Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Analysera permeabiliteten hos blod - hjärnbarriären genom mikrobiell traversal genom mikrovaskulära endotelceller

doi: 10.3791/60692 Published: February 14, 2020

Summary

Den mänskliga blod - hjärnbarriären förhindrar selektivt penetration av hydrofila molekyler och patogener i hjärnan. Flera patologier, inklusive hjärnhinneinflammation och postoperativa delirium, är associerade med en ökad permeabilitet av blod - hjärnbarriären. Här beskriver vi en endotelcellkulturmodell för att testa barriärpermeabiliteten genom mikrobiell traversal.

Abstract

Den mänskliga blod - hjärnbarriären (BBB) kännetecknas av en mycket låg permeabilitet för biomolekyler för att skydda och reglera hjärnans metabolism. BBB bildas huvudsakligen av endotelceller inbäddade i kollagen IV och fibronectin-rika källarmembran. Flera patologier beror på dysfunktion av BBB följt av mikrobiell traversal, orsakar sjukdomar som hjärnhinneinflammation. För att testa effekten av flera parametrar, inklusive olika läkemedel och bedövningsmedel, på permeabilitet en BBB vi etablerade en ny mänskliga cell kultur modell härma BBB med mänskliga hjärnan mikrovaskulära endotelceller. Endotelcellerna odlas på kollagen IV och fibronectin-belagda filterenheter tills sammanflödet och kan sedan behandlas med olika föreningar av intresse. För att visa en mikrobiell traversal, den övre kammaren med den apical ytan av endotelcellerna inokuleras med bakterier. Efter en inkubationstid pläteras prover av den nedre kammaren på agarplattor och de erhållna kolonierna räknas, varigenom antalet kolonier korrelerar med BBB:s genomsläpplighet. Endogena cellulära faktorer kan analyseras i denna experimentella uppsättning för att belysa grundläggande cellulära mekanismer i endotelceller som bidrar till BBB. Dessutom gör denna plattform det möjligt att utföra en skärm för föreningar som kan påverka permeabiliteten hos endotelcellerna. Slutligen, bakteriell traversal kan studeras och kopplas till olika patologier, såsom hjärnhinneinflammation. Det kan vara möjligt att utöka modellen och analysera vägarna hos bakterierna genom BBB. I den här artikeln tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll över den beskrivna metoden för att undersöka BBB:s genomsläpplighet.

Introduction

Den mänskliga BBB är en unik gräns för hjärnvävnad, separera hjärnan från blodet. Det reglerar strikt passagen av större och hydrofila molekyler, blockerar paracellulär diffusion och upprätthåller hjärnanhomeostas. Det skyddar också hjärnan från plasmafluktuationer, toxiner, mikrober och styr inflammatoriska celler som en del av immunsystemets (CNS) immunitet. Sedan upptäckten för ett sekel sedan1, många studier har genomförts för att förstå strukturen och funktionen av BBB. Den komplexa interaktioner av celler, proteiner, och signaler från hjärnan och blodet kräver ytterligare undersökning och modeller.

Den mänskliga BBB består av tre celltyper: hjärnan mikrovaskulära endotelceller (BMECs), pericyter och astrocyter2,3. BMECs skiljer sig från majoriteten av endotelcellerna i kroppen genom att de har ett stort antal snäva korsningar och vidhäftningar korsningar4,låg pinocytotisk aktivitet2,5, och en kontinuerlig källare membran6,7 för att blockera paracellulär diffusion. Små lipofila molekyler kan sprida sig och passera BBB efter deras koncentrationsgradient; större och hydrofila molekyler kommer in eller lämnar hjärnan endast genom polariserade uttryckta selektiva transportsystem8. Denna förordning resulterar i en hög transendotel elektrisk tång (TEER) på 1.500-2.000 Ω·cm2 som är omvänt korrelerade till permeabilitet9,10. Även om BMECs bygga en tät barriär, kan de reagera på lokala och perifera signaler11,12. Det finns en nära interaktion mellan BMECs och astrocyter13; astrocyt slutfötterna bygga ett lager runt kärlen och inducera bildandet av snäva korsningar13,14. De är involverade i BBB-mognad med olika faktorer, inklusive omvandling av tillväxtfaktor-β (TGF-β)15,16. Dessutom spelar pericyter en nyckelroll i regleringen av angiogenes17 och förhindra apoptos av endothelium i cellulär differentiering18 (figur 1). De är inbäddade i källaren membranet och ger strukturell stabilitet i kärlväggen19.

Figure 1
Figur 1: Den schematiska strukturen i blod - hjärnbarriären. Den unika strukturen hos den mänskliga BBB består av tre olika celltyper. Mikrokärlslumen omges av endotelceller, som är berikade i snäva korsningar, och är inte fenestrated. De är inbäddade i källaren membranet, som pericyter. Dessa celler är viktiga för kärlväggens strukturella stabilitet och spelar en roll i BBB:s utveckling bredvid astrocyterna. Deras ändfötter bygger ett nära lager runt fartyget och stöder byggandet av snäva korsningar. Alla komponenter i BBB är viktiga för fysiologisk funktionalitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Många olika patologier är relaterade till kollapsen av BBB (t.ex. septisk encefalopati). De drabbade patienterna har ökat proteinnivåerna i ryggmärgsvätskan20, och hjärnparenkymen hos drabbade gnagare visar ett ökat upptag av märkt kolloidal järnoxid och aminosyror21,22. Dessa resultat pekar mot en ökad permeabilitet av BBB som sker tillsammans med en ökad pinocytos is i BMECs21 och endotel aktivering23. En annan tillhörande patologi relaterad till en förändrad BBB är hjärnhinneinflammation, en medicinsk nödsituation och en komplex inflammation tillsammans med cerebral ödem som kan leda till neuronal cell död. Den primära ingångsplatsen för cirkulerande bakterier är tänkt att vara mikrokärlen24; BBB förhindrar dock att bakterier kommer in. BBB:s permeabbarhet är inte alltid kopplad till en ökning av experimentell hematogenous hjärnhinneinflammation25 och mekanismerna kan vara multifaktoriella. Tillfällighet av sepsis med postoperativa delirium (POD)26 och associering med preoperative infektioner27,28 indikerar behovet av en BBB modell som möjliggör direkt exponering för bakterier för att få en bättre förståelse för bakteriell patogenes.

Det finns många luckor i förståelsen och kvantifiera den mikrobiella traversal genom BBB. Därför utvecklade vi en modell som möjliggör en bekväm testning av olika faktorer och tillstånd med ett direkt samband mellan bakteriell traversal och influenser på bbbens genomsläppbarhet. Tidigare arbete fokuserade på paracellulära permeabilitet och inkluderade TEER-mätning och spårämnesflöde. Dessutom analyserades makromolekyltransport en av konjugerade molekyler eller antikroppar, där olika modeller som endast använder endotelceller eller kombinationer med astrocyter och pericyter utvecklades. På grund av svårigheten att regelbundet få mänsklig vävnad används många djurbaserade modeller. Hjärnan endotelceller av nötkreatur och svin ursprung bildar snäva monolayers med en hög TEER som bildar välformad apical-basala polaritet och är lämpade för undersökningar av små molekyler transport genom BBB. Proteinerna skiljer sig i följd från deras mänskliga homologer29,30, vilket gör undersökningen av terapeutiska antikroppar svårt. Av denna anledning kan murine eller mänskliga modeller kultur vara att föredra. Mus eller råttor som provkällor har fördelen av att erhållas från välkarakteriserade arter men ger få celler för studieändamål. Detta kan kringgås genom användning av förevigade mus hjärnan endoteliom (END) cellinjer bEND.3, bEND.5 eller cEND31,32,33.

Primära odlade celler från mänsklig vävnad är svåra att få och att hantera regelbundet. Därför är de flesta mänskliga cellulära modeller som används i forskning som undersöker den mänskliga BBB förevigade endotelcellinjer. En publicerad cellinje är mänskliga cerebrala mikrovaskulära endotelcellinjen hCMEC/D3, som är väl lämpad för studier av läkemedelsupptag och är lätt att hantera. Cellerna bygger ett monolayer och uttrycker de karakteristiska snäva kopplingsproteiner i BBB34, medan uttrycksnivån för claudin-5 rapporteras vara lägre än i intakta mikrofartyg35 och många specifika transportörer har upptäckts på avskriftsnivå36 samt i proteomiska studier34. En relativt låg TEER i intervallet 30-50 Ω·cm2 är fortfarande en utmaning37. En annan källa för hjärnan endotelceller är mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs)38 och mänskliga navelsträngsblod-härledda stamceller av cirkulerande endotel stamceller och hematopoietiska härstamningar39,40. Båda protokollen av differentiering resulterar i snäva cellmonolayers och kick TEER värderar (e.g., 1.450 Ω·cm2 i co-cultures)38. Dessa stamcellsmodeller kräver extrem vård för odling, men erbjuder ändå möjlighet att studera påverkan av reglerande hormoner41 eller sjukdomar med genetisk bakgrund42 på BBB utveckling.

I denna studie etablerade vi en förevigad transfected mänskliga hjärnan mikrovaskulären celllinje, THBMEC43, att efterlikna BBB och att studera bakteriell traversal. Celler är seedade på ett filter och odlas till 100% sammanflödet i denna cell kultur modell. Bakterier är inokuleras i den övre delen av cellodlingskammaren. Vi använder Escherichia coli (E. coli)i vår provstudie på grund av den höga incidensen av E. coli hjärnhinneinflammation44. Det har visat sig att den lägsta permeabiliteten hos cellmonolayer sker mellan dag 13 och dag 15 efter att45. Därför utförs behandling av THBMEC monolayer efter denna tid och bakterier inokuleras efteråt i mediet på monolayers apical yta. Efter en inkubationstid kvantifieras bakterier som kunde korsa barriären via pläteringsmedium med bakterierna på agarplattor och räknar kolonierna. Ett ökat antal kolonier korrelerar med högre bakteriell traversal genom BBB. TEER är ca 70 Ω·cm246. Det är dock inte nödvändigt att mäta Teer i den beskrivna metoden. Även om det är ett väletablerat värde för bbbens permeabilitet, verkar det inte ha någon inverkan på bakteriens genomfärd genom BBB. Obehandlade celler fungerar som en kontroll av täthet i vår modell. Det har visats i tidigare arbete att cellerna kan reagera på proinflammatoriska cytokiner och uttrycka typiska snäva korsningproteiner47. Detta möjliggör sammansatt screening och validering av en större uppsättning transportörsubstrat och receptorer.

Protocol

1. Beredning av buffert och reagenser

  1. Förbered 10x fosfatbuffertsaltlösning (10x PBS) genom att lägga till 80 g natriumklorid (NaCl), 2 g kaliumklorid (KCl), 14,4 g disnatriumvätefosfatdihydrat (Na2HPO4 · 2H2O) och 2 g kaliumdivätefosfat (KH2PO4)i en 1 L glaskolv i 1 L dubbeldestillrat H2O. Autoklav 10x PBS-lösningen och späd 100 ml av denna lösning i 900 ml dubbeldestillerat vatten för att få 1x PBS.
    1. Använd autoklaven för att sterilisera lösningar. Lägg glaskolven i korgen, stäng locket och sterilisera den i 15 min vid 121 °C och 98,9 kPa.
      DET här protokollet används alltid för automatiska lösningar i ytterligare steg.
  2. Förbered en 10 μg/mL kollagen IV och 10 μg/mL fibronectin lösning genom spädning 0,5 mg/mL fibronectin lösning och 0,3 mg/ml kollagen IV lösning vardera med 1x PBS till 100 mg/μL alikvoter i 1,5 mL mikrorör. Därefter blanda 100 μL av båda alikvoterna med 1 800 μl 1x PBS i 2 ml mikrorör och förvara dem vid -20 °C.
  3. Förbered DMEM/F-12 medium genom att lägga till 4% fetalt bovinserum och 2 mM L-glutamin och 100 mg/L penicillin/streptomycin till mediet och förvara det vid 4 °C.
  4. Förbered 1x trypsin-EDTA lösning genom att späda 5 ml av 10x koncentrerad trypsin-EDTA lösning med 45 ml 1x PBS i ett 50 ml rör och förvara den vid 4 °C.
  5. Förbered 500 ml LB medium genom att väga 10 g LB buljongbas i en 500 ml glaskolv. Tillsätt 500 ml steriliserat vatten och autoklav det.
  6. Förbered LB agar genom att väga 10 g LB buljongbas och 7,5 g agar-agar i en 500 ml glaskolv. Tillsätt 500 ml steriliserat vatten före automatisk lutning och stäng inte kolvens lock. Autoklav och låt lösningen svalna tills den är varm vid beröring.
  7. Förbered antibiotikafritt medium genom att lägga till 4% fetalt bovinserum och 2 mM L-glutamin, men ingen penicillin/streptomycin till DMEM/F-12 medium och förvara det vid 4 °C som i steg 1.3.

2. Tillväxten av blod- hjärnbarriären Härma celler

  1. För att montera 12 brunnsplattan, sätt cellodlingsskären i brunnarna(figur 2A).
    1. Packa upp plattan och varje insats i ett biologiskt säkerhetsskåp och utför ytterligare steg där. Använd steriliserade pincett för att ta tag i insatsen vid dess breda bas för att flytta den.
  2. Täck det porösa membranet för varje insats med 90 μl 10 μg/ml kollagen IV och 10 μg/mL fibronectin blandning. Inkubera 12 brunnsplattan för 24 h vid 37 °C i en cellkulturinkubator (figur 2B).
  3. Tvätta skären två gånger genom att pipetting 1 ml 1x PBS i varje skär och aspirera lösningen med en vakuumpump för cellkulturer.
  4. Jämviktmembranen genom att pipetting 0,5 ml förvärmt DMEM/F-12 medium i övre och 1,5 ml i den nedre kammaren. Inkubera plattan i 30 min vid 37 °C i en cellkulturinkubator med 5% CO2 atmosfär(figur 2C).
  5. Frö 2 x 105 humana mikrovaskulära endotelceller i varje övre kammare och inkubera 12 brunnsplattan vid 37 °C i en cellkulturinkubator (figur 2D).
    1. Sug upp mediet från cellodlingskolven med hjälp av en vakuumpump för cellkulturer och tvätta monolayer genom att pipetta 10 ml PBS och aspirera lösningen efteråt med en vakuumpump.
    2. Täck cellerna helt med 1x koncentrerad trypsin-EDTA genom att pipettering 5 ml av lösningen i cellodlingskolven. Inkubera kolven i 3-5 min vid 37 °C i en cellkulturinkubator.
      OBS: Om cellerna inte separeras, knacka kolven ordentligt mot handflatan för att lossa cellerna.
    3. Ta 5 ml med en pipett som en alikvot från cellsuspensionen i ett 15 ml-rör och tillsätt 5 ml av FCS-innehållande medium för att stoppa den enzymatiska reaktionen.
    4. Centrifugera fjädringen i 3 min vid 210 x g, ta bort supernatanten med en vakuumpump och återsuspenda pelleten i 5 ml medium med en pipett.
    5. Använd cellräknaren genom att blanda 10 μl cellsuspension med 10 μL 0,4 % trypanblå fläck i ett mikrorör på 1,5 ml. Tillsätt 10 μl av blandningen i en räkningkammare stänk, lägg den i cellräknaren och börja räkna.
      1. Fokusera räknaren på cellerna så att deras kant är mörkblå och den mellersta vita. Därefter starta lämpligt program för cellräkning.
    6. Om du vill beräkna volymen för varje skär delar du de erhållna 2 x 105 cellerna per skär med den beräknade koncentrationen av cellsuspensionen.

3. Odling av blod- hjärnbarriärmodellen

  1. Inkubera 12 brunnsplattan i 14 dagar vid 37 °C.
  2. Ändra 0,5 ml medium för den övre kammaren och 1,5 ml medium för den nedre var 2-3 dagar. Värm mediet innan du sätter det i cellkolven. Aspirera med vakuumpumpen(figur 2E).
    OBS: Arbeta noggrant för att undvika att röra vid membranet.
  3. Kontrollera cellernas status genom att avbilda dem med ett mikroskop och bestämma confluency. Se till att sammanflödet är 100% efter 14 dagar.

4. Beredning av bakterier

  1. En dag före mätning, sätta en koloni av E. coli stam GM2163 i LB medium. Inkubera kulturröret för 24 h vid 37 °C med 180 rpm i en inkubationsshaker (figur 2F).
    1. Odla E. coli-stammen på en LB-agarplatta vid 4 °C. Ta en koloni med ett steriliserat val och lägg plockningen i det förberedda kulturröret med 3 ml LB medium.
    2. Förbered en LB agar platta för varje insats med varm LB agar lösning och fyll Petri rätter till hälften av deras totala volym. Låt dem bli fasta och förvara dem vid 4 °C.

5. Behandling av celler

  1. Dag 14 efter sådd, behandla celler med föreningar eller mäta transendotelelektriska motstånd (TEER), om det planeras(figur 2G).
    OBS: Ha alltid några obehandlade celler som en kontroll.
    1. För att behandla celler med intressesammansättning, späd ut föreningen till den slutliga koncentrationen i DMEM/F-12 medium. Tillsätt 0,5 ml av denna blandning i den övre kammaren och 1,5 ml i den nedre kammaren. Inkubera plattan i en cellkulturinkubator för önskad tid.
  2. Därefter byt ut hela mediet med antibiotikafritt medium genom att aspirera med vakuumpumpen och pipettering (Figur 2H).

6. Mätning av permeabilitet

  1. För att få konstanta koncentrationer av bakterier, mäta den optiska densiteten med en fotomätare vid en våglängd på 600 nm. Späd över natten lösning av bakterier med LB medium i en 50 ml falk rör till en OD600 på 0,5 ± 0,05. Arbetet med is.
    1. Fyll 1 ml LB medium i en cuvette. Starta fotomätaren och sätt cuvette i, markerad sida framåt. Tryck på botten "Blank" för att mäta det tomma värdet efteråt.
    2. Mät tätheten av bakterielösningen genom att fylla den i en cuvette, sätta den i, och trycka på det nedre provet. Upprepa mätningen under spädningen tills den slutliga koncentrationen erhålls.
  2. Arbeta i ett biologiskt säkerhetsskåp där bakterier kan hanteras med den förberedda 12 brunnsplattan och bakterielösningen vid OD600 = 0,5. Tillsätt 450 μl bakterielösning endast i varje övre kammare som innehåller 0,5 ml medium(figur 2I).
  3. Inkubera 12 brunnsplattan för 6 h vid 37 °C i en inkubator.
    Obs: Protokollet dikterar för att pausa här.
  4. Prov 50 μl medium med en pipett från varje nedre kammare genom att ta bort insatsen med pincett(figur 2J). Var noga med att inte spilla mediet från de övre kamrarna till de nedre.
  5. Platta varje prov på en separat agarplatta(figur 2K). Släpp provet på plattan och strimmor lösningen med en cellspridare.
  6. Inkubera agarplattorna för 24 h vid 37 °C i en inkubator.
  7. Räkna kolonierna i varje platta (figur 2L).

7. Analysera data

  1. Skriv data i en tabell och beräkna den genomsnittliga och standardavvikelsen för de observerade kolonierna av behandlade och obehandlade celler.
  2. Visa genomsnittet som det absoluta antalet kolonier.
    1. För att normalisera resultaten, beräkna det relativa antalet kolonier genom att dela alla resultat med kontrollvärdet.

Figure 2
Bild 2: Detaljerad presentation av de enskilda stegen i protokollet. (A)Sätt skären med steriliserade pincett i 12 brunnsplattan. (B)Täck varje insats med 90 μl fibronectin- och kollagen IV-blandning och inkubera i 24 h. (C)Jämkna membranen med förvärmt medium i 30 min. (D)Frö 2 x 105 human adovaskulära endotelceller per insats. (E)Odla plattan under lämplig tid. (F)En dag före mätning, sätta en E. coli koloni i en LB medium kultur rör och inkubera för 24 h. (G) Behandla celler eller mäta TEER. (H)Byt komplett medium med antibiotikafritt medium. (I)Tillsätt 450 μl bakterielösning (OD600 = 0,5) i varje övre kammare och inkubera i 6 h. (J)Prov 50 μL medium från varje nedre kammare som tar bort insatsen med pincett. (K)Platta provet på agarplattor och inkubera i 24 timmar (L) Räkna kolonierna och analysera data. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

   

