBS, 1% v/v PS, 1 μM/L rosiglitazone, 10 nmol/L triiodothyronine, ו 1 μg/mL אינסולין). לשנות את המדיום כל 2 ימים עבור סך של 3 – 5x.
- עבור אינדוקציה האדיפוגניים לבן, תחילה לטפל בתאים עם השראה לבן אינדוקציה בינונית (HDMEM 10% FBS, 1% v/v PS, 0.5 mM/L IBMX, 0.1 μM/L dexamethone, ו-1 μg/mL אינסולין) במשך יומיים. שטוף את התאים עם PBS 2x ולהחליף עם בינוני טרי (HDMEM 10% FBS, 1% v/v PS, ו 1 μg/mL אינסולין). שנה בינונית זו כל 2 ימים עבור סך של 3-5x.
- לנתח את התאים האדיפוגניים לפי הצורך.
הערה: להיות עדין כאשר לשטוף את התאים עם PBS. אדיפוציטים בונות יכול בקלות לשטוף משם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל, הגענו ~ 0.5 – 1.0 x 106 ADSCs מ 5-6 wnt-1 היצורים+/-; Rosa26Rfp/+ עכברים (48 בן שבועות, זכר או נקבה).
תרשים הזרימה של אוסף PAAT מעכברים מוצג באיור 1. המבנה של הNCADSCs היה דומה ל-ADSC מן העכברים האחרים מרקמות האדיפוז. הNCADSCs התרבותיים הגיעו ל-80-90% שליטה לאחר 7 – 8 ימים של תרבות, ולNCADSCs הייתה מורפולוגיה מורחבת בצורת פיברולסט (איור 2ב, ג).
כדי לאשר עוד כי NCADSCs היה פוטנציאל adipogenic, הבידול של NCADSCs לתוך לבן או חום adipogenic המושרה. שמן אדום כתמים שימש כדי לזהות את אדיפוציטים בוגרים (איור 2). NCADSCs הציגו פוטנציאל אדיפוגני חזק עבור adipogenic לבן וחום לאחר האינדוקציה. Adipocytes מבוגרים נצפו לאחר 8 ימים של אינדוקציה לבן או חום השראה, עם מעל 60% של NCADSCs מראה הבחנה אדיפוגניים (איור 2D, F, H). שיפור הזמן האינדוקציה האדיפוגניים השתפר שיעור הקציר של adipogenic בוגרים (נתונים לא מוצגים). NCADSCs היה מופחת מאוד פוטנציאל אדיפוגני לאחר פאסאייג ' (איור 2E, G, H).
בלוק חיסוני וכמותי-PCR בזמן אמת (רביעיית-PCR) (ראה קובץ משלים 1 עבור התחל בשימוש) הוכיחה כי רמות הביטוי של adipocyte ספציפי חלבונים וגנים (Perilipin, PPARγ, cebp/α) ב הבדיל האדיפוגני NCADSCs גדל באופן משמעותי לאחר 8 ימים של אינדוקציה האדיפוגנייםלבן ( התוצאות של רביעיית ה-PCR הראו כי האינדוקציה של גנים ספציפיים של adipocyte (Perilipin, PPARγ, Cebp/α) ו-adipocyte חום-גנים ספציפיים (Pgc1α, UCP-1, PPARα, PRDM16) גדל באופן משמעותי ב 8 ימים של אינדוקציה חום אדיפוגניים של NCADSCs (איור 3B, C, D
איור 1: תרשים זרימה של אוסף של PAAT מעכברים. (א) מורדם ומקריב את היצורים האלה-1+/-; Rosa26Rfp/+ עכברים ולבצע לחיתוך האורך של העכבר כדי לחשוף את הלב והריאות; (ב) להסיר את הריאות בלוטת התימוס; (ג) לחשוף paat, קשת העורקים והלב; (ד) להסיר מגבת, העורקים והלב לתוך מאגר HBSS מקורר; (E) קציר paat ולהעביר לתוך מאגר HBSS מקורר. ח = לב; AA = קשת העורקים; T = קורנית; L = ריאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הבידול אדיפוגניים של NCADSCs בודד מ PAAT. (א) הערכה כללית לאפיון ומיון אוכלוסיות NCADSCs (rfp). (ב) תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטית להראות כי NCADSCs דבקה והתרחב לאחר 96 h זריעה על 12 לוחית התרבות היטב. (ג – ג) התמונות הנציגה מראה כי שמן אדום O ויטראז ' NCADSCs מ PAAT לאחר אינדוקציה adipogenic. (ג) שליטה (לא אינדוקציה). (ד) ראשי NCADSCs ו (E) 3x-passaged NCADSCs לאחר 10 ימים של אינדוקציה האדיגניים לבן. (ו) ראשי NCADSCs ו (G) 3x-passaged NCADSCs לאחר 10 ימים של אינדוקציה חום בהיר. (ח) התוצאות הסטטיסטיות של שטח השמן האדום כתמים של הראשי ו-3x Passaged NCADSCS מ paat לאחר 8 ימים של אינדוקציה אדיפוגניים. n = 6. הערכים מבוטאים כמשמעות של ± סטיית תקן (SD). סרגל בקנה מידה = 50 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: איפיון האינדוקציה הלבנה והחומה של NCADSCs. (א) חיסוני מראהרמות ביטוי של חלבונים ספציפיים של adipocyte (Perilipin, PPARγ, cebp/α) בNCADSCs הלבנה הבדיל. (ב) רביעיית-PCR תוצאות המציגות את האינדוקציה של גנים ספציפיים של adipocyte, cebp/α, PPARγ, Perilipin, Fabp4 בצבע לבן וחום הבדיל NCADSCs. (ג) רביעיית-PCR תוצאות המציגות את האינדוקציה של גנים מיוחדים בצבע אדיפוציטוטה, PGC1Α, ucp-1, PPARα, PRDM16 בNCADSCs הלבן והחום הבדיל. רמות הביטוי היו מנורמלות נגד HPRT ונמדדה בשיטת Ct (∆ ∆ Ct). התוצאה הייצוגית של n = 3 ניסויים עצמאיים. הערכים מבוטאים כממוצע ± SD. הבדיקה הדו של סטודנט בלתי מזווג 2-זנבי היתה בשימוש עבור השוואות בין שתי הקבוצות. * P < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
קובץ משלים 1. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר זה, אנו מציגים שיטה אמינה לבידוד, תרבות, ואינדוקציה אדיפוגניים של NCADSCs שחולצו מ-PVAT של Wnt-1 היצורים+/-; עכברים Rosa26rfp/+ טרנסגניים שתוכננו לייצר rfp+ ADSCs. הדיווחים הקודמים מראים כי אין הבדל משמעותי בביטוי של תאי גזע mesenchymal כללי רב עוצמה (MSCs) סמנים ב NCADSCs ו לא NCADSCs22, וכי NCADSCs יש פוטנציאל חזק כדי להבדיל לתוך אדיפוציטים ב מבחנה15,22,23. כך, NCADSCs מבודדים עם פרוטוקול זה צריך להיות מתאים לרוב ADSC לימודים.
היתרון של השיטה הנוכחית הוא שכתב פלורסנט הטבועה ב-NCADSCs הטרנסגניים הופך את תהליך הבידוד לפשוט וחסכוני ללא צורך בנוגדנים או בגשוש מבוסס FACS, או תא מגנטי המופעל מיון24. בנוסף, עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית של RFP הוא חזק יותר מ-FITC, אשר משפרת עוד יותר את היעילות של FACS.
המפתח לפרוטוקול זה הוא ניצול של עכברים צעירים. למרות שעכברים מבוגרים וגדולים יותר יכולים להניב כמות גדולה יותר של רקמת האדיפוז, החלק של האדיפוציטים הנגזרות NC ב PAAT פוחתת עם הגיל משום NCCs ק תורמים בעיקר להתפתחות המוקדמת של PAAT15. לפיכך, הפוטנציאל האדיגני של תאים אלה מסרב לגיל. בהתבסס על הניסויים שלנו, חלון הזמן האופטימלי עבור בידוד NCADSC בעכברים הוא 4 – 8 שבועות.
השיטה שלנו היא פשוטה, מעשית, והוא יכול ליצור ADSCs שופע לחקר המחקר של PVAT ע או אדיבגנזה או ליפוגנזה ב מבחנה, ולבחון תרופות הרומן נגד השמנת יתר ומחלות לב וכלי דם. יתר על כן, NCADSCs של Wnt-1 היצורים+/-; Rosa26Rfp/+ עכברים יכול להיות גם יעיל במערכת מבחנה עבור שדות מחקר אחרים. עם זאת, מספר אזהרות נשארות: ראשית, תאים אלה רגישים יותר ושבריריים יותר מאשר קווי אדיפותי הונצח. שנית, שיעור ההתפשטות הגבוה שלהם והבידול האדיפוגני מנוגד לעובדה שהם נוטים לאבד את הפוטנציאל האדיגני שלהם לאחר מקסימום של חמישה מעברים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
לאומי מפתח R & D תוכנית של סין (2018YFC1312504), הלאומית המדע הטבעי הקרן של סין (81970378, 81670360, 81870293), ועדת המדע והטכנולוגיה של עיריית שנגחאי (17411971000, 17140902402) סיפק את הכספים עבור מחקר זה .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% PFA | BBI life sciences | E672002-0500 | Lot #: EC11FA0001 |
| Agarose | ABCONE (China) | A47902 | 1% working concentration |
| Anti-cebp/α | ABclonal | A0904 | 1:1000 working concentration |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked | CST | 7076 | 1:5000 working concentration |
| Anti-perilipin | Abcam | AB61682 | 1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54 |
| Anti-PPARy | SANTA CRUZ | sc-7273 | 0.2 μg/mL working concentration |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked | CST | 7074 | 1:5000 working concentration |
| Anti-β-Tubulin | CST | 2146 | 1:1000 working concentration |
| BSA | VWR life sciences | 0332-100G | 50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008 |
| Collagenase, Type I | Gibco | 17018029 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | 0.1 µM working concentration |
| Erythrocyte Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333 | |
| FBS | Corning | R35-076-CV | 50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| HDMEM | Gelifesciences | SH30243.01 | Lot #: AD20813268 |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM working concentration |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | 1 μg/mL working concentration |
| Microsurgical forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F201A-1 | |
| Microsurgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-H121A | |
| Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1516 | 0.3% working concentration |
| PBS (Phosphate buffered saline) | ABCONE (China) | P41970 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PrimeScript RT reagent Kit | TAKARA | RR047A | Lot #: AK4802 |
| RNeasy kit | TAKARA | 9767 | Lot #: AHF1991D |
| Rosa26RFP/+ mice | JAX | No.007909 | C57BL/6 backgroud; male and female |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM working concentration |
| Standard forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F424 | |
| Surgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-S231 | |
| SYBR Premix Ex Taq | TAKARA | RR420A | Lot #: AK9003 |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | 10 nM working concentration |
| Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice | JAX | No.009107 | C57BL/6 backgroud; male and female |
References
- Afshin, A., et al. Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries over 25 Years. New England Journal of Medicine. 377 (1), 13-27 (2017).
- Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
- Britton, K. A., et al. Prevalence, distribution, and risk factor correlates of high thoracic periaortic fat in the Framingham Heart Study. Journal of the American Heart Association. 1 (6), 004200 (2012).
- Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (10), 1458-1464 (2009).
- Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (48), 47585-47593 (2003).
- Cinti, S. Between brown and white: novel aspects of adipocyte differentiation. Annals of Medicine. 43 (2), 104-115 (2011).
- Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
- Chen, Y., et al. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. Journal of Visualized Experiments. (109), e53886 (2016).
- Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).
- Medeiros, D. M. The evolution of the neural crest: new perspectives from lamprey and invertebrate neural crest-like cells. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 2 (1), 1-15 (2013).
- Fu, M., et al. Neural Crest Cells Differentiate Into Brown Adipocytes and Contribute to Periaortic Arch Adipose Tissue Formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. , (2019).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).
- Tamura, Y., et al. Neural crest-derived stem cells migrate and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 582-589 (2011).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Tan, P., Pepin, É, Lavoie, J. L. Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis. Journal of Visualized Experiments. (131), e57026 (2018).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
- Sowa, Y., et al. Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest. PLoS One. 8 (12), 84206 (2013).
- Billo, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
- Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), e55818 (2017).
