Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Analyse af permeabiliteten af blod-hjernebarrieren ved mikrobielle traversal gennem mikrovaskulære endotelceller

doi: 10.3791/60692 Published: February 14, 2020

Summary

Den menneskelige blod - hjerne barriere selektivt forhindrer indtrængen af hydrofile molekyler og patogener ind i hjernen. Flere patologier, herunder meningitis og postoperativ delirium, er forbundet med en øget gennemtrængelighed af blod - hjerne barrieren. Her beskriver vi en endotelcellekulturmodel for at teste barrierengennemtrængelighed ved mikrobiel traversal.

Abstract

Den menneskelige blod - hjerne barriere (BBB) er karakteriseret ved en meget lav gennemtrængelighed for biomolekyler for at beskytte og regulere stofskiftet i hjernen. Den BBB er hovedsageligt dannet ud af endotelceller indlejret i kollagen IV og fibronectin-rige kælder membraner. Flere patologier skyldes dysfunktion af BBB efterfulgt af mikrobielle traversal, forårsager sygdomme som meningitis. For at teste effekten af flere parametre, herunder forskellige lægemidler og anæstesi, om permeabilitet en BBB vi etableret en ny menneskelig celle kultur model efterligne BBB med menneskelige hjerne mikrovaskulære endotelceller celler. Endotelcellerne dyrkes på kollagen IV og fibronectinbelagte filterenheder indtil sammenløbet og kan derefter behandles med forskellige forbindelser af interesse. For at påvise en mikrobiel traversal, er det øverste kammer med den apiske overflade af endotelceller podet med bakterier. Efter en inkubationsperiode er prøver af det nederste kammer belagt på agarplader, og de opnåede kolonier tælles, hvorved antallet af kolonier korrelerer med BBB's gennemtrængelighed. Endogene cellulære faktorer kan analyseres i denne eksperimentelle set-up for at belyse grundlæggende cellulære mekanismer i endotelceller, der bidrager til BBB. Desuden, denne platform gør det muligt at udføre en skærm for forbindelser, der kan påvirke permeabilitet af endotelceller. Endelig kan bakteriel tværgående studeres og knyttes til forskellige patologier, såsom meningitis. Det kan være muligt at udvide modellen og analysere bakteriernes veje gennem BBB. I denne artikel giver vi en detaljeret protokol over den beskrevne metode til at undersøge BBB's gennemtrængelighed.

Introduction

Den menneskelige BBB er en unik grænse for hjernevæv, der adskiller hjernen fra blodet. Det strengt regulerer passage af større og hydrofile molekyler, blokerer paracellulær diffusion, og fastholder hjernen homøostase. Det beskytter også hjernen mod plasmaudsving, toksiner, mikrober og guider inflammatoriske celler som en del af centralnervesystemets (CNS) immunitet. Siden opdagelsen for et århundrede siden1, mange undersøgelser er blevet gennemført for at forstå strukturen og funktionen af BBB. De komplekse interaktioner mellem celler, proteiner og signaler fra hjerne og blod kræver yderligere undersøgelse og modeller.

Den menneskelige BBB består af tre celletyper: hjernemikrovaskulære endotelceller (BMECs), pericytter og astrocytter2,3. BMECs adskiller sig fra de fleste af de endotelceller i kroppen, idet de besidder et stort antal stramme vejkryds og klæber vejkryds4,lav pinocytotisk aktivitet2,5, og en kontinuerlig kælder membran6,7 til at blokere paracellulære diffusion. Små lipofile molekyler kan diffuse og passere BBB efter deres koncentration gradient; større og hydrofile molekyler kommer ind i eller efterlader kun hjernen gennem polariserede selektive transportsystemer8. Denne forordning resulterer i en høj transendotelelektrisk modstand (TEER) på 1.500-2.000 Ω·cm2 , der er omvendt korreleret med permeabilitet9,10. Selv om BMEC'er bygger en stram barriere, kan de reagere på lokale og perifere signaler11,12. Der er et tæt samspil mellem BMECs og astrocytter13; astrocytendfødderne bygger et lag omkring fartøjerne og fremkalder dannelsen af stramme vejkryds13,14. De er involveret i BBB-modning med forskellige faktorer, herunder omdannelse af vækstfaktor-β (TGF-β)15,16. Desuden spiller pericytter en central rolle i reguleringen af angiogenese17 og forhindre apoptose af endotel i cellulære differentiering18 (figur 1). De er indlejret i kælderen membran og giver strukturel stabilitet af fartøjet væg19.

Figure 1
Figur 1: Den skematiske struktur af blod- og hjernebarrieren. Den unikke struktur af den menneskelige BBB er sammensat af tre forskellige celletyper. Mikrokarlumen er omgivet af endotelceller, som er beriget i snævre vejkryds, og er ikke fenestrated. De er indlejret i kælderen membran, ligesom pericytter. Disse celler er vigtige for den strukturelle stabilitet af beholdervæggen og spiller en rolle i udviklingen af BBB ved siden af astrocytterne. Deres endefødder bygge et tæt lag omkring fartøjet og støtte bygningen af stramme vejkryds. Alle komponenter i BBB er vigtige for fysiologiske funktionalitet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Mange forskellige patologier er relateret til sammenbruddet af BBB (f.eks septisk encefalopati). De berørte patienter har øget proteinindholdet i cerebrospinalvæsken20, og hjernen parenkym i de berørte gnavere viser en øget optagelse af markant kolloid jernoxid og aminosyrer21,22. Disse resultater peger i retning af en øget permeabilitet af BBB , der opstår sammen med en øget pinocytose i BcMECs21 og endotelaktivering23. En anden associeret patologi relateret til en ændret BBB er meningitis, en medicinsk nødsituation og en kompleks betændelse ledsaget af cerebralødem, der kan føre til neuronal celledød. Det primære indsejlingssted for cirkulerende bakterier formodes at være mikrokarerne24; BBB forhindrer dog, at bakterier kommer i brug. BBB's permeabilitet er ikke altid forbundet med en stigning i eksperimentel hæmatogen meningitis25, og mekanismerne kan være multifaktorielle. Tilfældighed af sepsis med postoperative delirium (POD)26 og foreningen med præoperative infektioner27,28 angiver behovet for en BBB model, der gør det muligt for direkte eksponering for bakterier for at få en bedre forståelse i bakteriel patogenese.

Der er mange huller i forståelsen og kvantificeringen af den mikrobielle traversal gennem BBB. Derfor har vi udviklet en model, der giver mulighed for en bekvem test af forskellige faktorer og betingelser med en direkte sammenhæng mellem bakteriel tværgående og påvirkninger på gennemtrængelighed en BBB. Tidligere arbejde fokuserede på paracellulær permeabilitet og omfattede TEER-måling og sporstofflux. Desuden blev makromolekyletransport analyseret af konjugerede molekyler eller antistoffer, hvorved der kun blev udviklet forskellige modeller, der kun anvender endotelceller eller kombinationer med astrocytter og pericytter. På grund af vanskelighederne med at opnå humant væv på regelmæssig basis, mange dyrebaserede modeller anvendes. Hjerneendotelceller af kvæg- og svineoprindelse danner stramme monolag med en høj TEER, der danner velformet apitisk-basal polaritet og er velegnede til undersøgelser af små molekyletransport gennem BBB. Proteinerne adskiller sig i rækkefølge fra deres menneskelige homologer29,30, hvilket gør undersøgelse af terapeutiske antistoffer vanskelig. Af denne grund, murine eller menneskelige kultur modeller kan være at foretrække. Mus eller rotter som prøve kilder har den fordel, at blive opnået fra velkarakteriserede arter, men giver få celler til studieformål. Dette kan omgås ved brug af udødeliggjort mus hjerne endotel (END) cellelinjer bEND.3, bEND.5 eller cEND31,32,33.

Primære dyrkede celler fra humant væv er vanskelige at opnå og håndtere regelmæssigt. Derfor er de fleste menneskelige cellulære modeller, der anvendes i forskning undersøger den menneskelige BBB udødeliggjort endotelcellelinjer. En offentliggjort cellelinje er human cerebral mikrovaskulære endotelcellelinje hCMEC/D3, som er velegnet til at studere narkotikaoptagelse og er let at håndtere. Cellerne bygger et monolag og udtrykker bBB34'skarakteristiske stramme krydsproteiner , mens ekspressionsniveauet for claudin-5 formodes at være lavere end i intakte mikrokar35 , og mange specifikke transportører er blevet påvist på udskriftsniveau36 samt i proteomiske undersøgelser34. En relativt lav TEER i intervallet 30-50 Ω·cm2 er stadig en udfordring37. En anden kilde til hjerneendotelceller er humane pluripotente stamceller (HPSC'er)38 og menneskelige navlestrengsblod-afledte stamceller fra cirkulerende endotelafomiog hæmatopoietiske slægter39,40. Begge differentieringsprotokoller resulterer i stramme cellemonolag og høje TEER-værdier (f.eks. 1.450 Ω·cm2 i co-kulturer)38. Disse stamcellemodeller kræver ekstrem pleje til dyrkning, men giver mulighed for at undersøge virkningen af regulering af hormoner41 eller sygdomme med genetisk baggrund42 på BBB udvikling.

I denne undersøgelse etablerede vi en udødeliggjort transfunderet human hjerne mikrovaskulær endotelcellelinje, THBMEC43, at efterligne BBB og studere bakteriel traversal. Celler er seedet på et filter og dyrkes til 100% sammenløb i denne celle kultur model. Bakterier er vaccineret i den øverste del af cellekulturkammer. Vi bruger Escherichia coli (E. coli) i vores stikprøveundersøgelse på grund af den høje forekomst af E. coli meningitis44. Det er blevet påvist, at den laveste permeabilitet af cellemonolayer forekommer mellem dag 13 og dag 15 efter såning45. Derfor udføres behandlingen af THBMEC monolaget efter dette tidspunkt, og bakterier vaccineres bagefter i mediet på monolagets apical overflade. Efter en inkubationstid kvantificeres bakterier, der var i stand til at krydse barrieren, via platingsmedium med bakterierne på agarplader og optælling af kolonierne. Et øget antal kolonier korrelerer med højere bakteriel traversal gennem BBB. TEER er omkring 70 Ω·cm246. Det er dog ikke nødvendigt at måle TEER i den beskrevne metode. Selv om det er en veletableret værdi for BBB's gennemtrængelighed, synes det ikke at have nogen indvirkning på bakteriens gennemkørsel gennem BBB. Ubehandlede celler tjener som en kontrol af tæthed i vores model. Det er i tidligere arbejde blevet påvist, at cellerne er i stand til at reagere på proinflammatoriske cytokiner og udtrykke typiske stramme krydsproteiner47. Dette giver mulighed for sammensatte screening og validering af et større sæt transporter substrater og receptorer.