Representative Results

Efter protokollet var cellerna seedade, och BBB-modellen byggdes. Dag 14 efter sådd behandlades cellerna med glyoxal som en reaktiv aldehyd. Syftet med experimentet var att undersöka sambandet mellan ålder och diabetes i POD27 och den höga förekomsten av hjärnhinneinflammation hos äldre patienter48. De ökade nivåerna av avancerade slutprodukter för glycation(AGEs) i både ålder och diabetes49 kräver ytterligare undersökning av effekten av glyktion i patogenesen vid mikrobiell genomkorsande genom BBB. Glycation är en icke-enzymatisk reaktion av fria aminogrupper i proteiner med kolylgrupper för att minska kolhydrater eller andra kolylföreningar. Glukos är känd som givare av kolylgrupper; Det finns dock mer reaktiva kända. Efter att ha byggt en instabil Schiff bas, de ordna till mer stabila och reaktiva dicarbonyl föreningar som glyoxal. De slutliga produkterna kan orsaka tvärband mellan proteiner50. De kan skada cellulära strukturer och ändra cellulär funktion genom interaktion med receptorn för AGEs (RAGE)51.

Cellerna behandlades med en 0,05 och 0,15 mM glyoxal (GO) lösning för 1 h, och obehandlade celler fungerade som en kontroll. Glycation upptäcktes via immunblotting och detektion med anti-AGE antikropp(figur 3). De erhållna bakteriekolonierna räknades och representerades som det absoluta antalet kolonier (figur 4A)eller det relativa antalet kolonier normaliserade till kontrollen(figur 4B). Mediet tas från brunnar med obehandlade celler bildade mycket få kolonier. Detta resultat visade att de obehandlade cellerna kunde bygga en barriär och kunde fungera som en kontroll. Prover som behandlats med glyoxal visade ett ökat antal kolonier, vilket ledde till slutsatsen att det finns en effekt av glyoxal på THBMECs och cellulär barriärdensitet, eftersom antalet kolonier visade en betydande skillnad mellan obehandlade och behandlade celler. Den ökade bakteriepassagen av barriären efter behandlingen med glyoxal kan förklara varför diabetes är korrelerad till sjukdomar med en BBB-nedbrytning.

Figure 3
Figur 3: Detektion av proteinglycation via immunblotting. THBMECs behandlades med GO vid olika koncentrationer för 1 h. Totalt protein isolerades och separerades med SDS-PAGE. Glycation av proteinerna upptäcktes via immunblotting med anti-AGE-antikroppar (KML-26). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

I en annan miljö, protein glycation av THBMECs induceras av glukos. Steriliserad glukos lades till DMEM/F-12 medium för att öka glukoskoncentrationen från normalt glukosmedium (NG) med 17,5 mM till högglukosmedium (HG) med 42,5 mM. THBMECs odlades i två olika cellodlingsflaskor: ett i det normala glukosmediet (NG) och det andra i högglukosmedium (HG). Dessa två olika medier användes också för tillväxten av BBB på filter i 12 brunnsplattor. Celler som odlas i NG medium fungerade som en kontroll. De erhållna kolonierna representeras som det absoluta antalet kolonier(figur 4C)eller det relativa antalet kolonier normaliserade till kontrollen(figur 4D). Resultaten tyder inte på någon signifikant effekt på bakteriens genomfärd genom den mänskliga BBB, vilket leder till slutsatsen att effekten av NG vs HG inte var tillräckligt allvarlig för att påverka BBB:s integritet. De olika scenarierna utformades för att bevisa modellen och integriteten hos cellerna som härmar BBB.

Figure 4
Figur 4: Absolut och relativt antal räknade bakteriekolonier i BBB-modellen med THBMECs. THBMECs behandlades med 0,15 mM GO för 1 h, obehandlade celler fungerade som en kontroll. Totalt lades 450 μl E. coli suspension (OD600 = 0,5) till varje övre kammare. Medium från de nedre kamrarna var pläterade på agarplattor efter 6 h. (A) Diagrammet visar det genomsnittliga medelvärdet +/- SEM av räknade kolonier. (B)Diagrammet visar de räknade kolonierna normaliserade till de obehandlade cellerna som kontroll +/- SEM (n = 4). IcochDodlades THBMECs i NG- och hgmedium. Totalt lades 450 μl E. coli suspension (OD600 = 0,5) till varje övre kammare. Medium från den nedre kammaren var pläterad på agarplattor efter 6 h. (C) Diagrammet visar det genomsnittliga medelvärdet +/- SEM av räknade kolonier. (D)Diagrammet visar de räknade kolonierna normaliserade till de obehandlade cellerna som kontroll +/- SEM (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Begränsad insikt i patogenesen vid mikrobiell traversal begränsar vidareutveckling av terapier för POD eller hjärnhinneinflammation. Dödligheten och sjukligheten hos dessa sjukdomar kräver bättre patientbehandling, kräver forskning av de underliggande mekanismerna och behöver en robust plattform för sammansatt screening. Multifaktorial händelserna kan studeras med mänskliga BMECs. Flera framgångsrika rapporterade isoleringsförfaranden för BMECs från ett antal arter har visat en förlust av cellernas egenskaper molekylär signatur52,53. De beskrivna THBMECs i detta förfarande transfected i mycket tidiga passager, där de uppvisade specifika hjärnan endotel cell egenskaper och bevarade dem43. Detta är viktigt, eftersom inte alla steg i de drabbade vägarna har upptäckts hittills, och denna modell verkar efterlikna konventionella BMECs. Vår presenterade modell visar direkta influenser på BMECs och den mikrobiella traversal genom BBB.

Hanteringen av THBMEC-celler är enkel, och den nödvändiga tekniska utrustningen finns i de flesta life science laboratorier. Vår modell möjliggör en omedelbar start av utredningsförfaranden efter att THBMECs har byggt en stram monolayer. Användningsområdena kan vara omfattande på grund av möjliga kombinationer mellan nya tester och konventionella analyser som TEER-mätning eller märkning med spårämnen54. Det är också möjligt att lägga astrocyter eller pericyter för att göra en co- eller triple-culture modell. Påverkan av läkemedel på den mikrobiella traversal kan också testas i vår modell genom att behandla THBMECs med föreningar innan man inokulera den övre kammaren med bakterier. I själva verket är det möjligt att köpa skär med filter för 96 brunnsplattor som möjliggör automatisering av förfarandet. Detta kan underlätta genomförandet av höggenomströmning av läkemedel screening system för att påskynda upptäckten av läkemedel mot de nämnda sjukdomarna och att minska biverkningar na på BBB under läkemedelsutveckling.

Ett kritiskt steg i den presenterade metoden är inkubationstiden efter att ha lagt till bakterierna i den övre kammaren. Det är viktigt att använda timmar som tidslinjer i protokollet, eftersom genereringstiden för E. coli bara är 20 min55. Annars kan användningen av olika tidpunkter leda till vilseledande resultat. Det finns också en möjlig risk för kontaminering mellan övre och nedre kammaren under bakterieexponeringen om plattorna inte hanteras med försiktighet. Alla ändringar av 12 brunnplattan vid denna punkt kan förorena mediet i den nedre kammaren.

E. coli är en välkänd, mycket vanlig orsak till bakteriell hjärnhinneinflammation. Ytterligare undersökningar bör testa olika bakterier som också är associerade med hjärnhinneinflammation, såsom Neisseria meningitidis56 eller Streptococcus pneumoniae57. Dessa verkar använda olika mekanismer för att korsa BBB och måste förstås bättre för behandling av patienter. Hos äldre patienter ökar incidensen för POD26 samt antalet inträffar. Det är känt att det finns interaktioner mellan olika sjukdomar, särskilt systemiska som diabetes. I vår modell är det möjligt att simulera dessa villkor eller behandla cellerna innan du lägger till bakterierna.

Modellen begränsas av direkt kontakt mellan THBMECs och bakterier, och ytterligare forskning är nödvändig för att undersöka potentiella kontaktmekanismer för att upptäcka de inblandade vägar och proteiner. Det är dock möjligt att ta bort skär och skörda cellerna för ytterligare analys. Teer av modellen är lägre jämfört med stamcellsmodeller38,39,40. Vi bekräftade detta med hjälp av en bakteriell koncentration som inte korsade BBB i obehandlade celler efter 6 h.

Sammanfattningsvis representerar denna metod en robust plattform för att analysera spridning av bakterier genom BBB med potential att expandera den för hög genomströmning drog screenings.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författarna erkänner Dr Maryam Hussain för tidigare arbete på denna metod, gruppen pd Dr Kerstin Danker (Charité-Universitätsmedizin, Berlin) för att tillhandahålla THBMCs och Juliane Weber för kritiskt läsa manuskriptet. Denna studie stöddes av RTK 2155 (ProMoAge).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar - Agar Carl Roth 6494.3 BioScience-Grade
Autoclave Systec VX-150
Bacteria E.coli strain GM2163 Fermentas Life Sciences, Lithuania
Photometer Eppendorf 6131
Cells THBMEC Group of M. F. Stins
Cell culture flasks Greiner Bio-One 658175
Centrifuge Universal 320 Hettrichlab 1401
Collagen IV SIGMA Aldrich C6745 from human cell culture
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% Invitrogen C10311
Culture tubes Greiner Bio-One 191180
Cuvettes BRAND 759015
Di sodium hydrogen phosphate di hydrate MERCK 1065800500
DMEM/F-12 GIBCO/ Thermo Sc. 11330032 HEPES
Falcon tubes 15 ml Greiner Bio-One 188271
Falcon tubes 50 ml Greiner Bio-One 227261
Fetal Bovine Serum GIBCO/ Thermo Sc. 10270 value FBS -Brazil
Fibronectin SIGMA Aldrich F0556 solution human fibroblasts
Heracell 150 CO2 Incubator Heraeus 50116047
Incubator shaker I 26 New Brunswick Eppendorf M1324-0000
Inoculation loop Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel 641000
LB Broth Base GIBCO/ Thermo Sc. 12780029
L-Glutamine GIBCO/ Thermo Sc. 25030-081
Microbial incubator B 6200 Heraeus 51015192
Microbiological Safety Cabinet AURA 2000 M.A.C. Class II BIOAIR 12469
Microscope inverse Zeiss TELAVAL 31
Micro tubes 2 ml Sarstedt 72,695,400
Micro tubes 1,5 ml Sarstedt 72,706,400
Penicillin / Streptomycin GIBCO/ Thermo Sc. 15140122
Petri dish Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel 464-800
Potassium chloride Roth HN02.3
Potassium-di-hydrogen phosphate Roth P018.2
Sodium chloride Roth 9265.2
ThinCerts + Multiwell Plates Greiner Bio-One 665631 12 well, pore size 3.0 µm
Trypsin - EDTA GIBCO/ Thermo Sc. 15400054
Vacuumpump Laboport KNF N 86 KT.18

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldmann, E. E. Vitalfärbung am Zentralnervensystem: Beitrag z. Physio-Pathologie d Plexus chorioideus ud Hirnhäute. (1913).
  2. Reese, T. S., Karnovsky, M. J. Fine structural localization of a blood-brain barrier to exogenous peroxidase. Journal of Cell Biology. 34, (1), 207-217 (1967).
  3. Risau, W., Dingler, A., Albrecht, U., Dehouck, M. P., Cecchelli, R. Blood-brain barrier pericytes are the main source of gamma-glutamyltranspeptidase activity in brain capillaries. Journal of Neurochemistry. 58, (2), 667-672 (1992).
  4. Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40, (3), 648-677 (1969).
  5. Coomber, B. L., Stewart, P. A. Morphometric analysis of CNS microvascular endothelium. Microvascular Research. 30, (1), 99-115 (1985).
  6. Tilling, T., Korte, D., Hoheisel, D., Galla, H. J. Basement membrane proteins influence brain capillary endothelial barrier function in vitro. Journal of Neurochemistry. 71, (3), 1151-1157 (1998).
  7. Morris, A. W., et al. Vascular basement membranes as pathways for the passage of fluid into and out of the brain. Acta Neuropathologica. 131, (5), 725-736 (2016).
  8. Betz, A. L., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: neutral amino acid transport into isolated brain capillaries. Science. 202, (4364), 225-227 (1978).
  9. Butt, A. M., Jones, H. C., Abbott, N. J. Electrical resistance across the blood-brain barrier in anaesthetized rats: a developmental study. Journal of Physiology. 429, 47-62 (1990).
  10. Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. Journal of Neurochemistry. 97, (4), 922-933 (2006).
  11. O'Carroll, S. J., et al. Pro-inflammatory TNFalpha and IL-1beta differentially regulate the inflammatory phenotype of brain microvascular endothelial cells. Journal of Neuroinflammation. 12, (131), (2015).
  12. Simi, A., Tsakiri, N., Wang, P., Rothwell, N. J. Interleukin-1 and inflammatory neurodegeneration. Biochemical Society Transactions. 35, (Pt 5), 1122-1126 (2007).
  13. Janzer, R. C., Raff, M. C. Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells. Nature. 325, (6101), 253-257 (1987).
  14. Tao-Cheng, J. H., Nagy, Z., Brightman, M. W. Tight junctions of brain endothelium in vitro are enhanced by astroglia. Journal of Neuroscience. 7, (10), 3293-3299 (1987).
  15. Utsumi, H., et al. Expression of GFRalpha-1, receptor for GDNF, in rat brain capillary during postnatal development of the BBB. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 279, (2), (2000).
  16. Tran, N. D., Correale, J., Schreiber, S. S., Fisher, M. Transforming growth factor-beta mediates astrocyte-specific regulation of brain endothelial anticoagulant factors. Stroke. 30, (8), 1671-1678 (1999).
  17. Balabanov, R., Washington, R., Wagnerova, J., Dore-Duffy, P. CNS microvascular pericytes express macrophage-like function, cell surface integrin alpha M, and macrophage marker ED-2. Microvascular Research. 52, (2), 127-142 (1996).
  18. Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes. Faseb Journal. 16, (10), 1274-1276 (2002).
  19. Lindahl, P., Johansson, B. R., Leveen, P., Betsholtz, C. Pericyte loss and microaneurysm formation in PDGF-B-deficient mice. Science. 277, (5323), 242-245 (1997).
  20. Young, G. B., Bolton, C. F., Archibald, Y. M., Austin, T. W., Wells, G. A. The electroencephalogram in sepsis-associated encephalopathy. Journal of Clinical Neurophysiology. 9, (1), 145-152 (1992).
  21. Carlyle Clawson, C., Francis Hartmann, J., Vernier, R. L. Electron microscopy of the effect of gram-negative endotoxin on the blood-brain barrier. Journal of Comparative Neurology. 127, (2), 183-197 (1966).
  22. Jeppsson, B., et al. Blood-brain barrier derangement in sepsis: cause of septic encephalopathy? The American Journal of Surgery. 141, (1), 136-142 (1981).
  23. Tighe, D., Moss, R., Bennett, D. Cell surface adrenergic receptor stimulation modifies the endothelial response to SIRS. Systemic Inflammatory Response Syndrome. New Horizons (Baltimore, Md). 4, (4), 426-442 (1996).
  24. Kim, K. S., et al. The K1 capsule is the critical determinant in the development of Escherichia coli meningitis in the rat. Journal of Clinical Investigation. 90, (3), 897-905 (1992).
  25. Kim, K. S., Wass, C. A., Cross, A. S. Blood-brain barrier permeability during the development of experimental bacterial meningitis in the rat. Experimental Neurology. 145, (1), 253-257 (1997).
  26. Arshi, A., et al. Predictors and Sequelae of Postoperative Delirium in Geriatric Hip Fracture Patients. Geriatric Orthopaedic Surgery and Rehabililation. 9, 2151459318814823 (2018).
  27. Smulter, N., Lingehall, H. C., Gustafson, Y., Olofsson, B., Engstrom, K. G. Delirium after cardiac surgery: incidence and risk factors. Interactive CardioVascular and Thoracic Surgery. 17, (5), (2013).
  28. Kratz, T., Heinrich, M., Schlauss, E., Diefenbacher, A. Preventing postoperative delirium. Deutsches Arzteblatt International. 112, (17), 289-296 (2015).
  29. Uchida, Y., et al. Quantitative targeted absolute proteomics of human blood-brain barrier transporters and receptors. Journal of Neurochemistry. 117, (2), 333-345 (2011).
  30. Warren, M. S., et al. Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human. Pharmacology Research. 59, (6), 404-413 (2009).
  31. Omidi, Y., et al. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Research. 990, (1-2), 95-112 (2003).
  32. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31, (1), 315-327 (2011).
  33. Burek, M., Salvador, E., Forster, C. Y. Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model. Journal of Visualized Experiments. (66), e4022 (2012).
  34. Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmacolgy. 10, (1), 289-296 (2013).
  35. Urich, E., Lazic, S. E., Molnos, J., Wells, I., Freskgard, P. O. Transcriptional profiling of human brain endothelial cells reveals key properties crucial for predictive in vitro blood-brain barrier models. PLoS One. 7, (5), e38149 (2012).
  36. Lopez-Ramirez, M. A., et al. Cytokine-induced changes in the gene expression profile of a human cerebral microvascular endothelial cell-line, hCMEC/D3. Fluid Barrier CNS. 10, (27), (2013).
  37. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow Metabolism. 28, (2), 312-328 (2008).
  38. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30, (8), 783-791 (2012).
  39. Boyer-Di Ponio, J., et al. Instruction of circulating endothelial progenitors in vitro towards specialized blood-brain barrier and arterial phenotypes. PLoS One. 9, (1), e84179 (2014).
  40. Cecchelli, R., et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 9, (6), e99733 (2014).
  41. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Science Reports. 4, 4160 (2014).
  42. Lim, R. G., et al. Huntington's Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19, (7), 1365-1377 (2017).
  43. Stins, M. F., Badger, J., Sik Kim, K. Bacterial invasion and transcytosis in transfected human brain microvascular endothelial cells. Microbiological Pathogens. 30, (1), 19-28 (2001).
  44. Gaschignard, J., et al. Neonatal Bacterial Meningitis: 444 Cases in 7 Years. Pediatric Infectious Disease Journal. 30, (3), 212-217 (2011).
  45. Hussain, M. The Effect of Glycation on the Permeability of an in vitro Blood-brain Barrier Model. University Halle-Wittenberg. (2015).
  46. Weber, V. The effect of glycation on the permeability of human blood-brain barrier. University Halle-Wittenberg. (2019).
  47. Hussain, M., et al. Novel insights in the dysfunction of human blood-brain barrier after glycation. Mechanism of Ageing Development. 155, 48-54 (2016).
  48. Choi, C. Bacterial meningitis in aging adults. Clinical Infectious Disease. 33, (8), 1380-1385 (2001).
  49. Furth, A. J. Glycated proteins in diabetes. British Journal of Biomedical Science. 54, (3), 192-200 (1997).
  50. Sajithlal, G. B., Chithra, P., Chandrakasan, G. Advanced glycation end products induce crosslinking of collagen in vitro. Biochimica and Biophysica Acta. 1407, (3), 215-224 (1998).
  51. Ray, R., Juranek, J. K., Rai, V. RAGE axis in neuroinflammation, neurodegeneration and its emerging role in the pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis. Neuroscience and Biobehavior Reviews. 62, 48-55 (2016).
  52. DeBault, L. E., Cancilla, P. A. Gamma-Glutamyl transpeptidase in isolated brain endothelial cells: induction by glial cells in vitro. Science. 207, (4431), 653-655 (1980).
  53. Diglio, C. A., Grammas, P., Giacomelli, F., Wiener, J. Primary culture of rat cerebral microvascular endothelial cells. Isolation, growth, and characterization. Laboratory Investigation. 46, (6), 554-563 (1982).
  54. Buchert, M., Turksen, K., Hollande, F. Methods to examine tight junction physiology in cancer stem cells: TEER, paracellular permeability, and dilution potential measurements. Stem Cell Reviews. 8, (3), 1030-1034 (2012).
  55. Gibson, B., Wilson, D. J., Feil, E., Eyre-Walker, A. The distribution of bacterial doubling times in the wild. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 285, (1880), (2018).
  56. Pron, B., et al. Interaction of Neisseria maningitidis with the components of the blood-brain barrier correlates with an increased expression of PilC. Journal of Infectious Diseases. 176, (5), 1285-1292 (1997).
  57. Iovino, F., Orihuela, C. J., Moorlag, H. E., Molema, G., Bijlsma, J. J. Interactions between blood-borne Streptococcus pneumoniae and the blood-brain barrier preceding meningitis. PLoS One. 8, (7), e68408 (2013).
Analysera permeabiliteten hos blod - hjärnbarriären genom mikrobiell traversal genom mikrovaskulära endotelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weber, V., Bork, K., Horstkorte, R., Olzscha, H. Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (156), e60692, doi:10.3791/60692 (2020).More

Weber, V., Bork, K., Horstkorte, R., Olzscha, H. Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (156), e60692, doi:10.3791/60692 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter