Summary
Vi presenterar ett protokoll för isolering, kultur och adipogenic induktion av neurala crest härledda fett-härledda stamceller (NCADSCs) från periaortic fettvävnad wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ möss. NCADSCs kan vara en lättillgänglig källa till ADSCs för modellering adipogenesis eller lipogenesis in vitro.
Abstract
En överdriven mängd fettvävnad som omger blodkärlen (perikulär fettvävnad, även känd som PVAT) är associerad med en hög risk för hjärt-kärlsjukdom. ADSCs som härrör från olika fettvävnader visar olika funktioner, och de från PVAT har inte varit väl karakteriserade. I en färsk studie rapporterade vi att vissa ADSCs i periaortic arch fettvävnad (PAAT) härstammar från neurala crest celler (NCCs), en övergående population av flyttande celler som härrör från ektoderm.
I detta dokument beskriver vi ett protokoll för isolerande rött fluorescerande protein (RFP)-märkta NCCs från PAAT av Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ möss och inducerande deras adipogena differentiering in vitro. Kort är stromal vaskulär fraktion (SVF) enzymatically separeras från PAAT, och RFP+ neurala crest härledda ADSCs (NCADSCs) är isolerade av fluorescens aktiverad cell sortering (FACS). NCADSCs skiljer sig åt både bruna och vita adipocyter, kan kryobevaras, och behålla sin adipogenic potential för ~ 3-5 passager. Vårt protokoll kan generera rikliga ADSCs från PVAT för modellering PVAT adipogenesis eller lipogenesis in vitro. Således kan dessa NCADSCs ge ett värdefullt system för att studera de molekylära växlar som deltar i PVAT differentiering.
Introduction
Förekomsten av fetma ökar över hela världen, vilket ökar risken för relaterade kroniska sjukdomar, inklusive hjärt-kärlsjukdom och diabetes1. PVAT omger blodkärl och är en viktig källa till endokrina och paracrine faktorer som deltar i vaskulatur funktion. Kliniska studier visar att hög PVAT-innehåll är en oberoende riskfaktor för hjärt-kärlsjukdom2,3, och dess patologiska funktion beror på fenotypen av den konstituerande fetthärledda stamceller (ADSCs)4.
Även ADSC cellinjer som murine 3T3-L1, 3T3-F442A och OP9 är användbara cellulära modeller för att studera adipogenesis eller lipogenesis5, reglerande mekanismer för adipogenesis skiljer sig mellan cellinjer och primära celler. ADSCs i stromal vaskulär cell fraktion (SVF) isolerade direkt från fettvävnad och inducerad att skilja till adipocyter troligen rekapitulate in vivo adipogenesis och lipogenesis6. Men bräcklighet, flytkraft, och variationer i storlek och immunophenotypes av ADSCs gör deras direkta isolering utmanande. Dessutom kan de olika isoleringsförfarandena också avsevärt påverka fenotyp och adipogen adrisk adrisk adriska potentiella förmåga för dessa celler7, vilket betonar behovet av ett protokoll som upprätthåller ADSC integritet.
Fettvävnad klassificeras vanligtvis som antingen morfologiskt och funktionellt distinkt vit fettvävnad (WAT), eller den bruna fettvävnaden (BAT)8, som hyser olika ADSCs9. Medan ADSCs isolerade från perigonadal och inguinal subkutana WATs har karakteriserats i tidigare studier9,10,11,12, mindre är känt när det gäller ADSCs från PVAT som huvudsakligen består av BAT13.
I en färsk studie fann vi att en del av de bosatta ADSCs i periaortic arch fettvävnad (PAAT) härrör från neurala crest celler (NCCs), en övergående population av flyttande stamceller som kommer från ektoderm14,15. Wnt1-Cre transgena möss användes för att spåra neurala crest cell utveckling16,17. Vi korsade Wnt1-Cre+ möss med Rosa26RFP /+ möss för att generera Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ möss, där NCCs och deras ättlingar är märkta med rött fluorescerande protein (RFP) och är lätt spåras in vivo och in vitro15. Här beskriver vi en metod för att isolera neurala crest härledda ADSCs (NC-härledda ADSCs, eller NCADSCs) från musen PAAT och förmå NCADSCs att skilja sig till vita adipocyter eller bruna adipocyter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurprotokollet har granskats och godkänts av Animal Care Committee i Shanghai Jiao Tong University.
1. Generation av Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ Möss
- Cross Wnt-1 Cre+/- möss16 med Rosa26RFP/+ möss18 för att generera Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ möss. Husmöss under en 12 h ljus/mörk cykel i en patogenfri anläggning vid 25 °C och 45 % luftfuktighet tills de är 4–8 veckor gamla.
2. Dissekering av PAAT
SE bild 1.
- Sterilisera alla kirurgiska verktyg (t.ex. kirurgisk sax, standardpinps och mikrokirurgisk sax och pincett) genom att autoklavera vid 121 °C i 30 min.
- Förbered matsmältningsmediet (High glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium [HDMEM] som innehåller 2 mg/ml kollageni typ I). Förbered odlingsmediet (HDMEM som innehåller 10% fetalt bovinserum [FBS] och 1% v/v penicillin-streptomycin [PS]). Sterilisera med ett 0,22 μm sprutafilter före användning.
- Sterilisera cellodlingsreagensmed HJÄLP AV UV, etanol, filtrering eller ånga, beroende på vad som är lämpligt.
- Förbered en Petri skål med Hanks balanserade saltlösning (HBSS) och ett koniskt rör på 15 ml med 10 ml HBSS kompletterat med 1% v/v ps-lösning. Håll båda på is.
- Bedövningmössen 15 med isofluran och offer genom massundersökning störning. Sänk ner kropparna i en bägare fylld med 75% alkohol (200 ml) i 5 min för att sterilisera hudytan.
- Klipp och separera huden på buken och skär längs ventralmittlinjen från bäckenet till halsen. Öppna buken och flytta levern för att exponera membranet19.
- Skär membranet och revbenen på båda sidor av mittlinjen och exponera hjärta och lungor genom att skala tillbaka revbenen.
- Ta bort lungan och tymus och extrahera PAAT tillsammans med aorta och hjärta.
- Skär av aorta vid kolorektalroten för att ta bort hjärtat. Gör ett snitt mellan kolorektalbågen och fallande stora orta och separera försiktigt fettvävnaden kring både strukturer och vänster och höger gemensamma halspulsåder från den bakre bröstväggen. Överför vävnaden till den iskalla HBSS-bufferten i Petriskålen.
- Med sterila pincett, ta bort så mycket av vaskulaturen (t.ex. aorta, gemensamma halspulsåder och andra små vasculature) och fascia som möjligt, och överföra fettvävnaden till 2 ml Eppendorf rör innehåller 0,5 ml iskalla HBSS buffert på is.
3. Isolering av SVF
Samla PAAT av 5-6 möss i ett 2 ml mikrocentrifugrör som innehåller 1 ml nyberedd matsmältningsmedium och finhacka vävnaden med kirurgisk sax i ett Eppendorfrör vid rumstemperatur (RT).
- Överför blandningen till 50 ml-rör som innehåller 9 ml matsmältningsmediet. Homogenisera vävnaderna genom att pipetta upp och ner med en 1 mL pipett 10x.
- Inkubera rören vid 37 °C med konstant skakning vid 100 rpm i 30–45 min och kontrollera var 5–10 min för att förhindra övermatsmältning. Detta är avgörande för att förbättra cellens livskraft och avkastning.
OBS: God vävnad matsmältning kommer att resultera i en homogen, ljusgul fettvävnad som är synlig för blotta ögat på försiktigt virvlande röret. - Stoppa matsmältningen genom att lägga till 5 ml HDMEM som innehåller 10% FBS och 1% v / v PS på RT och blanda väl genom rörledningar.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 500 x g i 5 min vid RT. SVF kommer att synas som en brunaktig pellet. Aspirera försiktigt de flytande adipocyterna och dekantera de återstående supernatantutan att störa SVF. Lös upp SVF-pelleten i 10 ml odlingsmedium och filtrera genom en 70 μm cellsil.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 500 x g i 5 min, ta bort supernatanten och försiktigt återsuspendpelleten i 5 ml erytrocytlysbuffert i ett koniskt rör på 15 ml i 10 min på RT.
- Stoppa reaktionen genom att lägga till 10 ml 1x PBS som innehåller 1% FBS. Centrifugera cellsuspensionen vid 500 x g i 5 min vid 4 °C, ta bort supernatanten och återsuspenda pelleten i 10 ml 1x PBS innehållande 1% FBS.
- Centrifugera cellerna igen vid 500 x g i 5 min vid 4 °C. Ta bort supernatanten och resuspend pelleten i 5 ml odlingsmedium i ett koniskt rör på 15 ml vid 4 °C.