Protocol

1. Forberedelse af buffer- og reagenser

  1. 10x fosfatbuffersaltvand (10x PBS) ved tilsætning af 80 g natriumchlorid (NaCl), 2 g kaliumchlorid (KCl), 14,4 g dinatrium-hydrogen-fosfat-dihydrat (Na2HPO4 · 2H2O) og 2 g kalium-dihydrogen fosfat (KH2PO4)i en 1 L glaskolbe i 1 L dobbelt destilleret H2O. Autoclave 10x PBS opløsning og fortyndet 100 ml af denne opløsning i 900 ml dobbelt destilleret vand for at få 1x PBS.
    1. Brug autoklaven til at sterilisere opløsninger. Sæt glaskolben i kurven, luk låget og steriliser den i 15 min ved 121 °C og 98,9 kPa.
      BEMÆRK: Denne protokol bruges altid til autoklaveringløsninger i yderligere trin.
  2. Der fremstilles en opløsning på 10 μg/ml kollagen IV og 10 μg/mL fibronectin ved at fortynde 0,5 mg/mL fibronectinopløsning og opløsningen på 0,3 mg/mL kollagen IV hver med 1x PBS til 100 mg/μL aliquoter i 1,5 ml mikrorør. Derefter blandes 100 μL af begge aliquoter med 1.800 μL 1x PBS i 2 ml mikrorør og opbevares ved -20 °C.
  3. DMEM/F-12 medium klargør ved tilsætning af 4% føtal kvægserum og 2 mM L-glutamin og 100 mg/L penicillin/streptomycin til mediet og opbevares ved 4 °C.
  4. Forbered 1x trypsin-EDTA løsning ved at fortynde 5 ml af den 10x koncentrerede trypsin-EDTA opløsning med 45 ml 1x PBS i et 50 ml rør og opbevar den ved 4 °C.
  5. Forbered 500 ml LB medium ved vejning 10 g LB bouillon base i en 500 ml glaskolbe. Tilsæt 500 ml steriliseret vand og autoklave det.
  6. Forbered LB agar ved vejning 10 g LB bouillon base og 7,5 g agar-agar i en 500 ml glaskolbe. Tilsæt 500 ml steriliseret vand før autoklavering, og kolben må ikke lukkes. Autoklave og lad opløsningen køle af, indtil den er varm at røre ved.
  7. Der fremstilles antibiotikafrit medium ved at tilsætte 4 % føtal kvægserum og 2 mM L-glutamin, men ingen penicillin/streptomycin til DMEM/F-12-mediet og opbevar det ved 4 °C som i trin 1.3.

2. Vækst af blod - hjerne Barrier efterligne celler

  1. For at samle de 12 brøndplade, sætte cellekultur skær i brøndene (Figur 2A).
    1. Pak pladen ud og hver indsats i et biologisk sikkerhedsskab og udfør yderligere trin der. Brug steriliserede pincet til at få fat i indsatsen på sin brede base for at flytte den.
  2. Læg den porøse membran i hvert skær med 90 μL 10 μg/ml kollagen IV og 10 μg/mL fibronectin blanding. Inkuber 12 brøndpladen for 24 timer ved 37 °C i en cellekulturkuvøse (figur 2B).
  3. Skærne vaskes to gange ved at pipettere 1 ml 1 x PBS i hvert skær og aspirere opløsningen med en vakuumpumpe til cellekulturer.
  4. Membranerne udjævnser ved at pibe 0,5 ml forvarmet DMEM/F-12 medium i over- og 1,5 ml i underkammeret. Inkuberpladen i 30 min ved 37 °C i en cellekulturkuvøse med 5% CO2-atmosfære (figur 2C).
  5. Frø 2 x 105 humane mikrovaskulære endotelceller i hvert øvre kammer og inkuberer de 12 brøndpladen ved 37 °C i en cellekulturkuvøse (figur 2D).
    1. Aspirere mediet fra cellekulturkolben ved hjælp af en vakuumpumpe til cellekulturer og vask monolaget ved at pipettere 10 ml 1x PBS og derefter indsugning af opløsningen med en vakuumpumpe.
    2. Dæk cellerne helt med 1x koncentreret trypsin-EDTA ved at pipettere 5 ml af opløsningen i cellekulturkolben. Kolben inkuberes i 3-5 min ved 37 °C i en cellekulturkuvøse.
      BEMÆRK: Hvis cellerne ikke adskilles, skal du trykke på kolben mod håndfladen for at løsne cellerne.
    3. Tag 5 ml med en pipette som en aliquot fra celleaffjedringen i et 15 ml rør og tilsæt 5 ml af fcs-holdige medium for at stoppe enzymatisk reaktion.
    4. Centrifugeringen centrifugeres i 3 min ved 210 x g,fjern supernatantet med en vakuumpumpe, og pelleten skal suspenderes igen i 5 ml medium med en pipette.
    5. Brug celletælleren ved at blande 10 μL af celleaffjedringen med 10 μL 0,4% trypan blå plet i et 1,5 ml mikrorør. Tilsæt 10 μL af blandingen i et tællekammerdias, sæt den i celletælleren, og begynd at tælle.
      1. Fokuser tælleren på cellerne, så deres kant er mørkeblå og den midterste hvide. Derefter skal du starte det relevante program for celletælling.
    6. For at beregne volumenet for hvert skær skal de opnåede 2 x 105 celler fordeles pr. skær med den beregnede koncentration af cellesuspensionen.

3. Dyrkning af blod -hjerne Barrier Model

  1. Inkuber 12 brøndpladen i 14 dage ved 37 °C.
  2. Skift 0,5 ml medium for det øverste kammer og 1,5 ml medium for den nederste hver 2-3 dage. Varm mediet, før du lægger det i cellekolben. Aspirer med vakuumpumpen (Figur 2E).
    BEMÆRK: Arbejd forsigtigt for at undgå at røre ved membranen.
  3. Kontroller cellernes status ved at billeddanne dem med et mikroskop og bestemme sammenløbet. Sørg for, at sammenløbet er 100% efter 14 dage.

4. Forberedelse af bakterier

  1. En dag før måling, sætte en koloni af E. coli stamme GM2163 i LB medium. Inkubere kulturrøret i 24 timer ved 37 °C med 180 omdrejninger i en inkubationsshaker (figur 2F).
    1. Dyrke E. coli belastning på en LB agar plade ved 4 °C. Tag en koloni med en steriliseret pick og sætte pick i den forberedte kultur rør med 3 ml LB medium.
    2. Forbered en LB agar plade til hvert skær med varm LB agar løsning og fyld Petri retter til halvdelen af deres samlede volumen. Lad dem blive faste og opbevar dem ved 4 °C.

5. Behandling af celler

  1. På dag 14 efter såning, behandle celler med forbindelser eller måle den transendotel elektriske modstand (TEER), hvis det er planlagt (Figur 2G).
    BEMÆRK: Hav altid nogle ubehandlede celler som kontrolelement.
    1. Til behandling af celler med renters sammensætning udvandes forbindelsen til den endelige koncentration i DMEM/F-12 medium. Tilsæt 0,5 ml af denne blanding i det øverste kammer og 1,5 ml i underkammeret. Inkuberpladen i en cellekulturkuvøse for den ønskede tid.
  2. Derefter udskiftes hele mediet med antibiotikafrit medium ved at indsugning med vakuumpumpen og pipetteringen (figur 2H).

6. Måling af permeabilitet

  1. For at få konstante koncentrationer af bakterier, måle den optiske tæthed med et fotometer på en bølgelængde på 600 nm. Den overnattende opløsning af bakterier med LB-medium i et 50 ml falcon rør til en OD600 på 0,5 ± 0,05. Arbejde på is.
    1. Fyld 1 ml LB-medium i en cuvette. Start fotometeret og sæt cuvetten i, markeret side fremad. Tryk på bunden "Blank" for at måle den tomme værdi bagefter.
    2. Mål tætheden af bakterieopløsningen ved at fylde den i en cuvette, sætte den i, og trykke på den nederste prøve. Målingen gentages under fortyndingen, indtil den endelige koncentration opnås.
  2. Arbejd i et biologisk sikkerhedsskab, hvor bakterier kan håndteres med den forberedte 12 brøndplade og bakterieopløsning ved OD600 = 0,5. Der tilsættes 450 μL bakterieopløsning kun i hvert øvre kammer, der indeholder 0,5 ml medium (figur 2I).
  3. Inkuber 12 brøndpladen i 6 timer ved 37 °C i en kuvøse.
    BEMÆRK: Protokollen dikterer at holde pause her.
  4. Prøve 50 μL af mediet med en pipette fra hvert underkammer ved at fjerne indsatsen med pincet (figur 2J). Pas på ikke at spilde mediet fra de øverste kamre til de lavere.
  5. Hver prøve pladen på en separat agarplade (figur 2K). Slip prøven på pladen og stribe ud opløsningen med en celle sprederen.
  6. Inkuber agarpladerne for 24 timer ved 37 °C i en kuvøse.
  7. Tæl kolonierne i hver plade (figur 2L).

7. Analyse af data

  1. Data i en tabel og beregne gennemsnits- og standardafvigelsen for de observerede kolonier af behandlede og ubehandlede celler.
  2. Vis gennemsnittet som det absolutte antal kolonier.
    1. For at normalisere resultaterne skal du beregne det relative antal kolonier ved at dividere alle resultater med kontrolværdien.

Figure 2
Figur 2: Detaljeret præsentation af de enkelte trin i protokollen. (A) Sæt skærmed steriliserede pincet i 12 brøndpladen. B) Coat hver indsats med 90 μL fibronectin og kollagen IV blanding og inkubator i 24 h. (C) Ligevægt membranerne med forvarmet medium i 30 min. (D) Frø 2 x 105 menneskelige hjerne mikrovaskulære endotelceller pr indsætte. E) Opkog pladen i det passende tidsrum. F) En dag før måling, sætte en E. coli koloni i en LB medium kultur rør og inkubator for 24 h. (G) Behandle celler eller måle TEER. (H) Børst komplet medium med antibiotika-fri medium. I) Tilsættes 450 μL bakterieopløsning (OD600 = 0,5) i hvert overkammer og inkubator i 6 timer(J)Prøve 50 μL medium fra hvert underkammer, der fjerner skær med pincet. (K) Plade prøven på agar plader og inkubere for 24 h. (L) Tæl kolonierne og analysere data. Klik her for at se en større version af denne figur.

   

Representative Results

Efter protokollen blev cellerne seedet, og BBB-modellen blev bygget. På dag 14 efter såning blev cellerne behandlet med glyoxal som en reaktiv aldehyd. Formålet med forsøget var at undersøge sammenhængen mellem alder og diabetes i POD27 og den høje forekomst af meningitis hos ældre patienter48. De forhøjede niveauer af avancerede glykeringsslutprodukter (AB'er) i både alder og diabetes49 kræver yderligere undersøgelse af virkningen af glykning i patogenesen af mikrobielle traversal gennem BBB. Glykning er en ikke-enzymatisk reaktion fra frie aminogrupper i proteiner med carbonylgrupper, der reducerer kulhydrater eller andre karbonylforbindelser. Glukose er kendt som donor af carbonyl grupper; Der er dog mere reaktive dem kendt. Efter at have opbygget en ustabil Schiffbase omarrangerer de til mere stabile og reaktive dicarbonylforbindelser som glyoxal. Age, de endelige produkter, kan forårsage krydsforbindelser mellem proteiner50. De kan beskadige cellulære strukturer og ændre cellulære funktion ved interaktion med receptoren af AGEs (RAGE)51.

Celler blev behandlet med en 0,05 og 0,15 m glyoxal (GO) opløsning i 1 time, og ubehandlede celler tjente som en kontrol. Glykning blev påvist via immunblottning og påvisning med et anti-AGE antistof (figur 3). De opnåede bakteriekolonier blev talt og repræsenteret som det absolutte antal kolonier (figur 4A) eller det relative antal kolonier, der blev normaliseret til kontrollen (figur 4B). Mediet taget fra brønde med de ubehandlede celler dannede meget få kolonier. Dette resultat viste, at de ubehandlede celler var i stand til at opbygge en barriere og kunne tjene som kontrol. Prøver behandlet med glyoxal viste et øget antal kolonier, hvilket førte til den konklusion, at der er en effekt af glyoxal på THBMECs og cellulær barrieretæthed, fordi antallet af kolonier viste en betydelig forskel mellem ubehandlede og behandlede celler. Den øgede bakteriekrydsning af barrieren efter behandlingen med glyoxal kan forklare, hvorfor diabetes er korreleret med sygdomme med en BBB opdeling.

Figure 3
Figur 3: Påvisning af proteinlyklykning via immunblotting. THBMECs blev behandlet med GO i forskellige koncentrationer i 1 time. Det samlede protein blev isoleret og adskilt ved hjælp af SDS-PAGE. Glykning af proteinerne blev påvist via immunblotting ved hjælp af anti-AGE-antistof (CML-26). Klik her for at se en større version af denne figur.

I en anden indstilling, protein glykning af THBMECs blev induceret af glukose. Steriliseret glukose blev tilsat DMEM/F-12 medium for at øge glukosekoncentrationen fra normalt glukosemedium (NG) med 17,5 mM til høj glukosemedium (HG) med 42,5 mM. THBMECs blev dyrket i to forskellige celledyrkningskolber: det ene i det normale glukosemedium (NG) og det andet inden for højglukosemedium (HG). Disse to forskellige medier blev også brugt til vækst af BBB på filtre i 12 brøndplader. Celler dyrket i NG medium tjente som en kontrol. De opnåede kolonier er repræsenteret som det absolutte antal kolonier (figur 4C) eller det relative antal kolonier, der normaliseres til kontrollen (figur 4D). Resultaterne tyder ikke på nogen signifikant indvirkning på krydsningen af bakterier gennem den menneskelige BBB, hvilket førte til den konklusion, at virkningen af NG vs HG ikke var alvorlig nok til at påvirke BBB's integritet. De forskellige scenarier var designet til at bevise modellen og integriteten af de celler, der efterligner BBB.

Figure 4
Figur 4: Absolutte og relative antal optalte bakteriekolonier i BBB-modellen med THBMECs. THBMECs blev behandlet med 0,15 mM GO for 1 time, ubehandlede celler tjente som en kontrol. I alt 450 μL E. coli suspension (OD600 = 0,5) blev tilføjet til hvert øvre kammer. Medium fra de nederste kamre blev belagt på agarplader efter 6 h. (A) Grafen viser den gennemsnitlige gennemsnit +/- SEM af tællede kolonier. (B) Grafen viser de optalte kolonier, der normaliseres med de ubehandlede celler som kontrol +/- SEM (n = 4). I (C) ogd) blev DER dyrket THBMECs i NG- og HG-medium. I alt 450 μL E. coli suspension (OD600 = 0,5) blev tilføjet til hvert øvre kammer. Medium fra det nederste kammer blev belagt på agarplader efter 6 h. (C) Grafen viser den gennemsnitlige gennemsnit +/- SEM af tællede kolonier. (D) Grafen viser de optalte kolonier, der normaliseres med de ubehandlede celler som kontrol +/- SEM (n = 3). Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Begrænset indsigt i patogenesen af mikrobielle traversal grænser yderligere udvikling af behandlinger for POD eller meningitis. Dødeligheden og sygeligheden af disse sygdomme kræver bedre patientbehandling, kræver forskning i de underliggende mekanismer og har brug for en robust platform for sammensat screening. De multifaktorielle hændelser kan studeres med humane BMECs. Flere vellykkede rapporterede isolationsprocedurer for BMEC'er fra en række arter har vist tab af cellernes karakteristiske molekylære signatur52,53. De beskrevne THBMECs i denne procedure blev transfunderet i meget tidlige passager, hvor de udviste specifikke hjerneendotelcelleegenskaber og bevarede dem43. Dette er vigtigt, fordi ikke alle trin i de berørte veje er blevet opdaget hidtil, og denne model synes at efterligne konventionelle BMECs. Vores præsenterede model viser direkte indflydelse på BMECs og den mikrobielle traversal gennem BBB.

Håndteringen af THBMEC-celler er ligetil, og det nødvendige tekniske udstyr findes i de fleste life science laboratorier. Vores model giver mulighed for en øjeblikkelig start på efterforskningsprocedurer efter THBMECs har bygget en stram monolayer. Anvendelsesfeltet kan være omfattende på grund af de mulige kombinationer mellem nye test og konventionelle analyser såsom TEER-måling eller mærkning med sporstoffer54. Det er også muligt at tilføje astrocytter eller pericytter for at lave en co- eller triple-kultur model. Narkotikaens indflydelse på det mikrobielle traversal kunne også testes i vores model ved at behandle THBMECs med forbindelser, før det tilinossere det øverste kammer med bakterier. Faktisk er det muligt at købe skær med filtre til 96 brøndplader, der gør det muligt at automatisering af proceduren. Dette kan lette gennemførelsen af høj-throughput narkotika screening systemer til at fremskynde opdagelsen af lægemidler mod de nævnte sygdomme og for at reducere bivirkninger på BBB under udviklingen af lægemidler.

Et kritisk skridt i den præsenterede metode er inkubationstiden efter tilsætning af bakterierne til det øverste kammer. Det er vigtigt at bruge timer som tidslinjer i protokollen, fordi generationen tid af E. coli er kun 20 min55. Ellers kan brugen af forskellige tidspunkter føre til vildledende resultater. Der er også en mulig risiko for kontaminering mellem øvre og nedre kammer under bakterieeksponeringen, hvis pladerne ikke håndteres med forsigtighed. Eventuelle ændringer af de 12 brøndplade på dette punkt kunne forurene mediet i underkammeret.

E. coli er en velkendt, meget almindelig årsag til bakteriel meningitis. Yderligere undersøgelser bør teste forskellige bakterier, der også er forbundet med meningitis, såsom Neisseria meningitidis56 eller Streptococcus pneumoniae57. Disse synes at bruge forskellige mekanismer til at krydse BBB og skal forstås bedre til behandling af patienter. Hos ældre patienter, forekomsten for POD stiger26 samt antallet af forekommende comorbiditeter. Det er kendt, at der er interaktioner mellem forskellige sygdomme, især systemiske dem som diabetes. I vores model er det muligt at simulere disse betingelser eller behandle cellerne, før de tilføjer bakterierne.

Modellen er begrænset af den direkte kontakt mellem THBMECs og bakterier, og yderligere forskning er nødvendig for at undersøge potentielle kontaktmekanismer for at opdage de involverede veje og proteiner. Det er dog muligt at fjerne skær og høste cellerne til yderligere analyse. Modellens TEER er lavere i forhold til stamcellemodellerne38,39,40. Vi bekræftede dette ved hjælp af en bakteriekoncentration, der ikke krydsede BBB i ubehandlede celler efter 6 timer.

Sammenfattende repræsenterer denne metode en robust platform til at analysere krydsning af bakterier gennem BBB med potentiale til at udvide det til high-throughput drug screeninger.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender Dr. Maryam Hussain for tidligere arbejde på denne metode, gruppen af PD Dr. Kerstin Danker (Charité-Universitätsmedizin, Berlin) for at give THBMECs og Juliane Weber for kritisk at læse manuskriptet. Denne undersøgelse blev støttet af RTK 2155 (ProMoAge).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar - Agar Carl Roth 6494.3 BioScience-Grade
Autoclave Systec VX-150
Bacteria E.coli strain GM2163 Fermentas Life Sciences, Lithuania
Photometer Eppendorf 6131
Cells THBMEC Group of M. F. Stins
Cell culture flasks Greiner Bio-One 658175
Centrifuge Universal 320 Hettrichlab 1401
Collagen IV SIGMA Aldrich C6745 from human cell culture
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% Invitrogen C10311
Culture tubes Greiner Bio-One 191180
Cuvettes BRAND 759015
Di sodium hydrogen phosphate di hydrate MERCK 1065800500
DMEM/F-12 GIBCO/ Thermo Sc. 11330032 HEPES
Falcon tubes 15 ml Greiner Bio-One 188271
Falcon tubes 50 ml Greiner Bio-One 227261
Fetal Bovine Serum GIBCO/ Thermo Sc. 10270 value FBS -Brazil
Fibronectin SIGMA Aldrich F0556 solution human fibroblasts
Heracell 150 CO2 Incubator Heraeus 50116047
Incubator shaker I 26 New Brunswick Eppendorf M1324-0000
Inoculation loop Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel 641000
LB Broth Base GIBCO/ Thermo Sc. 12780029
L-Glutamine GIBCO/ Thermo Sc. 25030-081
Microbial incubator B 6200 Heraeus 51015192
Microbiological Safety Cabinet AURA 2000 M.A.C. Class II BIOAIR 12469
Microscope inverse Zeiss TELAVAL 31
Micro tubes 2 ml Sarstedt 72,695,400
Micro tubes 1,5 ml Sarstedt 72,706,400
Penicillin / Streptomycin GIBCO/ Thermo Sc. 15140122
Petri dish Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel 464-800
Potassium chloride Roth HN02.3
Potassium-di-hydrogen phosphate Roth P018.2
Sodium chloride Roth 9265.2
ThinCerts + Multiwell Plates Greiner Bio-One 665631 12 well, pore size 3.0 µm
Trypsin - EDTA GIBCO/ Thermo Sc. 15400054
Vacuumpump Laboport KNF N 86 KT.18

