Summary
Die Bildgebung von Bakterienzellen ist ein aufkommendem systembiologischen Ansatz, der sich auf die Definition statischer und dynamischer Prozesse konzentriert, die die Funktion großer makromolekularer Maschinen diktieren. Hier wird die Integration von quantitativer Live-Zell-Bildgebung und Kryo-Elektronentomographie verwendet, um Legionella pneumophila Typ IV Sekretionssystemarchitektur und -funktionen zu untersuchen.
Abstract
Das Dot/Icm-Sekretionssystem von Legionella pneumophila ist eine komplexe Typ-IV-Sekretionssystem (T4SS)-Nanomaschine, die am Bakteriellen Pol lokalisiert und die Lieferung von Protein- und DNA-Substraten an Zielzellen vermittelt, ein Prozess, der in der Regel einen direkten Zell-zu-Zell-Kontakt erfordert. Wir haben vor kurzem die Struktur des Dot/Icm-Apparats mittels Kryo-Elektronentomographie (Cryo-ET) gelöst und gezeigt, dass es einen Zellhüllen-Spannkanal bildet, der sich mit einem zytoplasmatischen Komplex verbindet. Die Anwendung von zwei komplementären Ansätzen, die die native Struktur der Probe erhalten, die fluoreszierende Mikroskopie in lebenden Zellen und Kryo-ET, ermöglicht die in situ-Visualisierung von Proteinen und die Assimilation der Stoiterminatrie und das Timing der Produktion jeder Maschinenkomponente im Vergleich zu anderen Dot/Icm-Untereinheiten. Um die Anforderungen an die polare Positionierung zu untersuchen und dynamische Merkmale im Zusammenhang mit der T4SS-Maschinenbiogenese zu charakterisieren, haben wir ein Gen kodiert, das superfolder green fluorescent protein zu Dot/Icm ATPase-Genen an ihren nativen Positionen auf dem Chromosom kodiert. Die folgende Methode integriert die quantitative Fluoreszenzmikroskopie lebender Zellen und Kryo-ET, um polare Lokalisation, Dynamik und Struktur dieser Proteine in intakten Bakterienzellen zu quantifizieren. Die Anwendung dieser Ansätze für die Untersuchung der Legionella pneumophila T4SS ist nützlich für die Charakterisierung der Funktion des Dot/Icm-Systems und kann angepasst werden, um eine Vielzahl von bakteriellen Krankheitserregern zu untersuchen, die die T4SS oder andere Arten von bakteriellen Sekretionskomplexen nutzen.
Introduction
Legionella pneumophila (L. pneumophila), das ätiologische Mittel der Legionärskrankheit, bewohnt Süßwasserreservoirs, in denen sich die Bakterien vermehren, indem sie sich in aquatischen, freischwimmenden Protozoen animieren. L. pneumophila verursacht Krankheitsausbrüche beim Menschen, wenn das Einatmen von aerosolisierten Bakterien aus Trinkwasserquellen auftritt. In infizierten Zellen ermöglicht die Subversion von Wirtswegen L. pneumophila, die endozytische Reifung des Vakuums, in dem es sich befindet, zu verzögern und die Biogenese eines Zellfachs zu fördern, das die bakterielle Replikation unterstützt. Dieser Prozess wird durch ein spezialisiertes bakterielles Sekretionssystem des Typs IVB (T4BSS) angetrieben, das als Dot/Icm bekannt ist, und seinem Repertoire von über 300 "Effektor"-Proteinen, die während der Infektion in den Wirtcytosol transloziert werden, um die Manipulation der Zellfunktionen1,2,3,4,5zu erleichtern. Mutanten ohne funktionelles Dot/Icm-Gerät liefern keine Effektoren in das Wirtszytosol, sind defekt für die intrazelluläre Replikation und sind in Tiermodellen der Krankheit6,7aviär.
Viele Bakterienarten haben extrem komplexe und dynamische Mehrkomponenten-Maschinen entwickelt, die für Infektionsprozesse benötigt werden. Andere T4BSS wie das Dot/Icm-System sind auch wichtig für die intrazelluläre Replikation von bakteriellen Krankheitserregern wie Coxiella burnetii und Rickettsiella grylli. Obwohl T4BSS evolutionär mit prototypischen IVA-Systemen des Typs verwandt sind, die DNA-Übertragung vermitteln und ein begrenztes Repertoire an Effektorproteinen liefern können, verfügt das Dot/Icm-System über fast doppelt so viele Maschinenkomponenten und liefert eine Vielzahl von Effektoren. Vermutlich hat diese Erweiterung der Anzahl der Komponenten es dem Dot/Icm-Gerät ermöglicht, neue Effektoren einfach unterzubringen und zu integrieren8,9.
Kürzlich haben wir die Kryo-Elektronen-Tomographie (Cryo-ET) verwendet, um die Struktur des Dot/Icm-Geräts in situ zu lösen und zeigten, dass es einen Zellhüllen-Spannkanal bildet, der sich mit einem zytoplasmatischen Komplex verbindet. Weitere Analysen ergaben, dass der zytosolische ATPase DotB durch Wechselwirkungen mit dem zytosolischen ATPase DotO mit dem Dot/Icm-System am L. pneumophila-Zellpol assoziiert. Wir haben entdeckt, dass DotB eine zytosolische Bewegung in den meisten Bakterienzellen zeigt, was darauf hindeutet, dass diese ATPase in einer dynamischen zytosolischen Population vorhanden ist, aber auch mit den polaren Dot/Icm-Komplexen assoziiert wird. Darüber hinaus bildet DotO eine hexamerische Baugruppe von DotO-Dimeren, die mit dem inneren Membrankomplex verbunden sind, und ein DotB-Hexamer verbindet sich mit der Basis dieses zytoplasmatischen Komplexes. Die Montage des DotB-DotO-Energiekomplexes erzeugt einen zytoplasmatischen Kanal, der die Translokation von Substraten durch das T4SS leitet (Abbildung 1)10.
Trotz dieser jüngsten Fortschritte ist wenig darüber bekannt, wie das Dot/Icm-System funktioniert und wie sich jedes Protein zu einem aktiven Apparat zusammenfügt8. Die Aufdeckung der regulatorischen Schaltungen des Dot/Icm T4SS ist von grundlegender Bedeutung für das Verständnis der molekularen Mechanismen von Wirts-Pathogen-Wechselwirkungen. Daher besprechen wir, wie man mit Live-Zellmikroskopie und Kryo-ET wesentliche L. pneumophila Dot/Icm-Systemkomponenten erkennt und charakterisiert, die mit Super-Ordner GFP (sfGFP) markiert sind. Mittels quantitativer Fluoreszenzmikroskopie wird die polare Lokalisation von DotB in einem Wildtyp-Hintergrund oder beim Löschen des Typ-IV-Systems definiert. Die Zeitraffermikroskopie wird verwendet, um Unterschiede in lokalisierung und Dynamik zwischen den zytosolischen AtPases Dot/Icm zu quantifizieren.
Die kombinierte Anwendung von zwei sich ergänzenden Ansätzen wie Live Imaging und Kryo-ET bietet einen Vorteil gegenüber anderen In-vitro-Systemen. Beide Methoden werden in intakten Zellen durchgeführt und erhalten die natürliche Umgebung des T4BSS, wodurch Störungen der nativen Struktur während der Probenvorbereitung minimiert werden. Da die Überexpression von Proteinen die Stoiiometrie des Sekretionsapparates beeinträchtigen kann, werden sfGFP-Fusionen über allelischen Austausch an das Legionella-Chromosom zurückgegeben, so dass jede Fusion in einer Kopie kodiert ist und die Expression vom endogenen Promotor angetrieben wird. Die Visualisierung chromosomal-kodierter Fusionen ermöglicht die Quantifizierung des genauen Proteinniveaus, das zu einem definierten Zeitpunkt exprimiert wird. Cryo-ET hat auch viele Vorteile bei der Bestimmung der Struktur von Sekretionssystemen. Der bemerkenswerteste Vorteil ist, dass Kryo-ET-Proben aus gefrorenen intakten Zellen bestehen, die native Komplexe im Kontext der bakteriellen Zellarchitektur bewahren. Daher kann Kryo-ET biochemischen Reinigungsansätzen vorzuziehen sein, die Membrankomplexe extrahieren und periphere Proteine aus dem Kernapparat entfernen oder die Gesamtstruktur verändern können. Darüber hinaus fügt die Kennzeichnung eines von Interesse sindden Proteins mit einem sperrigen Protein wie sfGFP eine Masse hinzu, die durch Cryo-ET nachweisbar ist und bei der Kartierung der verschiedenen Unterkomplexe des Dot/Icm-Geräts auf die durch Cryo-ET erhaltene Struktur helfen kann.
Dieser Ansatz ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um strukturelle Informationen über multimolekulare Komplexe aufzudecken, die sich in der bakteriellen Zellmembran zusammensetzen. Die Interpretation von Strukturen, die mit diesen Techniken aufgeklärt werden, wird dem Feld helfen zu verstehen, wie T4BSS-Komponenten funktionieren, warum so viele Komponenten für die Funktion benötigt werden, wie die Komponenten innerhalb des größeren Komplexes interagieren und welche Funktionen diese Unterbaugruppen ausführen.
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Protocol
HINWEIS: Alle Verfahren, die das Wachstum, die Manipulation und die Bildgebung von L. pneumophila beinhalten, sollten in einem Labor der biologischen Sicherheitsstufe 2 in Übereinstimmung mit den lokalen Richtlinien durchgeführt werden.
1. Einfügung von sfGFP in L. pneumophila Chromosom mit Allelic Exchange und Double Selection Strategy (Abbildung 2, Abbildung 3)
- Klonen Sie in den Genersatzvektor pSR47S11 die folgende Sequenz: die 1.000 bp vor dem Standort von Interesse, dann die sfGFP-Sequenz, dann die 1.000 bp flussabwärts des Sehenswürdigkeiten (Abbildung 2). Die sfGFP-Sequenz sollte in Frame zu den N-Terminus- oder C-Terminus-Enden mit einem Linker platziert werden, der vier bis acht Aminosäuren enthält. Verwandeln Sie den resultierenden Vektor in E. coli DH5-pir. Später, Streifen L. pneumophila (der Empfänger) für einzelne Kolonien auf Holzkohle-Hefe-Extrakt (CYE) Agar12 enthält 100 g/ml Streptomycin und wachsen für 5 Tage bei 37 °C (Abbildung 3).
- Streak L. pneumophila auf CYE-Agar-Streptomycin und wachsen für 2 Tage bei 37 °C (schweres Pflaster)10. Streak E. coli DH5- transformiert mit pRK600 Helfer-Plasmid (Helfer)13 auf LB-Agar mit 25 g/ml Chloramphenicol. Streichen Sie den E. coli DH5-pir (Spender) auf LB-Agar, der 50 g/ml Kanamycin enthält.
- Führen Sie eine triparentale Paarung durch: inkubieren Sie eine Kolonie des Helfers, einer Kolonie des Spenders und des Empfängers, indem Sie Flecken der drei Stämme auf einer CYE-Agarplatte ohne Auswahl überlagern und 4–8 h bei 37 °C bebrüten. Als negative Kontrollen inkubieren eine Helfer +Empfänger-Stamm-Mix und ein Spender + Empfänger Stamm-Mix für den gleichen Zeitraum.
- Setzen Sie die Paarungsreaktionen in 500 l ddH2O. Platte 20 l und 50 l der Reaktionen auf CYE-Agar mit 100 g/ml Streptomycin und 10 g/ml Kanamycin wieder auf und wachsen 5 Tage bei 37 °C. Streifen vier der resultierenden Klone auf CYE-Agar, der 100 g/ml Streptomycin enthält, und wachsen 5 Tage lang bei 37 °C.
- Streak 16 Klone auf CYE-Agar mit 5% Saccharose und 100 g/ml Streptomycin und wachsen 5 Tage bei 37 °C. Dann Streifen 32 dieser Klone auf CYE-Agar, der 100 g/ml Streptomycin enthält, und auf CYE-Agar, der 100 g/ml Streptomycin und 10 g/ml Kanamycin enthält, und 5 Tage bei 37 °C wachsen.
2. Isolierung von Klonen, die sfGFP in das L. pneumophila Chromosom integriert haben
- Streifenklone, die empfindlich auf Kanamycin auf CYE-Agar-Streptomycin-Platten waren und bestätigen das Einbringen von sfGFP in das Chromosom mit Kolonie PCR. Verwenden Sie Primer, die das sfGFP-Gen und den chromosomalen Bereich von Interesse ergänzen, um die Einfügekreuzung zu verstärken.
- Mischen Sie 0,5 l der 10-M-Primer-Lösungen und eine Kolonie auf ein Endvolumen von 12,5 l und denaturieren Sie 10 min bei 95 °C. 10 min auf Eis abkühlen, 12,5 L 2x PCR-Master-Mix-Lösung hinzufügen und eine PCR-Analyse durchführen.
- Wachsen Sie schwere Flecken der isolierten Kolonien auf CYE-Agar-Streptomycin-Platten für 2 Tage bei 37 °C. Untersuchen Sie den Expressionsgehalt und die Stabilität der sfGFP-Fusionen durch Immunoblotting mit einem Anti-GFP-Antikörper.
3. Live Cell Imaging von L. pneumophila mit fluoreszierend tagged Dot/Icm Komponenten
- Zubereitung von Agarose-Pads
- Machen Sie ca. 30 ml einer 1% niedrigschmelzenden Agarose-Lösung in Wasser. Mikrowelle in einem Glaskolben für ca. 90 s, gelegentlich wirbelnd, bis die Agarose vollständig aufgelöst ist.
- Legen Sie zwei 22 x 22 x 0,15 mm3 Glasschlitten am Rand eines 25 x 75 x 1,1 mm3 Glasschlittens, einer über dem anderen. Stapeln Sie zwei weitere 22 x 22 x 0,15 mm3 Glasschlitten auf der anderen Kante.
- Pipette ca. 1 ml der geschmolzenen Agarose in die Mittelrutsche zwischen den beiden oberen Glasrutschen, dann legen Sie eine weitere 25 x 75 x 1,1 mm3 Rutsche auf die geschmolzene Agarose. Versuchen Sie, die Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Kühlen Sie die Dias bei 4 °C für 15 min.
- Schneiden Sie das Pad mit einem Skalpell oder einer Rasierklinge vorsichtig in kleine Quadrate, 5 x 5 mm2. Befestigen Sie einen doppelseitigen Klebstoff 17 x 28 x 0,25 mm3 Rahmen auf einem 25 x 75 x 1,1 mm3 Glasschlitten und legen Sie mehrere Pads auf dem Schlitten.
- Bildaufnahme
HINWEIS: Die folgenden Schritte werden für ein Mikroskop beschrieben, das unter der Kontrolle von SlideBook 6.0 steht und mit Festkörper-Beleuchtungskörpern, EINER CCD-Monochromkamera und einem 100-fachen Objektiv (1,4 numerische Blende) ausgestattet ist. Verwenden Sie bei Bedarf alternative Mikroskopiegeräte mit entsprechenden Hardware- und Softwarekonfigurationen, die an die Protokolleinstellungen angepasst werden können.- Lösen Sie ein schweres Pflaster von L. pneumophila in 1 ml ddH2O, Wirbel und Pipet 2–3 l der Verdünnung auf die Pads. Legen Sie einen 50 x 24 x 0,15 mm 3-Abdeckungsrutsch sanft über den Kleberahmen.
- Passen Sie im Aufnahmefenster die ND auf 180 an. Passen Sie das Binning auf 2x2 an und verwenden Sie den 488 nm-Kanal, um die Probe zwischen 500–1.000 ms freizulegen. Validieren Sie die Spezifität des Fluoreszenzsignals, indem Sie nicht markierte L. pneumophila mit den gleichen Parametern abbilden (Abbildung 4).
4. Quantifizierung der Polarlokalisierung und Dynamik von Punkt/Icm-Komponenten
HINWEIS: Die folgenden Schritte sind für Bilder mit 0,129 m pro Pixel konzipiert, die mit 2 x 2 Binning aufgenommen wurden.
- Quantifizierung der Polarität für sfGFP-Fusionsproteine (Abbildung 5)
- Passen Sie den Bildkontrast so an, dass die Bakterien deutlich sichtbar sind. Verwenden Sie das Regionswerkzeug, um ein Rechteck von 0,25 x 1,3 m2 am Pol zu platzieren, das sich in das Zytoplasma ausdehnt. Das Rechteck muss genau innerhalb der bakteriellen Grenzen bleiben.
- Markieren Sie mindestens 200 Bakterien, und verwenden Sie die Schaltfläche "Region zum Maskieren", um Masken für die Interessengebiete zu erstellen. Wählen Sie unter Maskenstatistik und Maskenbereich Objektaus. Markieren Sie dann unter Features und Intensität die mittlere Intensität und Varianz.
- Exportieren Sie die Daten und berechnen Sie die Polaritätswerte jedes Bakteriums als Verhältnis zwischen der Varianz und der mittleren Intensität.
- Für Anwendungen mit hohem Durchsatz verwenden Sie ein Phasenobjektiv und ein entsprechendes Kondensator-Setup, um Bilder mit den Phasen- und 488 nm-Kanälen zu erfassen. Achten Sie darauf, Sichtfelder zu wählen, in denen die Bakterien vollständig getrennt sind.
- Passen Sie den Phasenkanalkontrast des Bildes auf eine Ebene an, auf der die Bakterien deutlich sichtbar sind. Öffnen Sie das Dual-Channel-Bild, starten Sie das Fenster Segmentmaske erstellen und ändern Sie den Kanal in Phase.
- Passen Sie einen geeigneten Schwellenwert an, und entfernen Sie kleine Objekte mit der Schaltfläche Objekte definieren. Wählen Sie unter Maske verfeinern die Option Kantenobjekte entfernen und später separate Masken von Bakterien, die nebeneinander liegen.
- Berechnen Sie die Polaritätswerte des Signals im 488-Kanal für jede Zelle, wie zuvor in den Schritten 4.1.2–4.1.3 beschrieben.
- Quantifizierung der Dynamik für sfGFP-Fusionsproteine (Abbildung 6)
HINWEIS: Befolgen Sie die Anweisungen in Abschnitt 3, um ein Beispiel für die Bildaufnahme vorzubereiten. Dynamik ist definiert als Änderungen der Intensität im Laufe der Zeit und die folgenden Schritte sind für kurze Bildgebungszeiträume (d. h. mehrere Minuten) ausgelegt. Fügen Sie dem Pad die entsprechenden Ergänzungen hinzu, wenn längere Bildgebungszeiten gewünscht werden.- Markieren Sie im Fenster Bildaufnahme Zeitraffer, geben Sie die Zeit der Intervalle in das Intervallfeld ein, und geben Sie 2 in das Feld Zeitpunkte ein. Erwerben Sie zwei aufeinanderfolgende Bilder von L. pneumophila, die das fluoreszierende Protein von Interesse ausdrücken.
- Passen Sie den Bildkontrast an, bis die Zellen deutlich sichtbar sind. Folgen Sie Abbildung 6A und den folgenden Beschreibungen, um drei verschiedene Masken zu platzieren. Verwenden Sie das Regionswerkzeug, um ein Quadrat von 0,25 x 0,25 m in der Mitte von mindestens 400 Zellen zu platzieren.
- Verwenden Sie die Schaltfläche "Zu maskieren Region", um eine Maske (Maske 1) der interessenden Quadrate zu erstellen. Erstellen Sie eine neue leere Maske (Maske 2) und verwenden Sie das Pixelwerkzeug oder das Polygonwerkzeug, um die gesamte Zellfläche von mindestens 25 zufälligen Zellen zu markieren, die zum Berechnen der Fluoreszenzbleiche verwendet wird. Erstellen Sie eine neue leere Maske (Maske 3), und markieren Sie mit dem großen Pinselwerkzeug Bereiche zwischen den Zellen, die für die Hintergrundsubtraktion verwendet werden.
- Wählen Sie unter Maskenstatistik und Maskenbereich Objekt für Maske 1 und Maske 2 aus. Wählen Sie dann unter Features und Intensität die mittlere Intensität aus und exportieren Sie die Daten der beiden Masken. Exportieren Sie für Maske 3 die mittlere Intensität der gesamten Maske.
- Berechnen Sie die Änderung der Fluoreszenzintensität für jedes Objekt in Maske 1 mit den folgenden Formeln:
wobei Maske 1 ein quadratisch von 0,25 m bei 0,25 m in der Zellenmitte ist, Maske 2 die gesamte Zelle abdeckt, Maske 3 der Hintergrund zwischen den Zellen, t1 die mittlere Intensität im ersten Zeitpunkt und t2 die mittlere Intensität im zweiten Zeitpunkt ist.
5. Detektion der sfGFP-Massendichte mit Cryo-ET
- Probenvorbereitung, Datenerfassung und -rekonstruktion
- Wachsen Sie einen schweren Fleck L. pneumophila, der ein fluoreszierend markiertes Dot/Icm-Protein auf CYE-Agar-Streptomycin-Platten 48 Stunden lang bei 37 °C ausdrückt. Setzen Sie die Zellen in ddH2O bis OD600 0,7 wieder aus. Fügen Sie 5 l kolloidale Goldpartikel (BSA Tracer, 10 nm) bis 20 l der Zellsuspension hinzu.
- Pipette 5 l des Zellgemisches auf frisch glühend entludtes holey Kohlenstoffgitter (R 2/1 auf Cu 200 Mesh) und 1 min stehen lassen. Mit Filterpapier bloten und in flüssigem Ethan mit einem schwerkraftgetriebenen Kolbengerät einfrieren, wie zuvorbeschrieben 14,15.
- Stellen Sie die gefrorenen Hydratten mit einem 300 kV Transmissionselektronenmikroskop auf, das mit einer Feldemissionspistole, einem Energiefilter, einer Volta-Phasenplatte und einer Direktdetektionsvorrichtung ausgestattet ist. Sammeln Sie einachsige Neigungsreihen mit 26.000x bzw. 42.000x Vergrößerungen, die zu Pixelgrößen auf der Probenebene von 5,4 x/Pixel bzw. 3,4 X/Pixel führen.
- Verwenden Sie das tomographische Paket SerialEM, um Bildstapel mit einem Neigungswinkelbereich zwischen -60° und +60° mit 3° Schrittinkrement und einer akkumulativen Dosis von 60 e-/2,16zu sammeln. Richten Sie dosisfraktionierte Filmbilder in jedem Stapel mit MotionCor217aus. Montieren Sie driftkorrigierte Stapel mit TOMOAUTO14.
- Ausrichtung von driftkorrigierten Stapeln durch die IMOD-Marker-abhängige Ausrichtung18. Rekonstruieren Sie Tomogramme mit der SIRT-Methode19 für Segmentierungen und direkte Bildanalyse und der WBP-Methode20.
- Subtomogrammanalyse von sfGFP-Fusionsproben
- Verwenden Sie das tomographische Paket I3 (0.9.9.3) für die Subtomogrammanalyse14,21,22.
ANMERKUNG: Die Ausrichtung verläuft iterativ, wobei jede Iteration aus drei Teilen besteht, in denen Referenzen und Klassifizierungsmasken generiert, Subtomogramme ausgerichtet und klassifiziert werden und Klassendurchschnitte aneinander ausgerichtet werden. - Verwenden Sie 4 x 4 x 4 binned Subtomogramme für eine anfängliche Ausrichtung. Verschmelzen Sie Partikel, die zu den Klassendurchschnitten gehören, und zeigen Sie eine Elektronendichte, die sfGFP entspricht. Nach dem Sortieren von Partikeln mit sfGFP-Fusionen verwenden Sie 2 x 2 x 2 binned Subtomogramme für eine fokussierte Ausrichtung eines Bereichs von Interesse (wie den Dot/Icm zytoplasmatischen ATPase-Komplex), um eine hochauflösende Struktur zu erhalten.
- Verwenden Sie das tomographische Paket I3 (0.9.9.3) für die Subtomogrammanalyse14,21,22.
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Representative Results
Homologe Rekombination mit doppelter Auswahl in zwei Schritten wurde verwendet, um die definierte Einfügung von sfGFP zu konstruieren. Im ersten Schritt wurde eine triparentale Paarung durchgeführt, bei der das konjugative Plasmid pRK600 (ein IncP-Plasmid) aus dem E. coli-Helferstamm MT616 mit dem Selbstmordvektor pSR47S, der das sfGFP-Gen enthält, das von den beiden homologen Regionen, dem Ursprung des TransferoriTs und dem Bacillus subtilis-Gegenselektions-SacB, flankiert wurde, zum Spender E. coli-Stamm mobilisiert wurde. Als nächstes unterstützte das Konjugationssystem von pRK600 die Mobilisierung des pSR47S-Derivats in L. pneumophila (Lp01, Abbildung 2A). Klone, die pSR47S durch ein einziges Crossover-Ereignis erfolgreich integriert haben, wurden aufgrund des Antibiotikaresistenzgens KanR ausgewählt und vermehrtt, um eine zweite Frequenzweiche zu ermöglichen. Klone, die das SacB-Gen während des zweiten Crossovers verloren haben, wurden ausgewählt, indem die Zellen auf die gegenselektive Agentin Saccharose plattiert wurden (Abbildung 2, Abbildung 3). Die Immunoblot-Analyse mit einem Anti-GFP-Antikörper (-GFP) wurde durchgeführt, um festzustellen, ob das sfGFP gespaltet wurde, und um die Stabilität und den Expressionsgrad des Fusionsproteins in einem wilden Typ oder in einer vollständigen Punkt/icm-Deletionsmutant zu bewerten. Darüber hinaus wurde vor der Mikroskopie die korrekte Integration des sfGFP-Gens in das Chromosom durch PCR bestätigt (Abbildung 3). Sobald die Stabilität und die Integration der Fusionen bestätigt wurden, wurde eine livezellfluoreszierende Mikroskopie durchgeführt und die Spezifität des fluoreszierenden Signalklons mit einem elterlichen sfGFP-negativen Stamm verglichen. Darüber hinaus wurde die duale Bildgebung mittels Hellfeld- oder Phasenmikroskopie verwendet, um den Anteil der Zellen zu untersuchen, die ein bestimmtes fluoreszierendes Signal besaßen (Abbildung 4).
Nur ein Bruchteil der Zellen, die DotB-sfGFP produzierten, zeigte eine polare Lokalisation des Fusionsproteins (Abbildung 5A). Um die Verteilung des DotB-Fluoreszenzsignals zu charakterisieren, wurde die Intensität von DotB-sfGFP entlang der Längsachse in diesen Zellen quantifiziert. Die DotB-Intensität an den Polen war etwa 2x höher als im Zytosol (Abbildung 5B). Da es wichtig ist, festzustellen, ob die Lokalisierung fluoreszierend markierter Fusionsproteine biologische Relevanz hat, haben wir gefragt, ob die DotB-sfGFP Polarlokalisierung von einem vollständig montierten T4BSS abhängig war. Daher wurden Polaritätswerte von DotB-sfGFP, die das Verhältnis der mittleren Fluoreszenz an den Polen gemessenen Werten im Vergleich zur Fluoreszenz, die in der Mitte der Zelle gemessen wurde, für einzelne Zellen in einem wilden Typ und in einer T4BSS-Mutation bestimmt (Abbildung 5C–E). Tatsächlich haben die Streichungen des gesamten Dot/Icm-Systems die polare Positionierung von DotB-sfGFP aufgehoben und bestätigt, dass polare Punktzeichen eine Assoziation von DotB mit dem T4SS und die Bedeutung der Dot/Icm-Maschine für die Rekrutierung dieser ATPase darstellen. In den meisten L. pneumophila Zellen zeigte DotB-sfGFP auch zytosolische Bewegung, was darauf hindeutet, dass es in einer dynamischen zytosolischen Population vorhanden ist, aber auch in der Lage ist, sich mit dem polaren Dot/Icm-Komplex zu verbinden. Um die Unterschiede in der dynamischen Bewegung zwischen dotO und DotB ATPases zu quantifizieren, wurden zwei aufeinanderfolgende Bilder erfasst und Veränderungen der Fluoreszenzintensität ermittelt und mit sfGFP verglichen (Abbildung 6A). Während sfGFP und DotO-sfGFP wenig bis gar keine dynamischen Muster zeigten, wurden DotB-sfGFP-Intensitätsänderungen im Cytosol verschoben und waren deutlich höher. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass die DotB ATPase in einer dynamischen zytosolischen Population vorhanden war und bei einer späten Montagereaktion wurde die räumlich dynamische DotB ATPase an den polarlokalisierten Dot/Icm T4SS rekrutiert (Abbildung 6B).
Um die räumliche Position von DotB relativ zur Dot/Icm-Maschine zu definieren, wurde der Hochdurchsatz-Cryo-ET verwendet, um das intakte T4BSS-Gerät in einem L. pneumophila-Stamm zu visualisieren, der DotB-sfGFP ausdrückt. Zunächst wurde die Rekonstruktion einer L. pneumophila Zelle, die DotB-sfGFP exdrückte, durchgeführt und zeigte typische multiple kegelförmige Komplexe, die in die Zellhülle eingebettet waren (Abbildung 7A, B). Wir haben zuvor mit epistatischen Experimenten mit einer Vielzahl von Dot/Icm-Mutationen, Fluoreszenzmikroskopie und Kryo-ET demonstriert, dass DotB sich räumlich unterhalb einer einzigartigen Baugruppe des ATPase DotO10befindet. Die Subtomogramm-Mittelung des Dehnungsexekts DotB-sfGFP bestimmte die Gesamtpositionierung von DotB in Bezug auf die intakte T4BSS-Maschine. Diese Analyse ergab eine zusätzliche Dichte, die mit der zusätzlichen Masse von sfGFP korreliert (Abbildung 7C). Schließlich zeigen dreidimensionale Oberflächendarstellungen des gesamten Dot/Icm T4SS an, dass sfGFP unterhalb des DotB-Hexamers positioniert ist, der sich als Scheibe an der Basis des zytoplasmatischen ATPase-Komplexes zusammensetzt (Abbildung 8)10.
Abbildung 1: Dreidimensionale Oberflächendarstellungen von L. pneumophila Dot/Icm T4SS. OM = äußere Membran, IM = innere Membran, PG = peptidoglycan. Das Bild wurde von Chetrit D. et al.10geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Schematische Übersicht über homologe Rekombination und Allelaustausch, die verwendet werden, um sfGFP in das L. pneumophila-Chromosom einzufügen. (A) Triparental E. coli-Stamm wurde zwischen einem E. coli MT616-Helferstamm durchgeführt, der das konjugative Plasmid pRK600 (ein IncP-Plasmid) beherbergt, einen Spender-E. coli-Stamm, der mit dem Selbstmordvektor pSR47S transformiert wird, und L. pneumophila als Empfänger. (B) Schematisches Modell, das die Schritte darstellt, die erforderlich sind, um sfGFP in das L. pneumophila Chromosom einzufügen, um C-terminale sfGFP-Fusionsproteine zu erzeugen. Die Auswahl von Allelic-Austauschmutanten erfolgte in zwei Schritten mit Kanamycin und dem gegenwählbaren Marker sacB. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Der allelic Exchange-Assay-Workflow. L. pneumophila wurde auf die entsprechenden Auswahl- und Wachstumszeiten gestreift (Details siehe Protokollabschnitt). Später wurde das Einbringen von sfGFP in das Chromosom mit Kolonie-PCR mit Primern bestätigt, die das sfGFP-Gen ergänzen, und in den Chromosomenbereich, der die Insertionsstelle flankiert. Die Stabilität des Fusionsproteins wurde durch Immunoblot-Analyse mit einem Anti-GFP-Antikörper untersucht. Untere linke Panels: Lane 1 = nicht markiert Lp01, Lane2 = sfGFP ausgedrückt aus dotB operon, Lane 3 = DotB-sfGFP ausgedrückt in einem vollständigen Punkt/icm Löschmutant, Lane 4 = DotB-sfGFP in einem wilden Typ Hintergrund ausgedrückt. WB = westlicher Blot. Die Anzahl der in jedem Schritt analysierten Klone wird in Klammern angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Live-Zell-Bildgebung von L. pneumophila, die fluoreszierend markierte Dot/Icm-Untereinheiten ausdrückt. (A) L. pneumophila aus einem zweitägigen schweren Pflaster wurde in ddH2O wieder ausgesetzt und auf 1% niedrigschmelzende Agarose-Pads platziert. (B) Die Spezifität des Fluoreszenzsignals eines Stammes, der DotB-sfGFP chromosomal kodiert, wurde mit dem elterlichen GFP-negativen Lp01-Stamm verglichen. Skalenbalken = 3 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Quantifizierung der polaren Lokalisierung von Dot/Icm-Systemuntereinheiten. (A) Die Echtzeit-Visualisierung von DotB-sfGFP, ausgedrückt in Lp01, zeigte eine polare Lokalisation. DotB-sfGFP zeigte ein diffuses Muster, wenn es in einem Stamm ausgedrücktwurde, bei dem der gesamte Dot/icm-Gencluster gelöscht wurde. Unfundiertes sfGFP, ausgedrückt aus dem dotB-Operon, zeigte ein diffuses zytosolisches Muster und diente als Kontrolle. Skalenbalken = 3 m. (B) Quantifizierung der DotB-sfGFP-Fluoreszenzintensität entlang der Längsachse von Zellen mit polaren oder diffusen Mustern. Die Probengrößen waren n = 20 Zellen für polare und unpolare Zellen. *p = 0,02, **p bei 0,0001. Die Signifikanz wurde durch den t-Test des zweischwanzigen Schülers berechnet und mit der Intensität am Pol verglichen. (C) Schematisches Modell der Masken zur Quantifizierung der Polarität. (D) DotB-sfGFP wie in Abbildung 5A dargestellt mit den Masken zur Quantifizierung der Polarität. (E) Die Fülle von DotB-sfGFP an den Polen, wenn es in einem Wildtyp-Hintergrund ausgedrückt wird oder wenn der gesamte Dot/icm-Gencluster gelöscht wurde, wird als Frequenzkurven angezeigt. Die Probengrößen waren n = 200 Zellen für jeden Stamm. * p < 0,0001. Die Signifikanz wurde durch den zweischwänzigen Mann Whitney-Test berechnet und mit sfGFP verglichen, die aus dem dotB-Operon ausgedrückt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Quantifizierung der Dynamik von Dot/Icm fluoreszierenden Fusionen. (A) Ein schematisches Modell, das die Masken darstellt, die zur Quantifizierung der Veränderungen der Fluoreszenzintensität für ein dynamisches oder statisches sfGFP-Fusionsprotein verwendet werden. T1,2 sind die Zeit des ersten und zweiten Zeitpunkts und m1,2,3 sind Maske 1, Maske 2 und Maske 3. (B) Die Dynamik von DotB-sfGFP, DotO-sfGFP und sfGFP, ausgedrückt aus dem DotB-Operon, wird als Frequenzkurven angezeigt. Die Probengrößen waren n = 400 Zellen für jeden Stamm. *p = 3,4 x 10-12, ***p = 1,0 x 10-147. Die Signifikanz wurde durch den t-Test des zweischwanzigen Studenten im Vergleich zu sfGFP berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Subtomogramm-Mittelung wird verwendet, um die sfGFP-Dichte von DotB-sfGFP zu bestimmen. (A) Eine tomographische Scheibe, die mit 26.000-facher Vergrößerung von einer repräsentativen L. pneumophila-Zelle erworben wurde, die DotB-sfGFP ausdrückt und mehrere Dot/Icm-Maschinen zeigt, die in die Zellhülle eingebettet sind. (B) Eine tomographische Scheibe, die mit einer 42.000-fachen Vergrößerung desselben L. pneumophila-Zellpols erworben wurde, die in Adargestellt ist. OM = äußere Membran, IM = innere Membran. (C) Eine Rekonstruktion aus einer Sorte, die DotB-sfGFP ausdrückt, zeigt Dichten, die DotB und sfGFP (gelbe Pfeile) entsprechen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Dreidimensionale Oberflächendarstellungen des zytosolischen Dot/Icm-Komplexes. Dreidimensionale Oberflächendarstellungen der gesamten Dot-Icm T4SS von den Stämmen"dotB " (A), wild type (B) und dotB-gfp (C) L. pneumophila. (D) Die Struktur des zytosolischen Komplexes zeigt die Positionierung von DotB (lila) und sfGFP (grün). Die Röntgenstruktur von DotB (PDB: 6GEB23) wurde an die DotB-Karte angedockt. IM = Innenmembran. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Aufklärung der Funktionen bakterieller Sekretionssysteme ist der Schlüssel zu einem vollständigen Verständnis der Wirts-Pathogen-Wechselwirkungen. Sekretionssysteme sind komplexe Maschinen, die Effektorenproteine in Wirtszellen injizieren können und in einigen Fällen die Etablierung einer subzellulären Nische fördern, die die bakterielle Replikation unterstützt. Die obige Methode bietet wichtige neue Werkzeuge für die Untersuchung des Dot/Icm-Sekretionssystems des reinspiratorischen bakteriellen Erregers Legionella pneumophila und liefert Hinweise auf die Mechanismen der Effektortranslokation, die für seine Pathogenität unerlässlich sind. Dieser Ansatz kann auf andere Sekretionssysteme angewendet werden, indem live bakterielle Zellbildgebung und Strukturstudien verwendet werden, um ihre Aktivität auf molekularer Ebene zu sezieren. Dies kann erreicht werden, indem die raumzeitliche Dynamik von fluoreszierend markierten Sekretionssystemkomponenten mittels Zeitraffer-Videomikroskopie untersucht wird.
Wir konstruierten saubere und nicht markierte Mutationen, bei denen ein Gen markiert oder durch ein modifiziertes Allel ersetzt wurde, was ein grundlegender Ansatz für das Verständnis der Pathogenität auf molekularer Ebene sowie für die Definition von Struktur-Funktions-Beziehungen ist, die zur Produktion von Medikamenttherapien führen können24,25. Stämme von L. pneumophila, die genetisch verändert wurden, um einzelne Dot- und Icm-Proteine zu eliminieren, können verwendet werden, um die Struktur des Dot/Icm-Systems durch Kryo-ET zu bestimmen. Ein wichtiger Schritt im Protokoll ist der Vergleich der Funktionalität von N-terminus und C-terminus getaggten Proteinen. Daher sollten Stämme, die die Fusionen kodieren, auf die Replikation in eukaryotischen Wirtszellen getestet, durch Mikroskopie visualisiert werden, um festzustellen, ob die markierte Proteinlokalisierung in der Bakterienzelle von einer vollständig zusammengesetzten Sekretionsmaschine abhängig ist, und auf die Stabilität von Proteinen aus vor- und nachgelagerten Genen untersucht werden.
Dieses Protokoll nutzt Live-Zellmikroskopie-Experimente, die häufig verwendet werden, um komplexe biologische Prozesse wie Signaltransduktion, Selbstmontage, aktiven Handel und Genregulation zu untersuchen. Das Verständnis der Dynamik, der Flugbahnen und der Wechselwirkungen einzelner Teilchen in Zellen stellt einen grundlegenden Ansatz in der Zellbiologiedar 26. Da jedoch die Verfolgung einzelner Partikel aufgrund schneller molekularer Bewegungen oder eines niedrigen Signal-Rausch-Verhältnisses möglicherweise nicht immer möglich ist, kann die Bewertung von Veränderungen der Fluoreszenzintensität als einfacher Ansatz zur Quantifizierung von Unterschieden in Dynamikmustern dienen. Da für die Analyse nur zwei Zeitpunkte erforderlich sind, garantiert diese Methode nur eine minimale Exposition der Probe gegenüber fluoreszierendem Licht und verhindert somit eine größere Bleichung der sfGFP-Fluoreszenzintensität. Da die Agarose-Pads keine Nährstoffquelle enthalten, ist es wichtig zu beachten, dass live gebildte Bilder sofort nach der Entnahme der Zellen von den CYE-Agarplatten durchgeführt werden sollten. Wenn längere Zeiträume der Bildgebung Zeit erforderlich sind, dann Ergänzungen, die L. pneumophila Überleben und Wachstum unterstützen sollte zu den Pads hinzugefügt werden. Die Bestimmung der Polarität fluoreszierend markierter Proteine kann auch für Anwendungen mit hohem Durchsatz modifiziert werden. Wenn diese benötigt werden, sollten ein Phasenziel und ein geeigneter Kondensatoraufbau verwendet werden, um Dual-Channel-Bilder (d. h. Phasen- und Fluoreszenzkanäle) zu erfassen. Es ist wichtig, Felder zu wählen, in denen die Bakterien vollständig getrennt sind. Verwenden Sie den Phasenkanal, um ganze Zellen zu maskieren und das Verhältnis der Intensitäten wie oben beschrieben zu quantifizieren.
Die Kryo-Elektronenmikroskopie (Cryo-EM) und kryo-ET bieten eine robuste Visualisierung von Nanopartikeln. Diese Techniken beinhalten die Abbildung der Probe in einem gefrorenen hydratisierten Zustand, so dass die Visualisierung von Nanopartikeln im Wesentlichen, wie sie in ihrer zellulären Umgebung existieren27. Da die Auflösung durch die Dicke der Probe begrenzt ist, weisen die durch Kryo-ET erhaltenen Strukturen eine niedrigere Auflösung auf als die, die durch Kryo-EM erhalten werden. Da in jedem Bild Tomogramm Typ IV-Maschinen jedoch in mehreren Kopien vorhanden sind, kann eine erhöhte Auflösung durch Erhöhung der Stichprobengröße für die Subtomogrammmittelung erreicht werden. Ein großer Vorteil von cryo-ET ist, dass die Visualisierung komplexer Baugruppen in intakten Bakterienzellen ihre Struktur besser erhalten kann, was bei der Extraktion aus ihrer natürlichen Umgebung drastische Veränderungen erfahren kann.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Untersuchung dynamischer Prozesse und die Lokalisierung von Molekülen zu den ersten Schritten zum Verständnis der Funktion biologischer Systeme gehören. Die Stärke und der Fokus der hier beschriebenen Methode ist die direkte Visualisierung von Dot/Icm-Komponenten in lebenden Bakterien, die die Möglichkeit bietet, dynamische Prozesse aufzudecken, die die Funktionen von Maschinen des Typs IVB oder anderen Multiprotein-Baugruppen regeln. Darüber hinaus ist die Kopplung von Live-Bildgebung mit Kryo-ET eine Strategie, die die Charakterisierung von Schlüsselkomponenten in der Dot/Icm-Maschine in Bezug auf die größere Struktur des Legionella pneumophila Sekretionssystems und das Verständnis, wie sie zusammenbauen und direkte Konformationsänderungen im Apparat ermöglichen. Eine Einschränkung der fluoreszierenden Protein-Tags, die zur Untersuchung des Proteinverhaltens in lebenden Zellen verwendet werden, ist ihre relativ große Größe, die die Funktion und die Eigenschaften des markierten Proteins beeinflussen könnte. Anschließend ist eine Bewertung der Stabilität und Funktionalität erforderlich. Eine weitere Einschränkung dieses Ansatzes besteht darin, dass derzeit keine atomaren Strukturen aufgrund der begrenzten Auflösung, die sich aus der Dicke der Probe ergibt, erreicht werden können. Modellierung und Anpassung können eine effektive Möglichkeit sein, die Dichten zu analysieren, wodurch die Lokalisierung von Untereinheiten oder die Auswertung von Konformationsänderungen ermöglicht werden. Künftige Untersuchungen und die weitere Perfektionierung dieses Ansatzes werden zu einem besseren Verständnis dafür führen, wie verschiedene Baugruppen einen funktionellen Typ-IV-Apparat umfassen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
D.C. und C.R.R. wurden vom NIH (R37AI041699 und R21AI130671) unterstützt. D.P., B.H. und J.L wurden von den National Institutes of Health (R01AI087946 und R01GM107629) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 nm colloidal gold particles | Aurion | 25486 | |
| 100x Plan Apo objective (1.4 NA) | Nikon | ||
| ACES | Sigma-Aldrich | A9758 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C5510 | |
| Agaroze GPG/LMP, low melt | American bioanalytical | AB00981 | |
| Bacto dehydrated agar | BD | 214010 | |
| CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera | Photometrics | ||
| Gene Frame, 1.7x2.8 cm, 125 µL | Fisher Scientific | AB-0578 | |
| Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh | Quantifoil | Q225-CR1 | |
| Iron(III) nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | 216828 | |
| K2 Summit camera for cryo-EM | GATAN | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| Microscope cover slides 22x22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope cover slides 24x50 mm | Fisher Scientific | 12-545K | |
| Microscope slides 25x75x1 mm | Globe Scientific | 1380 | |
| SlideBook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Spectra X light engine | Lumencor | ||
| Taq 2X Master Mix | New England BioLabs | M0270 | |
| Titan Krios | Thermo Fisher Scientific | ||
| Yeast Extract | BD | 212750 |
References
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