Summary
Wnt-1 Cre+/-periaortik yağ dokusundan elde edilen adipoz türetilmiş kök hücrelerin (NCADSCs) izolasyonu, kültürü ve adipojenik indüksiyonu için bir protokol salıyoruz. Rosa26RFP/+ fareler. NCADSCs in vitro adipogenez veya lipogenez modelleme için ADSCs kolay erişilebilir bir kaynak olabilir.
Abstract
Kan damarlarını çevreleyen yağ dokusunun aşırı miktarda (perivasküler yağ dokusu, ayrıca PVAT olarak da bilinir) kardiyovasküler hastalık riski ile ilişkilidir. Farklı yağ dokularından elde edilen ADSC'ler farklı özellikler gösterir ve PVAT'tan elde edilenler iyi karakterize edilmemiştir. Yakın zamanda yapılan bir çalışmada, periaortik ark yağ dokusundaki bazı ADSC'lerin (PAAT) ektodermden kaynaklanan geçici bir göçmen hücre popülasyonu olan nöral krest hücrelerinden (NJKs) indiğini bildirdik.
Bu yazıda, wnt-1 Cre+/-PAAT kırmızı floresan protein (RFP) etiketli NCCs izole etmek için bir protokol açıklar; Rosa26RFP/+ fareler ve in vitro onların adipojenik farklılaşma indükleyen. Kısaca, stromal vasküler fraksiyonu (SVF) enzimatik OLARAK PAAT'tan ayrıştırılır ve RFP+ nöral krest türetilen ADSC'ler (NCADSCs) floresan aktif hücre ayrıştırma (FACS) tarafından izole edilir. NCADSCs kahverengi ve beyaz adipositler hem de ayırt, cryopreserved olabilir, ve ~ 3-5 pasajlar için adipojenik potansiyelini korumak. Protokolümüz, PVAT adipogenez veya lipogenezin in vitro modelini almak için PVAT'tan bol miktarda ADSC üretebilir. Böylece, bu NCADSCs PVAT farklılaşma dahil moleküler anahtarları incelemek için değerli bir sistem sağlayabilir.
Introduction
Obezite prevalansı dünya çapında artmaktadır, hangi kardiyovasküler hastalık ve diyabet de dahil olmak üzere ilgili kronik hastalıkların riskini artırır1. PVAT kan damarlarını çevreler ve vaskülatür fonksiyonunda rol oynayan endokrin ve parakrin faktörlerin önemli bir kaynağıdır. Klinik çalışmalar, yüksek PVAT içeriğinin kardiyovasküler hastalık2,3bağımsız bir risk faktörü olduğunu ve patolojik fonksiyonu kurucu yağ türetilmiş kök hücrelerin fenotip bağlıdır göstermektedir (ADSCs)4.
Murine 3T3-L1, 3T3-F442A ve OP9 gibi ADSC hücre hatları adipogenez veya lipogenez5'iincelemek için yararlı hücresel modeller olmasına rağmen, adipogenez için düzenleyici mekanizmalar hücre hatları ile birincil hücreler arasında farklılık gösterir. Stromal vasküler hücre fraksiyonundaki (SVF) ADSK'lar doğrudan yağ dokularından izole edilmiş ve adipositlere ayırt etmek için indüklenen adipositler büyük olasılıkla vivo adipogenez ve lipogenezde recapitulate6. Ancak, kırılganlık, yüzdürme ve ADSC'lerin boyut ve immünofenotiplerindeki farklılıklar doğrudan izolasyonlarını zora sokuyor. Buna ek olarak, farklı izolasyon prosedürleri de önemli ölçüde bu hücrelerin fenotip ve adipojenik potansiyel yeteneğini etkileyebilir7,böylece ADSC bütünlüğünü koruyan bir protokol ihtiyacını vurgulayarak.
Yağ dokusu genellikle morfolojik ve işlevsel olarak farklı beyaz yağ dokusu (WAT) veya kahverengi yağ dokusu (BAT)8olarak sınıflandırılır, hangi farklı ADSCs barındıran9. Perigonadal ve inguinal subkutan WATs izole ADSCs önceki çalışmalarda karakterize edilmiş iken9,10,11,12, daha az ağırlıklı olarak BAT oluşur PVAT gelen ADSCs ile ilgili olarak bilinmektedir13.
Yakın tarihli bir çalışmada, periaortik ark yağ dokusunda yerleşik ADSC'lerin bir kısmının (PAAT) nöral krest hücrelerinden (NCD) türediğini bulduk, ektoderm den kaynaklanan göçmen progenitor hücreleringeçici bir popülasyon14,15. Wnt1-Cre transgenik fareler nöral krest hücre gelişimini izlemek için kullanılmıştır16,17. Biz Wnt-1 Cre+/-oluşturmak için Rosa26RFP / + fareler ile Wnt1-Cre+ fareler geçti; Rosa26RFP / + fareler, hangi NCCs ve onların torunları kırmızı floresan protein (RFP) ile etiketlenir ve kolayca in vivo ve in vitro15izlenir . Burada, fare PAAT'tan nöral krest türetilmiş ADSC'leri (NC türetilmiş ADSC'ler veya NCADSC'ler) yalıtmak için bir yöntem açıklıyoruz ve NCADSC'leri beyaz adipositler veya kahverengi adipositler olarak ayırt etmeye ikna ediyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan protokolü gözden geçirildi ve Şangay Jiao Tong Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı.
1. Wnt-1 Cre+/-Üretimi ; Rosa26RFP/+ Fareler
- Çapraz Wnt-1 Cre+/- fareler16 Rosa26RFP / + fareler18 Wnt-1 Cre+/-oluşturmak için; Rosa26RFP/+ fareler. Ev fareleri 25 °C'de patojensiz bir tesiste 12 saat açık/karanlık bir döngü altında ve 4-8 haftalık olana kadar %45 nem.
2. PAAT diseksiyon
NOT: Bkz. Şekil 1.
- Tüm cerrahi aletleri (örn. cerrahi makas, standart forseps ve mikrocerrahi makas ve forseps) 121 °C'de 30 dakika boyunca otoklavlayarak sterilize edin.
- Sindirim ortamını hazırlayın (Yüksek glikozlu Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta [HDMEM] içeren 2 mg/mL kollajenaz tip I). Kültür ortamını hazırlayın (HDMEM %10 fetal sığır serumu [FBS] ve %1 v/v penisilin-streptomisin [PS] içeren). Kullanmadan önce 0,22 m şırınga filtresi kullanarak sterilize edin.
- Uygun şekilde UV, etanol, filtrasyon veya buhar kullanarak hücre kültürü reaktiflerini sterilize edin.
- Hanks' Balanced Salin Solüsyonu (HBSS) ile bir Petri kabı ve 10 mL HBSS ile 15 mL konik tüp ile PS çözeltisinin %1 v/v'i ile desteklenmiş bir Petri kabı hazırlayın. İkiyi de buzda tut.
- Izofluran ile fareler15 anestezi ve servikal çıkığı ile kurban. Cilt yüzeyini sterilize etmek için 5 dakika boyunca %75 alkol (200 mL) ile dolu bir kabın içine daldırın.
- Snip ve karın üzerinde deri ayırmak ve boyun pelvis ventral orta hat boyunca kesti. Karın açın ve diyafram ortaya çıkarmak için karaciğer hareket19.
- Diyafram ve orta hattın her iki tarafında kaburga kesin ve kaburga geri soyma tarafından kalp ve akciğerler ortaya.
- Akciğer ve timus çıkarın ve aort ve kalp ile birlikte PAAT ayıklayın.
- Kalbi çıkarmak için aort kökündeki aort uortu kesin. Aort kemer ve alçalan aort arasında bir kesim yapmak ve dikkatle arka göğüs duvarından hem yapıları ve sol ve sağ ortak karotis arterleri çevreleyen yağ dokusu nu ayırın. Dokuyu Petri kabındaki buz gibi HBSS tamponuna aktarın.
- Steril çalgılar kullanarak, vaskülatür (örneğin, aort, ortak karotis arterler ve diğer küçük vaskülatür) ve fasya mümkün olduğunca kaldırmak ve 2 mL Eppendorf tüpler içine yağ dokusu transferi buz üzerinde 0.5 mL buz gibi HBS tampon içerir.
3. SVF'nin İzolasyon
5-6 farenin PAAT'ını 1 mL taze hazırlanmış sindirim ortamı içeren bir 2 mL mikrosantrifüj tüpe toplayın ve oda sıcaklığında (RT) eppendorf tüpünde cerrahi makas kullanarak dokuyu doyurun.
- Karışımı 9 mL sindirim ortamı içeren 50 mL tüplere aktarın. 1 mL pipet 10x ile yukarı ve aşağı boru ile dokuları homojenize.
- Tüpleri 37 °C'de 30-45 dakika boyunca 100 rpm'de sürekli sallayarak kuluçkaya yatırın ve aşırı hazımsızlığı önlemek için her 5-10 dakikada bir kontrol edin. Bu hücre canlılığı ve verim geliştirmek için önemlidir.
NOT: İyi doku sindirimi, tüpü hafifçe döndürerek çıplak gözle görülebilen homojen, açık sarı bir yağ dokusuna neden olur. - RT'ye %10 FBS ve %1 v/v PS içeren 5 mL HDMEM ekleyerek sindirimi durdurun ve pipetleme ile iyice karıştırın.
- Hücre süspansiyonuna 500 x g'de 5 dk RT'de santrifüj edin. SVF kahverengimsi bir pelet olarak görünür olacaktır. Yüzen adipositleri dikkatlice aspire edin ve Kalan supernatant'ı SVF'yi rahatsız etmeden dekant. SVF peletini 10 mL kültür ortamına eritin ve 70 μm'lik bir süzgeçten süzün.
- Hücre süspansiyonuna 5 0 0 x 5 dakika santrifüj edin, süpernatantı çıkarın ve 15 mL konik tüpte 5 mL eritrosit lysis tamponundaki peleti RT'de 10 dakika boyunca hafifçe uzaklaştırın.
- %1 FBS içeren 1x PBS 10 mL ekleyerek reaksiyonu durdurun. Hücre süspansiyonuna 500 x g'de 4 °C'de 5 dakika, süpernatantı çıkarın ve %1 FBS içeren 1x PBS'nin 10 mL'inde peleti yeniden askıya alın.
- Hücreleri 500 x g'de 4 °C'de 5 dk santrifüj edin. Supernatant çıkarın ve 4 °C'de 15 mL konik tüp içinde kültür orta 5 mL pelet resuspend.
- Son bir santrifüj turundan sonra (4 °C'de 5 dakika 5 dakika 500 x g), 5 mL FACS tamponundaki peletli hücreleri (PBS %10 FBS, 100 adet/mL DNA I ve %1 v/v PS) buz üzerinde yeniden askıya alın ve hemositometreli hücreleri sayın.
4. NCADSC'lerin FACS tarafından İznedilmesi
- Kullanım kılavuzunu izleyerek hücre ayırıcısını ayarlayın ve optimize edin. 100 μm nozül seçin, toplama tüpleri sterilize, gerekli toplama cihazı nı kurmak ve yan akışları kurmak20.
- RFP+ hücrelerinin sıralanması için 561 nm sarı/yeşil lazer ve optik filtre 579/16 önerilir. Negatif denetimi ve tek lekeli pozitif kontrolleri kullanarak telafigerçekleştirin. Gating şeması için Şekil 2A'ya bakın.
- Hücreleri 40 μm süzgeçten filtreleyin, 5 0 0 g'da 500 x g'de santrifüj edin ve 0,5-1 x 107/mLyoğunlukta 2 mL FACS tamponundaki hücreleri yeniden askıya alın. Hücreleri açıkça 5 mL yuvarlak alt polistiren tüpleretiketli aktarın ve ayırıcıiçine yükleyin.
- Deney numune tüpünü 4 °C'de çalıştırın, sapma plakalarını açın ve %1 FBS ve %1 v/v PS içeren RPMI ile önceden kaplanmış 15 mL konik tüp ekişin.
NOT: RFP söndürmeyi en aza indirmek için numuneleri güçlü ışıktan koruyun.
5. NCADSCs Kültürü
- Sıralanmış hücreleri, tam kültür ortamında 12 kuyu kültür plakasında 5.000 hücre/cm2 yoğunlukta plakalayın ve 37 °C'de nemli bir atmosferde %5 CO2 ile 20-24 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
- Kültür ortamını çıkarın, hücreleri önceden ısıtılmış (37 °C) PBS ile yıkayın, hücre enkazını temizler ve taze kültür ortamı ekleyin.
- Hücreler %80-90 konfluent olduktan sonra, 37 °C'de 37 °C'de %0,25 tripsin EDTA çözeltisi kullanarak monolayer'ı 3-5 dakika boyunca bir kuvözde sindirin ve 2 mL kültür ortamı ile nötralize edin.
- Toplanan hücreleri RT'de 250 x g'da 15 dakika boyunca santrifüj edin, süpernatantı çıkarın ve 1 mL kültür ortamında hücreleri yeniden askıya alın. Hücreleri hemositometreile say.
- Hücreleri 5.000 hücre/cm 2 yoğunlukta 12 kuyu kültürplakası içinde tohumlayın.
- %10 DMSO içeren kültür ortamındaki kalan hücreleri yeniden askıya alın, dondurun ve sıvı nitrojende depolayın.
6. NCADSC'lerin Adipojenik İndüksiyonu
- NCADSCs adipojenik farklılaşma neden 80-90% birleşimi ve standart kültür koşulları21.
- Kahverengi adipojenik indüksiyon için, ilk kahverengi adipojenik indüksiyon ortamı ile kültürlü hücreleri tedavi (HDMEM, 10% FBS, 1% v / v PS, 0.5 mM / L IBMX, 0.1μM / L deksametazon, 1 μM / L rosiglitazone, 10 nmol / L triiyodotikroin, ve 1 μg / mL insülin 2 gün. Hücreleri PBS 2x ile yıkayın ve taze ortam (HDMEM, %10 FBS, %1 v/v PS, 1 μM/L rosiglitazone, 10 nmol/L triiyodotironin ve 1 μg/mL insülin) ile değiştirin. Bu ortamı her 2 günde bir 3-5x olarak değiştirin.
- Beyaz adipojenik indüksiyon için ilk olarak hücreleri beyaz adipojenik indüksiyon ortamı (HDMEM, %10 FBS, %10 V PS, 0,5 mM/L IBMX, 0,1 μM/L deksametazon ve 1 μg/mL insülin) 2 gün boyunca tedavi edin. Hücreleri PBS 2x ile yıkayın ve taze ortam (HDMEM, %10 FBS, %1 v/v PS ve 1 μg/mL insülin) ile değiştirin. Bu ortamı 2 günde bir 3-5x olarak değiştirin.
- Uygun olarak adipojenik hücreleri analiz edin.
NOT: Hücreleri PBS ile yıkarken nazik olun. Diferansiye adipositler kolayca yıkanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda açıklanan protokolü kullanarak, 5-6 Wnt-1 Cre+/-den ~ 0.5-1.0 x 106 ADSCs elde ; Rosa26RFP/+ fareler (48 haftalık, erkek veya dişi).
PaAT'ın farelerden toplanmasının akış şeması Şekil 1'desunulmuştur. NCADSC'lerin morfolojisi diğer farelerin yağ dokularından gelen ADSC'ye benzerdi. Kültürlü NCADSC'ler 7-8 günlük kültürden sonra %80-90 biraraya geldi ve NCADSC'lerde fibroblast benzeri morfolojisi genişledi(Şekil 2B,C).
NCADSC'lerin adipojenik potansiyele sahip olduğunu doğrulamak için NCADSC'lerin beyaz veya kahverengi adipositlere farklılaşması neden oldu. Olgun adipositleri tespit etmek için yağlı kırmızı boyama kullanılmıştır(Şekil 2). NCADSCs indüksiyon sonrası hem beyaz hem de kahverengi adipositler için güçlü adipojenik potansiyel sergiledi. Olgun adipositler 8 günlük beyaz veya kahverengi adipojenik indüksiyondan sonra gözlendi ve NCADSC'lerin %60'Tan fazlasında adipojenik farklılaşma görüldü(Şekil 2D,F,H). Adipojenik indüksiyon süresinin uzatılması olgun adipositlerin hasat oranını artırdı (veriler gösterilmedi). NCADSCs büyük ölçüde geçtikten sonra adipojenik potansiyelini azaltmıştı(Şekil 2E,G,H).
İmmünoblotting ve kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) (kullanılan astarlar için Ek Dosya 1 bakınız) adiposit özgül göreli protein ve genlerin ekspresyon düzeylerinin (Perilipin, PPARγ, Cebp/α) adipojenik diferansiyesel diferkülasyonlu NCADSC'lerde 8 günlük beyaz adipojenik indüksiyondan sonra önemli ölçüde arttığını kanıtlamıştır(Şekil3,B). QRT-PCR sonuçları, adiposite özgü genlerin (Perilipin, PPARγ, Cebp/α) ve kahverengi adiposite özgü genlerin (Pgc1α, UCP-1, PPARα, PRDM16) 8 gün boyunca NCADSCs kahverengi adipojenik indüksiyonunun önemli ölçüde arttığını göstermiştir(Şekil 3B,C,D).
Şekil 1: Farelerden PAAT toplama akış şeması. (A) Esthetize ve Wnt-1 Cre+/-kurban ; Rosa26RFP /+ fareler ve kalp ve akciğerleri ortaya çıkarmak için farenin uzunlamasına diseksiyonu gerçekleştirmek; (B) Akciğerleri ve timusu çıkarın; (C) PAAT, aort kemeri ve kalbi açığa çıkarmak; (D) Önceden soğutulmuş HBSS Tampon içine PVAT, aort ve kalp çıkarın; (E) HASat PAAT ve önceden soğutulmuş HBSS tampon içine transfer. H = Kalp; AA = Aort kemeri; T = Timus; L = Akciğer. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: PAAT'tan izole edilen NCADSC'lerin adipojenik farklılaşması. (A) NCADSCs (RFP) popülasyonlarını karakterize etmek ve sıralamak için genel gating şeması. (B) Floresan mikroskop görüntüleri, NCADSC'lerin 12 kuyu kültür plakası üzerinde 96 saat tohumlamadan sonra yapışıp genişlediğini göstermektedir. (C–G) Adipojenik indüksiyon sonrası PAAT gelen yağ kırmızı O lekeli NCADSCs gösteren temsili görüntüler. (C) Kontrol (indüksiyon yok). (D) Primer NCADSCs ve (E) beyaz adipojenik indüksiyon 10 gün sonra 3x-passaged NCADSCs. (F) Primer NCADSCs ve (G) kahverengi adipojenik indüksiyon 10 gün sonra 3x-passaged NCADSCs. (H) Adipojenik indüksiyon 8 gün sonra PAAT primer ve 3x pasajlı NCADSCs yağ kırmızı boyama alanı istatistiksel sonuçları. n = 6 olarak Değerler ortalama ± standart sapma (SD) olarak ifade edilir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: NCADSC'lerin beyaz ve kahverengi adipojenik indüksiyonunun karakterizasyonu. (A) Beyaz adipojenik diferansiyetik diferansiyetik ncadscs adiposit özgül proteinlerin (Perilipin, PPARγ, Cebp / α) ekspresyon düzeylerini gösteren immünoblot. (B) qRT-PCR sonuçları, beyaz ve kahverengi adipojenik diyavri farklılaştırılmış NCADSC'lerde adiposite özgü genlerin, Cebp/α, PPARγ, Perilipin, Fabp4 indüksiyonunun olduğunu gösterir. (C) qRT-PCR sonuçları kahverengi adiposit özgügenlerin indüksiyongösteren, Pgc1α, UCP-1, PPARα, PRDM16 beyaz ve kahverengi adipogenically farklılaşmış NCADSCs. İfade düzeyleri HPRT'ye karşı normalleştirildi ve Ct (Ct) yöntemi ile ölçüldü. n = 3 bağımsız deneylerin temsili sonucu. Değerler ortalama ± SD olarak ifade edilir. İki grup arasındaki karşılaştırmalarda eşleşmemiş 2 kuyruklu öğrenci t-testi kullanılmıştır. *P < 0.05. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada Wnt-1 Cre+/-PVAT'ından çıkarılan NCADSC'lerin izolasyonu, kültürü ve adipojenik indüksiyonu için güvenilir bir yöntem sayılmaktadır. RFP+ ADSC üretmek için tasarlanmış Rosa26RFP/+ transgenik fareler. Önceki raporlar, NCADSCs ve non NCADSCs22genel multipotent mezenkimal kök hücre (MSCs) belirteçlerinin ekspresyonunda anlamlı bir fark olmadığını ve NCADSCs in vitro15,22,23adipositler ayırt etmek için güçlü bir potansiyele sahip olduğunu göstermektedir . Bu nedenle, bu protokol ile izole NCADSCs çoğu ADSC çalışmaları için uygun olmalıdır.
Mevcut yöntemin avantajı transgenik NCADSCs doğal floresan muhabiri antikorlar veya prob tabanlı FACS veya manyetik aktif hücre sıralama24gerek kalmadan izolasyon sürecini basit ve ekonomik hale getirir. Buna ek olarak, RFP floresan yoğunluğu DAHA FAZLA FACS verimliliğini artırır FITC, daha güçlüdür.
Bu protokolün anahtarı genç farelerin kullanımıdır. Büyük ve büyük fareler yağ dokusunun daha büyük miktarda verim rağmen, NCCs öncelikle PAAT erken gelişimine katkıda çünkü PAAT NC kaynaklı adipositlerin oranı yaşla birlikte azalır15. Böylece bu hücrelerin adipojenik potansiyeli yaşla birlikte azalır. Deneylerimize dayanarak, farelerde NCADSC izolasyonu için en uygun zaman süresi 4-8 haftadır.
Yöntemimiz basit, pratik ve PVAT adipogenez veya lipogenez in vitro çalışma için bol ADSC üretebilir, ve obezite ve kardiyovasküler hastalıklara karşı yeni ilaçlar test etmek için. Ayrıca, Wnt-1 Cre NCADSCs+/-; Rosa26RFP/+ fareler diğer araştırma alanları için de etkili bir in vitro sistem olabilir. Ancak, çeşitli uyarılar kalır: İlk olarak, bu hücreler daha hassas ve ölümsüzleştirilmiş adiposit hatları daha kırılgandır. İkinci olarak, yüksek proliferasyon hızları ve adipojenik farklılaşmaları, en fazla beş pasajdan sonra adipojenik potansiyellerini kaybetme eğiliminde olmaları ile etkisiz dir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2018YFC1312504), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81970378, 81670360, 81870293) ve Şangay Belediyesi Bilim ve Teknoloji Komisyonu (174119710000, 17140902402) bu çalışmanın fonlarını sağladı. .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% PFA | BBI life sciences | E672002-0500 | Lot #: EC11FA0001 |
| Agarose | ABCONE (China) | A47902 | 1% working concentration |
| Anti-cebp/α | ABclonal | A0904 | 1:1000 working concentration |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked | CST | 7076 | 1:5000 working concentration |
| Anti-perilipin | Abcam | AB61682 | 1 μg/mL working concentration; lot #: GR66486-54 |
| Anti-PPARy | SANTA CRUZ | sc-7273 | 0.2 μg/mL working concentration |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked | CST | 7074 | 1:5000 working concentration |
| Anti-β-Tubulin | CST | 2146 | 1:1000 working concentration |
| BSA | VWR life sciences | 0332-100G | 50 mg/mL working concentration; lot #: 0536C008 |
| Collagenase, Type I | Gibco | 17018029 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | 0.1 µM working concentration |
| Erythrocyte Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333 | |
| FBS | Corning | R35-076-CV | 50 mg/mL working concentration; lot #: R2040212FBS |
| HBSS | Gibco | 14025092 | |
| HDMEM | Gelifesciences | SH30243.01 | Lot #: AD20813268 |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM working concentration |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | 1 μg/mL working concentration |
| Microsurgical forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F201A-1 | |
| Microsurgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-H121A | |
| Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1516 | 0.3% working concentration |
| PBS (Phosphate buffered saline) | ABCONE (China) | P41970 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PrimeScript RT reagent Kit | TAKARA | RR047A | Lot #: AK4802 |
| RNeasy kit | TAKARA | 9767 | Lot #: AHF1991D |
| Rosa26RFP/+ mice | JAX | No.007909 | C57BL/6 backgroud; male and female |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM working concentration |
| Standard forceps | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-F424 | |
| Surgical scissor | Suzhou Mingren Medical Equipment Co.,Ltd. (China) | MR-S231 | |
| SYBR Premix Ex Taq | TAKARA | RR420A | Lot #: AK9003 |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | 10 nM working concentration |
| Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox mice | JAX | No.009107 | C57BL/6 backgroud; male and female |
References
- Afshin, A., et al. Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries over 25 Years. New England Journal of Medicine. 377 (1), 13-27 (2017).
- Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
- Britton, K. A., et al. Prevalence, distribution, and risk factor correlates of high thoracic periaortic fat in the Framingham Heart Study. Journal of the American Heart Association. 1 (6), 004200 (2012).
- Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (10), 1458-1464 (2009).
- Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (48), 47585-47593 (2003).
- Cinti, S. Between brown and white: novel aspects of adipocyte differentiation. Annals of Medicine. 43 (2), 104-115 (2011).
- Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
- Chen, Y., et al. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. Journal of Visualized Experiments. (109), e53886 (2016).
- Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).
- Medeiros, D. M. The evolution of the neural crest: new perspectives from lamprey and invertebrate neural crest-like cells. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 2 (1), 1-15 (2013).
- Fu, M., et al. Neural Crest Cells Differentiate Into Brown Adipocytes and Contribute to Periaortic Arch Adipose Tissue Formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. , (2019).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).
- Tamura, Y., et al. Neural crest-derived stem cells migrate and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 582-589 (2011).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Tan, P., Pepin, É, Lavoie, J. L. Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis. Journal of Visualized Experiments. (131), e57026 (2018).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
- Sowa, Y., et al. Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest. PLoS One. 8 (12), 84206 (2013).
- Billo, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
- Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), e55818 (2017).