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldmann, E. E. Vitalfärbung am Zentralnervensystem: Beitrag z. Physio-Pathologie d Plexus chorioideus ud Hirnhäute. (1913).
  2. Reese, T. S., Karnovsky, M. J. Fine structural localization of a blood-brain barrier to exogenous peroxidase. Journal of Cell Biology. 34, (1), 207-217 (1967).
  3. Risau, W., Dingler, A., Albrecht, U., Dehouck, M. P., Cecchelli, R. Blood-brain barrier pericytes are the main source of gamma-glutamyltranspeptidase activity in brain capillaries. Journal of Neurochemistry. 58, (2), 667-672 (1992).
  4. Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40, (3), 648-677 (1969).
  5. Coomber, B. L., Stewart, P. A. Morphometric analysis of CNS microvascular endothelium. Microvascular Research. 30, (1), 99-115 (1985).
  6. Tilling, T., Korte, D., Hoheisel, D., Galla, H. J. Basement membrane proteins influence brain capillary endothelial barrier function in vitro. Journal of Neurochemistry. 71, (3), 1151-1157 (1998).
  7. Morris, A. W., et al. Vascular basement membranes as pathways for the passage of fluid into and out of the brain. Acta Neuropathologica. 131, (5), 725-736 (2016).
  8. Betz, A. L., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: neutral amino acid transport into isolated brain capillaries. Science. 202, (4364), 225-227 (1978).
  9. Butt, A. M., Jones, H. C., Abbott, N. J. Electrical resistance across the blood-brain barrier in anaesthetized rats: a developmental study. Journal of Physiology. 429, 47-62 (1990).
  10. Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. Journal of Neurochemistry. 97, (4), 922-933 (2006).
  11. O'Carroll, S. J., et al. Pro-inflammatory TNFalpha and IL-1beta differentially regulate the inflammatory phenotype of brain microvascular endothelial cells. Journal of Neuroinflammation. 12, (131), (2015).
  12. Simi, A., Tsakiri, N., Wang, P., Rothwell, N. J. Interleukin-1 and inflammatory neurodegeneration. Biochemical Society Transactions. 35, (Pt 5), 1122-1126 (2007).
  13. Janzer, R. C., Raff, M. C. Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells. Nature. 325, (6101), 253-257 (1987).
  14. Tao-Cheng, J. H., Nagy, Z., Brightman, M. W. Tight junctions of brain endothelium in vitro are enhanced by astroglia. Journal of Neuroscience. 7, (10), 3293-3299 (1987).
  15. Utsumi, H., et al. Expression of GFRalpha-1, receptor for GDNF, in rat brain capillary during postnatal development of the BBB. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 279, (2), (2000).
  16. Tran, N. D., Correale, J., Schreiber, S. S., Fisher, M. Transforming growth factor-beta mediates astrocyte-specific regulation of brain endothelial anticoagulant factors. Stroke. 30, (8), 1671-1678 (1999).
  17. Balabanov, R., Washington, R., Wagnerova, J., Dore-Duffy, P. CNS microvascular pericytes express macrophage-like function, cell surface integrin alpha M, and macrophage marker ED-2. Microvascular Research. 52, (2), 127-142 (1996).
  18. Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes. Faseb Journal. 16, (10), 1274-1276 (2002).
  19. Lindahl, P., Johansson, B. R., Leveen, P., Betsholtz, C. Pericyte loss and microaneurysm formation in PDGF-B-deficient mice. Science. 277, (5323), 242-245 (1997).
  20. Young, G. B., Bolton, C. F., Archibald, Y. M., Austin, T. W., Wells, G. A. The electroencephalogram in sepsis-associated encephalopathy. Journal of Clinical Neurophysiology. 9, (1), 145-152 (1992).
  21. Carlyle Clawson, C., Francis Hartmann, J., Vernier, R. L. Electron microscopy of the effect of gram-negative endotoxin on the blood-brain barrier. Journal of Comparative Neurology. 127, (2), 183-197 (1966).
  22. Jeppsson, B., et al. Blood-brain barrier derangement in sepsis: cause of septic encephalopathy? The American Journal of Surgery. 141, (1), 136-142 (1981).
  23. Tighe, D., Moss, R., Bennett, D. Cell surface adrenergic receptor stimulation modifies the endothelial response to SIRS. Systemic Inflammatory Response Syndrome. New Horizons (Baltimore, Md). 4, (4), 426-442 (1996).
  24. Kim, K. S., et al. The K1 capsule is the critical determinant in the development of Escherichia coli meningitis in the rat. Journal of Clinical Investigation. 90, (3), 897-905 (1992).
  25. Kim, K. S., Wass, C. A., Cross, A. S. Blood-brain barrier permeability during the development of experimental bacterial meningitis in the rat. Experimental Neurology. 145, (1), 253-257 (1997).
  26. Arshi, A., et al. Predictors and Sequelae of Postoperative Delirium in Geriatric Hip Fracture Patients. Geriatric Orthopaedic Surgery and Rehabililation. 9, 2151459318814823 (2018).
  27. Smulter, N., Lingehall, H. C., Gustafson, Y., Olofsson, B., Engstrom, K. G. Delirium after cardiac surgery: incidence and risk factors. Interactive CardioVascular and Thoracic Surgery. 17, (5), (2013).
  28. Kratz, T., Heinrich, M., Schlauss, E., Diefenbacher, A. Preventing postoperative delirium. Deutsches Arzteblatt International. 112, (17), 289-296 (2015).
  29. Uchida, Y., et al. Quantitative targeted absolute proteomics of human blood-brain barrier transporters and receptors. Journal of Neurochemistry. 117, (2), 333-345 (2011).
  30. Warren, M. S., et al. Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human. Pharmacology Research. 59, (6), 404-413 (2009).
  31. Omidi, Y., et al. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Research. 990, (1-2), 95-112 (2003).
  32. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31, (1), 315-327 (2011).
  33. Burek, M., Salvador, E., Forster, C. Y. Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model. Journal of Visualized Experiments. (66), e4022 (2012).
  34. Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmacolgy. 10, (1), 289-296 (2013).
  35. Urich, E., Lazic, S. E., Molnos, J., Wells, I., Freskgard, P. O. Transcriptional profiling of human brain endothelial cells reveals key properties crucial for predictive in vitro blood-brain barrier models. PLoS One. 7, (5), e38149 (2012).
  36. Lopez-Ramirez, M. A., et al. Cytokine-induced changes in the gene expression profile of a human cerebral microvascular endothelial cell-line, hCMEC/D3. Fluid Barrier CNS. 10, (27), (2013).
  37. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow Metabolism. 28, (2), 312-328 (2008).
  38. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30, (8), 783-791 (2012).
  39. Boyer-Di Ponio, J., et al. Instruction of circulating endothelial progenitors in vitro towards specialized blood-brain barrier and arterial phenotypes. PLoS One. 9, (1), e84179 (2014).
  40. Cecchelli, R., et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 9, (6), e99733 (2014).
  41. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Science Reports. 4, 4160 (2014).
  42. Lim, R. G., et al. Huntington's Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19, (7), 1365-1377 (2017).
  43. Stins, M. F., Badger, J., Sik Kim, K. Bacterial invasion and transcytosis in transfected human brain microvascular endothelial cells. Microbiological Pathogens. 30, (1), 19-28 (2001).
  44. Gaschignard, J., et al. Neonatal Bacterial Meningitis: 444 Cases in 7 Years. Pediatric Infectious Disease Journal. 30, (3), 212-217 (2011).
  45. Hussain, M. The Effect of Glycation on the Permeability of an in vitro Blood-brain Barrier Model. University Halle-Wittenberg. (2015).
  46. Weber, V. The effect of glycation on the permeability of human blood-brain barrier. University Halle-Wittenberg. (2019).
  47. Hussain, M., et al. Novel insights in the dysfunction of human blood-brain barrier after glycation. Mechanism of Ageing Development. 155, 48-54 (2016).
  48. Choi, C. Bacterial meningitis in aging adults. Clinical Infectious Disease. 33, (8), 1380-1385 (2001).
  49. Furth, A. J. Glycated proteins in diabetes. British Journal of Biomedical Science. 54, (3), 192-200 (1997).
  50. Sajithlal, G. B., Chithra, P., Chandrakasan, G. Advanced glycation end products induce crosslinking of collagen in vitro. Biochimica and Biophysica Acta. 1407, (3), 215-224 (1998).
  51. Ray, R., Juranek, J. K., Rai, V. RAGE axis in neuroinflammation, neurodegeneration and its emerging role in the pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis. Neuroscience and Biobehavior Reviews. 62, 48-55 (2016).
  52. DeBault, L. E., Cancilla, P. A. Gamma-Glutamyl transpeptidase in isolated brain endothelial cells: induction by glial cells in vitro. Science. 207, (4431), 653-655 (1980).
  53. Diglio, C. A., Grammas, P., Giacomelli, F., Wiener, J. Primary culture of rat cerebral microvascular endothelial cells. Isolation, growth, and characterization. Laboratory Investigation. 46, (6), 554-563 (1982).
  54. Buchert, M., Turksen, K., Hollande, F. Methods to examine tight junction physiology in cancer stem cells: TEER, paracellular permeability, and dilution potential measurements. Stem Cell Reviews. 8, (3), 1030-1034 (2012).
  55. Gibson, B., Wilson, D. J., Feil, E., Eyre-Walker, A. The distribution of bacterial doubling times in the wild. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 285, (1880), (2018).
  56. Pron, B., et al. Interaction of Neisseria maningitidis with the components of the blood-brain barrier correlates with an increased expression of PilC. Journal of Infectious Diseases. 176, (5), 1285-1292 (1997).
  57. Iovino, F., Orihuela, C. J., Moorlag, H. E., Molema, G., Bijlsma, J. J. Interactions between blood-borne Streptococcus pneumoniae and the blood-brain barrier preceding meningitis. PLoS One. 8, (7), e68408 (2013).
Analyse af permeabiliteten af blod-hjernebarrieren ved mikrobielle traversal gennem mikrovaskulære endotelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weber, V., Bork, K., Horstkorte, R., Olzscha, H. Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (156), e60692, doi:10.3791/60692 (2020).More

Weber, V., Bork, K., Horstkorte, R., Olzscha, H. Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (156), e60692, doi:10.3791/60692 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter