Summary
Presentamos un protocolo para el aislamiento, el cultivo y la inducción adipogénica de células madre derivadas de cresta neural derivadas de la cresta adiposa (NCADSC) del tejido adiposorio periaortico de Wnt-1 Cre+/-; Ratones Rosa26RFP/+. Los NCADSC pueden ser una fuente de aXenatos de fácil acceso para modelar adipogénesis o lipogénesis in vitro.
Abstract
Una cantidad excesiva de tejido adiposo que rodea los vasos sanguíneos (tejido adiposo perivascular, también conocido como PVAT) se asocia con un alto riesgo de enfermedad cardiovascular. Los ADSC derivados de diferentes tejidos adiposos muestran características distintas, y los del PVAT no han sido bien caracterizados. En un estudio reciente, informamos que algunos ADSC en el tejido adiposo del arco periaortico (PAAT) descienden de las células de la cresta neural (NCC), una población transitoria de células migratorias que se originan en el ectodermo.
En este artículo, describimos un protocolo para aislar los CNC etiquetados con proteína fluorescente roja (RFP) del PAAT de Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ ratones e inducir su diferenciación adipogénica in vitro. Brevemente, la fracción vascular estromal (SVF) se disocia enzimáticamente del PAAT, y los ADSC derivados de cresta neural RFP+ (NCADSC) se aíslan por la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Los NCADSC se diferencian en adipocitos marrones y blancos, pueden ser crioconservados, y conservan su potencial adipogénico para pasajes de 3-5 euros. Nuestro protocolo puede generar abundantes ADSC del PVAT para modelar la adipogénesis PVAT o la lipogénesis in vitro. Por lo tanto, estos NCADSC pueden proporcionar un sistema valioso para el estudio de los interruptores moleculares involucrados en la diferenciación PVAT.
Introduction
La prevalencia de la obesidad está aumentando en todo el mundo, lo que aumenta el riesgo de enfermedades crónicas relacionadas, incluidas las enfermedades cardiovasculares y la diabetes1. PVAT rodea los vasos sanguíneos y es una fuente importante de factores endocrinos y paracrinos involucrados en la función de la vasculatura. Los estudios clínicos muestran que el alto contenido de PVAT es un factor de riesgo independiente de enfermedad cardiovascular2,3, y su función patológica depende del fenotipo de las células madre derivadas de la adiposa constituyente (ADSC)4.
Aunque las líneas celulares ADSC como la murino 3T3-L1, 3T3-F442A y OP9 son modelos celulares útiles para estudiar la adipogénesis o lipogénesis5, los mecanismos reguladores de la adipogénesis difieren entre las líneas celulares y las células primarias. Los ADSC en la fracción de células vasculares estromales (SVF) se aislaron directamente de los tejidos adiposos e indujeron a diferenciarse en adipocitos probablemente recapitulan in vivo adipogénesis y lipogénesis6. Sin embargo, la fragilidad, la flotabilidad y las variaciones en el tamaño y los inmunofenotipos de los ADSC hacen que su aislamiento directo sea un reto. Además, los diferentes procedimientos de aislamiento también pueden afectar significativamente el fenotipo y la capacidad potencial adipogénica de estas células7,haciendo hincapié así en la necesidad de un protocolo que mantenga la integridad ADSC.
El tejido adiposo se clasifica típicamente como el tejido adiposo blanco morfológica y funcionalmente distinto (WAT), o el tejido adiposo marrón (BAT)8,que alberga distintos ADSC9. Mientras que los ADSC aislados de WAT subcutáneos perigonadal e inguinales se han caracterizado en estudios anteriores9,10,11,12, menos se sabe con respecto a los ADSC de PVAT que se compone principalmente de BAT13.
En un estudio reciente, encontramos que una parte de los ADSC residentes en el tejido adiposo del arco periaortico (PAAT) se derivan de las células de la cresta neural (NCC), una población transitoria de células progenitoras migratorias que se originan en el ectoderm14,15. Los ratones transgénicos Wnt1-Cre se utilizaron para rastrear el desarrollo de células de cresta neural16,17. Cruzamos Wnt1-Cre+ ratones con ratones Rosa26RFP/+ para generar Wnt-1 Cre+/-; Ratones Rosa26RFP/+, en los que los CNC y sus descendientes están etiquetados con proteína fluorescente roja (RFP) y se rastrean fácilmente in vivo e in vitro15. Aquí, describimos un método para aislar los ADSC derivados de cresta neural (ADSC derivados de NC, o NCADSC) del PAAT del ratón e inducen a los NCADSC a diferenciarse en adipocitos blancos o adipocitos marrones.
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Protocol
El protocolo animal ha sido revisado y aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Jiao Tong de Shanghái.
1. Generación de Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ Ratones
- Cross Wnt-1 Cre+/- ratones16 con ratones Rosa26RFP/+ 18 para generar Wnt-1 Cre+/-; Ratones Rosa26RFP/+. Los ratones domésticos bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h en una instalación libre de patógenos a 25 oC y 45% de humedad hasta que tengan 4-8 semanas de edad.
2. Disección del PAAT
NOTA: Consulte la Figura 1.
- Esterilice todas las herramientas quirúrgicas (p. ej., tijeras quirúrgicas, fórceps estándar y tijeras y fórceps microquirúrgicas) autoclavendo a 121 oC durante 30 min.
- Preparar el medio de digestión (Alto medio de glucosa Dulbecco modificado Eagle Medium [HDMEM] que contiene 2 mg/ml de colagenasa tipo I). Preparar el medio de cultivo (HDMEM que contiene 10% de suero bovino fetal [FBS] y 1% v/v penicilina-estreptomicina [PS]). Esterilice utilizando un filtro de jeringa de 0,22 m antes de su uso.
- Esterilice los reactivos de cultivo celular utilizando UV, etanol, filtración o vapor, según corresponda.
- Prepare una placa Petri con la solución salina equilibrada (HBSS) de Hanks y un tubo cónico de 15 ml con 10 ml de HBSS complementado con 1% v/v de solución PS. Mantén ambos en hielo.
- Anestesiar a los ratones15 con isoflurano y sacrificio por luxación cervical. Sumerja los cuerpos en un vaso lleno de 75% de alcohol (200 ml) durante 5 minutos para esterilizar la superficie de la piel.
- Recorte y separe la piel del abdomen y corte a lo largo de la línea media ventral desde la pelvis hasta el cuello. Abra el abdomen y mueva el hígado para exponer el diafragma19.
- Corta el diafragma y las costillas a ambos lados de la línea media y expone el corazón y los pulmones despegando las costillas.
- Retire el pulmón y el timo y extraiga el PAAT junto con la aorta y el corazón.
- Corta la aorta en la raíz aórtica para eliminar el corazón. Haga un corte entre el arco aórtico y la aorta descendente y separe cuidadosamente el tejido adiposo que rodea ambas estructuras y las arterias carótidas comunes izquierda y derecha de la pared tórax posterior. Transfiera el tejido al tampón HBSS helado en la placa Petri.
- Usando fórceps estériles, retire la mayor parte de la vasculatura (por ejemplo, aorta, arterias carótidas comunes y otras pequeñas vasculaturas) y fascia como sea posible, y transfiera el tejido adiposo a los tubos Eppendorf de 2 ml contienen un tampón HBSS helado de 0,5 ml en hielo.
3. Aislamiento del SVF
Recoger el PAAT de 5-6 ratones en un tubo de microcentrífuga de 2 ml que contenga 1 ml de medio de digestión recién preparado y picar el tejido utilizando tijeras quirúrgicas en un tubo Eppendorf a temperatura ambiente (RT).
- Transfiera la mezcla a tubos de 50 ml que contengan 9 ml del medio de digestión. Homogeneizar los tejidos pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1 ml 10x.
- Incubar los tubos a 37 oC con agitación constante a 100 rpm durante 30-45 min y comprobar cada 5-10 minutos para evitar la sobredigestión. Esto es fundamental para mejorar la viabilidad celular y el rendimiento.
NOTA: Una buena digestión tisular dará lugar a un tejido adiposo homogéneo de color amarillo claro que es visible a simple vista al agitar suavemente el tubo. - Detenga la digestión añadiendo 5 ml de HDMEM que contiene 10% FBS y 1% v/v PS en RT y mezcle bien pipeteando.
- Centrifugar la suspensión celular a 500 x g durante 5 min a RT. El SVF será visible como un pellet marrón. Aspirar cuidadosamente los adipocitos flotantes y decantar el sobrenadante restante sin molestar al SVF. Disolver el pellet SVF en 10 ml de medio de cultivo y filtrar a través de un colador de células de 70 m.
- Centrifugar la suspensión celular a 500 x g durante 5 min, retirar el sobrenadante y resuspender suavemente el pellet en 5 ml de tampón de lisis de eritrocitos en un tubo cónico de 15 ml durante 10 minutos a RT.
- Detenga la reacción añadiendo 10 ml de 1PBS que contenga 1% de FBS. Centrifugar la suspensión celular a 500 x g durante 5 min a 4 oC, retirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 10 ml de 1x PBS que contenga 1% de FBS.
- Centrifugar las células de nuevo a 500 x g durante 5 min a 4 oC. Retirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 5 ml de medio de cultivo en un tubo cónico de 15 ml a 4 oC.
- Después de una ronda final de centrifugación (500 x g durante 5 min a 4 oC), resuspenda las células peletadas en 5 ml de tampón FACS (PBS que contiene 10% FBS, 100 unidades/ml de ADN I y 1% v/v PS) en hielo, y cuente las células con un hemocitómetro.
4. Aislamiento de las NCADSC por FACS
- Configure y optimice el clasificador de celdas siguiendo el manual de instrucciones. Seleccione la boquilla de 100 m, esterilice los tubos de recogida, instale el dispositivo de recogida necesario y configure las corrientes laterales20.
- Se recomienda un láser amarillo/verde de 561 nm y un filtro óptico 579/16 para clasificar las células RFP+. Realice la compensación utilizando el control negativo y los controles positivos de un solo mancha. Vea la figura 2A para el esquema de gating.
- Filtrar las células a través de un colador de 40 m, centrífuga a 500 x g durante 5 min, y resuspender las células en 2 ml de búfer FACS a una densidad de 0.5–1 x 107/mL. Transfiera las células a tubos de poliestireno de fondo redondo de 5 ml claramente etiquetados y cargue las celdas en el clasificador.
- Ejecuta el tubo de muestra experimental a 4oC, enciende las placas de desviación y ordena en un tubo cónico de 15 ml prerelado con RPMI que contiene 1% DE FBS y 1% v/v PS.
NOTA: Proteja las muestras de la luz fuerte para minimizar el enfriamiento RFP.
5. Cultura de las NCADSC
- Placar las células clasificadas a una densidad de 5.000 células/cm2 en una placa de cultivo de 12 pocillos en un medio de cultivo completo e incubar a 37oC en una atmósfera húmeda con 5% deCO2 para 20–24 h.
- Retire el medio de cultivo, lave las células con PBS precalentado (37 oC) para eliminar los restos celulares y agregue un medio de cultivo fresco.
- Una vez que las células sean de 80-90% de confluente, digerir la monocapa usando una solución EDTA de trippsina del 0,25% a 37 oC en una incubadora durante 3-5 min, y neutralizar con 2 ml de medio de cultivo.
- Centrifugar las células cosechadas durante 15 min a 250 x g en RT, eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 1 ml de medio de cultivo. Cuente las células con un hemocaquímetro.
- Sembrar las células en una placa de cultivo de 12 pozos a la densidad de 5.000 celdas/cm2.
- Resuspender las células restantes en el medio de cultivo que contiene 10% DMSO, congelar, y almacenar en nitrógeno líquido.
6. Inducción adipogénica de NCADSCs
- Inducir la diferenciación adipogénica de las NCADSC en 80-90% confluencia y condiciones de cultivo estándar21.
- Para la inducción adipogénica marrón, primero trate las células cultivadas con medio de inducción adipogénico marrón (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 0,5 mM/L IBMX, 0,1 m/L dexametasona, 1 m/L de rosiglitazona, 10 nmol/L triiodotironina y insulina de 1 m/ml) durante 2 días. Lavar las células con PBS 2x y reemplazarlas con un medio fresco (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 1 rosiglitazona, 10 nmol/L triiodotironina e insulina de 1 g/ml). Cambie este medio cada 2 días para un total de 3-5x.
- Para la inducción adipogénica blanca, primero trate las células con medio de inducción adipogénico blanco (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 0,5 mM/L IBMX, 0,1 m/L dexametasona y 1 insulina g/ml) durante 2 días. Lave las células con PBS 2x y sustitúyalas por un medio fresco (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS e insulina de 1 g/ml). Cambie este medio cada 2 días para un total de 3-5x.
- Analice las células adipogénicas según corresponda.
NOTA: Sea suave al lavar las celdas con PBS. Los adipocitos diferenciados pueden lavarse fácilmente.
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Representative Results
Usando el protocolo descrito anteriormente, obtuvimos .0.5–1.0 x 106 ADSC de 5–6 Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ ratones (48 semanas de edad, hombres o mujeres).
El diagrama de flujo de la colección de PAAT de ratones se presenta en la Figura 1. La morfología de los NCADSC era similar a la ADSC de otros ratones tejidos adiposos. Los NCADSC cultivados alcanzaron una confluencia del 80-90% después de 7-8 días de cultivo, y los NCADSC tenían una morfología ampliada similar a un fibroblasto(Figura 2B,C).
Para confirmar aún más que los NCADSC tenían potencial adipgénico, se indujo la diferenciación de los NCADSC en adipocitos blancos o marrones. Se utilizó la tinción roja de aceite para detectar los adipocitos maduros(Figura 2). Los NCADSC mostraron un fuerte potencial adipogénico para los adipocitos blancos y marrones después de la inducción. Se observaron adipocitos maduros después de 8 días de inducción adipogénica blanca o marrón, con más del 60% de los NCADSC mostrando diferenciación adipogénica(Figura 2D,F,H). El tiempo de inducción adipogénico prolongado mejoró la tasa de cosecha de adipocitos maduros (datos no mostrados). NCADSCs había reducido considerablemente el potencial adipogénico después del paso(Figura 2E, G, H).
La inmunoblotting y la PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) (véase el archivo suplementario 1 para los celositos utilizados) demostraron que los niveles de expresión de proteínas y genes relativos específicos de adipocitos (Perilipin, PPAR, Cebp/o) en los NCADSC adipógenos diferenciados adipógenoamente aumentaron significativamente después de 8 días de inducción adipogénica blanca(Figura 3A,B). Los resultados de qRT-PCR mostraron que la inducción de genes específicos de adipocitos (Perilipin, PPAR, Cebp/o) y genes específicos de adipocitos marrones (Pgc1, UCP-1, PPAR, PRDM16) aumentó significativamente en 8 días de inducción adipogénica marrón de NCADSC(Figura 3B,C,D).
Figura 1: Diagrama de flujo de la colección de PAAT de ratones. (A) Anestetizar y sacrificar el Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ ratones y realizar disección longitudinal del ratón para exponer el corazón y los pulmones; (B) Retire los pulmones y el timo; (C) Exponer PAAT, arco de aorta y corazón; (D) Retire el PVAT, la aorta y el corazón en el búfer HBSS preenfriado; (E) Cosecha PAAT y transfiera al búfer HBSS preenfriado. H - Corazón; AA - Arco de Aorta; T - Timo; L - Pulmón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diferenciación adipogénica de los NCADSC aislados del PAAT. (A) Esquema general de gating para caracterizar y clasificar poblaciones de NCADSC (RFP). (B) Las imágenes del microscopio de fluorescencia muestran que los NCADSC se adhirieron y ampliaron después de 96 h de sembración en una placa de cultivo de 12 pozos. (C–G) Imágenes representativas que muestran que el aceite rojo O teñida NCADSCs de PAAT después de la inducción adipogénica. (C) Control (sin inducción). (D) NCADSCs primarios y (E) 3X-pasajen NCADSCs después de 10 días de inducción adipogénica blanca. (F) NCADSCs primarios y (G) NCADSC sordos 3 veces después de 10 días de inducción adipogénica marrón. (H) Resultados estadísticos del área de tinción roja de aceite de los NCADSC primarios y 3x pasos de PAAT después de 8 días de inducción adipogénica. n a 6. Los valores se expresan como media s/ desviación estándar (SD). Barra de escala de 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Caracterización de la inducción adipogénica blanca y marrón de los NCADSC. (A) Inmunoblot que muestra los niveles de expresión de proteínas específicas de adipocitos (Perilipin, PPAR, Cebp/o) en los NCADSC blancos diferenciados adipócicamente. (B) resultados qRT-PCR que muestran la inducción de genes específicos de adipocitos, Cebp /o, PPAR, Perilipin, Fabp4 en los NCADSC blancos y marrones diferenciados adipogénicamente. (C) resultados qRT-PCR que muestran la inducción de genes específicos de adipocitos marrones, Pgc1, UCP-1, PPAR, PRDM16 en los NCADSC blancos y marrones diferenciados adipogénicamente. Los niveles de expresión se normalizaron con respecto al HPRT y se midieron mediante el método Ct. Resultado representativo de los experimentos independientes de n.o 3. Los valores se expresan como medias: SD. Se utilizó la prueba t de estudiante de 2 colas no emparejada para las comparaciones entre los dos grupos. *P < 0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo Suplementario 1. Haga clic aquí para ver este archivo (haga clic con el botón derecho para descargar).
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Discussion
En este estudio, presentamos un método fiable para el aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de NCADSC extraídos del PVAT de Wnt-1 Cre+/-; Ratones transgénicos Rosa26RFP/+ diseñados para producir RFP+ ADSC. Los informes anteriores muestran que no hay ninguna diferencia significativa en la expresión de marcadores generales de células madre mesenquimales multipotentes (MSC) en NCADSCs y no NCADSCs22, y que los NCADSC tienen un fuerte potencial para diferenciarse en adipocitos in vitro15,22,23. Por lo tanto, los NCADSC aislados con este protocolo deben ser adecuados para la mayoría de los estudios ADSC.
La ventaja del método actual es que el reportero fluorescente inherente en los NCADSC transgénicos hace que el proceso de aislamiento sea simple y económico sin necesidad de anticuerpos o FACS basado en sondas, o clasificación de células activadas magnéticas24. Además, la intensidad de fluorescencia de RFP es más fuerte que el FITC, lo que mejora aún más la eficiencia del FACS.
La clave de este protocolo es la utilización de ratones jóvenes. Aunque los ratones más viejos y más grandes pueden producir una mayor cantidad de tejido adiposo, la proporción de adipocitos derivados de NC en el PAAT disminuye con la edad porque los CNC contribuyen principalmente al desarrollo temprano de PAAT15. Por lo tanto, el potencial adipogénico de estas células disminuye con la edad. Basado en nuestros experimentos, la ventana de tiempo óptima para el aislamiento NCADSC en ratones es de 4 a 8 semanas.
Nuestro método es simple, práctico, y puede generar abundantes ADSC para el estudio de la adipogénesis PVAT o lipogénesis in vitro, y para probar nuevos fármacos contra la obesidad y las enfermedades cardiovasculares. Además, los NCADSC de Wnt-1 Cre+/-; Los ratones Rosa26RFP/+ también pueden ser un sistema in vitro eficaz para otros campos de investigación. Sin embargo, quedan varias advertencias: En primer lugar, estas células son más sensibles y frágiles que las líneas de adipocitos inmortalizados. En segundo lugar, su alta tasa de proliferación y diferenciación adipogénica se contrarresta por el hecho de que tienden a perder su potencial adipogénico después de un máximo de cinco pasajes.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
National Key R&D Program of China (2018YFC1312504), National Natural Science Foundation of China (81970378, 81670360, 81870293), y la Comisión de Ciencia y Tecnología del Municipio de Shanghái (17411971000, 17140902402) proporcionó los fondos para este estudio .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% PFA | BBI life sciences | E672002-0500 | Lot #: EC11FA0001 |
| Agarose | ABCONE (China) | A47902 | 1% working concentration |
| Anti-cebp/α | ABclonal | A0904 | 1:1000 working concentration |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked | CST | 7076 | 1:5000 working concentration |
| Anti-perilipin | Abcam | AB61682 | 1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54 |
| Anti-PPARy | SANTA CRUZ | sc-7273 | 0.2 μg/mL working concentration |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked | CST | 7074 | 1:5000 working concentration |
| Anti-β-Tubulin | CST | 2146 | 1:1000 working concentration |
| BSA | VWR life sciences | 0332-100G | 50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008 |
| Collagenase, Type I | Gibco | 17018029 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | 0.1 µM working concentration |
| Erythrocyte Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333 | |
| FBS | Corning | R35-076-CV | 50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| HDMEM | Gelifesciences | SH30243.01 | Lot #: AD20813268 |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM working concentration |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | 1 μg/mL working concentration |
| Microsurgical forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F201A-1 | |
| Microsurgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-H121A | |
| Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1516 | 0.3% working concentration |
| PBS (Phosphate buffered saline) | ABCONE (China) | P41970 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PrimeScript RT reagent Kit | TAKARA | RR047A | Lot #: AK4802 |
| RNeasy kit | TAKARA | 9767 | Lot #: AHF1991D |
| Rosa26RFP/+ mice | JAX | No.007909 | C57BL/6 backgroud; male and female |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM working concentration |
| Standard forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F424 | |
| Surgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-S231 | |
| SYBR Premix Ex Taq | TAKARA | RR420A | Lot #: AK9003 |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | 10 nM working concentration |
| Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice | JAX | No.009107 | C57BL/6 backgroud; male and female |
References
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