Summary
Den menneskelige blod-hjernebarrieren forhindrer selektivt penetrasjon av hydrofile molekyler og patogener inn i hjernen. Flere patologier, inkludert meningitt og postoperativ delirium, er forbundet med økt permeabilitet av blod-hjernebarrieren. Her beskriver vi en endotelcellekulturmodell for å teste barrierenpermeabiliteten ved mikrobiell traversering.
Abstract
Den menneskelige blod-hjernebarrieren (BBB) er preget av en svært lav permeabilitet for biomolekyler for å beskytte og regulere metabolismen av hjernen. BBB er hovedsakelig dannet ut av endotelceller innebygd i kollagen IV og fibronectin-rike kjellermembraner. Flere patologier skyldes dysfunksjon av BBB etterfulgt av mikrobiell traversering, forårsaker sykdommer som meningitt. For å teste effekten av flere parametere, inkludert forskjellige stoffer og bedøvelse, på permeabiliteten til BBB etablerte vi en ny menneskelig cellekulturmodell som etterlignet BBB med humane hjernemikrovaskulære endotelceller. Endotelcellene dyrkes på kollagen IV og fibronectinbelagte filterenheter til samløpet og kan deretter behandles med forskjellige forbindelser av interesse. For å demonstrere en mikrobiell traversering, er det øvre kammeret med den apikale overflaten av endotelcellene inokulert med bakterier. Etter en inkubasjonsperiode er prøver av det nedre kammeret belagt på agarplater og de oppnådde koloniene telles, hvorantall kolonier korrelerer med permeabiliteten til BBB. Endogene cellulære faktorer kan analyseres i dette eksperimentelle oppsettet for å belyse grunnleggende cellulære mekanismer i endotelcellene som bidrar til BBB. I tillegg gjør denne plattformen det mulig å utføre en skjerm for forbindelser som kan påvirke permeabiliteten til endotelcellene. Til slutt kan bakteriell traversering studeres og knyttes til forskjellige patologier, som meningitt. Det kan være mulig å utvide modellen og analysere bakterienes veier gjennom BBB. I denne artikkelen gir vi en detaljert protokoll av den beskrevne metoden for å undersøke permeabiliteten til BBB.
Introduction
Den menneskelige BBB er en unik grense for hjernevev, som skiller hjernen fra blodet. Det regulerer strengt passasjen av større og hydrofile molekyler, blokkerer paracellulær diffusjon, og opprettholder hjernenhomeostase. Det beskytter også hjernen mot plasmasvingninger, giftstoffer, mikrober og guider inflammatoriske celler som en del av sentralnervesystemet (CNS) immunitet. Siden oppdagelsen for hundre år siden1, mange studier har blitt utført for å forstå strukturen og funksjonen til BBB. De komplekse interaksjonene mellom celler, proteiner og signaler fra hjerne- og blodkrever fortsatt videre undersøkelse og modeller.
Den menneskelige BBB består av tre celletyper: hjernemikrovaskulærendotelceller (BMECer), pericytes og astrocytter2,3. BMECs skiller seg fra flertallet av endotelcellene i kroppen ved at de har et høyt antall tette veikryss og fester veikryss4, lav pinocytotisk aktivitet2,5og en kontinuerlig kjellermembran6,7 for å blokkere paracellulær diffusjon. Små lipofile molekyler kan spre og passere BBB etter konsentrasjonsgradienten; større og hydrofile molekyler kommer inn eller forlater hjernen bare gjennom polariserte uttrykte selektive transportsystemer8. Denne forskriften resulterer i en høy transendothelial elektrisk motstand (TEER) på 1500-2000 Ω·cm2 som er omvendt korrelert til permeabilitet9,10. Selv om BMECs bygger en stram barriere, kan de reagere på lokale og perifere signaler11,12. Det er en tett interaksjon mellom BMECs og astrocytter13; de astrocyttende endeføttene bygger et lag rundt fartøyene og induserer dannelsen av stramme veikryss13,14. De er involvert i BBB modning med ulike faktorer, inkludert transformere vekstfaktor-β (TGF-β)15,16. I tillegg spiller pericytes en nøkkelrolle i reguleringen av angiogenese17 og forhindrer apoptose av endotelet i cellulær differensiering18 (Figur 1). De er innebygd i kjellermembranen og gir strukturell stabilitet av fartøyetveggen19.
Figur 1: Skjematisk struktur av blod-hjernebarrieren. Den unike strukturen til den menneskelige BBB består av tre forskjellige celletyper. Mikrokarlumen er omgitt av endotelceller, som er beriket i trange veikryss, og er ikke fenestrated. De er innebygd i kjellermembranen, som pericytes. Disse cellene er viktige for strukturell stabilitet av fartøyetveggen og spiller en rolle i utviklingen av BBB ved siden av astrocytter. Deres ende-føtter bygge et nært lag rundt fartøyet og støtte bygging av trange veikryss. Alle komponenter i BBB er viktige for fysiologisk funksjonalitet. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Mange forskjellige patologier er relatert til sammenbruddet av BBB (f.eks. septisk encefalopati). De berørte pasientene har økt proteinnivåer i cerebrospinalvæsken20,og hjerneparenchyma hos berørte gnagere viser økt opptak av markert kolloidalt jernoksid og aminosyrer21,22. Disse resultatene peker mot økt permeabilitet av BBB som oppstår sammen med en økt pinocytose i BMECs21 og endotelaktivering23. En annen assosiert patologi relatert til en endret BBB er meningitt, en medisinsk nødsituasjon og en kompleks betennelse ledsaget av cerebralt ødem som kan føre til nevronal celledød. Det primære inngangsstedet for sirkulerende bakterier skal være mikrofartøyene24; BBB forhindrer imidlertid at bakterier kommer inn. Permeabiliteten til BBB er ikke alltid knyttet til en økning i eksperimentell hematogen meningitt25 og mekanismene kan være multifaktorielle. Tilfeldighet av sepsis med postoperativ delirium (POD)26 og foreningen med preoperative infeksjoner27,28 indikerer behovet for en BBB-modell som gjør det mulig for direkte eksponering for bakterier å få en bedre forståelse i bakteriell patogenese.
Det er mange hull i å forstå og kvantifisere mikrobiell traversgjennom BBB. Derfor utviklet vi en modell som muliggjør en praktisk testing av ulike faktorer og forhold med en direkte sammenheng mellom bakteriell traversog påvirkningpå permeabiliteten til BBB. Tidligere arbeid fokuserte på paracellulær permeabilitet og inkluderte TEER-måling og tracer flux. I tillegg ble makromolekyltransport analysert av konjugerte molekyler eller antistoffer, der forskjellige modeller som bare brukte endotelceller eller kombinasjoner med astrocytter og pericytes ble utviklet. På grunn av vanskeligheten med å skaffe menneskelig vev regelmessig, brukes mange dyrebaserte modeller. Hjerneendotelceller av storfe og svineopprinnelse danner stramme monolag med høy TEER som danner velformet apikal-basal polaritet og er egnet for undersøkelser av små molekyltransport gjennom BBB. Proteinene varierer i rekkefølge fra deres menneskelige homologer29,30, noe som gjør undersøkelse av terapeutiske antistoffer vanskelig. Av denne grunn kan murine eller menneskelig kultur modeller være å foretrekke. Mus eller rotter som utvalgskilder har fordelen av å bli hentet fra velkarakteriserte arter, men gir få celler for studieformål. Dette kan omgås ved bruk av udødeliggjort mus hjernen endothelioma (END) cellelinjer bEND.3, bEND.5 eller cEND31,32,33.
Primære kultiverte celler fra menneskelig vev er vanskelig å oppnå og å håndtere regelmessig. Derfor er de fleste menneskelige cellulære modeller som brukes i forskning som undersøker den menneskelige BBB udødeliggjort endotelcellelinjer. En publisert cellelinje er human cerebral mikrovaskulær endotelcellelinje hCMEC/D3, som er godt egnet for å studere legemiddelopptak og er lett å håndtere. Cellene bygger en monolayer og uttrykker de karakteristiske tette koblingsproteinene til BBB34, mens uttrykksnivået for claudin-5 rapporteres å være lavere enn i intakte mikrofartøy35 og mange spesifikke transportører har blitt oppdaget på transkripsjonsnivå36, samt i proteomiske studier34. En relativt lav TEER i området 30-50 Ω·cm2 er fortsatt en utfordring37. En annen kilde for hjerneendotelceller er humane pluripotente stamceller (hPSCs)38 og humane ledningen blod-avledede stamceller av sirkulerende endotelstamceller og hematopoetiske linjer39,40. Begge protokollene for differensiering resulterer i trange cellemonolag og høye TEER-verdier (f.eks. 1450 Ω·cm2 i co-kulturer)38. Disse stamcellemodellene krever ekstrem omsorg for dyrking, men gir likevel mulighet til å studere påvirkning av å regulere hormoner41 eller sykdommer med genetisk bakgrunn42 på BBB utvikling.
I denne studien etablerte vi en udødeliggjort transinfisert human hjerne mikrovaskulær endotelcellelinje, THBMEC43, for å etterligne BBB og for å studere bakteriell traversal. Celler seedes på et filter og dyrkes til 100% samflyt i denne cellekulturmodellen. Bakterier er vaksinert i den øvre delen av cellekulturkammeret. Vi bruker Escherichia coli (E. coli) i vår prøvestudie på grunn av den høye forekomsten av E. coli meningitt44. Det har vist seg at den laveste permeabiliteten til cellemonolayer oppstår mellom dag 13 og dag 15 etter seeding45. Derfor utføres behandling av THBMEC monolayer etter denne tiden, og bakterier inokulerer etterpå i mediet på monolayerens apikale overflate. Etter en inkubasjonstid kvantifiseres bakterier som var i stand til å krysse barrieren via platingmedium med bakteriene på agarplater og teller koloniene. Et økt antall kolonier korrelerer med høyere bakteriell traversering gjennom BBB. TEER er ca 70 Ω·cm246. Det er imidlertid ikke nødvendig å måle TEER i den beskrevne metoden. Selv om det er en veletablert verdi for permeabiliteten til BBB, synes det ikke å ha noen innvirkning på traverseringen av bakterier gjennom BBB. Ubehandlede celler tjener som en kontroll av tetthet i vår modell. Det har blitt vist i tidligere arbeid at cellene er i stand til å reagere på proinflammatoriske cytokiner og uttrykke typiske stramme koblingsproteiner47. Dette gjør det mulig for sammensatt screening og validering av et større sett med transportørsubstrater og reseptorer.
Protocol
1. Utarbeidelse av buffer- og reagenser
- Forbered 10x fosfatbuffersaltvann (10x PBS) ved å legge til 80 g natriumklorid (NaCl), 2 g kaliumklorid (KCl), 14,4 g disodium-hydrogen-fosfatdihydrat (Na2HPO4 · 2H2O) og 2 g kaliumdihydrogenfosfat (KH2PO4) i en 1 L glasskolbe i 1 L dobbeltdestillert H2O. Autoklav 10x PBS-oppløsning og fortynn 100 ml av denne løsningen i 900 ml dobbeltdestillert vann for å få 1x PBS.
- Bruk autoklaven til å sterilisere løsninger. Sett glasskolben i kurven, lukk lokket og steriliser den i 15 min ved 121 °C og 98,9 kPa.
MERK: Denne protokollen brukes alltid til autoklavingsløsninger i ytterligere trinn.
- Bruk autoklaven til å sterilisere løsninger. Sett glasskolben i kurven, lukk lokket og steriliser den i 15 min ved 121 °C og 98,9 kPa.
- Forbered en 10 μg/ml kollagen IV og 10 μg/ml fibronectinoppløsning ved å fortynne 0,5 mg/ml fibronectinoppløsning og 0,3 mg/ml kollagen IV-oppløsning hver med 1x PBS til 100 mg/μL aliquots i 1,5 ml mikrorør. Bland deretter 100 μL av begge aliquots med 1800 μL 1x PBS i 2 ml mikrorør og oppbevar dem ved -20 °C.
- Forbered DMEM/F-12 medium ved å legge til 4% føtal storfe serum og 2 mM L-glutamin og 100 mg / L penicillin / streptomycin til mediet og lagre den ved 4 ° C.
- Forbered 1x trypsin-EDTA-oppløsningved å fortynne 5 ml av 10x konsentrert trypsin-EDTA-oppløsning med 45 ml 1x PBS i et 50 ml rør og oppbevar den ved 4 °C.
- Forbered 500 ml LB medium ved å veie 10 g LB kjøttkraft base i en 500 ml glasskolbe. Tilsett 500 ml sterilisert vann og autoklav.
- Forbered LB agar ved å veie 10 g LB kjøttkraft base og 7,5 g agar-agar i en 500 ml glasskolbe. Tilsett 500 ml sterilisert vann før autoklaving og ikke lukk lokket på kolben. Autoklavog la oppløsningen avkjøles til den er varm å ta på.
- Forbered antibiotikafritt medium ved å legge til 4% føtal storfe serum og 2 mM L-glutamin, men ingen penicillin / streptomycin til DMEM / F-12 medium og lagre den ved 4 ° C som i trinn 1.3.
2. Vekst av blod-hjerne barrieren etterligne celler
- For å montere 12 brønnplaten, sett cellekulturen setter inn i brønnene (Figur 2A).
- Pakk ut platen og hver innsats i et biologisk sikkerhetsskap og utfør ytterligere trinn der. Bruk steriliserte tang for å ta tak i innsatsen på sin brede base for å flytte den.
- Bekle porøse membranen i hver innsats med 90 μL på 10 μg/ml kollagen IV og 10 μg/ml fibronectinblanding. Inkuber 12 brønnplate i 24 timer ved 37 °C i en cellekulturinkubator (figur 2B).
- Vask innsatsene to ganger ved å pipettere 1 ml 1x PBS i hver innsats og aspirere løsningen med en vakuumpumpe for cellekulturer.
- Equilibrate membranene ved pipettering 0,5 ml prewarmed DMEM / F-12 medium i øvre og 1,5 ml i nedre kammer. Inkuber platen i 30 min ved 37 °C i en cellekulturinkubator med 5 % CO2-atmosfære (figur 2C).
- Frø 2 x 105 humane mikrovaskulære endotelceller i hvert øvre kammer og inkuber 12 brønnplate ved 37 °C i en cellekulturinkubator (Figur 2D).
- Aspirer mediet fra cellekulturkolben ved hjelp av en vakuumpumpe for cellekulturer og vask monolayer ved å pipettere 10 ml 1x PBS og aspirere løsningen etterpå med en vakuumpumpe.
- Dekk cellene helt med 1x konsentrert trypsin-EDTA ved å pipettere 5 ml av løsningen inn i cellekulturkolben. Inkuber kolben i 3-5 min ved 37 °C i en cellekulturinkubator.
MERK: Hvis cellene ikke er dissosiert, trykk på kolben godt mot håndflaten for å løsne cellene. - Ta 5 ml med en pipette som en aliquot fra cellesuspensjonen i et 15 ml rør og tilsett 5 ml av FCS-holdig medium for å stoppe den enzymatiske reaksjonen.
- Sentrifuge suspensjonen i 3 min ved 210 x g,fjern supernatanten med en vakuumpumpe, og resuspender pellet i 5 ml medium med pipett.
- Bruk celletelleren ved å blande 10 μL av cellesuspensjonen med 10 μL 0,4 % trypanblå beis i et 1,5 ml mikrorør. Tilsett 10 μL av blandingen i et tellekammerlysbilde, legg den inn i celletelleren og begynn å telle.
- Fokuser telleren på cellene slik at kanten er mørk blå og den midterste hvite. Deretter starter du det riktige programmet for celletelling.
- For å beregne volumet for hver innsats, del de oppnådde 2 x 105 cellene per innsats med den beregnede konsentrasjonen av cellesuspensjonen.
3. Dyrking av Blod-hjerne barrieren modell
- Inkuber 12 brønnplate i 14 dager ved 37 °C.
- Endre 0,5 ml medium for det øvre kammeret og 1,5 ml medium for den nedre hver 2-3 dager. Varm mediet før du legger det i cellekolben. Aspirer med vakuumpumpen (Figur 2E).
MERK: Arbeid forsiktig for å unngå å berøre membranen. - Kontroller statusen til cellene ved å forestille dem med et mikroskop og bestem samløpet. Sørg for at samløpet er 100% etter 14 dager.
4. Fremstilling av bakterier
- En dag før måling, sette en koloni av E. coli belastning GM2163 i LB medium. Inkuber kulturrøret i 24 timer ved 37 °C med 180 o/min i en inkubasjonsshaker (Figur 2F).
- Dyrke E. coli-stammen på en LB agarplate ved 4 °C. Ta en koloni med en sterilisert plukke og sette plukke i forberedt kultur tube med 3 ml LB medium.
- Forbered en LB agar plate for hver innsats med varm LB agar løsning og fyll Petri retter til halvparten av sitt totale volum. La dem bli solide og lagre dem ved 4 °C.
5. Behandling av celler
- På dag 14 etter seeding behandler du celler med forbindelser eller måler den transendotheliale elektriske motstanden (TEER), hvis det er planlagt (figur 2G).
MERK: Ha alltid noen ubehandlede celler som kontroll.- For å behandle celler med sammensatt av interesse, fortynn forbindelsen til den endelige konsentrasjonen i DMEM / F-12 medium. Tilsett 0,5 ml av denne blandingen i det øvre kammeret og 1,5 ml inn i det nedre kammeret. Inkuber platen i en cellekulturinkubator for ønsket tid.
- Etterpå børser du hele mediet med antibiotikafritt medium ved å aspirere med vakuumpumpen og pipetteringen (figur 2H).
6. Måling av permeabilitet
- For å få konstante konsentrasjoner av bakterier, mål den optiske tettheten med et fotometer med en bølgelengde på 600 nm. Fortynn nattens løsning av bakterier med LB medium i et 50 ml falkerør til en OD600 på 0,5 ± 0,05. Arbeid på is.
- Fyll 1 ml LB medium i en cuvette. Start fotometeret og sett inn kuklasten, merket side fremover. Trykk på bunnen "Tom" for å måle den tomme verdien etterpå.
- Mål tettheten av bakterieoppløsningen ved å fylle den inn i en cuvette, sette den inn og trykke på den nederste prøven. Gjenta målingen under fortynningen til du får den endelige konsentrasjonen.
- Arbeid i et biologisk sikkerhetsskap hvor bakterier kan håndteres med den tilberedte 12 brønnplate- og bakterieløsningen ved OD600 = 0,5. Tilsett 450 μL bakteriell oppløsning bare i hvert øvre kammer som inneholder 0,5 ml medium(figur 2I).
- Inkuber 12 brønnplate i 6 timer ved 37 °C i en inkubator.
MERK: Protokollen tilsier å ta en pause her. - Prøv 50 μL av mediet med en pipette fra hvert nedre kammer ved å fjerne innsatsen med tang (Figur 2J). Pass på at du ikke søler mediet fra de øvre kamrene til de nedre.
- Plate hver prøve på en separat agar-plate (Figur 2K). Slipp prøven på platen og strek ut løsningen med en cellespreder.
- Inkuber agarplatene i 24 timer ved 37 °C i en inkubator.
- Tell koloniene i hver plate (figur 2L).
7. Analysere data
- Skriv dataene i en tabell og beregn gjennomsnittlig og standardavvik for de observerte koloniene av behandlede og ubehandlede celler.
- Vis gjennomsnittet som det absolutte antallet kolonier.
- For å normalisere resultatene, beregn det relative antallet kolonier ved å dele alle resultater med kontrollverdien.
Figur 2: Detaljert presentasjon av de enkelte trinnene i protokollen. (A) Sett innsatsene med steriliserte tang i 12 brønnplaten. (B) Coat hver innsats med 90 μL fibronectin og kollagen IV blanding og inkubator i 24 timer. (C) Equilibrate membranene med prewarmed medium i 30 min. (D) Seed 2 x 105 humanhjerne mikrovaskulærendotelielle celler per innsats. (E) Dyrke platen for riktig tid. (F) En dag før måling, legg en E. coli koloni i en LBmiddels kultur rør og inkuber i 24 timer . (H) Bytt komplett medium med antibiotikafritt medium. (I) Tilsett 450 μL bakteriell oppløsning (OD600 = 0,5) i hvert øvre kammer og inkubator i 6 timer . (J) Prøv 50 μL medium fra hvert nedre kammer fjerner innsats med tang. (K) Plate prøven på agar plater og inkubator i 24 timer. (L) Telle koloniene og analysere dataene. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Representative Results
Etter protokollen ble cellene seedet, og BBB-modellen ble bygget. På dag 14 etter seeding ble cellene behandlet med glysaal som reaktiv aldehyd. Målet med eksperimentet var å undersøke sammenhengen mellom alder og diabetes hos POD27 og den høye forekomsten av meningitt hos eldre pasienter48. De økte nivåene av avanserte glykasjonssluttprodukter (AgEs) i både alder og diabetes49 krever ytterligere undersøkelse av effekten av glykasjon i patogenesen av mikrobiell traversgjennom BBB. Glycation er en ikke-enzymatisk reaksjon av frie aminogrupper i proteiner med karbonylgrupper for å redusere karbohydrater eller andre karbonylforbindelser. Glukose er kjent som donor av karbonylgrupper; Det er imidlertid mer reaktive kjent. Etter å ha bygget en ustabil Schiffbase, omorganiserer de seg til mer stabile og reaktive dikarbonylforbindelser som glyoksal. AgEs, de endelige produktene, kan forårsake krysskoblinger mellom proteiner50. De kan skade cellulære strukturer og endre cellulær funksjon ved interaksjon med reseptoren av AGEs (RAGE)51.
Cellene ble behandlet med en 0,05 og 0,15 mM glysoksal (GO) oppløsning i 1 t, og ubehandlede celler fungerte som en kontroll. Glykasjon ble påvist via immunblotting og deteksjon med anti-AGE antistoff (figur 3). De oppnådde bakterielle koloniene ble regnet og representert som det absolutte antallkolonier (figur 4A) eller det relative antallet kolonier normalisert til kontrollen (Figur 4B). Mediet tatt fra brønner med ubehandlede celler dannet svært få kolonier. Dette resultatet viste at de ubehandlede cellene var i stand til å bygge en barriere og kunne tjene som en kontroll. Prøver behandlet med glyoksal viste et økt antall kolonier, noe som førte til konklusjonen at det er en effekt av glysall på THBMECs og cellulær barrieretetthet, fordi antall kolonier viste en signifikant forskjell mellom ubehandlede og behandlede celler. Den økte bakterielle kryssingen av barrieren etter behandling med glysaal kan forklare hvorfor diabetes er korrelert med sykdommer med bbbsammenbrudd.
Figur 3: Påvisning av proteinglykasjon via immunblotting. THBMECs ble behandlet med GO ved forskjellige konsentrasjoner i 1 t. Totalt protein ble isolert og separert ved hjelp av SDS-PAGE. Glyksjon av proteinene ble påvist via immunblotting ved hjelp av anti-AGE-antistoff (KML-26). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
I en annen setting ble proteinglykasjon av THBMECer indusert av glukose. Sterilisert glukose ble lagt til DMEM/F-12-mediet for å øke glukosekonsentrasjonen fra normalt glukosemedium (NG) med 17,5 mM til høyt glukosemedium (HG) med 42,5 mM. THBMECs ble dyrket i to forskjellige cellekulturflasker: en i normal glukose (NG) medium og den andre i høy glukose (HG) medium. Disse to forskjellige mediene ble også brukt til vekst av BBB på filtre i 12 brønnplater. Celler dyrket i NG medium fungerte som en kontroll. De oppnådde koloniene er representert som det absolutte antallkolonier (figur 4C)eller det relative antallet kolonier normalisert til kontrollen (Figur 4D). Resultatene indikerer ingen signifikant effekt på traversering av bakterier gjennom humanBBB, noe som fører til konklusjonen at effekten av NG vs. HG ikke var alvorlig nok til å påvirke integriteten til BBB. De ulike scenariene ble designet for å bevise modellen og integriteten til cellene som etterligner BBB.
Figur 4: Absolutt og relativt antall talte bakteriekolonier i BBB-modellen med THBMECs. THBMECs ble behandlet med 0,15 mM GO i 1 t, ubehandlede celler fungertsom en kontroll. Totalt 450 μL E. coli suspensjon (OD600 = 0,5) ble lagt til hvert øvre kammer. Medium fra de nedre kamrene ble belagt på agarplater etter 6 h. (A) Grafen viser gjennomsnittlig gjennomsnitt +/- SEM av teltkolonier. (B) Grafen viser de tellede koloniene normalisert til de ubehandlede cellene som kontroll +/- SEM (n = 4). I (C) og (D), ble THBMECs dyrket i NG og HG medium. Totalt 450 μL E. coli suspensjon (OD600 = 0,5) ble lagt til hvert øvre kammer. Medium fra det nedre kammeret ble belagt på agarplater etter 6 timer (C) Grafen viser gjennomsnittlig gjennomsnitt +/- SEM av talte kolonier. (D) Grafen viser de tellede koloniene normalisert til de ubehandlede cellene som kontroll +/- SEM (n = 3). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Discussion
Begrenset innsikt i patogenesen av mikrobiell traversering begrenser videre utvikling av terapier for POD eller meningitt. Dødeligheten og sykeligheten til disse sykdommene krever bedre pasientbehandling, krever forskning på de underliggende mekanismene, og trenger en robust plattform for sammensatt screening. De multifaktorielle hendelsene kan studeres med menneskelige BMECer. Flere vellykkede rapporterte isolasjonsprosedyrer av BMECer fra en rekke arter har vist tap av cellenes egenskaper molekylær signatur52,53. De beskrevne THBMECs i denne prosedyren ble transinfisert i svært tidlige passasjer, hvor de viste spesifikke hjerneendotelcelleegenskaper og bevarte dem43. Dette er viktig, fordi ikke alle trinnene i de berørte banene har blitt oppdaget så langt, og denne modellen ser ut til å etterligne konvensjonelle BMECs. Vår presenterte modell viser direkte påvirkninger på BMECs og mikrobiell traversgjennom BBB.
Håndteringen av THBMEC-celler er enkel, og det nødvendige tekniske utstyret finnes i de fleste biovitenskapelige laboratorier. Vår modell åpner for en umiddelbar start på undersøkende prosedyrer etter at THBMECs har bygget et stramt monolayer. Bruksområder kan være omfattende på grunn av mulige kombinasjoner mellom nye tester og konvensjonelle analyser som TEER-måling eller merking med tracers54. Det er også mulig å legge til astrocytter eller pericytes for å lage en co- eller trippel-kultur modell. Påvirkningen av legemidler på mikrobiell traverskan også testes i vår modell ved å behandle THBMECs med forbindelser før inokulering av det øvre kammeret med bakterier. Faktisk er det mulig å kjøpe innsatser med filtre for 96 brønnplater slik at automatisering av prosedyren. Dette kan lette gjennomføringen av høy gjennomstrømning narkotika screening systemer for å akselerere oppdagelsen av narkotika mot nevnte sykdommer og redusere bivirkninger på BBB under narkotikautvikling.
Et kritisk skritt i den presenterte metoden er inkubasjonstiden etter å ha tillagt bakteriene til det øvre kammeret. Det er viktig å bruke timer som tidslinjer i protokollen, fordi generasjonstiden til E. coli er bare 20 min55. Ellers kan bruk av forskjellige tidspunkter føre til villedende resultater. Det er også en mulig risiko for forurensning mellom øvre og nedre kammer under bakteriell eksponering hvis platene ikke håndteres med forsiktighet. Eventuelle endringer i 12 brønnplaten på dette tidspunktet kan forurense mediet i det nedre kammeret.
E. coli er en velkjent, svært vanlig årsak til bakteriell meningitt. Videre undersøkelser bør teste forskjellige bakterier som også er forbundet med meningitt, som Neisseria meningitidis56 eller Streptococcus pneumoniae57. Disse ser ut til å bruke forskjellige mekanismer for å krysse BBB og må forstås bedre for behandling av pasienter. Hos eldre pasienter øker forekomsten for POD26, samt antall forekommende komorbiditeter. Det er kjent at det er interaksjoner mellom ulike sykdommer, spesielt systemiske som diabetes. I vår modell er det mulig å simulere disse forholdene eller behandle cellene før du legger til bakteriene.
Modellen er begrenset av direkte kontakt med THBMECs og bakterier, og videre forskning er nødvendig for å undersøke potensielle kontaktmekanismer for å oppdage de involverte veier og proteiner. Det er imidlertid mulig å fjerne innsatser og høste cellene for videre analyse. TEER-en til modellen er lavere sammenlignet med stamcellemodellene38,39,40. Vi bekreftet dette ved hjelp av en bakteriell konsentrasjon som ikke krysset BBB i ubehandlede celler etter 6 timer.
Oppsummert representerer denne metoden en robust plattform for å analysere traversering av bakterier gjennom BBB med potensial til å utvide den for høy gjennomstrømning narkotika screenings.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne erkjenner Dr. Maryam Hussain for tidligere arbeid på denne metoden, gruppen av PD Dr. Kerstin Danker (Charité-Universitätsmedizin, Berlin) for å gi THBMECs og Juliane Weber for kritisk lesing manuskriptet. Denne studien ble støttet av RTK 2155 (ProMoAge).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar - Agar | Carl Roth | 6494.3 | BioScience-Grade |
| Autoclave | Systec | VX-150 | |
| Bacteria E.coli strain GM2163 | Fermentas Life Sciences, Lithuania | ||
| Photometer | Eppendorf | 6131 | |
| Cells THBMEC | Group of M. F. Stins | ||
| Cell culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
| Centrifuge Universal 320 | Hettrichlab | 1401 | |
| Collagen IV | SIGMA Aldrich | C6745 | from human cell culture |
| Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% | Invitrogen | C10311 | |
| Culture tubes | Greiner Bio-One | 191180 | |
| Cuvettes | BRAND | 759015 | |
| Di sodium hydrogen phosphate di hydrate | MERCK | 1065800500 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO/ Thermo Sc. | 11330032 | HEPES |
| Falcon tubes 15 ml | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 ml | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO/ Thermo Sc. | 10270 | value FBS -Brazil |
| Fibronectin | SIGMA Aldrich | F0556 | solution human fibroblasts |
| Heracell 150 CO2 Incubator | Heraeus | 50116047 | |
| Incubator shaker I 26 New Brunswick | Eppendorf | M1324-0000 | |
| Inoculation loop | Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel | 641000 | |
| LB Broth Base | GIBCO/ Thermo Sc. | 12780029 | |
| L-Glutamine | GIBCO/ Thermo Sc. | 25030-081 | |
| Microbial incubator B 6200 | Heraeus | 51015192 | |
| Microbiological Safety Cabinet AURA 2000 M.A.C. Class II | BIOAIR | 12469 | |
| Microscope inverse | Zeiss | TELAVAL 31 | |
| Micro tubes 2 ml | Sarstedt | 72,695,400 | |
| Micro tubes 1,5 ml | Sarstedt | 72,706,400 | |
| Penicillin / Streptomycin | GIBCO/ Thermo Sc. | 15140122 | |
| Petri dish | Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel | 464-800 | |
| Potassium chloride | Roth | HN02.3 | |
| Potassium-di-hydrogen phosphate | Roth | P018.2 | |
| Sodium chloride | Roth | 9265.2 | |
| ThinCerts + Multiwell Plates | Greiner Bio-One | 665631 | 12 well, pore size 3.0 µm |
| Trypsin - EDTA | GIBCO/ Thermo Sc. | 15400054 | |
| Vacuumpump Laboport | KNF | N 86 KT.18 |
References
- Goldmann, E. E. Vitalfärbung am Zentralnervensystem: Beitrag z. Physio-Pathologie d Plexus chorioideus ud Hirnhäute. , (1913).
- Reese, T. S., Karnovsky, M. J. Fine structural localization of a blood-brain barrier to exogenous peroxidase. Journal of Cell Biology. 34 (1), 207-217 (1967).
- Risau, W., Dingler, A., Albrecht, U., Dehouck, M. P., Cecchelli, R. Blood-brain barrier pericytes are the main source of gamma-glutamyltranspeptidase activity in brain capillaries. Journal of Neurochemistry. 58 (2), 667-672 (1992).
- Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
- Coomber, B. L., Stewart, P. A. Morphometric analysis of CNS microvascular endothelium. Microvascular Research. 30 (1), 99-115 (1985).
- Tilling, T., Korte, D., Hoheisel, D., Galla, H. J. Basement membrane proteins influence brain capillary endothelial barrier function in vitro. Journal of Neurochemistry. 71 (3), 1151-1157 (1998).
- Morris, A. W., et al. Vascular basement membranes as pathways for the passage of fluid into and out of the brain. Acta Neuropathologica. 131 (5), 725-736 (2016).
- Betz, A. L., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: neutral amino acid transport into isolated brain capillaries. Science. 202 (4364), 225-227 (1978).
- Butt, A. M., Jones, H. C., Abbott, N. J. Electrical resistance across the blood-brain barrier in anaesthetized rats: a developmental study. Journal of Physiology. 429, 47-62 (1990).
- Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. Journal of Neurochemistry. 97 (4), 922-933 (2006).
- O'Carroll, S. J., et al. Pro-inflammatory TNFalpha and IL-1beta differentially regulate the inflammatory phenotype of brain microvascular endothelial cells. Journal of Neuroinflammation. 12 (131), (2015).
- Simi, A., Tsakiri, N., Wang, P., Rothwell, N. J. Interleukin-1 and inflammatory neurodegeneration. Biochemical Society Transactions. 35 (Pt 5), 1122-1126 (2007).
- Janzer, R. C., Raff, M. C. Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells. Nature. 325 (6101), 253-257 (1987).
- Tao-Cheng, J. H., Nagy, Z., Brightman, M. W. Tight junctions of brain endothelium in vitro are enhanced by astroglia. Journal of Neuroscience. 7 (10), 3293-3299 (1987).
- Utsumi, H., et al. Expression of GFRalpha-1, receptor for GDNF, in rat brain capillary during postnatal development of the BBB. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 279 (2), (2000).
- Tran, N. D., Correale, J., Schreiber, S. S., Fisher, M. Transforming growth factor-beta mediates astrocyte-specific regulation of brain endothelial anticoagulant factors. Stroke. 30 (8), 1671-1678 (1999).
- Balabanov, R., Washington, R., Wagnerova, J., Dore-Duffy, P. CNS microvascular pericytes express macrophage-like function, cell surface integrin alpha M, and macrophage marker ED-2. Microvascular Research. 52 (2), 127-142 (1996).
- Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes. Faseb Journal. 16 (10), 1274-1276 (2002).
- Lindahl, P., Johansson, B. R., Leveen, P., Betsholtz, C. Pericyte loss and microaneurysm formation in PDGF-B-deficient mice. Science. 277 (5323), 242-245 (1997).
- Young, G. B., Bolton, C. F., Archibald, Y. M., Austin, T. W., Wells, G. A. The electroencephalogram in sepsis-associated encephalopathy. Journal of Clinical Neurophysiology. 9 (1), 145-152 (1992).
- Carlyle Clawson, C., Francis Hartmann, J., Vernier, R. L. Electron microscopy of the effect of gram-negative endotoxin on the blood-brain barrier. Journal of Comparative Neurology. 127 (2), 183-197 (1966).
- Jeppsson, B., et al. Blood-brain barrier derangement in sepsis: cause of septic encephalopathy? The American Journal of Surgery. 141 (1), 136-142 (1981).
- Tighe, D., Moss, R., Bennett, D. Cell surface adrenergic receptor stimulation modifies the endothelial response to SIRS. Systemic Inflammatory Response Syndrome. New Horizons (Baltimore, Md). 4 (4), 426-442 (1996).
- Kim, K. S., et al. The K1 capsule is the critical determinant in the development of Escherichia coli meningitis in the rat. Journal of Clinical Investigation. 90 (3), 897-905 (1992).
- Kim, K. S., Wass, C. A., Cross, A. S. Blood-brain barrier permeability during the development of experimental bacterial meningitis in the rat. Experimental Neurology. 145 (1), 253-257 (1997).
- Arshi, A., et al. Predictors and Sequelae of Postoperative Delirium in Geriatric Hip Fracture Patients. Geriatric Orthopaedic Surgery and Rehabililation. 9, 2151459318814823 (2018).
- Smulter, N., Lingehall, H. C., Gustafson, Y., Olofsson, B., Engstrom, K. G. Delirium after cardiac surgery: incidence and risk factors. Interactive CardioVascular and Thoracic Surgery. 17 (5), (2013).
- Kratz, T., Heinrich, M., Schlauss, E., Diefenbacher, A. Preventing postoperative delirium. Deutsches Arzteblatt International. 112 (17), 289-296 (2015).
- Uchida, Y., et al. Quantitative targeted absolute proteomics of human blood-brain barrier transporters and receptors. Journal of Neurochemistry. 117 (2), 333-345 (2011).
- Warren, M. S., et al. Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human. Pharmacology Research. 59 (6), 404-413 (2009).
- Omidi, Y., et al. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Research. 990 (1-2), 95-112 (2003).
- Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (1), 315-327 (2011).
- Burek, M., Salvador, E., Forster, C. Y. Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model. Journal of Visualized Experiments. (66), e4022 (2012).
- Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmacolgy. 10 (1), 289-296 (2013).
- Urich, E., Lazic, S. E., Molnos, J., Wells, I., Freskgard, P. O. Transcriptional profiling of human brain endothelial cells reveals key properties crucial for predictive in vitro blood-brain barrier models. PLoS One. 7 (5), e38149 (2012).
- Lopez-Ramirez, M. A., et al. Cytokine-induced changes in the gene expression profile of a human cerebral microvascular endothelial cell-line, hCMEC/D3. Fluid Barrier CNS. 10 (27), (2013).
- Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).
- Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
- Boyer-Di Ponio, J., et al. Instruction of circulating endothelial progenitors in vitro towards specialized blood-brain barrier and arterial phenotypes. PLoS One. 9 (1), e84179 (2014).
- Cecchelli, R., et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 9 (6), e99733 (2014).
- Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Science Reports. 4, 4160 (2014).
- Lim, R. G., et al. Huntington's Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).
- Stins, M. F., Badger, J., Sik Kim, K. Bacterial invasion and transcytosis in transfected human brain microvascular endothelial cells. Microbiological Pathogens. 30 (1), 19-28 (2001).
- Gaschignard, J., et al. Neonatal Bacterial Meningitis: 444 Cases in 7 Years. Pediatric Infectious Disease Journal. 30 (3), 212-217 (2011).
- Hussain, M. The Effect of Glycation on the Permeability of an in vitro Blood-brain Barrier Model. , University Halle-Wittenberg. (2015).
- Weber, V. The effect of glycation on the permeability of human blood-brain barrier. , University Halle-Wittenberg. (2019).
- Hussain, M., et al. Novel insights in the dysfunction of human blood-brain barrier after glycation. Mechanism of Ageing Development. 155, 48-54 (2016).
- Choi, C. Bacterial meningitis in aging adults. Clinical Infectious Disease. 33 (8), 1380-1385 (2001).
- Furth, A. J. Glycated proteins in diabetes. British Journal of Biomedical Science. 54 (3), 192-200 (1997).
- Sajithlal, G. B., Chithra, P., Chandrakasan, G. Advanced glycation end products induce crosslinking of collagen in vitro. Biochimica and Biophysica Acta. 1407 (3), 215-224 (1998).
- Ray, R., Juranek, J. K., Rai, V. RAGE axis in neuroinflammation, neurodegeneration and its emerging role in the pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis. Neuroscience and Biobehavior Reviews. 62, 48-55 (2016).
- DeBault, L. E., Cancilla, P. A. Gamma-Glutamyl transpeptidase in isolated brain endothelial cells: induction by glial cells in vitro. Science. 207 (4431), 653-655 (1980).
- Diglio, C. A., Grammas, P., Giacomelli, F., Wiener, J. Primary culture of rat cerebral microvascular endothelial cells. Isolation, growth, and characterization. Laboratory Investigation. 46 (6), 554-563 (1982).
- Buchert, M., Turksen, K., Hollande, F. Methods to examine tight junction physiology in cancer stem cells: TEER, paracellular permeability, and dilution potential measurements. Stem Cell Reviews. 8 (3), 1030-1034 (2012).
- Gibson, B., Wilson, D. J., Feil, E., Eyre-Walker, A. The distribution of bacterial doubling times in the wild. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 285 (1880), (2018).
- Pron, B., et al. Interaction of Neisseria maningitidis with the components of the blood-brain barrier correlates with an increased expression of PilC. Journal of Infectious Diseases. 176 (5), 1285-1292 (1997).
- Iovino, F., Orihuela, C. J., Moorlag, H. E., Molema, G., Bijlsma, J. J. Interactions between blood-borne Streptococcus pneumoniae and the blood-brain barrier preceding meningitis. PLoS One. 8 (7), e68408 (2013).
