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Immunology and Infection

माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं के माध्यम से माइक्रोबियल ट्रैवर्सल द्वारा रक्त-मस्तिष्क बाधा की पारगम्यता का विश्लेषण करना

doi: 10.3791/60692 Published: February 14, 2020

Summary

मानव रक्त-मस्तिष्क बाधा चुनिंदा मस्तिष्क में हाइड्रोफिलिक अणुओं और रोगजनकों के प्रवेश को रोकती है। दिमागी प्रतिभा और पश्चात प्रलाप सहित कई विकृतियां, रक्त-मस्तिष्क बाधा की बढ़ी हुई सामर्थ्य से जुड़ी हुई हैं। यहां, हम माइक्रोबियल ट्रैवर्सल द्वारा बाधा पारगम्यता का परीक्षण करने के लिए एक एंडोथेलियल सेल संस्कृति मॉडल का वर्णन करते हैं।

Abstract

मस्तिष्क के चयापचय की रक्षा और विनियमित करने के लिए मानव रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) को जैव अणुओं के लिए बहुत कम सामर्थ्य की विशेषता है। बीबीबी मुख्य रूप से एंडोथेलियल कोशिकाओं से बनता है जो कोलेजन चतुर्थ और फाइब्रोनेक्टिन से भरपूर तहखाने झिल्ली में एम्बेडेड होते हैं। कई विकृतियां बीबीबी की शिथिलता से होती हैं, जिसके बाद माइक्रोबियल ट्रैवर्सल होते हैं, जिससे दिमागी खुजली जैसी बीमारियां होती हैं। बीबीबी की सामर्थ्य पर विभिन्न दवाओं और एनेस्थेटिक्स सहित कई मापदंडों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए हमने मानव मस्तिष्क माइक्रोवेस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ बीबीबी की नकल करने वाला एक उपन्यास मानव कोशिका संस्कृति मॉडल स्थापित किया। एंडोथेलियल कोशिकाओं कोकोलेजन चतुर्थ और फाइब्रोनेक्टिन-लेपित फिल्टर इकाइयों पर संगम तक उगाया जाता है और फिर ब्याज के विभिन्न यौगिकों के साथ इलाज किया जा सकता है। एक माइक्रोबियल ट्रैवर्सल प्रदर्शित करने के लिए, एंडोथेलियल कोशिकाओं की एपिकल सतह के साथ ऊपरी कक्ष बैक्टीरिया के साथ टीका लगाया जाता है। एक ऊष्मायन अवधि के बाद, निचले कक्ष के नमूने आगर प्लेटों पर चढ़ाया जाता है और प्राप्त कॉलोनियों की गणना की जाती है, जिससे कॉलोनियों की संख्या बीबीबी की स्थायित्व के साथ सहसंबंधित होती है। बीबीबी में योगदान देने वाली एंडोथेलियल कोशिकाओं के बुनियादी सेलुलर तंत्र को स्पष्ट करने के लिए इस प्रयोगात्मक सेट-अप में एंडोजेनस सेलुलर कारकों का विश्लेषण किया जा सकता है। इसके अलावा, यह प्लेटफ़ॉर्म यौगिकों के लिए स्क्रीन करने की अनुमति देता है जो एंडोथेलियल कोशिकाओं की स्थायित्व को प्रभावित कर सकता है। अंत में, बैक्टीरियल ट्रैवर्सल का अध्ययन किया जा सकता है और दिमागी खुजली जैसी विभिन्न विकृतियों से जोड़ा जा सकता है। मॉडल का विस्तार करना और बीबीबी के माध्यम से बैक्टीरिया के रास्तों का विश्लेषण करना संभव हो सकता है। इस लेख में, हम बीबीबी की सामर्थ्य की जांच करने के लिए वर्णित विधि का एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

Introduction

मानव बीबीबी मस्तिष्क के ऊतकों की एक अनूठी सीमा है, जो मस्तिष्क को रक्त से अलग करती है। यह बड़े और हाइड्रोफिलिक अणुओं के पारित होने को कड़ाई से नियंत्रित करता है, पैरासेलुलर प्रसार को अवरुद्ध करता है, और मस्तिष्क होमोस्टोसिस को बनाए रखता है। यह मस्तिष्क को प्लाज्मा के उतार-चढ़ाव, विषाक्त पदार्थों, रोगाणुओं से भी बचाता है, और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) प्रतिरक्षा के हिस्से के रूप में भड़काऊ कोशिकाओं को गाइड करता है। 1 सदी पहले अपनी खोजकेबाद से, बीबीबी की संरचना और कार्य को समझने के लिए कई अध्ययन किए गए हैं। कोशिकाओं, प्रोटीन, और मस्तिष्क और रक्त की मांग से संकेतों की जटिल बातचीत अभी भी आगे की जांच और मॉडल ।

मानव बीबीबी तीन कोशिका प्रकारों से बना है: मस्तिष्क माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं (बीएमईसी), पेरिसाइट्स, और एस्ट्रोसाइट्स2,3। बीएमईसी शरीर में एंडोथेलियल कोशिकाओं के बहुमत से अलग है कि उनके पास उच्च संख्या में तंग जंक्शन होते हैं और जंक्शनों4,कम पिनोसाइटोटिक गतिविधि2,5और पैरासेलुलर प्रसार को अवरुद्ध करने के लिए एक निरंतर तहखाने झिल्ली6,7 का पालन करता है। छोटे लिपोफिलिक अणु अपनी एकाग्रता ढाल के बाद बीबीबी को फैला सकते हैं और पारित कर सकते हैं; बड़ा और हाइड्रोफिलिक अणुओं में प्रवेश या केवल ध्रुवीकृत व्यक्त चयनात्मक परिवहन सिस्टम8के माध्यम से मस्तिष्क छोड़ . इस नियमन के परिणामस्वरूप 1,500-2,000 का उच्च ट्रांसेंडोथेलियल इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस (टीईईआर) होता हैω·सेमी2 जो विपरीत पारगम्यता9,10से संबंधित है। हालांकि BMECs एक तंग बाधा का निर्माण, वे स्थानीय और परिधीय संकेतों11, 12पर प्रतिक्रिया कर सकतेहैं। बीएमईसी और एस्ट्रोसाइट्स13के बीच घनिष्ठ बातचीत है ; एस्ट्रोसाइट एंड फीट जहाजों के चारों ओर एक परत का निर्माण और टाइट जंक्शनों13,14के गठन प्रेरित . वे विभिन्न कारकों के साथ बीबीबी परिपक्वता में शामिल हैं, जिसमें विकासकारक-15,16को बदलना शामिल है। इसके अलावा, पेरिकेट्स एंजियोजेनेसिस17 के नियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और सेलुलर विभेदन18 (चित्रा 1)में एंडोथेलियम के एपोप्टोसिस को रोकते हैं। वे तहखाने झिल्ली में एम्बेडेड हैं और पोत की दीवार19की संरचनात्मक स्थिरता प्रदान करते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: रक्त-मस्तिष्क बाधा की योजनाबद्ध संरचना। मानव बीबीबी की अनूठी संरचना तीन अलग-अलग सेल प्रकारों से बनी है। माइक्रोवेसल ल्यूमेन एंडोथेलियल कोशिकाओं से घिरा हुआ है, जो तंग जंक्शनों में समृद्ध होते हैं, और फेनेस्ट्रेटेड नहीं होते हैं। वे पेरिसाइट्स की तरह तहखाने झिल्ली में एम्बेडेड होते हैं। ये कोशिकाएं पोत की दीवार की संरचनात्मक स्थिरता के लिए महत्वपूर्ण हैं और एस्ट्रोसाइट्स के बगल में बीबीबी के विकास में भूमिका निभाती हैं। उनके अंत पैर पोत के चारों ओर एक करीबी परत का निर्माण और तंग जंक्शनों के निर्माण का समर्थन करते हैं । बीबीबी के सभी घटक शारीरिक कार्यक्षमता के लिए महत्वपूर्ण हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

कई अलग-अलग विकृतियां बीबीबी (जैसे, सेप्टिक एंसेफेलोपैथी) के पतन से संबंधित हैं। प्रभावित रोगियों में सेरेब्रोस्पाइनल द्रव20में प्रोटीन का स्तर बढ़ गया है और प्रभावित कृंतकों में मस्तिष्क परेंचिमा चिह्नित कोलॉयडल आयरन ऑक्साइड और अमीनो एसिड21,22के बढ़ते हुए दिखाता है । ये परिणाम बीबीबी की बढ़ती सामर्थ्य की ओर इशारा करते हैं जो बीएमईसी21 और एंडोथेलियल एक्टिवेशन23में वृद्धि के साथ होता है । एक बदल बीबीबी से संबंधित एक और संबद्ध विकृति दिमागी भूमिका, एक चिकित्सा आपात स्थिति और मस्तिष्क एडीमा के साथ एक जटिल सूजन है जो न्यूरोनल सेल मौत का कारण बन सकती है। परिसंचारी बैक्टीरिया की प्राथमिक प्रवेश स्थल को माइक्रोवेसल्स24माना जाता है ; हालांकि बीबीबी बैक्टीरिया के प्रवेश को रोकता है। बीबीबी की स्थायित्व हमेशा प्रयोगात्मक हेमेटोजेनस दिमागी बूटाइटिस25 में वृद्धि से जुड़ा नहीं होता है और तंत्र बहुकारक हो सकता है। पश्चात प्रलाप (पीओडी)26 के साथ सेप्सिस का संयोग और प्रीऑपरेटिव संक्रमण27,28 के साथ सहयोग बीबीबी मॉडल की आवश्यकता को इंगित करता है जो बैक्टीरिया के सीधे संपर्क को बैक्टीरियल रोगजनकता में बेहतर समझ प्राप्त करने में सक्षम बनाता है।

बीबीबी के माध्यम से माइक्रोबियल ट्रैवर्सल को समझने और मात्रा में कई अंतराल हैं। इसलिए, हमने एक मॉडल विकसित किया है जो बैक्टीरियल ट्रैवर्सल और बीबीबी की पारगम्यता पर प्रभावों के बीच सीधा संबंध के साथ विभिन्न कारकों और स्थितियों के सुविधाजनक परीक्षण की अनुमति देता है। पिछला काम पैरासेलुलर पारगम्यता पर केंद्रित था और इसमें टीईआर माप और ट्रेसर फ्लक्स शामिल थे। इसके अलावा, मैक्रोमॉलिक्यूल परिवहन का विश्लेषण संयुग्मित अणुओं या एंटीबॉडी द्वारा किया गया था, जिससे एस्ट्रोसाइट्स और पेरिसाइट्स के साथ केवल एंडोथेलियल कोशिकाओं या संयोजनों का उपयोग करने वाले विभिन्न मॉडल विकसित किए गए थे। नियमित आधार पर मानव ऊतक प्राप्त करने में कठिनाई के कारण, कई पशु आधारित मॉडलका उपयोग किया जाता है। गोजातीय और पोर्सिन मूल की मस्तिष्क एंडोथेलियल कोशिकाएं एक उच्च टीईआर के साथ तंग मोनोलेयर बनाती हैं जो अच्छी तरह से आकार की एपिकल-बेसल ध्रुवता बनाती हैं और बीबीबी के माध्यम से छोटे अणु परिवहन की जांच के लिए अनुकूल होती हैं। प्रोटीन उनके मानव होमोलॉग29,30से अनुक्रम में भिन्न होते हैं, जिससे चिकित्सीय एंटीबॉडी की जांच मुश्किल हो जाती है। इस कारण से, मूत्र या मानव संस्कृति मॉडल बेहतर हो सकते हैं। नमूना स्रोतों के रूप में माउस या चूहों को अच्छी तरह से विशेषता वाली प्रजातियों से प्राप्त होने का लाभ होता है लेकिन अध्ययन उद्देश्यों के लिए कुछ कोशिकाओं की उपज होती है। इसे अमर माउस ब्रेन एंडोथेलियोमा (अंत) सेल लाइनों bEND.3, bEND.5 या CEND31,32,33के उपयोग से दरकिनार किया जा सकता है।

मानव ऊतक से प्राथमिक सुसंस्कृत कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए और एक नियमित आधार पर संभालकरने के लिए मुश्किल कर रहे हैं । इसलिए, मानव बीबीबी की जांच करने वाले अनुसंधान में उपयोग किए जाने वाले अधिकांश मानव सेलुलर मॉडल एंडोथेलियल सेल लाइनों को अमर कर रहे हैं। एक प्रकाशित सेल लाइन मानव मस्तिष्क माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल सेल लाइन hCMEC/D3 है, जो अच्छी तरह से दवा तेज का अध्ययन करने के लिए अनुकूल है और संभालने के लिए आसान है । कोशिकाएं मोनोलेयर बनाती हैं और बीबीबी34के विशिष्ट तंग जंक्शन प्रोटीन को व्यक्त करती हैं, जबकि क्लॉडर्न-5 का अभिव्यक्ति स्तर अक्षुण्ण माइक्रोवेसल्स35 की तुलना में कम बताया गया है और कई विशिष्ट ट्रांसपोर्टरों को ट्रांसक्रिप्ट स्तर36 के साथ - साथ प्रोटेओमिक अध्ययन34में पाया गया है। 30-50 की सीमा में अपेक्षाकृत कम TEERω ·cm2 अभी भी एक चुनौती३७है । मस्तिष्क एंडोथेलियल कोशिकाओं के लिए एक और स्रोत मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSCs)38 और मानव गर्भनाल रक्त से व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं परिसंचारी एंडोथेलियल प्रोजेनिटर और हेमेटोपोइटिक वंश39,40हैं । भेदभाव के दोनों प्रोटोकॉल तंग सेल मोनोलेयर और उच्च TEER मानों में परिणाम (जैसे, सह संस्कृतियों में 1,450ω·cm2) 38. इन स्टेम सेल मॉडल खेती के लिए चरम देखभाल की आवश्यकता है, अभी तक बीबीबी विकास पर आनुवंशिक पृष्ठभूमि४२ के साथ हार्मोन४१ या रोगों को विनियमित करने के प्रभाव का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करते हैं ।

इस अध्ययन में, हमने बीबीबी की नकल करने और बैक्टीरियल ट्रैवर्सल का अध्ययन करने के लिए एक अमर ट्रांससंक्रमित मानव मस्तिष्क माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल सेल लाइन, THBMEC43की स्थापना की। कोशिकाओं को एक फिल्टर पर वरीयता प्राप्त कर रहे है और इस सेल संस्कृति मॉडल में १००% प्रवाह के लिए हो रहे हैं । कोशिका संस्कृति कक्ष के ऊपरी हिस्से में बैक्टीरिया को टीका लगाया जाता है। ई. कोलाई दिमागी पहचान44की उच्च घटनाओं के कारण हम अपने नमूना अध्ययन में एस्चेरिचिया कोलाई (ई कोलाई)का उपयोग करते हैं। यह दर्शाया गया है कि सेल मोनोलेयर की सबसे कम सामर्थ्य45सीडिंग के बाद 13 दिन और दिन 15 के बीच होती है . इसलिए, THBMEC मोनोलेयर का उपचार इस समय के बाद किया जाता है और बैक्टीरिया को बाद में मोनोलेयर की एपिकल सतह पर माध्यम में टीका लगाया जाता है। एक ऊष्मायन समय के बाद, बैक्टीरिया है कि बाधा को पार करने में सक्षम थे आगर प्लेटों पर बैक्टीरिया के साथ चढ़ाना माध्यम के माध्यम से मात्रा निर्धारित कर रहे है और कालोनियों गिनती । कॉलोनियों की बढ़ी हुई संख्या बीबीबी के माध्यम से उच्च जीवाणु ट्रैवर्सल के साथ संबंधित है। टीईआर लगभग 70ω246है। हालांकि, वर्णित विधि में टीईआर को मापना आवश्यक नहीं है। हालांकि यह बीबीबी की पारगम्यता के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित मूल्य है, यह बीबीबी के माध्यम से बैक्टीरिया के traversal पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता लगता है । अनुपचारित कोशिकाएं हमारे मॉडल में जकड़न के नियंत्रण के रूप में काम करती हैं। पिछले काम में यह दर्शाया गया है कि कोशिकाएं भड़काऊ साइटोकिन्स पर प्रतिक्रिया देने और ठेठ तंग जंक्शन प्रोटीन47व्यक्त करने में सक्षम हैं । यह ट्रांसपोर्टर सब्सट्रेट्स और रिसेप्टर्स के एक बड़े सेट की यौगिक स्क्रीनिंग और सत्यापन के लिए अनुमति देता है।

Protocol

1. बफर और रिएजेंट्स की तैयारी

  1. 80 ग्राम सोडियम क्लोराइड (नासीएल), 2 ग्राम पोटेशियम क्लोराइड (केसीएल), 14.4 ग्राम डाइसोडियम-हाइड्रोजन-फॉस्फेट डिहाइड्रेट (एनए2एचपीओ4 · 2एच2ओ) और 2 ग्राम जोड़कर 10x फॉस्फेट बफर लवलाइन (10x पीबीएस) तैयार करें डबल आसुत एच2ओ ऑटोक्लेव के 1 एल में 1 एल ग्लास फ्लास्क में पोटेशियम-डाइहाइड्रोजन फॉस्फेट (KH2पीओ4)का 1x पीबीएस प्राप्त करने के लिए डबल आसुत पानी के 900 मिली0 में इस समाधान का 100 मिलीएम पतला हो गया।
    1. समाधान ों को निष्फल करने के लिए ऑटोक्लेव का उपयोग करें। कांच के फ्लास्क को टोकरी में रखें, ढक्कन बंद करें और 15 मिन के लिए 121 डिग्री सेल्सियस और 98.9 केपीए पर बंध्याकरण करें।
      नोट: इस प्रोटोकॉल का उपयोग हमेशा आगे के चरणों में समाधानों को स्वचालित करने के लिए किया जाता है।
  2. 0.5 मिलीग्राम/एमएल फाइब्रोनेक्टिन सॉल्यूशन और 0.3 मिलीग्राम/एमएल कोलेजन चतुर्थ समाधान को 1.5 मिलीग्राम माइक्रो ट्यूब में 100 मिलीग्राम/माइक्रोएल एलिकोट के साथ 10 μg/mL कोलेजन चतुर्थ और 10 ग्राम/एमएल फाइब्रोनेक्टिन सॉल्यूशन तैयार करें। इसके बाद दोनों एलिकोट्स के 100 माइक्रोन को 2 मिलीकर माइक्रो ट्यूब में 1x पीबीएस के 1,800 माइक्रोन के साथ मिलाएं और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. डीएमईएम/एफ-12 मीडियम को 4% भ्रूण गोजातीय सीरम और 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन और 100 मिलीग्राम/एल पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन को मीडियम में जोड़कर तैयार करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. 10x केंद्रित ट्राइप्सिन-ईटीए समाधान को 50 मीटर ट्यूब में 1x पीबीएस के 45 मिलील के साथ 10x केंद्रित ट्राइप्सिन-ईटीए समाधान को कमजोर करके 1x ट्राइप्सिन-ईटीए समाधान तैयार करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. 500 मीटर ग्लास फ्लास्क में एलबी शोरबा बेस के 10 ग्राम वजनी करके एलबी मीडियम का 500 एमएएल तैयार करें। 500 मीटर बंध्याकरण वाले पानी को जोड़ें और इसे ऑटोक्लेव करें।
  6. 500 मीटर ग्लास फ्लास्क में एलबी शोरबा बेस के 10 ग्राम और 7.5 ग्राम एगर-एगर का वजन करके एलबी एगर तैयार करें। ऑटोक्लेव िंग से पहले 500 मीटर बंध्याकृत पानी डालें और फ्लास्क के ढक्कन को बंद न करें। ऑटोक्लेव और समाधान को ठंडा करने के लिए छोड़ दें जब तक कि यह स्पर्श के लिए गर्म न हो जाए।
  7. 4% भ्रूण गोजातीय सीरम और 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन जोड़कर एंटीबायोटिक-मुक्त माध्यम तैयार करें, लेकिन डीएमईएम/एफ-12 मीडियम में पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन नहीं करें और इसे चरण 1.3 के अनुसार 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. रक्त मस्तिष्क बाधा नकल कोशिकाओं के विकास

  1. 12 अच्छी तरह से थाली को इकट्ठा करने के लिए, कुओं में सेल संस्कृति आवेषण डाल(चित्रा 2ए)
    1. प्लेट को खोलें और प्रत्येक को जैविक सुरक्षा कैबिनेट में डालें और वहां आगे कदम उठाएं। इसे स्थानांतरित करने के लिए अपने व्यापक आधार पर डालने को हड़पने के लिए निष्फल संदंश का उपयोग करें।
  2. प्रत्येक डालने की असुरक्षित झिल्ली को 10 μg/mL कोलेजन चतुर्थ और 10 μg/mL फाइब्रोनेक्टिन मिश्रण के ९० μL के साथ कोट करें । एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर(चित्रा 2बी)में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए 12 अच्छी प्लेट इनक्यूबेट करें।
  3. प्रत्येक सम्मिलित में 1x पीबीएस के 1 mL पाइपिंग और सेल संस्कृतियों के लिए एक वैक्यूम पंप के साथ समाधान aspirate द्वारा दो बार आवेषण धोने।
  4. ऊपरी कक्ष में पूर्वगरम डीएमईएम/एफ-12 माध्यम के 0.5 मिलील और निचले कक्ष में 1.5 मिलील के पाइपिंग द्वारा झिल्ली को अलग करें। 5% सीओ2 वातावरण(चित्रा 2सी)के साथ एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 min के लिए प्लेट इनक्यूबेट करें।
  5. बीज 2 x 105 मानव माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को प्रत्येक ऊपरी कक्ष में और एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर(चित्रा 2डी)में 37 डिग्री सेल्सियस पर 12 अच्छी तरह से प्लेट इनक्यूबेट।
    1. सेल संस्कृति फ्लास्क से माध्यम को सेल संस्कृतियों के लिए वैक्यूम पंप का उपयोग करके मध्यम को एस्पिरेट करें और 1x पीबीएस के 10 मिलील को पाइप करके मोनोलेयर धोएं और बाद में वैक्यूम पंप के साथ समाधान को एस्पिरेटिंग करें।
    2. कोशिका संस्कृति फ्लास्क में समाधान के 5 mL पाइपिंग द्वारा 1x केंद्रित ट्राइप्सिन-EDTA के साथ पूरी तरह से कोशिकाओं को कवर करें। एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 3-5 मिन के लिए फ्लास्क इनक्यूबेट करें।
      नोट: यदि कोशिकाओं को विप्रेरित नहीं किया जाता है, तो कोशिकाओं को उखाड़ फेंकने के लिए हाथ की हथेली के खिलाफ फ्लास्क को मजबूती से टैप करें।
    3. एक 15 मिलीग्राम ट्यूब में सेल निलंबन से एक aliquot के रूप में एक पिपेट के साथ 5 mL ले लो और एंजाइमैटिक प्रतिक्रिया को रोकने के लिए FCS युक्त माध्यम के 5 mL जोड़ें ।
    4. 210 x ग्रामपर 3 मिन के लिए निलंबन को केंद्रित करें, वैक्यूम पंप के साथ अधिनायक को हटा दें, और एक पिपेट के साथ मध्यम के 5 mL में गोली को फिर से निलंबित करें।
    5. 1.5 मिलीएम माइक्रो ट्यूब में 0.4% ट्राइपैन ब्लू दाग के 10 माइक्रोन के साथ सेल निलंबन के 10 माइक्रोन मिलाकर सेल काउंटर का उपयोग करें। एक गिनती कक्ष स्लाइड में मिश्रण के 10 μL जोड़ें, यह सेल काउंटर में डाल दिया, और गिनती शुरू करते हैं ।
      1. काउंटर को कोशिकाओं पर केंद्रित करें ताकि उनकी धार गहरे नीले और मध्यम सफेद हो। इसके बाद सेल काउंटिंग के लिए उपयुक्त कार्यक्रम शुरू करें।
    6. प्रत्येक डालने के लिए मात्रा की गणना करने के लिए, सेल निलंबन की गणना एकाग्रता के साथ प्रति सम्मिलित 2 x 105 कोशिकाओं को विभाजित करें।

3. रक्त मस्तिष्क बाधा मॉडल की खेती

  1. 14 दिनों के लिए 12 वेल प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. ऊपरी कक्ष के लिए मध्यम के 0.5 mL और हर 2-3 दिनों में निचले एक के लिए मध्यम के 1.5 मीटर बदलें। इसे सेल फ्लास्क में डालने से पहले मीडियम को गर्म करें। वैक्यूम पंप के साथ एस्पिरेट(चित्रा 2ई)।
    नोट: झिल्ली को छूने से बचने के लिए सावधानी से काम करें।
  3. कोशिकाओं की स्थिति की जांच करें उन्हें माइक्रोस्कोप के साथ इमेजिंग करके और संबलता निर्धारित करें। सुनिश्चित करें कि 14 दिनों के बाद 100% है।

4. बैक्टीरिया की तैयारी

  1. माप से एक दिन पहले ई कोलाई स्ट्रेन GM2163 की एक कॉलोनी को एलबी मीडियम में डाल दें। एक ऊष्मायन शेखर(चित्रा 2एफ)में 180 आरपीएम के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए संस्कृति ट्यूब को इनक्यूबेट करें।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर एलबी एगर प्लेट पर ई कोलाई स्ट्रेन की खेती करें। एक निष्फल लेने के साथ एक कॉलोनी ले लो और पौंड माध्यम के 3 mL के साथ तैयार संस्कृति ट्यूब में लेने डाल दिया ।
    2. गर्म पौंड आगर समाधान के साथ प्रत्येक डालने के लिए एक पौंड आगर प्लेट तैयार करें और पेट्री व्यंजन ों को उनकी कुल मात्रा को आधा भरें। उन्हें ठोस बनने दें और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

5. कोशिकाओं का उपचार

  1. सीडिंग के बाद 14 दिन, यौगिकों के साथ कोशिकाओं का इलाज करें या ट्रांसेंडोथेलियल इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस (TEER) को मापें, यदि योजना बनाई गई है(चित्रा 2जी)।
    नोट: हमेशा एक नियंत्रण के रूप में कुछ अनुपचारित कोशिकाओं है ।
    1. ब्याज के यौगिक के साथ कोशिकाओं का इलाज करने के लिए, DMEM/F-12 माध्यम में अंतिम एकाग्रता के लिए यौगिक पतला । इस मिश्रण का 0.5 मीटर ऊपरी कक्ष में और 1.5 मीटर निचले कक्ष में जोड़ें। वांछित समय के लिए एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में थाली इनक्यूबेट।
  2. बाद में, वैक्यूम पंप और पाइपिंग(चित्रा 2एच)के साथ aspirating द्वारा एंटीबायोटिक मुक्त माध्यम के साथ पूर्ण माध्यम का आदान-प्रदान करें।

6. सामर्थ्य का मापन

  1. बैक्टीरिया की निरंतर सांद्रता प्राप्त करने के लिए, 600 एनएम की तरंगदैर्ध्य पर फोटोमीटर के साथ ऑप्टिकल घनत्व को मापें। 0.5 ± 0.05 के एक ओडी600 के लिए 50 मीटर फाल्कन ट्यूब में एलबी माध्यम के साथ बैक्टीरिया के रातोंरात समाधान को पतला करें। बर्फ पर काम करें।
    1. एलबी मीडियम का 1 एलभरें एक क्यूवेट में। फोटोमीटर शुरू करें और क्यूवेट को आगे की ओर चिह्नित करें। बाद में खाली मूल्य को मापने के लिए नीचे"खाली"दबाएं।
    2. बैक्टीरियल समाधान के घनत्व को एक क्यूवेट में भरकर, इसे डालकर और नीचे के नमूने को दबाकर मापें। अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने तक कमजोर होने के दौरान माप दोहराएं।
  2. एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में काम करें जहां बैक्टीरिया को तैयार 12 अच्छी तरह से प्लेट और ओडी600 = 0.5 पर बैक्टीरियल समाधान के साथ संभाला जा सकता है। केवल प्रत्येक ऊपरी कक्ष में बैक्टीरियल समाधान के 450 माइक्रोन जोड़ें जिसमें 0.5 मीटर का मध्यम(चित्रा 2I)शामिल है।
  3. इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे के लिए 12 अच्छी प्लेट इनक्यूबेट करें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां थामने के लिए तय करता है ।
  4. संदंश(चित्रा 2जे)के साथ डालने को हटाकर प्रत्येक निचले कक्ष से एक पिपेट के साथ मध्यम का नमूना 50 μL। ऊपरी कक्षों से ऊपरवाले तक माध्यम न फैलें, इसका ध्यान रखें।
  5. एक अलग आगर प्लेट(चित्रा 2K)पर प्रत्येक नमूना प्लेट । प्लेट पर नमूना छोड़ दें और एक सेल स्प्रेडर के साथ समाधान को बाहर निकालें।
  6. एक इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए आगर प्लेटें इनक्यूबेट करें।
  7. प्रत्येक प्लेट(चित्रा 2एल)में उपनिवेशों की गणना करें।

7. डेटा का विश्लेषण

  1. एक तालिका में डेटा लिखें और इलाज और अनुपचारित कोशिकाओं की देखी गई उपनिवेशों के औसत और मानक विचलन की गणना करें।
  2. कॉलोनियों की पूर्ण संख्या के रूप में औसत प्रदर्शित करें।
    1. परिणामों को सामान्य बनाने के लिए, नियंत्रण मूल्य के साथ सभी परिणामों को विभाजित करके कॉलोनियों की सापेक्ष संख्या की गणना करें।

Figure 2
चित्रा 2: प्रोटोकॉल में व्यक्तिगत चरणों की विस्तृत प्रस्तुति। (क)12 अच्छी तरह से थाली में निष्फल संदंश के साथ आवेषण रखो । (ख)कोट प्रत्येक फाइब्रोनेक्टिन और कोलेजन चतुर्थ मिश्रण के 90 माइक्रोन के साथ डालें और 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें (सी)झिल्ली को 30 मिन के लिए पूर्वगरम माध्यम से समतुल्य करें ।(डी)बीज 2 x 105 मानव मस्तिष्क माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं प्रति सम्मिलित करें। (ई)उचित मात्रा में थाली में खेती करें। (एफ)मापने से एक दिन पहले, एक एलबी मध्यम संस्कृति ट्यूब में एक ई कोलाई कॉलोनी डाल दिया और 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट(जी)कोशिकाओं का इलाज या TEER उपाय । (ज)एंटीबायोटिक मुक्त माध्यम के साथ एक्सचेंज पूरा माध्यम । (I)प्रत्येक ऊपरी कक्ष में बैक्टीरियल समाधान (ओडी600 = 0.5) का 450 माइक्रोन जोड़ें और 6 घंटे(जे)प्रत्येक निचले कक्ष से मध्यम के 50 माइक्रोन का नमूना संदंश के साथ डालने को हटा दें। (K)आगर प्लेटों पर नमूना प्लेट और 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट(एल)कालोनियों की गिनती और डेटा का विश्लेषण । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

   

Representative Results

प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, कोशिकाओं को वरीयता दी गई थी, और बीबीबी मॉडल बनाया गया था। सीडिंग के बाद 14 दिन में कोशिकाओं को ग्लाइऑक्सल के साथ रिएक्टिव एल्डिहाइड माना जाता था । इस प्रयोग का उद्देश्य पीओडी27 में आयु और मधुमेह के बीच संबंध और बुजुर्ग रोगियों में दिमागी बुखार की उच्चघटनाओं कीजांच करना था । उम्र और मधुमेह दोनों में उन्नत ग्लाइसेशन एंड उत्पादों (एजीई) के बढ़े हुए स्तरबीबीबी के माध्यम से माइक्रोबियल ट्रैवर्सल के रोगजनन में ग्लाइसेशन के प्रभाव की आगे की जांच की मांग करते हैं। ग्लाइसेशन कार्बोहाइड्रेट या अन्य कार्बोनाइल यौगिकों को कम करने के कार्बोनाइल समूहों के साथ प्रोटीन में मुफ्त अमीनो समूहों की एक गैर-एंजाइमीय प्रतिक्रिया है। ग्लूकोज अच्छी तरह से कार्बोनाइल समूहों के दाता के रूप में जाना जाता है; हालांकि, अधिक प्रतिक्रियाशील लोग ों को जाना जाता है। एक अस्थिर शिफ के आधार के निर्माण के बाद, वे ग्लाइऑक्सल जैसे अधिक स्थिर और प्रतिक्रियाशील डाइकार्बोनल यौगिकों को पुनर्व्यवस्थित करते हैं। AGEs, अंतिम उत्पादों, प्रोटीन५०के बीच क्रॉसलिंक पैदा कर सकता है । वे सेलुलर संरचनाओं को नुकसान पहुंचा सकते हैं और एजीईएस (क्रोध)51के रिसेप्टर के साथ बातचीत करके सेलुलर फ़ंक्शन को बदल सकते हैं।

कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए 0.05 और 0.15 एमएम ग्लाइऑक्सल (गो) समाधान के साथ इलाज किया गया, और अनुपचारित कोशिकाओं को नियंत्रण के रूप में कार्य किया गया। ग्लाइसेशन का पता इम्यूनोलॉटिंग और एंटी-एज एंटीबॉडी(चित्रा 3)के साथ पता लगाने के माध्यम से किया गया था । प्राप्त जीवाणु उपनिवेशों को गिना गया और कालोनियों की पूर्ण संख्या(चित्र4ए)या नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत कॉलोनियों की सापेक्ष संख्या(चित्र 4बी)के रूप में दर्शाया गया। अनुपचारित कोशिकाओं के साथ कुओं से लिया गया माध्यम बहुत कम कॉलोनियों का गठन किया। इस परिणाम से पता चला कि अनुपचारित कोशिकाएं एक बाधा बनाने में सक्षम थीं और एक नियंत्रण के रूप में काम कर सकती थीं। ग्लाइऑक्सल के साथ इलाज किए गए नमूनों में कॉलोनियों की बढ़ी हुई संख्या दिखाई गई, जिससे यह निष्कर्ष निकला कि THBMECs और सेलुलर बैरियर घनत्व पर ग्लाइऑक्सल का प्रभाव है, क्योंकि उपनिवेशों की संख्या ने अनुपचारित और उपचारित कोशिकाओं के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर का प्रदर्शन किया। ग्लाइऑक्सल के साथ उपचार के बाद बाधा के बढ़े हुए बैक्टीरियल क्रॉसिंग समझा सकता है कि मधुमेह बीबीबी टूटने के साथ बीमारियों से सहसंबद्ध क्यों है।

Figure 3
चित्रा 3: इम्यूनोलोटिंग के माध्यम से प्रोटीन ग्लाइसेशन का पता लगाना। THBMECs 1 घंटे के लिए विभिन्न सांद्रता पर जाने के साथ इलाज किया गया कुल प्रोटीन अलग और SDS-पृष्ठ का उपयोग कर अलग किया गया था । एंटी-एज-एंटीबॉडी (सीएमएल-26) का उपयोग करके इम्यूनोलोटिंग के माध्यम से प्रोटीन के ग्लाइसेशन का पता चला था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

एक अलग सेटिंग में, THBMECs के प्रोटीन ग्लाइसेशन ग्लूकोज द्वारा प्रेरित किया गया था। ४२.५ मीटर के साथ १७.५ मीटर से उच्च ग्लूकोज माध्यम (एचजी) के साथ सामान्य ग्लूकोज माध्यम (एनजी) से ग्लूकोज एकाग्रता बढ़ाने के लिए डीएमईएम/एफ-12 माध्यम में स्टरलाइज्ड ग्लूकोज जोड़ा गया । THBMECs दो अलग सेल संस्कृति flasks में खेती की गई: एक सामान्य ग्लूकोज (एनजी) मध्यम में और दूसरा उच्च ग्लूकोज (एचजी) माध्यम में। इन दो अलग-अलग मीडिया का इस्तेमाल 12 वेल प्लेट्स में फिल्टर पर बीबीबी के ग्रोथ के लिए भी किया गया था। एनजी माध्यम में खेती की कोशिकाओं को एक नियंत्रण के रूप में कार्य किया । प्राप्त उपनिवेशों को कालोनियों की पूर्ण संख्या(चित्रा 4सी)या नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत कॉलोनियों की सापेक्ष संख्या(चित्र4डी) के रूप में दर्शाया जाताहै। परिणाम मानव बीबीबी के माध्यम से बैक्टीरिया के ट्रैवर्सल पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं दर्शाते हैं, जिससे यह निष्कर्ष निकलता है कि एनजी बनाम एचजी का प्रभाव बीबीबी की अखंडता को प्रभावित करने के लिए पर्याप्त गंभीर नहीं था । विभिन्न परिदृश्यों को बीबीबी की नकल करने वाली कोशिकाओं के मॉडल और अखंडता को साबित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था।

Figure 4
चित्रा 4: THBMECs के साथ BBB मॉडल में गिना जीवाणु कालोनियों की निरपेक्ष और सापेक्ष संख्या । THBMECs 1 घंटे के लिए 0.15 mM जाने के साथ इलाज किया गया, अनुपचारित कोशिकाओं को एक नियंत्रण के रूप में कार्य किया। प्रत्येक ऊपरी कक्ष में ई कोलाई निलंबन (ओडी600 = 0.5) के कुल 450 माइक्रोन जोड़े गए थे। निचले कक्षों से मध्यम 6 घंटे के बाद आगर प्लेटों पर चढ़ाया गया था(ए)ग्राफ गिना कालोनियों के औसत मतलब +/-SEM से पता चलता है । (ख)ग्राफ से पता चलता है कि अनुपचारित कोशिकाओं को नियंत्रण के रूप में सामान्यीकृत गिना गया कालोनियों +/-एसईएम (एन = 4) के रूप में सामान्यीकृत किया गया है । (सी)और(डी)में एनजी और एचजी मीडियम में टीएचबीईएमसी की खेती की गई थी । प्रत्येक ऊपरी कक्ष में ई कोलाई निलंबन (ओडी600 = 0.5) के कुल 450 माइक्रोन जोड़े गए थे। निचले कक्ष से मध्यम 6 घंटे के बाद आगर प्लेटों पर चढ़ाया गया था(सी)ग्राफ गिना कालोनियों के औसत मतलब +/-SEM से पता चलता है । (D)ग्राफ से पता चलता है कि अनुपचारित कोशिकाओं को नियंत्रण के रूप में सामान्यीकृत गिना गया कालोनियों +/-एसईएम (एन = 3) के रूप में सामान्यीकृत किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

माइक्रोबियल ट्रैवर्सल के रोगजनन में सीमित अंतर्दृष्टि पीओडी या दिमागी पहचान के लिए उपचारों के और विकास को सीमित करती है। इन बीमारियों की मृत्यु दर और रुग्णता बेहतर रोगी उपचार की मांग करती है, अंतर्निहित तंत्रों के अनुसंधान की आवश्यकता होती है, और यौगिक स्क्रीनिंग के लिए एक मजबूत मंच की आवश्यकता होती है। मल्टीफैक्टरियल घटनाओं का अध्ययन मानव बीएमईसी के साथ किया जा सकता है। कई प्रजातियों से बीएमईसी की कई सफल रिपोर्ट की गई अलगाव प्रक्रियाओं में कोशिकाओं की विशेषताओं आणविक हस्ताक्षर52,53का नुकसान हुआ है। इस प्रक्रिया में वर्णित THBMECs बहुत जल्दी मार्ग में ट्रांससंक्रमित थे, जहां वे विशिष्ट मस्तिष्क एंडोथेलियल सेल विशेषताओं का प्रदर्शन किया और उन्हेंसंरक्षित 43. यह महत्वपूर्ण है, क्योंकि प्रभावित रास्तों में सभी कदम अब तक खोजे गए हैं, और यह मॉडल पारंपरिक बीएमईसी की नकल करने लगता है। हमारा प्रस्तुत मॉडल बीबीबी के माध्यम से बीएमईसी और माइक्रोबियल ट्रैवर्सल पर प्रत्यक्ष प्रभाव दिखाता है।

THBMEC कोशिकाओं की हैंडलिंग सीधी है, और आवश्यक तकनीकी उपकरण अधिकांश जीवन विज्ञान प्रयोगशालाओं में मौजूद हैं। हमारा मॉडल THBMECs के एक तंग मोनोलेयर का निर्माण किया है के बाद खोजी प्रक्रियाओं की तत्काल शुरुआत के लिए अनुमति देता है । नए परीक्षणों और पारंपरिक रूप से संभावित संयोजनों जैसे टीईआर माप या ट्रेसर54के साथ लेबलिंग के कारण अनुप्रयोगों का क्षेत्र व्यापक हो सकता है। सह-या ट्रिपल-कल्चर मॉडल बनाने के लिए एस्ट्रोसाइट्स या पेरिसाइट्स को जोड़ना भी संभव है। बैक्टीरिया के साथ ऊपरी कक्ष को इनकुलेट करने से पहले यौगिकों के साथ THBMECs का इलाज करके माइक्रोबियल ट्रैवर्सल पर दवाओं के प्रभाव का परीक्षण हमारे मॉडल में भी किया जा सकता है। वास्तव में, प्रक्रिया के स्वचालन की अनुमति देने वाली 96 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए फिल्टर के साथ आवेषण खरीदना संभव है। इससे उल्लिखित रोगों के खिलाफ दवाओं की खोज में तेजी लाने और दवा विकास के दौरान बीबीबी पर दुष्प्रभावों को कम करने के लिए उच्च थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग सिस्टम के कार्यान्वयन में सुविधा हो सकती है ।

प्रस्तुत विधि में एक महत्वपूर्ण कदम ऊपरी कक्ष में बैक्टीरिया जोड़ने के बाद ऊष्मायन समय है। प्रोटोकॉल में समयसीमा के रूप में घंटों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि ई कोलाई का पीढ़ी का समय केवल 20 मिन55है। अन्यथा, विभिन्न समय बिंदुओं के उपयोग से भ्रामक परिणाम हो सकते हैं । यदि प्लेटों को देखभाल के साथ नहीं संभाला जाता है तो बैक्टीरियल एक्सपोजर के दौरान ऊपरी और निचले कक्ष के बीच संदूषण का संभावित खतरा भी होता है। इस बिंदु पर 12 अच्छी तरह से थाली के लिए किसी भी परिवर्तन निचले कक्ष में माध्यम दूषित सकता है ।

ई. कोलाई बैक्टीरियल दिमागी होने का एक प्रसिद्ध, बहुत आम कारण है। आगे की जांच में विभिन्न बैक्टीरिया का परीक्षण करना चाहिए जो दिमागी पहचान से भी जुड़े होते हैं, जैसे कि निसेरिया मेनिंगिटिस56 या स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया57। ये बीबीबी को पार करने के लिए विभिन्न तंत्रों का उपयोग करने लगते हैं और रोगियों के इलाज के लिए बेहतर ढंग से समझने की आवश्यकता होती है। बुजुर्ग रोगियों में, POD के लिए घटना26 बढ़ जाती है और साथ ही होने वाली comorbidities की संख्या । यह ज्ञात है कि विभिन्न रोगों, विशेष रूप से मधुमेह जैसे प्रणालीगत लोगों के बीच बातचीत होती है। हमारे मॉडल में, उन स्थितियों का अनुकरण करना या बैक्टीरिया को जोड़ने से पहले कोशिकाओं का इलाज करना संभव है।

मॉडल THBMECs और बैक्टीरिया के सीधे संपर्क से सीमित है, और आगे अनुसंधान के लिए शामिल रास्ते और प्रोटीन का पता लगाने के लिए संपर्क के संभावित तंत्र की जांच आवश्यक है । हालांकि, आवेषण को हटाना और आगे के विश्लेषण के लिए कोशिकाओं को फसल करना संभव है। स्टेम सेलमॉडल38,39,40की तुलना में मॉडल का टीयर कम है . हमने एक बैक्टीरियल एकाग्रता का उपयोग करके इसकी पुष्टि की जो 6 घंटे के बाद अनुपचारित कोशिकाओं में बीबीबी को पार नहीं करता था।

सारांश में, यह विधि बीबीबी के माध्यम से बैक्टीरिया के ट्रैवर्स का विश्लेषण करने के लिए एक मजबूत मंच का प्रतिनिधित्व करती है जिसमें उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग के लिए इसका विस्तार करने की क्षमता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक इस विधि पर पिछले काम के लिए डॉ मरयम हुसैन को स्वीकार करते हैं, पांडुलिपि को गंभीर रूप से पढ़ने के लिए THBMECs और जूलियन वेबर प्रदान करने के लिए पीडी डॉ केर्स्टिन डैनकर (चारिट-यूनीवर्सिटस्मेडिजिन, बर्लिन) का समूह। इस अध्ययन को आरटीके 2155 (प्रोमोएज) ने समर्थन दिया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar - Agar Carl Roth 6494.3 BioScience-Grade
Autoclave Systec VX-150
Bacteria E.coli strain GM2163 Fermentas Life Sciences, Lithuania
Photometer Eppendorf 6131
Cells THBMEC Group of M. F. Stins
Cell culture flasks Greiner Bio-One 658175
Centrifuge Universal 320 Hettrichlab 1401
Collagen IV SIGMA Aldrich C6745 from human cell culture
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% Invitrogen C10311
Culture tubes Greiner Bio-One 191180
Cuvettes BRAND 759015
Di sodium hydrogen phosphate di hydrate MERCK 1065800500
DMEM/F-12 GIBCO/ Thermo Sc. 11330032 HEPES
Falcon tubes 15 ml Greiner Bio-One 188271
Falcon tubes 50 ml Greiner Bio-One 227261
Fetal Bovine Serum GIBCO/ Thermo Sc. 10270 value FBS -Brazil
Fibronectin SIGMA Aldrich F0556 solution human fibroblasts
Heracell 150 CO2 Incubator Heraeus 50116047
Incubator shaker I 26 New Brunswick Eppendorf M1324-0000
Inoculation loop Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel 641000
LB Broth Base GIBCO/ Thermo Sc. 12780029
L-Glutamine GIBCO/ Thermo Sc. 25030-081
Microbial incubator B 6200 Heraeus 51015192
Microbiological Safety Cabinet AURA 2000 M.A.C. Class II BIOAIR 12469
Microscope inverse Zeiss TELAVAL 31
Micro tubes 2 ml Sarstedt 72,695,400
Micro tubes 1,5 ml Sarstedt 72,706,400
Penicillin / Streptomycin GIBCO/ Thermo Sc. 15140122
Petri dish Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel 464-800
Potassium chloride Roth HN02.3
Potassium-di-hydrogen phosphate Roth P018.2
Sodium chloride Roth 9265.2
ThinCerts + Multiwell Plates Greiner Bio-One 665631 12 well, pore size 3.0 µm
Trypsin - EDTA GIBCO/ Thermo Sc. 15400054
Vacuumpump Laboport KNF N 86 KT.18

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माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं के माध्यम से माइक्रोबियल ट्रैवर्सल द्वारा रक्त-मस्तिष्क बाधा की पारगम्यता का विश्लेषण करना
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Weber, V., Bork, K., Horstkorte, R., Olzscha, H. Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (156), e60692, doi:10.3791/60692 (2020).More

Weber, V., Bork, K., Horstkorte, R., Olzscha, H. Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (156), e60692, doi:10.3791/60692 (2020).

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