- Efter en sista centrifugeringsrunda (500 x g i 5 min vid 4 °C) upphäver du de pelleterade cellerna i 5 ml FACS-buffert (PBS som innehåller 10% FBS, 100 enheter/ml DNA I och 1% v/v PS) på is och räkna cellerna med en hemocytometer.
4. F.D. Isolation av NCADSCs av FACS
- Ställ in och optimera cellsorteringen enligt bruksanvisningen. Välj munstycket på 100 μm, sterilisera uppsamlingsrören, installera den nödvändiga uppsamlingsenheten och ställ in sidoströmmarna20.
- En 561 nm gul/grön laser och optiskt filter 579/16 rekommenderas för sortering av RFP+ celler. Utför kompensationen med hjälp av den negativa kontrollen och de enkelfärgade positiva kontrollerna. Se figur 2A för gating-schemat.
- Filtrera cellerna genom en 40 μm sil, centrifugera vid 500 x g i 5 min, och resuspend cellerna i 2 ml FACS buffert med en densitet av 0,5–1 x 107/ml. Överför cellerna till tydligt märkta 5 ml runda botten polystyrenrör och ladda in i sorters.
- Kör provröret vid 4 °C, slå på deformationsplattorna och sortera i ett koniskt rör på 15 ml som är förbelagd med RPMI som innehåller 1% FBS och 1% v/v PS.
OBS: Skydda proverna från starkt ljus för att minimera RFP-kylning.
5. NCADSCs kultur
- Platta de sorterade cellerna med en densitet av 5000 celler/cm2 i en 12 brunn kulturplatta i komplett odlingsmedium och inkubera vid 37 °C i fuktig atmosfär med 5% CO2 för 20–24 h.
- Ta bort odlingsmediet, tvätta cellerna med förvärmd (37 °C) PBS för att ta bort cellskräp och tillsätt färskt odlingsmedium.
- När cellerna är 80–90% confluent, smälta monolayer med hjälp av en 0,25% trypsin EDTA lösning vid 37 ° C i en inkubator för 3-5 min, och neutralisera med 2 ml kulturmedium.
- Centrifugera de skördade cellerna i 15 min vid 250 x g vid RT, ta bort supernatanten och återsuspendera cellerna i 1 ml odlingsmedium. Räkna cellerna med en hemocytometer.
- Frö cellerna i en 12 brunn kultur platta vid tätheten av 5.000 celler/cm2.
- Resuspend de återstående cellerna i odlingsmedium som innehåller 10% DMSO, frysa och lagra i flytande kväve.
6. Adipogenic Induktion av NCADSCs
- Inducera adipogen differentiering av NCADSCs vid 80-90% confluency och standard kultur förhållanden21.
- För brun adipogenic induktion, behandla först de odlade cellerna med brun adipogenic induktionmedium (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 0,5 mM/L IBMX, 0.1μM/L dexametason, 1 μM/L rosiglitazone, 10 nmol/L triiodothyronine, och 1 μg/mL insulin) i 2 dagar. Tvätta cellerna med PBS 2x och byt ut med färskt medium (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 1 μM/L rosiglitazone, 10 nmol/L triiodothyronine och 1 μg/mL insulin). Ändra detta medium varannan dag för totalt 3–5x.
- För vit adipogenic induktion, behandla först cellerna med vit adipogenic induktionmedium (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 0,5 mM/L IBMX, 0,1 μM/L dexametason, och 1 μg/mL insulin) i 2 dagar. Tvätta cellerna med PBS 2x och byt ut med färskt medium (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS och 1 μg/mL insulin). Ändra detta medium var annan dag för totalt 3-5x.
- Analysera adipogena celler som är lämpliga.
OBS: Var försiktig när du tvättar cellerna med PBS. Differentierade adipocyter kan enkelt tvätta bort.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av det protokoll som beskrivs ovan fick vi ~0,5–1,0 x 106 ADSCs från 5–6 Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ möss (48 veckor gamla, manliga eller kvinnliga).
Flödesschemat för insamling av PAAT från möss presenteras i figur 1. Morfologi nCADSCs liknade ADSC från andra möss fettvävnader. De odlade NCADSCs nådde 80-90% confluency efter 7-8 dagars kultur, och NCADSCs hade en utökad fibroblast-liknande morfologi (Figur 2B,C).
För att ytterligare bekräfta att NCADSCs hade adipogenic potential, differentiering av NCADSCs i vita eller bruna adipocyter inducerades. Olja röd färgning användes för att upptäcka mogna adipocyter(figur 2). NCADSCs uppvisade stark adipogenic potential för både vita och bruna adipocyter efter induktion. Mogna adipocyter observerades efter 8 dagar av vit eller brun adipogenic induktion, med över 60% av NCADSCs visar adipogenic differentiering(figur 2D, F,H). Långvarig adipogen induktionstid förbättrade avverkningshastigheten för mogna adipocyter (data visas inte). NCADSCs hade kraftigt minskat adipogenic potential efter passaging(Figur 2E,G,H).
Immunoblotting och kvantitativ realtid PCR (qRT-PCR) (se Kompletterande fil 1 för primers används) visade att uttrycksnivåerna av adipocyte-specifika relativa proteiner och gener (Perilipin, PPARγ, Cebp/α) i adipogeniskt differentierade NCADSCs ökade betydligt efter 8 dagar av vit adipogenic induktion ( figur3A,B). QRT-PCR-resultaten visade att induktionen av adipocyte-specifika gener (Perilipin, PPARγ, Cebp/α) och bruna adipocyte-specifika gener (Pgc1α, UCP-1, PPARα, PRDM16) ökade avsevärt i 8 dagar av brun adipogenic induktion av NCADSCs(figur 3B, C,D).
Bild 1: Flödesdiagram över insamling av PAAT från möss. (A)Bedövning och offra Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ möss och utför längsgående dissekering av musen för att exponera hjärta och lungor; (B)Ta bort lungorna och brässen. (C)Exponera PAAT, aorta båge och hjärta; (D)Ta ut PVAT, aorta och hjärta till förkyld HBSS-buffert. (E)Skörda PAAT och överför till förkyld HBSS-buffert. H = Hjärta; AA = Aorta båge; T = Tym; L = Lung. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Adipogenic differentiering av NCADSCs isolerade från PAAT. (A)Allmänt gatingsystem för karaktärisering och sortering av NCADSCs(RFP) populationer. (B)Fluorescensmikroskopbilder visar att NCADSCs följde och expanderade efter 96 h seedning på en 12 brunn kultur tallrik. (C–G) Representativa bilder som visar att olja röd O färgade NCADSCs från PAAT efter adipogenic induktion. (C)Kontroll (ingen induktion). (D)Primära NCADSCs och (E)3x-passagede NCADSCs efter 10 dagars vit adipogenic induktion. (F)Primära NCADSCs och (G)3x-passagede NCADSCs efter 10 dagars brun adipogenic induktion. (H)Statistiska resultat av oljeröda färgningsområdet för primär och 3x passagen NCADSCs från PAAT efter 8 dagars adipogen induktion. n = 6. Värdena uttrycks som genomsnittlig ± standardavvikelse (SD). Skala bar = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Karakterisering av den vita och bruna adipogena induktionen av NCADSCs. (A)Immunoblot som visar uttrycksnivåer av adipocyte-specifika proteiner (Perilipin, PPARγ, Cebp/α) i den vita adipogeniskt differentierade NCADSCs. (B)qRT-PCR-resultat som visar induktion av adipocyte-specifika gener, Cebp/α, PPARγ, Perilipin, Fabp4 i vit och brun adipogenically differentierade NCADSCs. (C)qRT-PCR-resultat som visar induktion av bruna adipocyte-specifika gener, Pgc1α, UCP-1, PPARα, PRDM16 i vit och brun adipogenically differentierade NCADSCs. Uttrycksnivåerna normaliserades mot HPRT och mättes med ct-metoden (∆∆Ct). Representativt resultat av n = 3 oberoende experiment. Värden uttrycks som medelvärde ± SD. Oparade 2-tailed Student t-test användes för jämförelser mellan de två grupperna. *P < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande fil 1. Klicka här för att se den här filen (Högerklicka för att ladda ner).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie presenterar vi en tillförlitlig metod för isolering, kultur och adipogenic induktion av NCADSCs utvinns ur PVAT av Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ transgena möss som är utformade för att producera RFP+ ADSCs. Tidigare rapporter visar att det inte finns någon signifikant skillnad i uttrycket av allmänna multipotenta mesenchymal stamceller (MSCs) markörer i NCADSCs och icke NCADSCs22, och att NCADSCs har en stark potential att skilja till adipocyter in vitro15,22,23. Således bör NCADSCs isolerade med detta protokoll vara lämpliga för de flesta ADSC-studier.
Fördelen med den nuvarande metoden är att den inneboende fluorescerande reportern i transgena NCADSCs gör isoleringsprocessen enkel och ekonomisk utan behov av antikroppar eller sondbaserade FACS, eller magnetisk aska sortera24. Dessutom är fluorescensintensiteten i RFP starkare än FITC, vilket ytterligare förbättrar effektiviteten i FACS.
Nyckeln till detta protokoll är utnyttjandet av unga möss. Även äldre och större möss kan ge en större mängd fettvävnad, andelen NC-härledda adipocyter i PAAT minskar med åldern eftersom NCCs främst bidra till tidig utveckling av PAAT15. Således minskar den adipogena potentialen hos dessa celler med åldern. Baserat på våra experiment är det optimala tidsfönstret för NCADSC isolering hos möss 4–8 veckor.
Vår metod är enkel, praktisk, och kan generera rikliga ADSCs för studier av PVAT adipogenesis eller lipogenesis in vitro, och att testa nya läkemedel mot fetma och hjärt-kärlsjukdom. Dessutom ncadscs av Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ möss kan också vara ett effektivt in vitro-system för andra forskningsområden. Men flera varningar kvar: För det första är dessa celler känsligare och bräckligare än förevigade adipocyte linjer. För det andra motverkas deras höga spridningsfrekvens och adipogena differentiering av det faktum att de tenderar att förlora sin adipogena potential efter högst fem passager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
National Key FoU Program of China (2018YFC1312504), National Natural Science Foundation of China (81970378, 81670360, 81870293) och Vetenskaps- och teknikkommissionen i Shanghai kommun (17411971000, 17140902402) tillhandahöll medlen för denna studie .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% PFA | BBI life sciences | E672002-0500 | Lot #: EC11FA0001 |
| Agarose | ABCONE (China) | A47902 | 1% working concentration |
| Anti-cebp/α | ABclonal | A0904 | 1:1000 working concentration |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked | CST | 7076 | 1:5000 working concentration |
| Anti-perilipin | Abcam | AB61682 | 1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54 |
| Anti-PPARy | SANTA CRUZ | sc-7273 | 0.2 μg/mL working concentration |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked | CST | 7074 | 1:5000 working concentration |
| Anti-β-Tubulin | CST | 2146 | 1:1000 working concentration |
| BSA | VWR life sciences | 0332-100G | 50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008 |
| Collagenase, Type I | Gibco | 17018029 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | 0.1 µM working concentration |
| Erythrocyte Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333 | |
| FBS | Corning | R35-076-CV | 50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| HDMEM | Gelifesciences | SH30243.01 | Lot #: AD20813268 |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM working concentration |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | 1 μg/mL working concentration |
| Microsurgical forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F201A-1 | |
| Microsurgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-H121A | |
| Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1516 | 0.3% working concentration |
| PBS (Phosphate buffered saline) | ABCONE (China) | P41970 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PrimeScript RT reagent Kit | TAKARA | RR047A | Lot #: AK4802 |
| RNeasy kit | TAKARA | 9767 | Lot #: AHF1991D |
| Rosa26RFP/+ mice | JAX | No.007909 | C57BL/6 backgroud; male and female |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM working concentration |
| Standard forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F424 | |
| Surgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-S231 | |
| SYBR Premix Ex Taq | TAKARA | RR420A | Lot #: AK9003 |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | 10 nM working concentration |
| Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice | JAX | No.009107 | C57BL/6 backgroud; male and female |
References
- Afshin, A., et al. Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries over 25 Years. New England Journal of Medicine. 377 (1), 13-27 (2017).
- Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
- Britton, K. A., et al. Prevalence, distribution, and risk factor correlates of high thoracic periaortic fat in the Framingham Heart Study. Journal of the American Heart Association. 1 (6), 004200 (2012).
- Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (10), 1458-1464 (2009).
- Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (48), 47585-47593 (2003).
- Cinti, S. Between brown and white: novel aspects of adipocyte differentiation. Annals of Medicine. 43 (2), 104-115 (2011).
- Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
- Chen, Y., et al. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. Journal of Visualized Experiments. (109), e53886 (2016).
- Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).
- Medeiros, D. M. The evolution of the neural crest: new perspectives from lamprey and invertebrate neural crest-like cells. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 2 (1), 1-15 (2013).
- Fu, M., et al. Neural Crest Cells Differentiate Into Brown Adipocytes and Contribute to Periaortic Arch Adipose Tissue Formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. , (2019).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).
- Tamura, Y., et al. Neural crest-derived stem cells migrate and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 582-589 (2011).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Tan, P., Pepin, É, Lavoie, J. L. Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis. Journal of Visualized Experiments. (131), e57026 (2018).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
- Sowa, Y., et al. Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest. PLoS One. 8 (12), 84206 (2013).
- Billo, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
- Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), e55818 (2017).
