Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Mikrovasküler Endotel Hücreleri Ile Mikrobiyal Traversal ile Kan-Beyin Bariyerinin Geçirgenliğinin Analizi

doi: 10.3791/60692 Published: February 14, 2020

Summary

İnsan kan-beyin bariyeri seçici hidrofilik moleküllerin ve patojenlerin beyne penetrasyon engeller. Menenjit ve postoperatif deliryum da dahil olmak üzere çeşitli patolojiler, kan-beyin bariyerinin artan geçirgenliği ile ilişkilidir. Burada, bariyer geçirgenliğini mikrobiyal geçiş le test etmek için bir endotel hücre kültür modelini tanımlıyoruz.

Abstract

İnsan kan-beyin bariyeri (BBB) korumak ve beyin metabolizmasını düzenleyen biyomoleküller için çok düşük geçirgenlik ile karakterizedir. BBB esas olarak kollajen IV ve fibronektin açısından zengin bazal membranlara gömülü endotel hücrelerinden oluşur. BBB'nin disfonksiyonu ndan kaynaklanan çeşitli patolojiler ve ardından mikrobiyal travers, menenjit gibi hastalıklara neden olur. Farklı ilaçlar ve anestezikler de dahil olmak üzere birden fazla parametrenin BBB'nin geçirgenliği üzerindeki etkisini test etmek için BBB'yi insan beyni mikrovasküler endotel hücreleriyle taklit eden yeni bir insan hücresi kültürü modeli oluşturduk. Endotel hücreleri kollajen IV ve fibronektin kaplı filtre üniteleri üzerinde biraraya gelene kadar yetiştirilir ve daha sonra ilgi farklı bileşikler ile tedavi edilebilir. Mikrobiyal bir geçiş göstermek için, endotel hücrelerinin apikal yüzeyi ile üst oda bakteri ile aşılanır. Kuluçka döneminden sonra alt hazneörnekleri agar plakaları üzerine kaplanır ve elde edilen koloniler sayılır ve koloni sayısı BBB'nin geçirgenliği ile ilişkilidir. Enddogenöz hücresel faktörler bbb katkıda bulunan endotel hücrelerinin temel hücresel mekanizmaları açıklamak için bu deneysel kurulum analiz edilebilir. Buna ek olarak, bu platform endotel hücrelerinin geçirgenliğini etkileyebilecek bileşikler için bir ekran gerçekleştirmeye olanak sağlar. Son olarak, bakteriyel traversal incelenebilir ve farklı patolojiler ile bağlantılı, menenjit gibi. Bu modeli genişletmek ve BBB ile bakteri yollarını analiz etmek mümkün olabilir. Bu makalede, BBB geçirgenliğini araştırmak için açıklanan yöntemin ayrıntılı bir protokolünü salıyoruz.

Introduction

İnsan BBB beyin dokusunun benzersiz bir sınır, kan dan beyin ayıran. Kesinlikle büyük ve hidrofilik moleküllerin geçişini düzenler, bloklar parasellüler difüzyon, ve beyin homeostaz korur. Aynı zamanda plazma dalgalanmaları, toksinler, mikroplar, ve merkezi sinir sistemi (CNS) bağışıklık bir parçası olarak inflamatuar hücrelere rehberlik beyni korur. Bir yüzyıl önce keşfinden bu yana1,BBB'nin yapısını ve işlevini anlamak için birçok çalışma yapılmıştır. Hücrelerin karmaşık etkileşimleri, proteinler, ve beyin ve kan dan sinyalleri hala daha fazla araştırma ve modelleri talep.

İnsan BBB üç hücre tipioluşur: beyin mikrovasküler endotel hücreleri (BMECs), perisitler, ve astrositler2,3. BMECs onlar sıkı kavşaklar ve yapışık kavşaklar4,düşük pinositotik aktivite2,5,ve sürekli bir bazal membran6,7 parasellüler difüzyon engellemek için yüksek sayıda sahip olduğu vücuttaki endotel hücrelerinin çoğunluğu farklıdır. Küçük lipophilic molekülleri diffüz ve konsantrasyon gradyanı aşağıdaki BBB geçebilir; daha büyük ve hidrofilik moleküller girin veya sadece polarize ifade seçici taşıma sistemleri ile beyin bırakın8. Bu düzenleme, geçirgenlik9,10ile ters orantılı olan 1.500-2.000 Ω·cm2 transentelyal elektrik direnci (TEER) ile sonuçlanır. BMECs sıkı bir bariyer inşa rağmen, onlar yerel ve çevresel sinyalleri tepki verebilir11,12. BMEC'ler ve astrositler arasında yakın bir etkileşim vardır13; astrosit end-feet damarların etrafında bir tabaka oluşturmak ve sıkı kavşakoluşumunu neden13,14. BBB olgunlaşmasında büyüme faktörü-β (TGF-β)15,16gibi farklı faktörlerle katılırlar. Buna ek olarak, perisitler anjiyogenez17 düzenlenmesinde ve hücresel farklılaşma da endotel apoptozunun önlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır18 (Şekil 1). Onlar bodrum membran gömülü ve damar duvarının yapısal istikrar sağlamak19.

Figure 1
Şekil 1: Kan-beyin bariyerinin şematik yapısı. İnsan BBB'nin eşsiz yapısı üç farklı hücre tipinden oluşur. Mikro damar lümeni, sıkı kavşaklarda zenginleştirilmiş endotel hücreleri ile çevrilidir ve fenestrated değildir. Perisitler gibi bodrum zarına gömülüler. Bu hücreler damar duvarının yapısal stabilitesi için önemlidir ve astrositlerin yanında BBB'nin gelişiminde rol oynarlar. Onların end-feet geminin etrafında yakın bir tabaka inşa ve sıkı kavşaklar bina destek. BBB'nin tüm bileşenleri fizyolojik işlevsellik açısından önemlidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Birçok farklı patoloji BBB'nin çöküşüile ilişkilidir (örn. septik ensefalopati). Etkilenen hastalar beyin omurilik sıvısı protein düzeyleri artmıştır20, ve etkilenen kemirgenlerde beyin parankim işaretli kolloidal demir oksit ve aminoasitlerinartan bir alımı gösterir 21,22. Bu sonuçlar BBB'ninBMEC21'de artmış pinositoz ve endotel aktivasyonu23ile birlikte oluşan geçirgenliğinin arttığına işaret eder. Bir başka ilişkili patoloji değişmiş BBB ile ilgili menenjit, tıbbi bir acil durum ve nöronal hücre ölümüne yol açabilir serebral ödem ile birlikte karmaşık bir inflamasyon. Dolaşan bakterilerin birincil giriş sitesi mikrogemiler olması gerekiyordu24; ancak, BBB bakteri girişini engeller. BBB geçirgenliği her zaman deneysel hematojen menenjit25 artış ile bağlantılı değildir ve mekanizmalar multifaktöriyel olabilir. Postoperatif deliryum (POD)26 ile sepsis inklüsi ve ameliyat öncesi enfeksiyonlarla ilişki27,28 bakteri patogenezi içine daha iyi bir anlayış elde etmek için bakterilere doğrudan maruz kalma sağlayan bir BBB modeli ihtiyacını gösterir.

BBB'de mikrobiyal geçişi anlama ve ölçmede birçok boşluk vardır. Bu nedenle, bakteriyel traversal ve BBB geçirgenliği üzerindeki etkileri arasında doğrudan bir korelasyon ile farklı faktörler ve koşulların uygun bir test sağlayan bir model geliştirdik. Daha önceki çalışmalarda parasellüler geçirgenlik üzerinde duruldu ve TEER ölçümü ve tracer fluc dahil. Buna ek olarak, makromolekül taşıma konjuge moleküller veya antikorlar tarafından analiz edildi, bu şekilde sadece endotel hücreleri veya astrosit ve perisitler ile kombinasyonları kullanılarak farklı modeller geliştirilmiştir. Düzenli olarak insan dokusu elde etmede güçlük nedeniyle birçok hayvan bazlı model kullanılmaktadır. Sığır ve domuz kökenli beyin endotel hücreleri iyi şekilli apikal-bazal polarite oluşturan ve BBB ile küçük molekül taşıma araştırmalar için uygundur yüksek TEER ile sıkı monolayers oluştururlar. Proteinler insan homologlarından sırayla farklılıkgösterir29,30, terapötik antikorların araştırılmasını zorlaştırır. Bu nedenle, murine veya insan kültürü modelleri tercih edilebilir. Örnek kaynaklar olarak fare veya sıçanlar iyi karakterize edilen türlerden elde edilme avantajına sahiptirler ancak çalışma amacıyla az sayıda hücre verim ilerlerler. Bu ölümsüzleştirilmiş fare beyin endotelyoma (END) hücre hatları bEND.3, bEND.5 veya cEND31,32,33kullanımı ile atlatılabilir.

İnsan dokusundan birincil kültürlü hücrelerin elde edilmesi ve düzenli olarak ele alınması zordur. Bu nedenle, insan BBB araştırmalarında kullanılan çoğu insan hücresel modelleri ölümsüzleştirilmiş endotel hücre hatları vardır. Yayınlanan bir hücre hattı insan serebral mikrovasküler endotel hücre hattı hCMEC / D3, iyi ilaç alımı eğitimi için uygundur ve kullanımı kolaydır. Hücreler bir monolayer oluşturmak ve BBB34karakteristik sıkı kavşak proteinleri ifade , claudin-5 ifade düzeyi bozulmamış mikrokaplar daha düşük olduğu bildirilmiştir35 ve birçok özel taşıyıcılar transkript düzeyinde tespit edilmiştir36 yanı sıra proteomik çalışmalarda34. 30-50 Ω·cm2 aralığında nispeten düşük BIR TEER hala bir meydan okuma37. Beyin endotel hücreleri için başka bir kaynak insan pluripotent kök hücreleri (hPSCs)38 ve insan kordon kanı kaynaklı kök hücreleri dolaşan endotel döl ve hematopoetik soy39,40. Diferansiyasyonun her iki protokolü de sıkı hücre monokatmanları ve yüksek TEER değerleri (örneğin, ortak kültürlerde 1.450 Ω·cm2) ile sonuçlanır38. Bu kök hücre modelleri ekimi için aşırı bakım gerektirir, henüz hormonlar düzenleyen etkisini incelemek için fırsat sunuyoruz41 veya genetik geçmişe sahip hastalıklarınhastalıkları 42 BBB gelişimi.

Bu çalışmada, bbb'yi taklit etmek ve bakteriyel traversal'i incelemek için ölümsüzleştirilmiş transfecize edilmiş insan beyni mikrovasküler endotel hücre hattı THBMEC43'ükurduk. Hücreler bir filtreüzerinde tohumlanır ve bu hücre kültürü modelinde %100 biraraya kadar büyür. Bakteriler hücre kültür odasının üst kısmına aşılanır. Escherichia coli (E. coli)çalışmamızda E. coli menenjitinin yüksek insidansı nedeniyle44. Hücre tek katmanlı en düşük geçirgenlik gün 13 ve gün 15arasında 45tohumlama sonra oluşur gösterilmiştir. Bu nedenle, THBMEC monolayer tedavisi bu süre sonra yapılır ve bakteriler daha sonra monolayer apikal yüzeyinde orta aşılanır. Kuluçka süresinden sonra, bariyeri geçebilen bakteriler, agar plakaları üzerindeki bakterilerle kaplama ve koloniler sayma yoluyla ölçülür. Kolonilerin artan sayıda BBB ile yüksek bakteriyel geçiş ile ilişkilidir. TEER yaklaşık 70 Ω·cm246'dır. Ancak, belirtilen yöntemde TEER'in ölçülmesi gerekli değildir. BBB geçirgenliği için iyi kurulmuş bir değer olmasına rağmen, BBB ile bakterilerin geçiş üzerinde hiçbir etkisi var gibi görünüyor. Tedavi edilmeyen hücreler modelimizde sıkılığın kontrolü nde dir. Önceki çalışmalarda hücrelerin proinflamatuar sitokinlere tepki ve tipik sıkı kavşak proteinleri ifade edebiliyoruz gösterilmiştir47. Bu bileşik tarama ve taşıyıcı yüzeyler ve reseptörleri daha büyük bir dizi doğrulama sağlar.

Protocol

1. Tampon ve Reaktiflerin Hazırlanması

  1. 80 g sodyum klorür (NaCl), 2 g potasyum klorür (KCl), 14,4 g disodyum-hidrojen-fosfat dihidrat (Na2HPO4 · 2H2O) ve 2 ekleyerek 10x fosfat tampon salin (10x PBS) hazırlayın potasyum-dihidrojen fosfat g (KH2PO4) 1 L cam şişe 1 L çift distile H2O. Autoclave 10x PBS çözeltisi ve seyreltmek 100 mL bu çözeltinin 900 mL çift distile su 1x PBS almak için.
    1. Çözümleri sterilize etmek için otoklav kullanın. Cam şişeyi sepete koyun, kapağıkapatın ve 121 °C ve 98,9 kPa'da 15 dakika sterilize edin.
      NOT: Bu protokol her zaman sonraki adımlarda çözümleri otoklavlama için kullanılır.
  2. 0.5 mg/mL fibronektin çözeltisi ve 0.3 mg/mL kollajen IV çözeltisi 1.5 mL mikro tüplerde 100 mg/μL aliquots ile 10 g/mL fibronektin çözeltisi 10 g/mL kollajen IV ve 10 μg/mL fibronektin çözeltisi hazırlayın. Daha sonra, her iki aliquot'un 100 μL'sini 2 mL mikro tüpte 1.800 μL 1x PBS ile karıştırın ve -20 °C'de saklayın.
  3. DMEM/F-12 ortamını %4 fetal büyükbaş ve 2 mM L-glutamin ve 100 mg/L penisilin/streptomisin ekleyerek hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.
  4. 10x konsantre trypsin-EDTA çözeltisinin 5 mL'ini 50 mL'lik bir tüpte 45 mL 1x PBS ile seyrelterek 1x tripsin-EDTA çözeltisini hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.
  5. 500 mL cam şişede 10 g LB suyu tabanı tartarak 500 mL LB orta hazırlayın. Sterilize su 500 mL ekleyin ve otoklav.
  6. LB agar'ı 10 g LB suyu tabanı ve 500 mL cam şişede 7,5 g agar-agar ağırlığında hazırlayın. Otoklavlamadan önce 500 mL steril ize edilmiş su ekleyin ve şişenin kapağını kapatmayın. Otoklav ve dokunmak için sıcak olana kadar soğumaya sol.
  7. %4 fetal sığır serumu ve 2 mM L-glutamin ekleyerek antibiyotiksiz ortam hazırlayın, ancak DMEM/F-12 ortamına penisilin/streptomisin eklemeyin ve adım 1.3'te olduğu gibi 4 °C'de saklayın.

2. Kan-beyin bariyerinin büyüme Hücreleri Taklit

  1. 12 kuyu plakasını monte etmek için hücre kültürünü kuyulara yerleştirin (Şekil 2A).
    1. Plakayı boşaltın ve her bir sinibiyolojik güvenlik kabinine yerleştirin ve orada daha fazla adım atın. Taşımak için geniş tabanında eklemek kapmak için sterilize forceps kullanın.
  2. Her kesici nilanın gözenekli membranını 90 μL 10 g/mL kollajen IV ve 10 μg/mL fibronectin karışımı ile kaplayın. Hücre kültürü kuluçka makinesinde 37 °C'de 24 saat boyunca 12 kuyu plakasını kuluçkaya yatırın (Şekil 2B).
  3. Kesici uçları her kesici uça 1 mL 1x PBS boru tutarak iki kez yıkayın ve çözeltiyi hücre kültürleri için bir vakum pompası ile aspire edin.
  4. Üst haznede önceden ısıtılmış DMEM/F-12 ortamının 0,5 mL'sini, alt haznesinde 1,5 mL pipetleme yaparak membranları dengeleyin. Plakayı 30 dakika 37 °C'de hücre kültürü kuvözlerinde %5 CO2 atmosfere sahip bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın(Şekil 2C).
  5. Tohum 2 x 105 insan mikrovasküler endotel hücreleri her üst odaya ve bir hücre kültürü kuluçka 37 °C'de 12 kuyu plaka kuluçka (Şekil 2D).
    1. Hücre kültürleri için bir vakum pompası kullanarak hücre kültürü şişesinden orta aspire ve 1x PBS 10 mL pipetleme ve daha sonra bir vakum pompası ile çözelti aspire ederek monolayer yıkayın.
    2. Çözeltinin 5 mL'ini hücre kültürü şişesine borulandırarak 1x konsantre trypsin-EDTA ile hücreleri tamamen kapatın. Şişeyi 37 °C'de 3-5 dakika boyunca hücre kültürü kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.
      NOT: Hücreler ayrıştırılmazsa, hücreleri yerinden çıkarmak için şişeyi avuç içine sıkıca dokunun.
    3. 15 mL'lik bir tüpteki hücre süspansiyonundan aliquot olarak pipetle 5 mL alın ve enzimatik reaksiyonu durdurmak için FCS içeren ortamın 5 mL'sini ekleyin.
    4. Santrifüj süspansiyon için 3 dk 210 x g, bir vakum pompası ile supernatant kaldırmak ve bir pipet ile orta 5 mL pelet resuspend.
    5. Hücre süspansiyonunun 10 μL'sini 1,5 mL mikro tüpte %0,4 trypan mavi samanı ile karıştırarak hücre sayacını kullanın. Karışımın 10 μL'sini sayma odası slaytına ekleyin, hücre sayacına koyun ve saymaya başlayın.
      1. Tezgahı hücrelere odaklar, böylece kenarları koyu mavi ve orta beyaz dır. Bundan sonra, hücre sayma için uygun programı başlatın.
    6. Her kesici uç için hacmi hesaplamak için, elde edilen 2 x 105 hücreyi uç başına hücre süspansiyonunun hesaplanan konsantrasyonuyla bölün.

3. Kan-beyin Bariyer Modeli Nin Yetiştirilmesi

  1. 12 kuyu plakasını 37 °C'de 14 gün kuluçkaya yatırın.
  2. Üst oda için 0,5 mL, alt oda için 1,5 mL orta 2-3 günde bir değiştirin. Hücre şişesine koymadan önce ortayı ısıtın. Vakum pompası ile aspire (Şekil 2E).
    NOT: Membrana dokunmamak için dikkatli çalışın.
  3. Bir mikroskop ile görüntüleme ve birleşimini belirleyerek hücrelerin durumunu kontrol edin. 14 gün sonra birleşimin %100 olduğundan emin olun.

4. Bakterilerin Hazırlanması

  1. Ölçümden bir gün önce, E. coli suşu GM2163'ün kolonine LB ortamına yerleştirin. Kültür tüpünü 37 °C'de 24 saat, kuluçka çalkalayıcıda 180 rpm ile kuluçkaya yatırın (Şekil 2F).
    1. 4 °C'de LB agar plakaüzerinde E. coli türünü yetiştirin. Sterilize edilmiş bir kazma ile bir koloni alın ve 3 mL LB orta ile hazırlanan kültür tüpünde pick koyun.
    2. Sıcak LB agar çözeltisi ile her kesici uç için bir LB agar plakası hazırlayın ve Petri kaplarını toplam hacminin yarısına kadar doldurun. Katı hale gelsinler ve 4 °C'de saklayın.

5. Hücrelerin Tedavisi

  1. Tohumlamadan sonra 14.
    NOT: Her zaman bir kontrol olarak bazı işlenmemiş hücreler var.
    1. Hücreleri faiz bileşiğiile tedavi etmek için, dmem/F-12 ortamındaki son konsantrasyona kadar bileşiği seyreltin. Bu karışımın 0,5 mL'sini üst hazneye, 1,5 mL'sini alt hazneye ekleyin. İstediğiniz zaman için bir hücre kültürü kuluçka plaka kuluçka.
  2. Daha sonra, vakum pompası ve pipetleme(Şekil 2H)ile azarlayarak antibiyotiksiz orta ile tam orta değişimi.

6. Geçirgenliğin Ölçülmesi

  1. Sürekli bakteri konsantrasyonları elde etmek için optik yoğunluğu 600 nm dalga boyunda bir fotometre ile ölçün. 50 mL'lik bir şahin tüpündeki LB ortamı ile bakterilerin bir gecede çözeltisini 0,5 ± 0,05'lik bir OD600'e seyreltin. Buz üzerinde çalış.
    1. Bir cuvette içine LB orta 1 mL doldurun. Fotometreyi başlatın ve cuvette'yi öne doğru işaretli olarak koyun. Daha sonra boş değeri ölçmek için alt "Boş" tuşuna basın.
    2. Bir cuvette içine doldurarak, koyarak ve alt örnek basarak bakteriyel çözeltinin yoğunluğunu ölçün. Son konsantrasyonelde edene kadar seyreltme sırasında ölçümü tekrarlayın.
  2. OD600 = 0.5'te hazırlanan 12 kuyu plakası ve bakteriyel çözelti ile bakterilerin işlenebileceği biyolojik güvenlik kabininde çalışın. Sadece 0,5 mL orta içeren her üst hazneye 450 μL bakteriyel çözelti ekleyin(Şekil 2I).
  3. 12 kuyu plakasını 37 °C'de 6 saat boyunca bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın.
    NOT: Protokol burada duraklatma yı emreder.
  4. Kesici uçları forceps ile çıkararak her alt hazneden bir pipet ile ortanın 50 μL'sini örnekle(Şekil 2J). Orta yı üst odalardan alt odalara dökülmemeye dikkat edin.
  5. Her numuneyi ayrı bir agar plakası üzerine levhalayın (Şekil 2K). Plaka üzerinde örnek bırakın ve bir hücre dağıtıcı ile çözelti dışarı çizgi.
  6. Bir kuluçka makinesinde 37 °C'de 24 saat boyunca agar plakalarını kuluçkaya yatırın.
  7. Her plakadaki kolonileri sayın (Şekil 2L).

7. Verilerin Analizi

  1. Verileri bir tabloya yazın ve tedavi edilen ve işlenmemiş hücrelerin gözlenen kolonilerinin ortalama ve standart sapmasını hesaplayın.
  2. Ortalamayı mutlak koloni sayısı olarak görüntüleyin.
    1. Sonuçları normalleştirmek için, tüm sonuçları denetim değeriyle bölerek göreli koloni sayısını hesaplayın.

Figure 2
Şekil 2: Protokoldeki tek tek adımların ayrıntılı sunumu. (A) 12 kuyu plakaiçine steril leştirilmiş forceps ile ekler koyun. (B) Kat her eklemek 90 μL fibronektin ve kollajen IV karışımı ve inkübat için 24 saat. (C) 30 dk. (D) Tohum 2 x 105 insan beyni mikrovasküler endotel hücreleri eklemek başına önceden ısıtılmış orta ile membranlar dengeleyin. (E) Plakayı uygun süre için yetiştirin. (F) Ölçümden bir gün önce, bir LB orta kültür tüpüne Bir E. coli kolonisi yerleştirin ve 24 saat boyunca kuluçkaya yatırın. (H) Antibiyotiksiz ortam ile tam orta değişimi. (I) Her üst hazneye 450 μL bakteriyel solüsyon (OD600 = 0,5) ekleyin ve 6 saat boyunca kuluçkaya yatırın. (J) Numune 50 μL orta her alt odadan forseps ile kesici uç ları çıkararak. (K) Örneği agar plakaları üzerine plakalayın ve 24 saatboyuncakuluçkaya yatırın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

   

Representative Results

Protokolün ardından hücreler tohumlandı ve BBB modeli üretildi. 14. gün tohumlamadan sonra hücreler reaktif aldehit olarak glyoxal ile tedavi edildi. Deneyin amacı POD27'de yaş ve diyabet arasındaki korelasyon ile yaşlı hastalarda menenjit insidansının yüksek olduğunu araştırmaktır48. Hem yaş hem de diyabet49'da gelişmiş glisasyon sonu ürünlerinin (AGE) artmış düzeyleri, BBB'de mikrobiyal traversin patogenezinde glisasyonun etkisinin daha fazla incelenmesini talep eder. Glisasyon karbonhidrat veya diğer karbonil bileşikleri azaltarak karbonil grupları ile proteinlerde serbest amino gruplarının non-enzimatik reaksiyonudur. Glikoz iyi karbonil gruplarının donör olarak bilinir; ancak, bilinen daha reaktif olanlar vardır. Kararsız bir Schiff üssü inşa ettikten sonra, onlar glyoxal gibi daha kararlı ve reaktif dikarbonil bileşikleri yeniden düzenlemek. AGEs, nihai ürünler, proteinler arasında çapraz bağlantılara neden olabilir50. Hücresel yapılara zarar verebilir ve AGEs (RAGE)51reseptörü ile etkileşim yoluyla hücresel işlevi değiştirebilir.

Hücreler 0.05 ve 0.15 mM glyoxal (GO) çözeltisi ile 1 saat boyunca tedavi edildi ve tedavi edilmeyen hücreler kontrol olarak görev yaptı. Glisasyon immünoblotlama ve anti-AGE antikor ile saptandı (Şekil 3). Elde edilen bakteri kolonileri sayıldı ve mutlak koloni sayısı olarak temsil edildi(Şekil 4A) veya kontrole normalleştirilen kolonilerin göreceli sayısı(Şekil 4B). İşlenmemiş hücrelerle kuyulardan alınan ortam çok az koloni oluşturmuştur. Bu sonuç, tedavi edilmeyen hücrelerin bir bariyer oluşturabildiğini ve bir kontrol görevi görebileceklerini göstermiştir. Glyoxal ile tedavi edilen örnekler kolonilerin artan sayıda görüntülenen, THBMECs ve hücresel bariyer yoğunluğu üzerinde glyoxal bir etkisi olduğu sonucuna yol açan, kolonilerin sayısı tedavi edilmemiş ve tedavi hücreleri arasında önemli bir fark gösterdi çünkü. Glyoxal ile tedavi den sonra bariyerin artan bakteriyel geçiş diyabet bbb arıza ile hastalıklarla ilişkili neden açıklayabilir.

Figure 3
Şekil 3: İmmünoblotlama yoluyla protein glisasyonunun saptanması. THBMECs 1 saat için farklı konsantrasyonlarda GO ile tedavi edildi. Toplam protein izole edildi ve SDS-PAGE kullanılarak ayrıldı. Proteinlerin glisasyonu anti-AGE-antikor (CML-26) kullanılarak immünolotlama ile saptandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Farklı bir ortamda, THBMECs protein glisasyonu glikoz tarafından indüklenen oldu. Sterilize glukoz DMEM/F-12 ortamına 17,5 mM ile normal glukoz lu ortamdan (NG) 42,5 mM ile yüksek glikoz ortamına (HG) glikoz konsantrasyonu arttırıldı. THBMECs iki farklı hücre kültürü şişeleri ekili edildi: normal glikoz (NG) orta ve yüksek glikoz (HG) orta diğer. Bu iki farklı ortam aynı zamanda 12 kuyu plakalı filtrelerde BBB'nin büyümesi için de kullanılmıştır. NG ortamda yetiştirilen hücreler kontrol olarak görev yaptı. Elde edilen koloniler mutlak koloni sayısı(Şekil 4C)veya kontrole normalleştirilen kolonilerin göreli sayısı olarak temsil edilir (Şekil 4D). Sonuçlar, insan BBB yoluyla bakterilerin geçiş üzerinde önemli bir etkisi olduğunu göstermektedir, NG vs HG etkisi BBB bütünlüğünü etkileyecek kadar şiddetli olmadığı sonucuna yol açan. Farklı senaryolar modeli ve BBB taklit hücrelerin bütünlüğünü kanıtlamak için tasarlanmıştır.

Figure 4
Şekil 4: THBMECs ile BBB modelinde sayılan bakteri kolonilerinin mutlak ve göreceli sayıları. THBMECs 1 saat için 0.15 mM GO ile tedavi edildi, tedavi edilmemiş hücreler bir kontrol olarak görev yaptı. Her üst hazne toplam 450 μL E. coli süspansiyon (OD600 = 0,5) eklendi. Alt bölmelerden orta 6 saat sonra agar plakaları üzerine kaplanmıştır. (A) Grafik, sayılan kolonilerin ortalama +/- SEM ortalamasını gösterir. (B) Grafik, tedavi edilmeyen hücrelere normalleştirilen sayılan kolonileri kontrol +/- SEM (n = 4) olarak gösterir. (C) ve (D), THBMECs NG ve HG ortamda yetiştirildi. Her üst hazne toplam 450 μL E. coli süspansiyon (OD600 = 0,5) eklendi. Alt hazneden orta 6 saat sonra agar plakaları üzerine kaplanmıştır. (C) Grafik, sayılan kolonilerin ortalama +/- SEM ortalamasını gösterir. (D) Grafik, tedavi edilmeyen hücrelere normalleştirilen sayılan kolonileri kontrol +/- SEM (n = 3) olarak gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Mikrobiyal traversel sınırların patogenezine sınırlı bakış pod veya menenjit için tedavilerin daha da geliştirilmesi. Bu hastalıkların mortalitesi ve morbiditesi daha iyi hasta tedavisi gerektirir, altta yatan mekanizmaların araştırılmasını gerektirir ve bileşik tarama için sağlam bir platforma ihtiyaç duyar. Çok faktörlü olaylar insan BMEC'leri ile incelenebilir. Çeşitli türlerden BMECs birkaç başarılı bildirilen izolasyon prosedürleri hücrelerin özellikleri moleküler imza52,53kaybı göstermiştir. Bu prosedürde tanımlanan THBMECs çok erken pasajlarda transfected edildi, onlar belirli beyin endotel hücre özellikleri sergiledi ve onları korudu43. Bu önemlidir, çünkü etkilenen yollardaki tüm adımlar şimdiye kadar keşfedilmemiştir ve bu model konvansiyonel BMEC'leri taklit ediyor gibi görüner. Sunduğumuz model, BMEC'ler ve BBB'deki mikrobiyal geçiş üzerindeki doğrudan etkileri göstermektedir.

THBMEC hücrelerinin kullanımı basittir ve gerekli teknik ekipmanlar çoğu yaşam bilimi laboratuvarında bulunmaktadır. Modelimiz THBMECs sıkı bir monolayer inşa ettikten sonra soruşturma prosedürleri hemen başlamasını sağlar. Yeni testler ve TEER ölçümü veya54izleyicisi ile etiketleme gibi geleneksel denemeler arasındaki olası kombinasyonlar nedeniyle uygulama alanı geniş olabilir. Ortak veya üçlü kültür modeli yapmak için astrosit veya perisit eklemek de mümkündür. Mikroplar la kapital üzerinde ilaçların etkisi de bakteriler ile üst oda aşılama dan önce bileşikler ile THBMECs tedavi ederek modelimizde test edilebilir. Aslında, 96 kuyu plakası için filtreli kesici uçlar satın almak mümkündür ve bu uçlar prosedürün otomasyonuna olanak sağlar. Bu, söz konusu hastalıklara karşı ilaçların keşfini hızlandırmak ve ilaç geliştirme sırasında BBB üzerindeki yan etkileri azaltmak için yüksek iş itimatlı ilaç tarama sistemlerinin uygulanmasını kolaylaştırabilir.

Sunulan yöntemde kritik bir adım üst hazneye bakteri ekledikten sonra kuluçka süresidir. E. coli'nin üretim süresi sadece 20 dk55olduğundan, protokolde saatleri zaman çizelgesi olarak kullanmak önemlidir. Aksi takdirde, farklı zaman noktalarının kullanımı yanıltıcı sonuçlara yol açabilir. Plakalar özenle ele alınmadığı takdirde bakteriyel maruziyet sırasında üst ve alt oda arasında kontaminasyon riski de vardır. Bu noktada 12 kuyu plakasında herhangi bir değişiklik alt haznedeki ortamı kirletebilir.

E. coli bakteriyel menenjit iyi bilinen, çok yaygın bir nedenidir. Daha fazla araştırma da menenjit ile ilişkili farklı bakterileri test etmelidir, Neisseria menenjitidisgibi56 veya Streptococcus pneumoniae57. Bu BBB çapraz farklı mekanizmalar kullanmak gibi görünüyor ve hastaların tedavisi için daha iyi anlaşılması gerekir. Yaşlı hastalarda POD görülme sıklığı26'ya ve ortaya çıkan komorbidite lerin sayısını arttırmaktadır. Farklı hastalıklar, özellikle diyabet gibi sistemik hastalıklar arasında etkileşimler olduğu bilinmektedir. Bizim modelinde, bu koşulları simüle etmek veya bakteri eklemeden önce hücreleri tedavi etmek mümkündür.

Model THBMECs ve bakterilerin doğrudan temas ile sınırlıdır, ve daha fazla araştırma ilgili yollar ve proteinlertespit etmek için temas potansiyel mekanizmaları araştırmak için gereklidir. Ancak, ekler kaldırmak ve daha fazla analiz için hücreleri hasat mümkündür. Modelin TEER kök hücre modelleri38,39,40göre daha düşüktür. Bunu, 6 saat sonra tedavi edilmeyen hücrelerde BBB'yi geçmeyen bir bakteri konsantrasyonu kullanarak doğruladık.

Özetle, bu yöntem yüksek işlemli ilaç taramaları için genişletmek için potansiyel ile BBB ile bakterilerin geçiş analiz etmek için sağlam bir platform temsil eder.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Yazarlar bu yöntem üzerinde önceki çalışmaları için Dr Maryam Hussain kabul, PD Dr Kerstin Danker grubu (Charité-Universitätsmedizin, Berlin) kritik el yazması okumak için THBMECs ve Juliane Weber sağlamak için. Bu çalışma RTK 2155 (ProMoAge) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar - Agar Carl Roth 6494.3 BioScience-Grade
Autoclave Systec VX-150
Bacteria E.coli strain GM2163 Fermentas Life Sciences, Lithuania
Photometer Eppendorf 6131
Cells THBMEC Group of M. F. Stins
Cell culture flasks Greiner Bio-One 658175
Centrifuge Universal 320 Hettrichlab 1401
Collagen IV SIGMA Aldrich C6745 from human cell culture
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% Invitrogen C10311
Culture tubes Greiner Bio-One 191180
Cuvettes BRAND 759015
Di sodium hydrogen phosphate di hydrate MERCK 1065800500
DMEM/F-12 GIBCO/ Thermo Sc. 11330032 HEPES
Falcon tubes 15 ml Greiner Bio-One 188271
Falcon tubes 50 ml Greiner Bio-One 227261
Fetal Bovine Serum GIBCO/ Thermo Sc. 10270 value FBS -Brazil
Fibronectin SIGMA Aldrich F0556 solution human fibroblasts
Heracell 150 CO2 Incubator Heraeus 50116047
Incubator shaker I 26 New Brunswick Eppendorf M1324-0000
Inoculation loop Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel 641000
LB Broth Base GIBCO/ Thermo Sc. 12780029
L-Glutamine GIBCO/ Thermo Sc. 25030-081
Microbial incubator B 6200 Heraeus 51015192
Microbiological Safety Cabinet AURA 2000 M.A.C. Class II BIOAIR 12469
Microscope inverse Zeiss TELAVAL 31
Micro tubes 2 ml Sarstedt 72,695,400
Micro tubes 1,5 ml Sarstedt 72,706,400
Penicillin / Streptomycin GIBCO/ Thermo Sc. 15140122
Petri dish Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel 464-800
Potassium chloride Roth HN02.3
Potassium-di-hydrogen phosphate Roth P018.2
Sodium chloride Roth 9265.2
ThinCerts + Multiwell Plates Greiner Bio-One 665631 12 well, pore size 3.0 µm
Trypsin - EDTA GIBCO/ Thermo Sc. 15400054
Vacuumpump Laboport KNF N 86 KT.18

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldmann, E. E. Vitalfärbung am Zentralnervensystem: Beitrag z. Physio-Pathologie d Plexus chorioideus ud Hirnhäute. (1913).
  2. Reese, T. S., Karnovsky, M. J. Fine structural localization of a blood-brain barrier to exogenous peroxidase. Journal of Cell Biology. 34, (1), 207-217 (1967).
  3. Risau, W., Dingler, A., Albrecht, U., Dehouck, M. P., Cecchelli, R. Blood-brain barrier pericytes are the main source of gamma-glutamyltranspeptidase activity in brain capillaries. Journal of Neurochemistry. 58, (2), 667-672 (1992).
  4. Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40, (3), 648-677 (1969).
  5. Coomber, B. L., Stewart, P. A. Morphometric analysis of CNS microvascular endothelium. Microvascular Research. 30, (1), 99-115 (1985).
  6. Tilling, T., Korte, D., Hoheisel, D., Galla, H. J. Basement membrane proteins influence brain capillary endothelial barrier function in vitro. Journal of Neurochemistry. 71, (3), 1151-1157 (1998).
  7. Morris, A. W., et al. Vascular basement membranes as pathways for the passage of fluid into and out of the brain. Acta Neuropathologica. 131, (5), 725-736 (2016).
  8. Betz, A. L., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: neutral amino acid transport into isolated brain capillaries. Science. 202, (4364), 225-227 (1978).
  9. Butt, A. M., Jones, H. C., Abbott, N. J. Electrical resistance across the blood-brain barrier in anaesthetized rats: a developmental study. Journal of Physiology. 429, 47-62 (1990).
  10. Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. Journal of Neurochemistry. 97, (4), 922-933 (2006).
  11. O'Carroll, S. J., et al. Pro-inflammatory TNFalpha and IL-1beta differentially regulate the inflammatory phenotype of brain microvascular endothelial cells. Journal of Neuroinflammation. 12, (131), (2015).
  12. Simi, A., Tsakiri, N., Wang, P., Rothwell, N. J. Interleukin-1 and inflammatory neurodegeneration. Biochemical Society Transactions. 35, (Pt 5), 1122-1126 (2007).
  13. Janzer, R. C., Raff, M. C. Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells. Nature. 325, (6101), 253-257 (1987).
  14. Tao-Cheng, J. H., Nagy, Z., Brightman, M. W. Tight junctions of brain endothelium in vitro are enhanced by astroglia. Journal of Neuroscience. 7, (10), 3293-3299 (1987).
  15. Utsumi, H., et al. Expression of GFRalpha-1, receptor for GDNF, in rat brain capillary during postnatal development of the BBB. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 279, (2), (2000).
  16. Tran, N. D., Correale, J., Schreiber, S. S., Fisher, M. Transforming growth factor-beta mediates astrocyte-specific regulation of brain endothelial anticoagulant factors. Stroke. 30, (8), 1671-1678 (1999).
  17. Balabanov, R., Washington, R., Wagnerova, J., Dore-Duffy, P. CNS microvascular pericytes express macrophage-like function, cell surface integrin alpha M, and macrophage marker ED-2. Microvascular Research. 52, (2), 127-142 (1996).
  18. Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes. Faseb Journal. 16, (10), 1274-1276 (2002).
  19. Lindahl, P., Johansson, B. R., Leveen, P., Betsholtz, C. Pericyte loss and microaneurysm formation in PDGF-B-deficient mice. Science. 277, (5323), 242-245 (1997).
  20. Young, G. B., Bolton, C. F., Archibald, Y. M., Austin, T. W., Wells, G. A. The electroencephalogram in sepsis-associated encephalopathy. Journal of Clinical Neurophysiology. 9, (1), 145-152 (1992).
  21. Carlyle Clawson, C., Francis Hartmann, J., Vernier, R. L. Electron microscopy of the effect of gram-negative endotoxin on the blood-brain barrier. Journal of Comparative Neurology. 127, (2), 183-197 (1966).
  22. Jeppsson, B., et al. Blood-brain barrier derangement in sepsis: cause of septic encephalopathy? The American Journal of Surgery. 141, (1), 136-142 (1981).
  23. Tighe, D., Moss, R., Bennett, D. Cell surface adrenergic receptor stimulation modifies the endothelial response to SIRS. Systemic Inflammatory Response Syndrome. New Horizons (Baltimore, Md). 4, (4), 426-442 (1996).
  24. Kim, K. S., et al. The K1 capsule is the critical determinant in the development of Escherichia coli meningitis in the rat. Journal of Clinical Investigation. 90, (3), 897-905 (1992).
  25. Kim, K. S., Wass, C. A., Cross, A. S. Blood-brain barrier permeability during the development of experimental bacterial meningitis in the rat. Experimental Neurology. 145, (1), 253-257 (1997).
  26. Arshi, A., et al. Predictors and Sequelae of Postoperative Delirium in Geriatric Hip Fracture Patients. Geriatric Orthopaedic Surgery and Rehabililation. 9, 2151459318814823 (2018).
  27. Smulter, N., Lingehall, H. C., Gustafson, Y., Olofsson, B., Engstrom, K. G. Delirium after cardiac surgery: incidence and risk factors. Interactive CardioVascular and Thoracic Surgery. 17, (5), (2013).
  28. Kratz, T., Heinrich, M., Schlauss, E., Diefenbacher, A. Preventing postoperative delirium. Deutsches Arzteblatt International. 112, (17), 289-296 (2015).
  29. Uchida, Y., et al. Quantitative targeted absolute proteomics of human blood-brain barrier transporters and receptors. Journal of Neurochemistry. 117, (2), 333-345 (2011).
  30. Warren, M. S., et al. Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human. Pharmacology Research. 59, (6), 404-413 (2009).
  31. Omidi, Y., et al. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Research. 990, (1-2), 95-112 (2003).
  32. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31, (1), 315-327 (2011).
  33. Burek, M., Salvador, E., Forster, C. Y. Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model. Journal of Visualized Experiments. (66), e4022 (2012).
  34. Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmacolgy. 10, (1), 289-296 (2013).
  35. Urich, E., Lazic, S. E., Molnos, J., Wells, I., Freskgard, P. O. Transcriptional profiling of human brain endothelial cells reveals key properties crucial for predictive in vitro blood-brain barrier models. PLoS One. 7, (5), e38149 (2012).
  36. Lopez-Ramirez, M. A., et al. Cytokine-induced changes in the gene expression profile of a human cerebral microvascular endothelial cell-line, hCMEC/D3. Fluid Barrier CNS. 10, (27), (2013).
  37. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow Metabolism. 28, (2), 312-328 (2008).
  38. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30, (8), 783-791 (2012).
  39. Boyer-Di Ponio, J., et al. Instruction of circulating endothelial progenitors in vitro towards specialized blood-brain barrier and arterial phenotypes. PLoS One. 9, (1), e84179 (2014).
  40. Cecchelli, R., et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 9, (6), e99733 (2014).
  41. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Science Reports. 4, 4160 (2014).
  42. Lim, R. G., et al. Huntington's Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19, (7), 1365-1377 (2017).
  43. Stins, M. F., Badger, J., Sik Kim, K. Bacterial invasion and transcytosis in transfected human brain microvascular endothelial cells. Microbiological Pathogens. 30, (1), 19-28 (2001).
  44. Gaschignard, J., et al. Neonatal Bacterial Meningitis: 444 Cases in 7 Years. Pediatric Infectious Disease Journal. 30, (3), 212-217 (2011).
  45. Hussain, M. The Effect of Glycation on the Permeability of an in vitro Blood-brain Barrier Model. University Halle-Wittenberg. (2015).
  46. Weber, V. The effect of glycation on the permeability of human blood-brain barrier. University Halle-Wittenberg. (2019).
  47. Hussain, M., et al. Novel insights in the dysfunction of human blood-brain barrier after glycation. Mechanism of Ageing Development. 155, 48-54 (2016).
  48. Choi, C. Bacterial meningitis in aging adults. Clinical Infectious Disease. 33, (8), 1380-1385 (2001).
  49. Furth, A. J. Glycated proteins in diabetes. British Journal of Biomedical Science. 54, (3), 192-200 (1997).
  50. Sajithlal, G. B., Chithra, P., Chandrakasan, G. Advanced glycation end products induce crosslinking of collagen in vitro. Biochimica and Biophysica Acta. 1407, (3), 215-224 (1998).
  51. Ray, R., Juranek, J. K., Rai, V. RAGE axis in neuroinflammation, neurodegeneration and its emerging role in the pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis. Neuroscience and Biobehavior Reviews. 62, 48-55 (2016).
  52. DeBault, L. E., Cancilla, P. A. Gamma-Glutamyl transpeptidase in isolated brain endothelial cells: induction by glial cells in vitro. Science. 207, (4431), 653-655 (1980).
  53. Diglio, C. A., Grammas, P., Giacomelli, F., Wiener, J. Primary culture of rat cerebral microvascular endothelial cells. Isolation, growth, and characterization. Laboratory Investigation. 46, (6), 554-563 (1982).
  54. Buchert, M., Turksen, K., Hollande, F. Methods to examine tight junction physiology in cancer stem cells: TEER, paracellular permeability, and dilution potential measurements. Stem Cell Reviews. 8, (3), 1030-1034 (2012).
  55. Gibson, B., Wilson, D. J., Feil, E., Eyre-Walker, A. The distribution of bacterial doubling times in the wild. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 285, (1880), (2018).
  56. Pron, B., et al. Interaction of Neisseria maningitidis with the components of the blood-brain barrier correlates with an increased expression of PilC. Journal of Infectious Diseases. 176, (5), 1285-1292 (1997).
  57. Iovino, F., Orihuela, C. J., Moorlag, H. E., Molema, G., Bijlsma, J. J. Interactions between blood-borne Streptococcus pneumoniae and the blood-brain barrier preceding meningitis. PLoS One. 8, (7), e68408 (2013).
Mikrovasküler Endotel Hücreleri Ile Mikrobiyal Traversal ile Kan-Beyin Bariyerinin Geçirgenliğinin Analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weber, V., Bork, K., Horstkorte, R., Olzscha, H. Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (156), e60692, doi:10.3791/60692 (2020).More

Weber, V., Bork, K., Horstkorte, R., Olzscha, H. Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (156), e60692, doi:10.3791/60692 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter