Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

تحليل نفاذية حاجز الدم في الدماغ من قبل اجتياز الميكروبات من خلال الخلايا البوائية الدقيقة

doi: 10.3791/60692 Published: February 14, 2020

Summary

حاجز الدم البشري في الدماغ يمنع بشكل انتقائي تغلغل الجزيئات المائية ومسببات الأمراض في الدماغ. ترتبط العديد من الأمراض ، بما في ذلك التهاب السحايا والهذيان بعد الجراحة ، بزيادة نفاذية حاجز الدم في الدماغ. هنا، نصف نموذج ثقافة الخلايا البُنفية لاختبار نفاذية الحاجز عن طريق اجتياز الميكروبات.

Abstract

يتميز حاجز الدم البشري (BBB) بنفاذية منخفضة جدًا للجزيئات الحيوية من أجل حماية وتنظيم عملية التمثيل الغذائي للدماغ. يتم تشكيل BBB أساسا من الخلايا البطانة جزءا لا يتجزأ من الكولاجين الرابع والأغشية السفلية الغنية بالفيفينكتين. تنتج العديد من الأمراض عن خلل في BBB يليه اجتياز الميكروبات ، مما يسبب أمراضًا مثل التهاب السحايا. من أجل اختبار تأثير معلمات متعددة، بما في ذلك الأدوية والتخدير المختلفة، على نفاذية BBB أنشأنا نموذج ثقافة الخلايا البشرية رواية تحاكي BBB مع خلايا البوائية الدقيقة في الدماغ البشري. تزرع الخلايا الفيوثيلية على الكولاجين الرابع ووحدات التصفية المغلفة بالفينكتين حتى التقاء ويمكن بعد ذلك علاجها بمركبات مختلفة ذات أهمية. من أجل إظهار اجتياز الميكروبات ، يتم تلقيح الغرفة العليا مع السطح apical للخلايا الفيوليلية مع البكتيريا. بعد فترة الحضانة ، يتم وضع عينات من الغرفة السفلية على لوحات أجار ويتم حساب المستعمرات التي تم الحصول عليها ، حيث يرتبط عدد المستعمرات بنفاذية BBB. يمكن تحليل العوامل الخلوية الذاتية في هذا الإعداد التجريبي من أجل توضيح الآليات الخلوية الأساسية للخلايا الفيوليلية التي تساهم في BBB. بالإضافة إلى ذلك، يسمح هذا النظام الأساسي بتنفيذ شاشة للمركبات التي قد تؤثر على نفاذية الخلايا البُنائية. وأخيراً، يمكن دراسة اجتياز البكتيريا وربطها بالأمراض المختلفة، مثل التهاب السحايا. قد يكون من الممكن توسيع النموذج وتحليل مسارات البكتيريا من خلال BBB. في هذه المقالة، نقدم بروتوكول مفصل للطريقة الموصوفة للتحقيق في نفاذية BBB.

Introduction

BBB الإنسان هو حدود فريدة من أنسجة الدماغ، وفصل الدماغ من الدم. وهو ينظم بدقة مرور الجزيئات الأكبر والمائية، ويمنع الانتشار شبه الخلوي، ويحافظ على التوازن الدماغي. كما أنه يحمي الدماغ من تقلبات البلازما والسموم والميكروبات، ويوجه الخلايا الالتهابية كجزء من مناعة الجهاز العصبي المركزي (CNS). منذ اكتشافه قبل قرن من الزمان1، تم إجراء العديد من الدراسات لفهم بنية ووظيفة BBB. التفاعلات المعقدة من الخلايا والبروتينات، والإشارات من الدماغ والدم الطلب لا يزال مزيد من التحقيق والنماذج.

يتكون BBB البشري من ثلاثة أنواع من الخلايا: الخلايا الفيوائية الوعائية الدقيقة في الدماغ (BMECs) ، pericytes ، والخلايا الفلكية2،3. وBMECs تختلف عن غالبية الخلايا البطانة في الجسم في أنها تمتلك عددا كبيرا من تقاطعات ضيقة والتقيد تقاطعاتالنشاط البينوسيتوتيك منخفضةوغشاء الطابق السفلي المستمر7 لمنع انتشار شبه الخلوية. جزيئات الدهون الصغيرة يمكن أن تنتشر وتمر BBB بعد تدرج تركيزها; الجزيئات الكبيرة والمائية تدخل أو تغادر الدماغ فقط من خلال أنظمة النقل الانتقائية المستقطبة المعبر عنها8. ينتج عن هذه اللائحة مقاومة كهربائية نقلية عالية (TEER) من 1,500-2,000 Ο·cm2 التي ترتبط عكسياً بنفاذية9,10. على الرغم من أن BMECs بناء حاجز ضيق، فإنها يمكن أن تتفاعل مع الإشارات المحلية والطرفية11،12. هناك تفاعل وثيق بين BMECs والخلايا الفلكية13؛ الخلايا الفلكية نهاية القدمين بناء طبقة حول السفن والحث على تشكيل تقاطعات ضيقة13،14. وهم يشاركون في نضوج BBB مع عوامل مختلفة، بما في ذلك تحويل عامل النمو-α (TGF-α)15،16. وبالإضافة إلى ذلك، pericytes تلعب دورا رئيسيا في تنظيم تولد الأوعية17 ومنع الخلايا المبرمج في التمايز الخلوي18 (الشكل 1). وهي جزءا لا يتجزأ من غشاء الطابق السفلي وتوفير الاستقرار الهيكلي للسفينة الجدار19.

Figure 1
الشكل 1: البنية التخطيطية لحاجز الدم في الدماغ. يتكون الهيكل الفريد لـ BBB البشري من ثلاثة أنواع مختلفة من الخلايا. ويحيط تجويف السفينة الصغيرة من قبل الخلايا الفيولوميلية، والتي يتم إثراؤها في تقاطعات ضيقة، وليس fenestrated. وهي مضمنة في غشاء الطابق السفلي، مثل pericytes. هذه الخلايا مهمة للاستقرار الهيكلي لجدار السفينة وتلعب دورا في تطوير BBB بجوار الخلايا الفلكية. أقدامهم النهائية بناء طبقة قريبة حول السفينة ودعم بناء تقاطعات ضيقة. جميع مكونات BBB مهمة للوظائف الفسيولوجية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ترتبط العديد من الأمراض المختلفة بانهيار BBB (على سبيل المثال ، اعتلال الدماغ الانتاني). وقد زاد المرضى المتضررين من مستويات البروتين في السائل النخاعي20، ويظهر parenchyma الدماغ في القوارض المتضررة زيادة في تناول أكسيد الحديد الغرواني ملحوظ والأحماض الأمينية21،22. تشير هذه النتائج إلى زيادة نفاذية BBB التي تحدث إلى جانب زيادة الخلايا البينوسيتوسية في BMECs21 وتنشيط البوثيليال23. علم الأمراض الأخرى المرتبطة المرتبطة BBB غيرت هو التهاب السحايا، وحالة طبية طارئة والتهاب معقد يرافقه وذمة دماغية التي يمكن أن تؤدي إلى موت الخلايا العصبية. من المفترض أن يكون موقع الدخول الرئيسي للبكتيريا المتداولة هو الأوعية الدقيقة24. ومع ذلك ، فإن BBB يمنع دخول البكتيريا. لا ترتبط نفاذية BBB دائمًا بزيادة في التهاب السحايا الهيماتوس التجريبي25 ويمكن أن تكون الآليات متعددة العوامل. صدفة الإنتان مع الهذيان بعد الجراحة (POD)26 والارتباط مع العدوى قبل الجراحة27،28 يشير إلى الحاجة إلى نموذج BBB التي تمكن من التعرض المباشر للبكتيريا للحصول على فهم أفضل في الإمراض البكتيري.

هناك العديد من الثغرات في فهم وقياس اجتياز الميكروبية من خلال BBB. لذلك ، قمنا بتطوير نموذج يسمح بإجراء اختبار مناسب لعوامل وظروف مختلفة مع ارتباط مباشر بين اجتياز البكتيريا والتأثيرات على نفاذية BBB. وركزت الأعمال السابقة على نفاذية الخلايا وشملت قياس TEER وتدفق التتبع. وبالإضافة إلى ذلك، تم تحليل نقل الجزيئات الكبيرة بواسطة جزيئات مُترافقة أو أجسام مضادة، حيث تم تطوير نماذج مختلفة باستخدام الخلايا الفيوثيلية فقط أو تركيبات مع الخلايا الفلكية والبريسيت. بسبب صعوبة الحصول على الأنسجة البشرية على أساس منتظم ، يتم استخدام العديد من النماذج القائمة على الحيوانات. الخلايا البُنائية للدماغ من أصل الأبقار والخنزير تشكل أحادية ضيقة مع TEER عالية التي تشكل على شكل جيد apical-basal القطبية ومناسبة للتحقيقات في نقل الجزيئات الصغيرة من خلال BBB. تختلف البروتينات في تسلسل من المتماثلات البشرية29،30، مما يجعل التحقيق في الأجسام المضادة العلاجية صعبة. لهذا السبب، قد يكون من الأفضل نماذج المورين أو الثقافة البشرية. الفئران أو الفئران كمصادر عينة لديها ميزة الحصول عليها من الأنواع ذات الخصائص المحددة بشكل جيد ولكن هاهي خلايا قليلة لأغراض الدراسة. ويمكن التحايل على هذا من خلال استخدام الظهارة الدماغية الماوس خلدة (END) خطوط الخلية bEND.3، bEND.5 أو cEND31،32،33.

من الصعب الحصول على الخلايا المستزرعة الأولية من الأنسجة البشرية والتعامل معها على أساس منتظم. ولذلك، فإن معظم النماذج الخلوية البشرية المستخدمة في البحوث التحقيق في BBB الإنسان هي خلدخطوط الخلايا الانبوبيليالية. خط الخلية المنشورة هو الإنسان الدماغي الدقيق خط الخلية الانجيويلية hCMEC/D3، وهو مناسب تماما لدراسة تناول المخدرات وسهلة للتعامل معها. الخلايا بناء أحادية وتعبر عن البروتينات تقاطع ضيق مميزة من BBB34, في حين أن مستوى التعبير من كلودين-5 وتفيد التقارير أن تكون أقل مما كانت عليه في microvesselsسليمة 35 وقد تم الكشف عن العديد من ناقلات محددة في مستوى النص36 وكذلك في الدراسات البروتينية34. وTEER منخفضة نسبيا في حدود 30-50 · سم2 لا يزال تحديا37. مصدر آخر للخلايا البذالية الدماغ هي الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs)38 والخلايا الجذعية المشتقة من دم الحبل البشري من السلف البذالي المتداول والأنساب الدموية39،40. كلا بروتوكولي التمايز يؤدي إلى أحادية الخلية الضيقة وقيم TEER العالية (على سبيل المثال، 1,450 ·2 في الثقافات المشتركة)38. تتطلب نماذج الخلايا الجذعية هذه عناية فائقة للزراعة ، ولكنها توفر الفرصة لدراسة تأثير الهرمونات المنظمة41 أو الأمراض ذات الخلفيات الوراثية42 على تطوير BBB.

في هذه الدراسة، أنشأنا خلاثة الدماغ البشري عبر المصابين خط الخلايا الانبوبيلية الدقيقة، THBMEC43،لمحاكاة BBB ودراسة اجتياز البكتيرية. يتم بذر الخلايا على مرشح ونمت إلى التقاء 100٪ في هذا النموذج ثقافة الخلية. يتم تلقيح البكتيريا في الجزء العلوي من غرفة ثقافة الخلية. نحن نستخدم الإشريكية القولونية (E. coli)في دراسة العينة بسبب ارتفاع معدل الإصابة بالتهاب السحايا الإشريكية القولونية44. وقد تبين أن أدنى نفاذية من أحادية الخلية يحدث بين اليوم 13 واليوم 15 بعد البذر45. لذلك ، يتم تنفيذ علاج الطبقة الأحادية THBMEC بعد هذا الوقت ويتم تلقيح البكتيريا بعد ذلك في الوسط على السطح apical من الطبقة الأحادية. بعد وقت الحضانة ، يتم قياس البكتيريا التي كانت قادرة على عبور الحاجز عن طريق الطلاء المتوسط مع البكتيريا على لوحات أجار وحساب المستعمرات. يرتبط عدد متزايد من المستعمرات بارتفاع اجتياز البكتيريا من خلال BBB. وTEER حوالي 70 · سم246. ومع ذلك، ليس من الضروري قياس TEER في الأسلوب الموصوف. على الرغم من أنها قيمة راسخة لنفاذية BBB ، يبدو أنه ليس لها أي تأثير على اجتياز البكتيريا من خلال BBB. الخلايا غير المعالجة بمثابة السيطرة على ضيق في نموذجنا. وقد ثبت في العمل السابق أن الخلايا قادرة على التفاعل مع السيتوكينات proinflammatory والتعبير عن البروتينات تقاطع ضيق نموذجي47. وهذا يسمح للفحص المركب والتحقق من صحة مجموعة أكبر من ركائز الناقل ومستقبلات.

Protocol

1. إعداد العازلة والكواشف

  1. إعداد 10x الفوسفات العازلة المالحة (10x PBS) عن طريق إضافة 80 غرام من كلوريد الصوديوم (NaCl), 2 غرام من كلوريد البوتاسيوم (KCl), 14.4 غرام من ديهيدرات الصوديوم الهيدروجين والفوسفات (Na2HPO4 · 2H2O) و 2 غرام من فوسفات البوتاسيوم-ثنائي الهيدروجين (KH2PO4)في قارورة زجاجية 1 لتر في 1 لتر من أوتوكلاف حل 10x PBS وتمييع 100 مل من هذا الحل في 900 مل من الماء المقطر المزدوج للحصول على 1x PBS.
    1. استخدام الأوتوكلاف لتعقيم الحلول. وضع قارورة الزجاج في السلة، وإغلاق الغطاء وتعقيمها لمدة 15 دقيقة في 121 درجة مئوية و 98.9 كيلو باسكال.
      ملاحظة: يتم استخدام هذا البروتوكول دائماً لحلول التعقيم في مزيد من الخطوات.
  2. إعداد 10 ميكروغرام / مل الكولاجين الرابع و 10 ميكروغرام / مل محلول ليفينكتين عن طريق تخفيف 0.5 ملغ / مل محلول ليفينكتين و0.3 ملغ / مل الكولاجين الرابع الحل مع كل 1x PBS إلى 100 ملغ / ميكرولتر aliquots في 1.5 مل أنابيب صغيرة. بعد ذلك، مزيج 100 ميكرولتر من كل من aliquots مع 1800 ميكرولتر من 1x PBS في 2 مل أنابيب صغيرة وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  3. إعداد DMEM/F-12 المتوسطة عن طريق إضافة 4٪ مصل الأبقار الجنين و 2 M L-الجلوتامين و 100 ملغ/لتر البنسلين/ستريبتومسين إلى المتوسط وتخزينها في 4 درجة مئوية.
  4. إعداد 1x تريبسين-EDTA الحل عن طريق تخفيف 5 مل من 10x تركيز حل التربسين-EDTA مع 45 مل من 1x PBS في أنبوب 50 مل وتخزينها في 4 درجة مئوية.
  5. إعداد 500 مل من متوسط LB من خلال وزن 10 غرام من قاعدة مرق LB في قارورة زجاجية 500 مل. إضافة 500 مل من الماء المعقم والأوتوكلاف عليه.
  6. إعداد LB أغار من خلال وزن 10 غرام من قاعدة مرق LB و 7.5 غرام من أغار أجار في قارورة زجاجية 500 مل. إضافة 500 مل من الماء المعقم قبل التعقيم ولا تغلق غطاء القارورة. الأوتوكلاف وترك الحل لتهدئة حتى يكون دافئا لمسة.
  7. إعداد متوسطة خالية من المضادات الحيوية عن طريق إضافة 4٪ مصل الأبقار الجنين و 2 MM L-الجلوتامين، ولكن لا البنسلين / ستريبتومسين إلى DMEM/F-12 المتوسطة وتخزينها في 4 درجة مئوية كما هو الحال في الخطوة 1.3.

2. نمو حاجز الدم في الدماغ الخلايا المحاكية

  1. لتجميع لوحة بئر 12 ، ضع ثقافة الخلية تدرج في الآبار(الشكل 2A).
    1. فك لوحة وإدراج كل في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية وتنفيذ خطوات أخرى هناك. استخدام ملقط معقمة للاستيلاء على إدراج في قاعدتها واسعة لتحريكه.
  2. معطف الغشاء المسامي لكل إدراج مع 90 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل الكولاجين الرابع و 10 ميكروغرام / مل خليط ليفينكتين. احتضان لوحة بئر 12 لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية في حاضنة ثقافة الخلية(الشكل 2B).
  3. غسل إدراج مرتين عن طريق pipetting 1 مل من 1x PBS في كل إدراج واستنشاق الحل مع مضخة فراغ لثقافات الخلية.
  4. توازن الأغشية عن طريق الأنابيب 0.5 مل من DMEM/ F-12 متوسطة في الجزء العلوي و 1.5 مل في الغرفة السفلى. احتضان لوحة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية في حاضنة ثقافة الخلية مع 5٪ CO2 الغلاف الجوي(الشكل 2C).
  5. البذور 2 × 105 خلايا البوائية الدقيقة البشرية في كل غرفة علوية واحتضان لوحة بئر 12 في 37 درجة مئوية في حاضنة ثقافة الخلية(الشكل 2D).
    1. اسشق الوسط من قارورة ثقافة الخلية باستخدام مضخة فراغ لثقافات الخلية وغسل أحادية الطبقة عن طريق pipetting 10 مل من 1x PBS وaspiing الحل بعد ذلك مع مضخة فراغ.
    2. تغطية الخلايا تماما مع 1x التربسين تركز EDTA عن طريق الأنابيب 5 مل من الحل في قارورة ثقافة الخلية. احتضان قارورة لمدة 3-5 دقيقة في 37 درجة مئوية في حاضنة ثقافة الخلية.
      ملاحظة: إذا لم يتم فصل الخلايا، اضغط بقوة على قارورة ضد راحة اليد لطرد الخلايا.
    3. تأخذ 5 مل مع ماصة كما aliquot من تعليق الخلية في أنبوب 15 مل وإضافة 5 مل من المتوسطة التي تحتوي على FCS لوقف رد الفعل الأنزيمي.
    4. الطرد المركزي تعليق لمدة 3 دقيقة في 210 × ز، وإزالة supernatant مع مضخة فراغ ، وإعادة تعليق بيليه في 5 مل من المتوسطة مع ماصة.
    5. استخدام عداد الخلية عن طريق خلط 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 10 ميكرولتر من 0.4٪ بقعة زرقاء trypan في أنبوب صغير 1.5 مل. أضف 10 ميكرولتر من الخليط إلى شريحة غرفة العد، ووضعها في عداد الخلية، والبدء في العد.
      1. تركيز العداد على الخلايا بحيث حافة زرقاء داكنة والأبيض الأوسط. بعد ذلك، ابدأ البرنامج المناسب لعد الخلايا.
    6. لحساب حجم كل إدراج، تقسيم الخلايا التي تم الحصول عليها 2 × 105 لكل إدراج مع التركيز المحسوب لتعليق الخلية.

3. زراعة نموذج حاجز الدم في الدماغ

  1. احتضان لوحة بئر 12 لمدة 14 يوما في 37 درجة مئوية.
  2. تغيير 0.5 مل من المتوسطة للغرفة العليا و 1.5 مل من المتوسط لواحد أقل كل 2-3 أيام. دافئة المتوسطة قبل وضعه في قارورة الخلية. يستنشق مع مضخة فراغ(الشكل 2E).
    ملاحظة: اعمل بعناية لتجنب لمس الغشاء.
  3. تحقق من حالة الخلايا عن طريق تصويرها بالمجهر وتحديد التقاء. تأكد من أن التقاء هو 100٪ بعد 14 يوما.

4. إعداد البكتيريا

  1. قبل يوم واحد من القياس، وضع مستعمرة من سلالة القولونية E. GM2163 في وسط LB. احتضان أنبوب الثقافة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 180 دورة في الدقيقة في شاكر الحضانة(الشكل 2F).
    1. زراعة سلالة الإشريكية القولونية على لوحة أغار LB عند 4 درجة مئوية. اتخاذ مستعمرة واحدة مع اختيار معقمة ووضع اختيار في أنبوب الثقافة المعدة مع 3 مل من وسط LB.
    2. إعداد لوحة أجار LB لكل إدراج مع حل LB أجار الحارة وملء أطباق بيتري إلى نصف حجمها الإجمالي. دعهم يصبحون صلبين ويخزنونها عند درجة حرارة 4 درجة مئوية.

5. علاج الخلايا

  1. في اليوم 14 بعد البذر، علاج الخلايا مع مركبات أو قياس المقاومة الكهربائية عبر (TEER)، إذا كان مقررا(الشكل 2G).
    ملاحظة: دائماً لديك بعض الخلايا غير المعالجة كعنصر تحكم.
    1. لعلاج الخلايا مع مركب الفائدة, تخفيف المركب إلى التركيز النهائي في DMEM/F-12 المتوسطة. أضف 0.5 مل من هذا الخليط إلى الغرفة العلوية و1.5 مل في الغرفة السفلى. احتضان لوحة في حاضنة ثقافة الخلية للوقت المطلوب.
  2. بعد ذلك ، تبادل المتوسطة كاملة مع وسيط خالية من المضادات الحيوية عن طريق النفخ مع مضخة فراغ وpipetting(الشكل 2H).

6- قياس نفاذية

  1. للحصول على تركيزات ثابتة من البكتيريا، قم بقياس الكثافة البصرية باستخدام مقياس ضوئي عند طول موجي يبلغ 600 نانومتر. تمييع محلول البكتيريا بين عشية وضحاها مع LB المتوسطة في أنبوب فالكون 50 مل إلىOD 600 من 0.5 ± 0.05. العمل على الثلج.
    1. ملء 1 مل من وسط LB في كوفيت. بدء photometer ووضع في كفيت، الجانب ملحوظ إلى الأمام. اضغط على الجزء السفلي"فارغ"لقياس القيمة الفارغة بعد ذلك.
    2. قياس كثافة المحلول البكتيري عن طريق ملئه في كوفيت ، ووضعه فيه ، والضغط على العينة السفلية. كرر القياس أثناء التمييع حتى الحصول على التركيز النهائي.
  2. العمل في خزانة السلامة البيولوجية حيث يمكن التعامل مع البكتيريا مع لوحة بئر 12 أعدت والحل البكتيري في OD600 = 0.5. إضافة 450 ميكرولتر من المحلول البكتيري فقط في كل غرفة علوية تحتوي على 0.5 مل من المتوسط(الشكل 2I).
  3. احتضان لوحة بئر 12 لمدة 6 ساعة في 37 درجة مئوية في حاضنة.
    ملاحظة: البروتوكول يملي إيقاف مؤقت هنا.
  4. عينة 50 ميكرولتر من الوسط مع ماصة من كل غرفة سفلية عن طريق إزالة إدراج مع ملقط(الشكل 2J). الحرص على عدم انسكاب المتوسطة من الغرف العليا إلى تلك السفلى.
  5. لوحة كل عينة على لوحة منفصلة أغار(الشكل 2K). إسقاط العينة على لوحة وسلسلة من الحل مع موزع الخلية.
  6. احتضان لوحات أجار لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية في حاضنة.
  7. عد المستعمرات في كل لوحة(الشكل 2L).

7. تحليل البيانات

  1. كتابة البيانات في جدول وحساب متوسط والانحراف المعياري للمستعمرات الملاحظة من الخلايا المعالجة وغير المعالجة.
  2. عرض المتوسط كعدد مطلق من المستعمرات.
    1. لتطبيع النتائج، قم بحساب العدد النسبي للمستعمرات عن طريق تقسيم كافة النتائج مع قيمة التحكم.

Figure 2
الشكل 2: عرض مفصل للخطوات الفردية في البروتوكول. (أ)وضع إدراج مع الملقط المعقمة في لوحة 12 جيدا. (B)معطف كل إدراج مع 90 ميكرولتر من خليط الليفيا والكولاجين الرابع واحتضان لمدة 24 ساعة(C)توازن الأغشية مع متوسطة الدفء لمدة 30 دقيقة. (D) البذور 2 × 105 خلايا بطانة الأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ البشري لكل إدراج. (E)زراعة لوحة لمقدار الوقت المناسب. (F)يوم واحد قبل القياس، ووضع مستعمرة القولونية E. في أنبوب الثقافة المتوسطة LB واحتضان لمدة 24 ساعة(G)علاج الخلايا أو قياس TEER. (H)تبادل المتوسطة كاملة مع وسيط خالية من المضادات الحيوية. (I)إضافة 450 ميكرولتر من المحلول البكتيري (OD600 = 0.5) في كل غرفة علوية واحتضان لمدة 6 ساعة(J)عينة 50 ميكرولتر من المتوسط من كل غرفة أقل إزالة إدراج مع ملقط. (K)لوحة العينة على لوحات أجار واحتضان لمدة 24 ساعة(L)عد المستعمرات وتحليل البيانات. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

   

Representative Results

بعد البروتوكول، تم بذر الخلايا، وتم بناء نموذج BBB. في اليوم 14 بعد البذر ، تم التعامل مع الخلايا مع غليوكال كألدهيد رد الفعل. وكان الهدف من التجربة هو التحقيق في العلاقة بين العمر ومرض السكري في POD27 وارتفاع معدل الإصابة بالتهاب السحايا في المرضى المسنين48. تتطلب المستويات المتزايدة من المنتجات النهائية المتقدمة للسكري (AGEs) في كل من العمر والسكري49 إجراء مزيد من الفحص لتأثير السكر في الإمراض من اجتياز الميكروبات من خلال BBB. الغليكة هو رد فعل غير أنزيمي من المجموعات الأمينية الحرة في البروتينات مع مجموعات الكربونيل من تقليل الكربوهيدرات أو مركبات الكربونيل الأخرى. ومن المعروف جيدا الجلوكوز كما المانحة لمجموعات الكربونيل; ومع ذلك ، هناك أكثر منها رد الفعل المعروفة. بعد بناء قاعدة شيف غير مستقرة، فإنها إعادة ترتيب لمركبات ثنائي الكربون أكثر استقرارا وتفاعلية مثل غليوكال. AGEs، والمنتجات النهائية، يمكن أن يسبب الروابط المتقاطعة بين البروتينات50. أنها يمكن أن تضر الهياكل الخلوية وتغيير وظيفة الخلوية عن طريق التفاعل مع مستقبلات AGEs (الغضب)51.

عولجت الخلايا بمحلول الغليوكال 0.05 و0.15 مM (GO) لساعة واحدة، وكانت الخلايا غير المعالجة بمثابة عنصر تحكم. تم الكشف عن الغليكة عن طريق النشاف المناعي والكشف عن طريق الأجسام المضادة للعمر(الشكل 3). تم عد المستعمرات البكتيرية التي تم الحصول عليها وتمثيلها كعدد مطلق من المستعمرات(الشكل 4A)أو العدد النسبي للمستعمرات التي تم تطبيعها إلى السيطرة(الشكل 4B). شكلت الوسط المأخوذ من الآبار مع الخلايا غير المعالجة مستعمرات قليلة جدا. وأظهرت هذه النتيجة أن الخلايا غير المعالجة كانت قادرة على بناء حاجز ويمكن أن تكون بمثابة عنصر تحكم. أظهرت العينات التي عولجت بالغليوكال عدداً متزايداً من المستعمرات، مما أدى إلى استنتاج أن هناك تأثير غليوكال على THBMECs وكثافة الحاجز الخلوي، لأن عدد المستعمرات أظهر فرقاً كبيراً بين الخلايا غير المعالجة والخلايا المعالجة. زيادة عبور البكتيريا من الحاجز بعد العلاج مع الغليوكال يمكن أن يفسر لماذا يرتبط مرض السكري إلى الأمراض مع انهيار BBB.

Figure 3
الشكل 3: الكشف عن غليكة البروتين عن طريق النشاف المناعي. عولجت THBMECs مع GO بتركيزات مختلفة ل1 ح. تم عزل البروتين الكلي وفصله باستخدام SDS-PAGE. تم الكشف عن غليكات البروتينات عن طريق النفية باستخدام الأجسام المضادة لـ AGE (CML-26). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

في وضع مختلف، تم حث السكر البروتين من THBMECs بواسطة الجلوكوز. تمت إضافة الجلوكوز المعقم إلى متوسط DMEM/F-12 لزيادة تركيز الجلوكوز من متوسط الجلوكوز العادي (NG) مع 17.5 متر إلى متوسط الجلوكوز العالي (HG) مع 42.5 متر مربع. تم زراعة THBMECs في قارورة مختلفة لاستزراع الخلايا: واحدة في وسط الجلوكوز العادي (NG) والأخرى في متوسط الجلوكوز العالي (HG). كما تم استخدام هذين الوسائط المختلفة لنمو BBB على المرشحات في 12 لوحة بئر. خدم الخلايا المزروعة في وسط NG كتحكم. يتم تمثيل المستعمرات التي تم الحصول عليها كعدد مطلق من المستعمرات(الشكل 4C)أو العدد النسبي للمستعمرات التي تم تطبيعها إلى السيطرة(الشكل 4D). تشير النتائج إلى عدم وجود تأثير كبير على اجتياز البكتيريا من خلال BBB البشري ، مما أدى إلى استنتاج أن تأثير NG مقابل HG لم يكن شديدًا بما يكفي للتأثير على سلامة BBB. تم تصميم السيناريوهات المختلفة لإثبات النموذج وسلامة الخلايا التي تحاكي BBB.

Figure 4
الشكل 4: الأعداد المطلقة والنسبية للمستعمرات البكتيرية المحسوبة في نموذج BBB مع THBMECs. تم علاج THBMECs مع 0.15 mM GO ل1 ساعة، والخلايا غير المعالجة بمثابة عنصر تحكم. تمت إضافة ما مجموعه 450 ميكرولتر من تعليق الإشريكية القولونية (OD600 = 0.5) إلى كل غرفة علوية. كانت مطلية متوسطة من الغرف السفلية على لوحات أجار بعد 6 ساعة(أ)يظهر الرسم البياني متوسط +/- SEM من المستعمرات المحسوبة. (ب)الرسم البياني يظهر المستعمرات التي تم عدها التي تم تطبيعها إلى الخلايا غير المعالجة كتحكم +/- SEM (n = 4). في(C)و(D)، تم زراعة THBMECs في NG وHG المتوسطة. تمت إضافة ما مجموعه 450 ميكرولتر من تعليق الإشريكية القولونية (OD600 = 0.5) إلى كل غرفة علوية. كانت مطلية متوسطة من الغرفة السفلى على لوحات أجار بعد 6 ساعة(C)يظهر الرسم البياني متوسط +/- SEM من المستعمرات المحسوبة. (D)الرسم البياني يظهر المستعمرات التي تم عدها التي تم تطبيعها إلى الخلايا غير المعالجة كتحكم +/- SEM (n = 3). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

محدودية البصيرة في الإمراض من اجتياز الميكروبات يحد من مزيد من تطوير العلاجات لبود أو التهاب السحايا. وتتطلب الوفيات والمراضة الناجمة عن هذه الأمراض تحسين علاج المرضى، وتتطلب إجراء بحوث بشأن الآليات الأساسية، وتحتاج إلى منصة قوية للفحص المركب. ويمكن دراسة الأحداث المتعددة العوامل مع BMECs الإنسان. وقد أظهرت العديد من إجراءات العزل الناجحة المبلغ عنها من BMECs من عدد من الأنواع فقدان خصائص الخلايا 'التوقيع الجزيئي52،53. تم نقل THBMECs الموصوفة في هذا الإجراء في مقاطع مبكرة جدًا ، حيث أظهرت خصائص محددة للخلايا البُنتمية في الدماغ وحافظت عليها43. وهذا أمر مهم، لأنه لم يتم اكتشاف جميع الخطوات في المسارات المتضررة حتى الآن، ويبدو أن هذا النموذج يحاكي BMECs التقليدية. نموذجنا المقدم يظهر التأثيرات المباشرة على BMECs واجتياز الميكروبات من خلال BBB.

التعامل مع خلايا THBMEC واضحة، والمعدات التقنية المطلوبة موجودة في معظم مختبرات علوم الحياة. يسمح نموذجنا بالبدء الفوري في إجراءات التحقيق بعد أن تقوم المراكز المتعددة الاتصالات بإنشاء طبقة أحادية ضيقة. يمكن أن يكون مجال التطبيقات واسعًا بسبب التركيبات المحتملة بين الاختبارات الجديدة والتجارب التقليدية مثل قياس TEER أو وضع العلامات باستخدام التتبع54. من الممكن أيضًا إضافة الخلايا الفلكية أو البيريسيتات لجعل نموذج الثقافة المشتركة أو الثلاثية. ويمكن أيضا أن يكون تأثير المخدرات على اجتياز الميكروبات اختبارها في نموذجنا عن طريق علاج THBMECs مع مركبات قبل تلقيح الغرفة العليا مع البكتيريا. في الواقع، فمن الممكن لشراء إدراج مع مرشحات للوحات بئر 96 السماح أتمتة الإجراء. وهذا يمكن أن يسهل تنفيذ نظم فحص الأدوية عالية الإنتاجية لتسريع اكتشاف الأدوية ضد الأمراض المذكورة والحد من الآثار الجانبية على BBB أثناء تطوير الدواء.

خطوة حاسمة في الطريقة المقدمة هي وقت الحضانة بعد إضافة البكتيريا إلى الغرفة العليا. من المهم استخدام ساعات كجداول زمنية في البروتوكول ، لأن وقت إنشاء الإشريكية القولونية هو 20 دقيقةفقط 55. وإلا فإن استخدام نقاط زمنية مختلفة يمكن أن يؤدي إلى نتائج مضللة. هناك أيضًا خطر محتمل للتلوث بين الغرفة العلوية والسفلية أثناء التعرض البكتيري إذا لم يتم التعامل مع اللوحات بعناية. أي تعديلات على لوحة بئر 12 في هذه المرحلة يمكن أن تلوث المتوسطة في الغرفة السفلى.

الإشريكية القولونية هو أحد الأسباب المعروفة والشائعة جدًا لالتهاب السحايا البكتيري. يجب إجراء المزيد من التحقيقات لاختبار البكتيريا المختلفة المرتبطة أيضًا بالتهاب السحايا ، مثل التهاب السحايا Neisseria56 أو المكورات العقدية الالتهابية57. ويبدو أن هذه استخدام آليات مختلفة لعبور BBB وتحتاج إلى أن تكون مفهومة بشكل أفضل لعلاج المرضى. في المرضى المسنين ، يزيد معدل الإصابة بـ POD26 بالإضافة إلى عدد المراضات المصاحبة التي تحدث. ومن المعروف أن هناك تفاعلات بين الأمراض المختلفة، وخاصة تلك الجهازية مثل مرض السكري. في نموذجنا ، من الممكن محاكاة تلك الحالات أو علاج الخلايا قبل إضافة البكتيريا.

ويقتصر هذا النموذج من خلال الاتصال المباشر من THBMECs والبكتيريا، والمزيد من البحوث اللازمة للتحقيق في آليات الاتصال المحتملة للكشف عن المسارات والبروتينات المعنية. ومع ذلك ، فمن الممكن لإزالة إدراج وحصاد الخلايا لمزيد من التحليل. وTEER من النموذج هو أقل بالمقارنة مع نماذج الخلايا الجذعية38،39،40. أكدنا ذلك باستخدام تركيز بكتيري لم يعبر BBB في الخلايا غير المعالجة بعد 6 ساعة.

باختصار ، تمثل هذه الطريقة منصة قوية لتحليل اجتياز البكتيريا من خلال BBB مع إمكانية توسيعها لفحوصات الأدوية عالية الإنتاجية.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

وينوه المؤلفان بالدكتورة مريم حسين لعملها السابق على هذا الأسلوب، ومجموعة الدكتور كيرستن دانكر (شاريتيه - يونيفرسيت، برلين) لتوفيرها مراكز التجارة والتنمية وجوليان ويبر لقراءة المخطوطة بشكل نقدي. تم دعم هذه الدراسة من قبل RTK 2155 (ProMoAge).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar - Agar Carl Roth 6494.3 BioScience-Grade
Autoclave Systec VX-150
Bacteria E.coli strain GM2163 Fermentas Life Sciences, Lithuania
Photometer Eppendorf 6131
Cells THBMEC Group of M. F. Stins
Cell culture flasks Greiner Bio-One 658175
Centrifuge Universal 320 Hettrichlab 1401
Collagen IV SIGMA Aldrich C6745 from human cell culture
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% Invitrogen C10311
Culture tubes Greiner Bio-One 191180
Cuvettes BRAND 759015
Di sodium hydrogen phosphate di hydrate MERCK 1065800500
DMEM/F-12 GIBCO/ Thermo Sc. 11330032 HEPES
Falcon tubes 15 ml Greiner Bio-One 188271
Falcon tubes 50 ml Greiner Bio-One 227261
Fetal Bovine Serum GIBCO/ Thermo Sc. 10270 value FBS -Brazil
Fibronectin SIGMA Aldrich F0556 solution human fibroblasts
Heracell 150 CO2 Incubator Heraeus 50116047
Incubator shaker I 26 New Brunswick Eppendorf M1324-0000
Inoculation loop Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel 641000
LB Broth Base GIBCO/ Thermo Sc. 12780029
L-Glutamine GIBCO/ Thermo Sc. 25030-081
Microbial incubator B 6200 Heraeus 51015192
Microbiological Safety Cabinet AURA 2000 M.A.C. Class II BIOAIR 12469
Microscope inverse Zeiss TELAVAL 31
Micro tubes 2 ml Sarstedt 72,695,400
Micro tubes 1,5 ml Sarstedt 72,706,400
Penicillin / Streptomycin GIBCO/ Thermo Sc. 15140122
Petri dish Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel 464-800
Potassium chloride Roth HN02.3
Potassium-di-hydrogen phosphate Roth P018.2
Sodium chloride Roth 9265.2
ThinCerts + Multiwell Plates Greiner Bio-One 665631 12 well, pore size 3.0 µm
Trypsin - EDTA GIBCO/ Thermo Sc. 15400054
Vacuumpump Laboport KNF N 86 KT.18

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldmann, E. E. Vitalfärbung am Zentralnervensystem: Beitrag z. Physio-Pathologie d Plexus chorioideus ud Hirnhäute. (1913).
  2. Reese, T. S., Karnovsky, M. J. Fine structural localization of a blood-brain barrier to exogenous peroxidase. Journal of Cell Biology. 34, (1), 207-217 (1967).
  3. Risau, W., Dingler, A., Albrecht, U., Dehouck, M. P., Cecchelli, R. Blood-brain barrier pericytes are the main source of gamma-glutamyltranspeptidase activity in brain capillaries. Journal of Neurochemistry. 58, (2), 667-672 (1992).
  4. Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40, (3), 648-677 (1969).
  5. Coomber, B. L., Stewart, P. A. Morphometric analysis of CNS microvascular endothelium. Microvascular Research. 30, (1), 99-115 (1985).
  6. Tilling, T., Korte, D., Hoheisel, D., Galla, H. J. Basement membrane proteins influence brain capillary endothelial barrier function in vitro. Journal of Neurochemistry. 71, (3), 1151-1157 (1998).
  7. Morris, A. W., et al. Vascular basement membranes as pathways for the passage of fluid into and out of the brain. Acta Neuropathologica. 131, (5), 725-736 (2016).
  8. Betz, A. L., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: neutral amino acid transport into isolated brain capillaries. Science. 202, (4364), 225-227 (1978).
  9. Butt, A. M., Jones, H. C., Abbott, N. J. Electrical resistance across the blood-brain barrier in anaesthetized rats: a developmental study. Journal of Physiology. 429, 47-62 (1990).
  10. Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. Journal of Neurochemistry. 97, (4), 922-933 (2006).
  11. O'Carroll, S. J., et al. Pro-inflammatory TNFalpha and IL-1beta differentially regulate the inflammatory phenotype of brain microvascular endothelial cells. Journal of Neuroinflammation. 12, (131), (2015).
  12. Simi, A., Tsakiri, N., Wang, P., Rothwell, N. J. Interleukin-1 and inflammatory neurodegeneration. Biochemical Society Transactions. 35, (Pt 5), 1122-1126 (2007).
  13. Janzer, R. C., Raff, M. C. Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells. Nature. 325, (6101), 253-257 (1987).
  14. Tao-Cheng, J. H., Nagy, Z., Brightman, M. W. Tight junctions of brain endothelium in vitro are enhanced by astroglia. Journal of Neuroscience. 7, (10), 3293-3299 (1987).
  15. Utsumi, H., et al. Expression of GFRalpha-1, receptor for GDNF, in rat brain capillary during postnatal development of the BBB. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 279, (2), (2000).
  16. Tran, N. D., Correale, J., Schreiber, S. S., Fisher, M. Transforming growth factor-beta mediates astrocyte-specific regulation of brain endothelial anticoagulant factors. Stroke. 30, (8), 1671-1678 (1999).
  17. Balabanov, R., Washington, R., Wagnerova, J., Dore-Duffy, P. CNS microvascular pericytes express macrophage-like function, cell surface integrin alpha M, and macrophage marker ED-2. Microvascular Research. 52, (2), 127-142 (1996).
  18. Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes. Faseb Journal. 16, (10), 1274-1276 (2002).
  19. Lindahl, P., Johansson, B. R., Leveen, P., Betsholtz, C. Pericyte loss and microaneurysm formation in PDGF-B-deficient mice. Science. 277, (5323), 242-245 (1997).
  20. Young, G. B., Bolton, C. F., Archibald, Y. M., Austin, T. W., Wells, G. A. The electroencephalogram in sepsis-associated encephalopathy. Journal of Clinical Neurophysiology. 9, (1), 145-152 (1992).
  21. Carlyle Clawson, C., Francis Hartmann, J., Vernier, R. L. Electron microscopy of the effect of gram-negative endotoxin on the blood-brain barrier. Journal of Comparative Neurology. 127, (2), 183-197 (1966).
  22. Jeppsson, B., et al. Blood-brain barrier derangement in sepsis: cause of septic encephalopathy? The American Journal of Surgery. 141, (1), 136-142 (1981).
  23. Tighe, D., Moss, R., Bennett, D. Cell surface adrenergic receptor stimulation modifies the endothelial response to SIRS. Systemic Inflammatory Response Syndrome. New Horizons (Baltimore, Md). 4, (4), 426-442 (1996).
  24. Kim, K. S., et al. The K1 capsule is the critical determinant in the development of Escherichia coli meningitis in the rat. Journal of Clinical Investigation. 90, (3), 897-905 (1992).
  25. Kim, K. S., Wass, C. A., Cross, A. S. Blood-brain barrier permeability during the development of experimental bacterial meningitis in the rat. Experimental Neurology. 145, (1), 253-257 (1997).
  26. Arshi, A., et al. Predictors and Sequelae of Postoperative Delirium in Geriatric Hip Fracture Patients. Geriatric Orthopaedic Surgery and Rehabililation. 9, 2151459318814823 (2018).
  27. Smulter, N., Lingehall, H. C., Gustafson, Y., Olofsson, B., Engstrom, K. G. Delirium after cardiac surgery: incidence and risk factors. Interactive CardioVascular and Thoracic Surgery. 17, (5), (2013).
  28. Kratz, T., Heinrich, M., Schlauss, E., Diefenbacher, A. Preventing postoperative delirium. Deutsches Arzteblatt International. 112, (17), 289-296 (2015).
  29. Uchida, Y., et al. Quantitative targeted absolute proteomics of human blood-brain barrier transporters and receptors. Journal of Neurochemistry. 117, (2), 333-345 (2011).
  30. Warren, M. S., et al. Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human. Pharmacology Research. 59, (6), 404-413 (2009).
  31. Omidi, Y., et al. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Research. 990, (1-2), 95-112 (2003).
  32. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31, (1), 315-327 (2011).
  33. Burek, M., Salvador, E., Forster, C. Y. Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model. Journal of Visualized Experiments. (66), e4022 (2012).
  34. Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmacolgy. 10, (1), 289-296 (2013).
  35. Urich, E., Lazic, S. E., Molnos, J., Wells, I., Freskgard, P. O. Transcriptional profiling of human brain endothelial cells reveals key properties crucial for predictive in vitro blood-brain barrier models. PLoS One. 7, (5), e38149 (2012).
  36. Lopez-Ramirez, M. A., et al. Cytokine-induced changes in the gene expression profile of a human cerebral microvascular endothelial cell-line, hCMEC/D3. Fluid Barrier CNS. 10, (27), (2013).
  37. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow Metabolism. 28, (2), 312-328 (2008).
  38. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30, (8), 783-791 (2012).
  39. Boyer-Di Ponio, J., et al. Instruction of circulating endothelial progenitors in vitro towards specialized blood-brain barrier and arterial phenotypes. PLoS One. 9, (1), e84179 (2014).
  40. Cecchelli, R., et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 9, (6), e99733 (2014).
  41. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Science Reports. 4, 4160 (2014).
  42. Lim, R. G., et al. Huntington's Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19, (7), 1365-1377 (2017).
  43. Stins, M. F., Badger, J., Sik Kim, K. Bacterial invasion and transcytosis in transfected human brain microvascular endothelial cells. Microbiological Pathogens. 30, (1), 19-28 (2001).
  44. Gaschignard, J., et al. Neonatal Bacterial Meningitis: 444 Cases in 7 Years. Pediatric Infectious Disease Journal. 30, (3), 212-217 (2011).
  45. Hussain, M. The Effect of Glycation on the Permeability of an in vitro Blood-brain Barrier Model. University Halle-Wittenberg. (2015).
  46. Weber, V. The effect of glycation on the permeability of human blood-brain barrier. University Halle-Wittenberg. (2019).
  47. Hussain, M., et al. Novel insights in the dysfunction of human blood-brain barrier after glycation. Mechanism of Ageing Development. 155, 48-54 (2016).
  48. Choi, C. Bacterial meningitis in aging adults. Clinical Infectious Disease. 33, (8), 1380-1385 (2001).
  49. Furth, A. J. Glycated proteins in diabetes. British Journal of Biomedical Science. 54, (3), 192-200 (1997).
  50. Sajithlal, G. B., Chithra, P., Chandrakasan, G. Advanced glycation end products induce crosslinking of collagen in vitro. Biochimica and Biophysica Acta. 1407, (3), 215-224 (1998).
  51. Ray, R., Juranek, J. K., Rai, V. RAGE axis in neuroinflammation, neurodegeneration and its emerging role in the pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis. Neuroscience and Biobehavior Reviews. 62, 48-55 (2016).
  52. DeBault, L. E., Cancilla, P. A. Gamma-Glutamyl transpeptidase in isolated brain endothelial cells: induction by glial cells in vitro. Science. 207, (4431), 653-655 (1980).
  53. Diglio, C. A., Grammas, P., Giacomelli, F., Wiener, J. Primary culture of rat cerebral microvascular endothelial cells. Isolation, growth, and characterization. Laboratory Investigation. 46, (6), 554-563 (1982).
  54. Buchert, M., Turksen, K., Hollande, F. Methods to examine tight junction physiology in cancer stem cells: TEER, paracellular permeability, and dilution potential measurements. Stem Cell Reviews. 8, (3), 1030-1034 (2012).
  55. Gibson, B., Wilson, D. J., Feil, E., Eyre-Walker, A. The distribution of bacterial doubling times in the wild. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 285, (1880), (2018).
  56. Pron, B., et al. Interaction of Neisseria maningitidis with the components of the blood-brain barrier correlates with an increased expression of PilC. Journal of Infectious Diseases. 176, (5), 1285-1292 (1997).
  57. Iovino, F., Orihuela, C. J., Moorlag, H. E., Molema, G., Bijlsma, J. J. Interactions between blood-borne Streptococcus pneumoniae and the blood-brain barrier preceding meningitis. PLoS One. 8, (7), e68408 (2013).
تحليل نفاذية حاجز الدم في الدماغ من قبل اجتياز الميكروبات من خلال الخلايا البوائية الدقيقة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weber, V., Bork, K., Horstkorte, R., Olzscha, H. Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (156), e60692, doi:10.3791/60692 (2020).More

Weber, V., Bork, K., Horstkorte, R., Olzscha, H. Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (156), e60692, doi:10.3791/60692 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter