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Developmental Biology

पेरियाऑर्टिक एडीपोज ऊतक से न्यूरल क्रेस्ट मूल आदिपोज-व्युत्पन्न स्टेम सेल का अलगाव, संस्कृति और एडिपोजेनिक प्रेरण

Published: March 2, 2020 doi: 10.3791/60691
Automatic Translation
*1, *2, 3, 3, 4, 5, 4, 5, 1
1Department of Cardiology, Shanghai Chest Hospital, Shanghai Jiao Tong University, 2Shanghai Institute of Nutrition and Health, Shanghai Institute for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, 3Shanghai Key Laboratory of Hypertension, Shanghai Institute of Hypertension, Ruijin Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 4Department of Cardiology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 5Department of Cardiology, Shanghai Key Laboratory of Clinical Geriatric Medicine, Huadong Hospital Affiliated to Fudan University
* These authors contributed equally

Summary

हम एनडब्ल्यूटी-1 क्रे+/-के पेरियाऑर्टिक एडीपोज ऊतक से न्यूरल क्रेस्ट व्युत्पन्न स्टेम सेल (एनसीएडीएससी) के अलगाव, संस्कृति और आदिपोजेनिक प्रेरण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं; Rosa26RFP/+ चूहों । एनसीएडीसीएस विट्रो में एडिपोजेनेसिस या लिपोजेनेसिस मॉडलिंग के लिए एडीएससी का आसानी से सुलभ स्रोत हो सकता है।

Abstract

रक्त वाहिकाओं के आसपास के एडीपोस ऊतक की अत्यधिक मात्रा (पेरिवस्कुलर एडीपोज ऊतक, जिसे पीवीएटी भी कहा जाता है) हृदय रोग के उच्च जोखिम से जुड़ा हुआ है। विभिन्न एडीपोज़ ऊतकों से प्राप्त एडीएससी अलग-अलग विशेषताएं दिखाते हैं, और पीवीएटी के लोगों को अच्छी तरह से चित्रित नहीं किया गया है। हाल ही में एक अध्ययन में, हमने बताया कि पेरियाऑर्टिक आर्क एडीपोज ऊतक (PAAT) में कुछ एडीएससी तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं (एनसीसी) से उतरते हैं, जो एक्टोडर्म से उत्पन्न प्रवासी कोशिकाओं की क्षणिक आबादी है।

इस पेपर में, हम लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) को अलग-थलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं- डब्ल्यूएनटी-1 क्रे+/-के सैट से एनसीसी लेबल; Rosa26RFP/+ चूहों और विट्रो में उनके आदिपोजेनिक भेदभाव उत्प्रेरण । संक्षेप में, स्ट्रोमल वैस्कुलर अंश (एसवीएफ) को पीएटी से एंजाइमेट रूप से अलग किया जाता है, और आरएफपी+ तंत्रिका क्रेस्ट व्युत्पन्न एडीएससी (एनसीएडीसी) फ्लोरेसेंस सक्रिय सेल छंटाई (एफएसीएस) द्वारा अलग-थलग कर दिया जाता है। एनसीएडीसीएस भूरे और सफेद आदिपोसाइट्स दोनों में अंतर करते हैं, क्रायोपआरक्षित हो सकते हैं, और ~ 3-5 मार्ग के लिए अपनी आदिगतिजनक क्षमता को बनाए रखते हैं। हमारा प्रोटोकॉल वीट्रो में पीवीएटी एडिपोजेनेसिस या लिपोजेनेसिस मॉडलिंग के लिए पीवीएटी से प्रचुर मात्रा में एडीएससी उत्पन्न कर सकता है। इस प्रकार, ये एनसीएडीसीएस पीवीएटी विभेदन में शामिल आणविक स्विच ों का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान प्रणाली प्रदान कर सकते हैं।

Introduction

मोटापे की व्यापकता दुनिया भर में बढ़ रही है, जो हृदय रोग और मधुमेहसहितसंबंधित पुरानी बीमारियों का खतरा बढ़ जाती है 1 । PVAT रक्त वाहिकाओं के चारों ओर है और वैकुलचर समारोह में शामिल एंडोक्राइन और पैराक्रिन कारकों का एक प्रमुख स्रोत है। नैदानिक अध्ययनों से पता चलता है कि उच्च पीवीएटी सामग्री हृदय रोग2,3का एक स्वतंत्र जोखिम कारक है, और इसका पैथोलॉजिकल फ़ंक्शन घटक एडीपोज-व्युत्पन्न स्टेम सेल (एडीएससी)4के फेनोटाइप पर निर्भर करता है।

हालांकि डाययूरिन 3T3-L1, 3T3-F442A, और OP9 जैसी एडीएससी सेल लाइनें एडीपोजेनेसिस या लिपोजेनेसिस5का अध्ययन करने के लिए उपयोगी सेलुलर मॉडल हैं, आदिपोजेनेसिस के लिए नियामक तंत्र सेल लाइनों और प्राथमिक कोशिकाओं के बीच भिन्न होते हैं। स्ट्रोमल वैस्कुलर सेल अंश (एसवीएफ) में एडीएससी सीधे एडीपोस ऊतकों से अलग हो गए और वीवो एडिपोजेनेसिस और लिपोजेनेसिस6में सबसे अधिक संभावना के पुनर्काटिलेट में अंतर करने के लिए प्रेरित किया। हालांकि, एडीएससी के आकार और इम्यूनोफेनोटाइप में कमजोरी, उछाल और भिन्नताएं उनके प्रत्यक्ष अलगाव को चुनौतीपूर्ण बनाती हैं। इसके अलावा, विभिन्न अलगाव प्रक्रियाएं इन कोशिकाओं7की फेनोटाइप और आदिगति संभावित क्षमता को भी काफी प्रभावित कर सकती हैं, इस प्रकार एडीएससी अखंडता को बनाए रखने वाले प्रोटोकॉल की आवश्यकता पर जोर दे सकती हैं।

एडीपोज ऊतक को आमतौर पर रूपात्मक रूप से और कार्यात्मक रूप से अलग सफेद एडीपोज ऊतक (वाट), या भूरे रंग के एडीपोज ऊतक (बैट)8के रूप में वर्गीकृत किया जाता है, जो अलग एएससी9को आश्रय देता है। जबकि पेरिगोननडाल और इंगिनल चमड़े के नीचे WATs से अलग एडीएससी पिछले अध्ययनों में विशेषता है9,10,11,12,कम PVAT से एडीएससी के बारे में जाना जाता है कि मुख्य रूप से BAT13से बना है ।

हाल ही में एक अध्ययन में, हमने पाया कि पेरिओरटिक आर्क एडीपोज ऊतक (PAAT) में निवासी एडीएससी का एक हिस्सा तंत्रिका शिखर कोशिकाओं (एनसीसी) से प्राप्त होता है, जो प्रवासी जनक कोशिकाओं की क्षणिक आबादी है जो एक्टोडर्म14,15से उत्पन्न होती है। WNt1-क्रे ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग तंत्रिका क्रेस्ट सेल विकास16,17का पता लगाने के लिए किया गया था। हमने Wnt-1 क्रे+/-उत्पन्न करने के लिए Rosa26RFP/+ चूहों के साथ Wnt1-Cre+ चूहों को पार कर लिया; Rosa26RFP/+ चूहों, जिसमें एनसीसी और उनके वंशजलाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) के साथ लेबल कर रहे है और आसानी से वीवो में और इन विट्रो15ट्रैक कर रहे हैं । यहां, हम माउस PAAT से तंत्रिका क्रेस्ट व्युत्पन्न एडीएससी (नेकां-व्युत्पन्न एडीएससी, या एनसीएडीसी) को अलग करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं और एनसीएडीडीसी को सफेद आदिपोसाइट्स या ब्राउन एडीपोसाइट्स में अंतर करने के लिए प्रेरित करते हैं।

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Protocol

शंघाई जियाओ टोंग विश्वविद्यालय की एनिमल केयर कमेटी द्वारा एनिमल प्रोटोकॉल की समीक्षा और मंजूरी दी गई है ।

1. Wnt-1 क्रे+/-की पीढ़ी; Rosa26RFP/+ चूहों

  1. क्रॉस Wnt-1 Cre+/-चूहों 16 Rosa26RFP के साथ/+ चूहों18 Wnt-1 Cre+/-उत्पन्न करने के लिए; Rosa26RFP/+ चूहों । 25 डिग्री सेल्सियस और 45% आर्द्रता पर रोगजनक मुक्त सुविधा में 12 घंटे के प्रकाश/अंधेरे चक्र के तहत घर चूहों जब तक वे 4-8 सप्ताह पुराने हैं।

2. PAAT का विच्छेदन

नोट: देखें चित्र 1।

  1. 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर ऑटोक्लेव करके सभी सर्जिकल उपकरण (जैसे, सर्जिकल कैंची, मानक संदंश, और माइक्रोसर्जिकल कैंची और संदंश) को स्टरलाइज करें।
  2. पाचन माध्यम (उच्च ग्लूकोज Dulbecco संशोधित ईगल माध्यम [HDMEM] 2 मिलीग्राम/mL कोलेजेनेज़ प्रकार मैं युक्त तैयार करें। संस्कृति माध्यम (एचडीएमएम जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम [एफबीएस] और 1% वी/वी पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन [पीएस]) तैयार करें। उपयोग से पहले 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर का उपयोग करके स्टरलाइज करें।
  3. सेल संस्कृति अभिकर्मकों को यूवी, इथेनॉल, निस्पंदन या भाप का उपयोग करके उचित रूप से स्टरलाइज करें।
  4. हैंक्स के संतुलित लवण समाधान (एचबीएस) के साथ एक पेट्री डिश तैयार करें और पीएस समाधान के 1% v/v के साथ पूरक एचबीएस के 10 मिलील के साथ 15 मिलीएल शंकुपूर्ण ट्यूब । दोनों को बर्फ पर रखें।
  5. आइसोफ्लोरीन और सर्वाइकल अव्यवस्था द्वारा बलिदान के साथचूहों 15 एनेस्थेटइज़ करें। त्वचा की सतह को स्टरलाइज करने के लिए 5 मिन के लिए 75% अल्कोहल (200 mL) से भरे बीकर में शरीर को विसर्जित करें।
  6. स्निप और पेट पर त्वचा अलग और श्रोणि से गर्दन के लिए वेंट्रल मिडलाइन के साथ काट। पेट खोलें और डायाफ्राम19को बेनकाब करने के लिए जिगर को स्थानांतरित करें ।
  7. मिडलाइन के दोनों ओर डायाफ्राम और पसलियों को काट लें और पसलियों को वापस छीलकर दिल और फेफड़ों को बेनकाब करें।
  8. फेफड़ों और थाइमस को हटा दें और महाधमनी और दिल के साथ-साथ पाट निकालें।
  9. दिल को दूर करने के लिए महाधमनी जड़ में महाधमनी काट लें। महाधमनी आर्क और उतरते महाधमनी के बीच एक कट बनाओ और ध्यान से दोनों संरचनाओं और पीछे छाती की दीवार से बाईं और सही आम कैरोटिड धमनियों आसपास के एडीपोज ऊतक अलग । पेट्री डिश में बर्फ-ठंडे एचबीएसएस बफर में टिश्यू को ट्रांसफर करें।
  10. बाँझ संदंश का उपयोग करके, जितना वास्कुलचर (उदाहरण के लिए, महाधमनी, आम कैरोटिड धमनियां, और अन्य छोटे वास्कुल्चर) और संभावित रूप से प्रावरणी ऊतक को स्थानांतरित करें, और 2 एमएल एपपेन ट्यूबडोर्फ में एडीपोस ऊतक को स्थानांतरित करें जिसमें बर्फ पर 0.5 मिलीएल आइस-कोल्ड एचबीएस बफर होता है।

3. एसवीएफ का अलगाव

5-6 चूहों के PAAT को एक 2 mL माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में एकत्र करें जिसमें 1 mL हौसले से तैयार पाचन माध्यम होता है और कमरे के तापमान (आरटी) पर एक Eppendorf ट्यूब में सर्जिकल कैंची का उपयोग कर ऊतक कीमा ।

  1. मिश्रण को पाचन माध्यम के 9 मिलील वाली 50 मिलीएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें। 1 एमएल पिपेट 10x के साथ ऊपर और नीचे पाइपिंग करके ऊतकों को समरूप करें।
  2. 30-45 मिन के लिए 100 आरपीएम पर लगातार मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें और अपच को रोकने के लिए हर 5-10 सीन की जांच करें। यह सेल व्यवहार्यता और उपज में सुधार के लिए महत्वपूर्ण है।
    नोट: अच्छे ऊतक पाचन के परिणामस्वरूप एक समरूप, हल्के पीले एडीपोज ऊतक होंगे जो ट्यूब को धीरे-धीरे घूमता होने पर नग्न आंखों को दिखाई देता है।
  3. HDMEM के 5 mL जोड़कर पाचन बंद करो जिसमें 10% एफबीएस और आरटी में 1% v/v पीएस होते हैं और पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं ।
  4. आरटी में 5 मिन के लिए 500 x ग्राम पर सेल निलंबन को सेंट्रलाइज किया। एसवीएफ भूरे रंग के छर्रे के रूप में दिखाई देगा। ध्यान से फ्लोटिंग आदिपोसाइट्स को एस्पिरेट करें और एसवीएफ को परेशान किए बिना शेष अधिनेत को डिडेंट करें। एसवीएफ गोली को संस्कृति माध्यम के 10 मिलील में भंग करें और 70 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से फ़िल्टर करें।
  5. 5 मिन के लिए 500 x ग्राम पर सेल निलंबन को सेंट्रलाइज करें, सुपरनेटेंट को हटा दें, और आरटी में 10 मिन के लिए 15 मीटर शंकुई ट्यूब में एरिथ्रोसाइट लाइसिस बफर के 5 mL में गोली को धीरे से फिर से निलंबित करें।
  6. 1% एफबीएस युक्त 1x पीबीएस के 10 मिलील जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 500 x ग्राम पर सेल निलंबन को केंद्राधीक्षक, सुपरनेटेंट को हटा दें, और 1% एफबीएस वाले 1x पीबीएस के 10 मीटर में गोली को फिर से निलंबित करें।
  7. कोशिकाओं को फिर से 500 x ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 00 x के लिए अपकेंद्रित्र करें। सुपरनेट निकालें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिलील शंकुई ट्यूब में संस्कृति माध्यम के 5 मिलील में गोली को फिर से निलंबित करें।
  8. अपन्तिफेशन के अंतिम दौर (4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 500 x ग्राम) के अंतिम दौर के बाद, एफएसीएस बफर के 5 मिलीग्राम (पीबीएस युक्त 10% एफबीएस, 100 इकाइयों/mL डीएनए I, और बर्फ पर 1% v/v PS) में पैलेट्ड कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और कोशिकाओं को हीमोसाइटोमीटर के साथ गिनें।

4. एफएसीएस द्वारा एनसीएडीडीसी का अलगाव

  1. अनुदेश मैनुअल का पालन करते हुए सेल सॉर्टर को सेट करें और अनुकूलित करें। 100 माइक्रोन नोजल का चयन करें, संग्रह ट्यूबों की नसबंदी करें, आवश्यक संग्रह डिवाइस स्थापित करें, और साइड स्ट्रीम20सेट करें।
  2. आरएफपी+ कोशिकाओं को छांटने के लिए 561 एनएम येलो/ग्रीन लेजर और ऑप्टिकल फिल्टर 579/16 की सिफारिश की जाती है। नकारात्मक नियंत्रण और एकल दाग सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग कर मुआवजा प्रदर्शन करते हैं । गेटिंग योजना के लिए चित्र ा 2ए देखें।
  3. कोशिकाओं को 40 माइक्रोन छलनी के माध्यम से फ़िल्टर करें, 5 मिन के लिए 500 x ग्राम पर अपकेंद्री, और 0.5-1 x 107/mLके घनत्व पर FACS बफर के 2 mL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। कोशिकाओं को स्पष्ट रूप से 5 मिलील गोल बॉटम पॉलीस्टीरिन ट्यूबों को लेबल करने के लिए स्थानांतरित करें, और सॉर्टर में लोड करें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रयोगात्मक नमूना ट्यूब चलाएं, विक्षेप प्लेटों को चालू करें, और आरपीएमआई के साथ 15 मिलीस शंकुपूर्ण ट्यूब में सॉर्ट करें जिसमें 1% एफबीएस और 1% वी/वी पीएस शामिल हैं।
    नोट: आरएफपी शमन को कम करने के लिए नमूनों को मजबूत प्रकाश से बचाएं।

5. एनसीएडीडीसी की संस्कृति

  1. प्लेट 5,000 कोशिकाओं के घनत्व पर हल कोशिकाओं/सेमी2 पूर्ण संस्कृति माध्यम में एक 12 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट में और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्र वातावरण में इनक्यूबेट के साथ 5% सीओ2 के साथ 20-24 घंटे के लिए।
  2. संस्कृति माध्यम को हटादें, कोशिका ओं के मलबे को हटाने और ताजा संस्कृति माध्यम जोड़ने के लिए पूर्वगरम (37 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं।
  3. एक बार कोशिकाओं 80-90% संधाराहोती है, 3-5 मिन के लिए एक इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.25% ट्राइप्सिन EDTA समाधान का उपयोग कर मोनोलेयर पचा, और संस्कृति माध्यम के 2 mL के साथ बेअसर।
  4. आरटी पर 250 x ग्राम पर 15 मिन के लिए काटा कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र, अधिनात को हटा दें, और संस्कृति माध्यम के 1 mL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। कोशिकाओं को हीमोसाइटोमीटर से गिनें।
  5. 5,000 कोशिकाओं/सेमी2के घनत्व पर 12 अच्छी संस्कृति प्लेट में कोशिकाओं को बीज ।
  6. 10% DMSO युक्त संस्कृति माध्यम में शेष कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, फ्रीज, और तरल नाइट्रोजन में स्टोर करें।

6. एनसीएडीडीसी का एडिपोजेनिक इंडक्शन

  1. एनसीएडीसी के आदिजेनिक भेदभाव को 80-90% कन्फ्लनऔर मानक संस्कृति की स्थिति21पर प्रेरित करें।
  2. ब्राउन आदिजेनिक इंडक्शन के लिए सबसे पहले सुसंस्कृत कोशिकाओं को ब्राउन एडिपोजेनिक इंडक्शन मीडियम (एचडीएमईएम, 10% एफबीएस, 1% वी/वी पीएस, 05 एमएम/एल आईबीएमएक्स, 01μM/L dexamethasone, 1 μM/L rosiglitazone, 10 nmol/L triiodothyronine, और 1 μg/mL इंसुलिन) के साथ 2 दिनों के लिए इलाज करें । पीबीएस 2x के साथ कोशिकाओं को धोएं और ताजा माध्यम (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 1 μM/L rosiglitazone, 10 nmol/L triiodothyronine, और 1 μ/mL इंसुलिन) के साथ बदलें । इस माध्यम को कुल 3-5x के लिए हर 2 दिन में बदलें।
  3. व्हाइट एडिपोजेनिक इंडक्शन के लिए सबसे पहले कोशिकाओं को व्हाइट एडिपोजेनिक इंडक्शन मीडियम (एचडीएमईएम, 10% एफबीएस, 1% वी/वी पीएस, 05 एमएम/एल आईबीएमएक्स, 01 माइक्रोएम/एल डिक्सेथासोन और 1 माइक्रोन/एमएल इंसुलिन) के साथ 2 दिन तक ट्रीट करें। पीबीएस 2x के साथ कोशिकाओं को धोएं और ताजा माध्यम (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, और 1 μg/mL इंसुलिन) के साथ बदलें । इस माध्यम को कुल 3-5x के लिए हर 2 दिन में बदलें।
  4. उचित के रूप में आदिजेनिक कोशिकाओं का विश्लेषण करें।
    नोट: पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोते समय कोमल रहें। विभेदित एडीपोसाइट्स आसानी से धो सकते हैं।

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Representative Results

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने ~ 0.5-1.0 x 106 एडीएससी 5-6 WNt-1 क्रे+/-से प्राप्त किए; Rosa26RFP/+ चूहों (४८ सप्ताह पुराने, पुरुष या महिला) ।

चूहों से PAAT के संग्रह का प्रवाह चार्ट चित्र 1में प्रस्तुत किया गया है । एनसीएडीडीसी की आकृति विज्ञान अन्य चूहों से एडीएससी के समान थी। संस्कारी एनसीएडीसीएस 7-8 दिनों की संस्कृति के बाद 80-90% तक पहुंच गया, और एनसीएडीएससी में विस्तारित फाइब्रोब्लास्ट जैसी आकृति विज्ञान(चित्रा 2बी, सी)था।

आगे की पुष्टि करने के लिए कि एनसीएडीसीएस में एडीपोजेनिक क्षमता थी, एनसीएडीडीसी को सफेद या भूरे रंग के आदिपोसाइट्स में अंतर प्रेरित किया गया था। परिपक्व आदिपोसाइट्स(चित्रा 2)का पता लगाने के लिए तेल लाल धुंधला का उपयोग किया गया था। एनसीएडीसीएस ने इंडक्शन के बाद सफेद और भूरे रंग के दोनों एडिपोसाइट्स के लिए मजबूत आदिजेनिक क्षमता का प्रदर्शन किया । सफेद या भूरे रंग के आदिपोजेनिक इंडक्शन के 8 दिनों के बाद परिपक्व एडीपोसाइट्स देखे गए, जिसमें 60% से अधिक एनसीएडीसीएस आदिपोजेनिक भेदभाव(चित्रा 2डी, एफ, एच)दिखा रहे हैं। लंबे समय तक एडिपोजेनिक प्रेरण समय परिपक्व आदिपोसाइट्स (नहीं दिखाए गए डेटा) की कटाई दर में सुधार हुआ। एनसीएडीएससी ने पासिंग(चित्रा 2ई, जी, एच)के बाद एडीपोजेनिक क्षमता को बहुत कम कर दिया था।

इम्यूनोब्लॉटिंग और मात्रात्मक रीयल-टाइम पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर) (प्राइमर के लिए पूरक फ़ाइल 1 देखें) ने साबित कर दिया कि आदिपोजेनिक रूप से अलग एनसीएडीसीएस में आदिपोसाइट-विशिष्ट सापेक्ष प्रोटीन और जीन (पेरिडिपिन, पीपीआर) की अभिव्यक्ति का स्तर काफी बढ़ गया है जो सफेद आदिजेनिक प्रेरण(चित्रा 3ए, बी)के 8 दिनों के बाद काफी बढ़ गया है । क्यूआरटी-पीसीआर परिणामों से पता चला है कि एडिपोसाइट-विशिष्ट जीन (पेरिरिपिन, पीपीआर, सीबीपी/α) और ब्राउन आदिपोसाइट-विशिष्ट जीन (Pgc1α, यूसीपी-1, पीपीआरα, PRDM16) के शामिल होने से एनसीएडीडीसी(चित्रा 3बी, सी, डी)के ब्राउन आदिपोजेनिक इंडक्शन के 8 दिनों में काफी वृद्धि हुई है ।

Figure 1
चित्रा 1: चूहों से PAAT के संग्रह का प्रवाह चार्ट। (A)एनस्थेटाइज़ और डब्ल्यूएनटी-1 क्रे+/-का बलिदान करें; Rosa26RFP/+ चूहों और दिल और फेफड़ों का पर्दाफाश करने के लिए माउस के देशीयत विच्छेदन प्रदर्शन; (ख)फेफड़ों और थाइमस को हटा दें; (ग)PAAT, महाधमनी आर्क, और दिल का पर्दाफाश; (D)प्रीकूल्ड एचबीएसएस बफर में पीवीएटी, महाधमनी और दिल को हटा दें; (ई)हार्वेस्ट PAAT और प्रीकूल्ड एचबीएसएस बफर में स्थानांतरित करें। एच = दिल; ए. ए. = महाधमनी आर्क; टी = थाइमस; एल = फेफड़े। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: PAAT से अलग NCADSCs के आदिपोजेनिक भेदभाव । (A)एनसीएडीडीसी (आरएफपी) आबादी की विशेषता और छंटाई के लिए सामान्य गेटिंग योजना। (ख)फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप छवियों से पता चलता है कि एनसीएडीसीएस ने 12 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट पर ९६ एच सीडिंग के बाद पालन और विस्तार किया । (सी-जी) प्रतिनिधि छवियां दिखा रही हैं कि तेल लाल ओ ने आदिपोजेनिक इंडक्शन के बाद PAAT से NCADSCs को दाग दिया। (ग)नियंत्रण (कोई प्रेरण नहीं) । (D)प्राथमिक एनसीएडीसीएस और(ई)3x-पैसेज एनसीएडीसीएस सफेद आदिपोजेनिक इंडक्शन के 10 दिनों के बाद । (एफ)ब्राउन एडिपोजेनिक इंडक्शन के 10 दिनों के बाद प्राथमिक एनसीएडीसीएस और(जी)3एक्स-पैसेज्ड एनसीएडीसीएस । (एच)प्राथमिक और 3x मार्गित एनसीएडीडीसी के तेल लाल धुंधला क्षेत्र के सांख्यिकीय परिणाम पैट से 8 दिनों के बाद आदिजेनिक प्रेरण । n = 6. मूल्यों को मतलब ± मानक विचलन (एसडी) के रूप में व्यक्त किया जाता है। स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एनसीएडीडीसी के सफेद और भूरे रंग के आदिजेनिक प्रेरण का लक्षण वर्णन। (A)इम्यूनोब्लॉट सफेद आदिजनिक रूप से अंतर एनसीएडीसीएस में आदिपोसाइट-विशिष्ट प्रोटीन (पेरिनिपिन, पीपीआर, सीईबीपी/α) की अभिव्यक्ति के स्तर को दर्शाते हैं । (ख)क्यूआरटी-पीसीआर परिणाम ों में सफेद और भूरे रंग के अडिपोजिकल अंतर एनसीएडीडीसी में आदिपोसाइट-विशिष्ट जीन, सीईबीपी/α, पीपीआर, पेरिनिपिन, फैब4 को शामिल किया गया है । (C)क्यूआरटी-पीसीआर परिणाम भूरे रंग के आदिपोसाइट-विशिष्ट जीन, पीजीसी1α, यूसीपी-1, पीपीआरα, पीआरडीएम16 को सफेद और भूरे रंग में शामिल करने वाले एनसीएडीडीसी को दर्शाते हैं । अभिव्यक्ति के स्तर को एचपीआरटी के खिलाफ सामान्य ीकृत किया गया था और सीटी (सीटी) विधि द्वारा मापा गया था। एन = 3 स्वतंत्र प्रयोगों का प्रतिनिधि परिणाम। मूल्यों के रूप में व्यक्त कर रहे है मतलब ± एसडी । अनपेयर 2-पूंछ वाले छात्र टी-टेस्ट का उपयोग दोनों समूहों के बीच तुलना के लिए किया गया था । * पी एंड एलटी; 0.05। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक फ़ाइल 1. कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

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Discussion

इस अध्ययन में, हम WNt-1 क्रे+/-के पीवीएटी से निकाले गए एनसीएडीडीसी के अलगाव, संस्कृति और आदिजनीय प्रेरण के लिए एक विश्वसनीय तरीका प्रस्तुत करते हैं; Rosa26RFP/+ ट्रांसजेनिक चूहों आरएफपी+ ADSCs का उत्पादन करने के लिए डिज़ाइन किया गया । पिछली रिपोर्टों से पता चलता है कि एनसीएडीडीसी और गैर एनसीएडीएससी22में सामान्य बहुशक्तिशाली मेसेनचिमल स्टेम सेल (एमएससी) मार्कर की अभिव्यक्ति में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं है और एनसीएडीडीसी में विट्रो15,22,23में एडीपोसाइट्स में अंतर करने की प्रबल क्षमता है । इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल के साथ अलग NCADSCs अधिकांश एडीएससी अध्ययन के लिए उपयुक्त होना चाहिए।

वर्तमान विधि का लाभ यह है कि ट्रांसजेनिक एनसीएडीसीएस में अंतर्निहित फ्लोरोसेंट रिपोर्टर एंटीबॉडी या प्रोब-आधारित FACS, या चुंबकीय सक्रिय सेल छंटाई24की आवश्यकता के बिना अलगाव की प्रक्रिया को सरल और किफायती बनाता है। इसके अलावा, आरएफपी की फ्लोरेसेंस तीव्रता फिटैसी की तुलना में मजबूत है, जो एफएसीएस की दक्षता को और बेहतर बनाता है।

इस प्रोटोकॉल की कुंजी युवा चूहों का उपयोग है। हालांकि पुराने और बड़े चूहों एडीपोज ऊतक की एक बड़ी मात्रा में उपज कर सकते हैं, PAAT में नेकां व्युत्पन्न adipocytes का अनुपात उंर के साथ कम हो जाती है क्योंकि एनसीसी मुख्य रूप से PAAT15के प्रारंभिक विकास में योगदान देते हैं । इस प्रकार, उम्र के साथ इन कोशिकाओं की एडिपोजेनिक क्षमता में गिरावट आती है। हमारे प्रयोगों के आधार पर, चूहों में एनसीएडीएससी अलगाव के लिए इष्टतम समय खिड़की 4-8 सप्ताह है।

हमारी विधि सरल, व्यावहारिक है, और विट्रो में पीवीएटी एडिपोजेनेसिस या लिपोजेनेसिस के अध्ययन के लिए प्रचुर मात्रा में एडीएससी उत्पन्न कर सकती है, और मोटापे और हृदय रोग के खिलाफ उपन्यास दवाओं का परीक्षण करने के लिए। इसके अलावा, WNt-1 Cre+/-के NCADSCs; Rosa26RFP/+ चूहों भी अन्य अनुसंधान क्षेत्रों के लिए एक प्रभावी इन विट्रो प्रणाली हो सकता है । हालांकि, कई चेतावनी बनी हुई हैं: सबसे पहले, ये कोशिकाएं अमर आदिपोसाइट लाइनों की तुलना में अधिक संवेदनशील और नाजुक हैं। दूसरा, उनकी उच्च प्रसार दर और आदिपोजेनिक भेदभाव इस तथ्य से प्रतिकार किया जाता है कि वे अधिकतम पांच मार्गों के बाद अपनी आदिगतिजनक क्षमता खो देते हैं ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

चीन का राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (2018YFC1312504), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81970378, 81670360, 81870293), और शंघाई नगर पालिका के विज्ञान एवं प्रौद्योगिकी आयोग (17411971000, 17140902402) ने इस अध्ययन के लिए धन प्रदान किया .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% PFA BBI life sciences E672002-0500 Lot #: EC11FA0001
Agarose ABCONE (China) A47902 1% working concentration
Anti-cebp/α ABclonal A0904 1:1000 working concentration
Anti-mouse IgG, HRP-linked CST 7076 1:5000 working concentration
Anti-perilipin Abcam AB61682 1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54
Anti-PPARy SANTA CRUZ sc-7273 0.2 μg/mL working concentration
Anti-rabbit IgG, HRP-linked CST 7074 1:5000 working concentration
Anti-β-Tubulin CST 2146 1:1000 working concentration
BSA VWR life sciences 0332-100G 50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008
Collagenase, Type I Gibco 17018029
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902 0.1 µM working concentration
Erythrocyte Lysis Buffer Invitrogen 00-4333
FBS Corning R35-076-CV 50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS
HBSS Gibco 14025092
HDMEM Gelifesciences SH30243.01 Lot #: AD20813268
IBMX Sigma-Aldrich I7018 0.5 mM working concentration
Insulin Sigma-Aldrich I3536 1 μg/mL working concentration
Microsurgical forceps Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) MR-F201A-1
Microsurgical scissor Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) MR-H121A
Oil Red O solution Sigma-Aldrich O1516 0.3% working concentration
PBS (Phosphate buffered saline) ABCONE (China) P41970
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
PrimeScript RT reagent Kit TAKARA RR047A Lot #: AK4802
RNeasy kit TAKARA 9767 Lot #: AHF1991D
Rosa26RFP/+ mice JAX No.007909 C57BL/6 backgroud; male and female
Rosiglitazone Sigma-Aldrich R2408 1 μM working concentration
Standard forceps Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) MR-F424
Surgical scissor Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) MR-S231
SYBR Premix Ex Taq TAKARA RR420A Lot #: AK9003
Triiodothyronine Sigma-Aldrich T2877 10 nM working concentration
Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice JAX No.009107 C57BL/6 backgroud; male and female

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 157 तंत्रिका क्रेस्ट सेल Wnt-1 माउस परिसिद्धांत एडीपोज ऊतक आदिपोस-व्युत्पन्न स्ट्रोमल कोशिकाएं स्ट्रोमल संवहनी अंश सेल संस्कृति आदिपोजेनिक प्रेरण
पेरियाऑर्टिक एडीपोज ऊतक से न्यूरल क्रेस्ट मूल आदिपोज-व्युत्पन्न स्टेम सेल का अलगाव, संस्कृति और एडिपोजेनिक प्रेरण
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Qi, Y., Miao, X., Xu, L., Fu, M., Peng, S., Shi, K., Li, J., Ye, M., Li, R. Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (157), e60691, doi:10.3791/60691 (2020).

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