Summary
A imagem de células bacterianas é uma abordagem de biologia de sistemas emergentes focada na definição de processos estáticos e dinâmicos que ditam a função de grandes máquinas macromoleculares. Aqui, a integração da imagem quantitativa de células vivas e tomografia crio-elétron é usada para estudar a arquitetura e funções do sistema de secreção legionella tipo IV.
Abstract
O sistema de secreção Dot/ICM da pneumophila Legionella é uma nanomáquina complexa do sistema de secreção tipo IV (T4SS) que localiza no pólo bacteriano e media a entrega de substratos de proteína e DNA às células-alvo, um processo que geralmente requer contato direto entre células. Recentemente, resolvemos a estrutura do aparelho Dot/Icm por tomografia crio-elétron (crio-ET) e mostramos que ele forma um canal de abrangência de envelopes de células que se conecta a um complexo citoplasmático. A aplicação de duas abordagens complementares que preservam a estrutura nativa do espécime, a microscopia fluorescente em células vivas e crio-ET, permite a visualização in situ de proteínas e assimilação da estequiometria e tempo de produção de cada componente da máquina em relação a outras subunidades do Ponto/Icm. Para investigar os requisitos para o posicionamento polar e para caracterizar características dinâmicas associadas à biogênese da máquina T4SS, fundimos uma proteína fluorescente verde de codificação de genes de superpasta para genes Dot/Icm ATPase em suas posições nativas no cromossomo. O método a seguir integra a microscopia quantitativa de fluorescência de células vivas e crio-ET para quantificar a localização polar, a dinâmica e a estrutura dessas proteínas em células bacterianas intactas. A aplicação dessas abordagens para o estudo da Legionella pneumophila T4SS é útil para caracterizar a função do sistema Dot/Icm e pode ser adaptada para estudar uma grande variedade de patógenos bacterianos que utilizam o T4SS ou outros tipos de complexos de secreção bacteriana.
Introduction
Legionella pneumophila (L. pneumophila), o agente etiológico da doença dos Legionários, habita reservatórios de água doce, onde as bactérias se propagam infectando e replicando dentro de protozoários aquáticos de natação livre. L. pneumophila causa surtos de doenças em humanos quando ocorre inalação de bactérias aerossolizadas de fontes de água potável. Nas células infectadas, a subversão das vias hospedeiras permite que a L. pneumophila atrase a maturação endocítica do vacúolo em que reside e promova a biogênese de um compartimento celular que suporta a replicação bacteriana. Este processo é conduzido por um sistema especializado de secreção de tipo bacteriano IVB (T4BSS) conhecido como Ponto/Icm e seu repertório de mais de 300 proteínas "eficazes" que são translocadas no citosol hospedeiro durante a infecção para facilitar a manipulação das funções celulares1,2,3,4,5. Mutantes sem um aparelho funcional Dot/Icm não conseguem entregar os efeitos no citosol hospedeiro, são defeituosos para replicação intracelular e são aviudores em modelos animais da doença6,7.
Muitas espécies bacterianas desenvolveram máquinas multicomponentes extremamente complexas e dinâmicas que são necessárias para processos de infecção. Outros T4BSS como o sistema Dot/Icm também são essenciais para a replicação intracelular de patógenos bacterianos como Coxiella burnetii e Rickettsiella grylli. Embora o T4BSS esteja evolutivamente relacionado aos sistemas iva do tipo prototípico, que mediam a transferência de DNA e podem fornecer um repertório limitado de proteínas eficazes, o sistema Dot/Icm tem quase o dobro de componentes da máquina e fornece uma grande variedade de efeitos. Presumivelmente, essa expansão no número de componentes permitiu que o aparelho Dot/Icm acomodasse e integrasse facilmente novos efeitos8,9.
Recentemente usamos a tomografia crio-elétron (crio-ET) para resolver a estrutura do aparelho Dot/Icm in situ e mostramos que ele forma um canal de abrangência de envelopes de células que se conecta a um complexo citoplasmático. Análises posteriores revelaram que o citosolicatat ATPase DotB associa-se ao sistema Dot/Icm no pólo celular L. pneumophila através de interações com o citosolicatATPase DotO. Descobrimos que o DotB apresenta um movimento citosólico na maioria das células bacterianas, indicando que este ATPase está presente em uma população citossólica dinâmica, mas também se associa aos complexos polares do Dot/Icm. Além disso, DotO forma uma montagem hexamérica de dimers DotO associados com o complexo de membrana interna, e um Hexamer DotB se junta à base deste complexo citoplasmático. A montagem do complexo energético DotB-DotO cria um canal citoplasmático que direciona a translocação de substratos através do T4SS (Figura 1)10.
Apesar desses avanços recentes, pouco se sabe sobre como funciona o sistema Ponto/Icm e como cada proteína se reúne para formar um aparelho ativo8. Descobrir os circuitos regulatórios do Ponto/Icm T4SS é fundamental para compreender os mecanismos moleculares das interações hospedeira-patógena. Portanto, discutimos como usar a microscopia de células vivas e crio-ET para detectar e caracterizar componentes essenciais do sistema L. pneumophila Dot/Icm que são marcados com a super pasta GFP (sfGFP). Utilizando microscopia quantitativa de fluorescência, a localização polar do DotB será definida em um tipo de fundo selvagem ou quando o sistema tipo IV for excluído. A microscopia de lapso de tempo será usada para quantificar diferenças na localização e dinâmica entre os ATPas citosolic do TT/ICM.
A aplicação combinada de duas abordagens complementares, como imagem ao vivo e crio-ET, proporciona uma vantagem em comparação com outros sistemas in vitro. Ambos os métodos são realizados em células intactas e preservam o ambiente natural do T4BSS, minimizando assim a interrupção da estrutura nativa durante a preparação da amostra. Como a superexpressão das proteínas pode prejudicar a estequiometria do aparelho de secreção, as fusões sfGFP são devolvidas através da troca alélica ao cromossomo Legionella para que cada fusão seja codificada em cópia única e a expressão seja conduzida pelo promotor endógeno. A visualização de fusões codificadas cromossomicamente permite quantificação do nível exato de proteína sendo expressa em um ponto de tempo definido. O Cryo-ET também tem muitas vantagens para determinar a estrutura dos sistemas de secreção. A vantagem mais notável é que as amostras crio-ET são compostas de células intactas congeladas que preservam complexos nativos no contexto da arquitetura celular bacteriana. Consequentemente, o crio-ET pode ser preferível às abordagens de purificação bioquímica, que extraem complexos de membrana e podem retirar proteínas periféricas do aparelho central ou modificar a estrutura geral. Além disso, a marcação de uma proteína de interesse com uma proteína volumosa como o sfGFP adiciona uma massa que é detectável pelo crio-ET e pode auxiliar no mapeamento dos diferentes subcomplexos do aparelho Dot/Icm na estrutura obtida pelo crio-ET.
Esta abordagem é uma poderosa ferramenta para descobrir informações estruturais sobre complexos multimoleculares que se reúnem na membrana celular bacteriana. A interpretação das estruturas elucidadas usando essas técnicas ajudará o campo a entender como funcionam os componentes T4BSS, por que tantos componentes são necessários para a função, como os componentes interagem dentro do complexo maior e quais funções esses subconjuntos funcionam.
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Protocol
NOTA: Todos os procedimentos envolvendo o crescimento, manipulação e imagem de L. pneumophila devem ser realizados em um laboratório de segurança biológica nível 2 em conformidade com as diretrizes locais.
1. Inserção de sfGFP no Cromossomo L. pneumophila utilizando a Estratégia de Troca Adélia e Dupla Seleção(Figura 2, Figura 3)
- Clone no vetor de substituição genética pSR47S11 a seguinte seqüência: a 1.000 bp upstream do local de interesse, depois a seqüência sfGFP, em seguida, a 1.000 bp downstream do site de interesse(Figura 2). A seqüência sfGFP deve ser colocada no quadro para as extremidades N-terminus ou C-terminus com um linker que contém quatro a oito aminoácidos. Transforme o vetor resultante em E. coli DH5αλpir. Posteriormente, estria L. pneumophila (o receptor) para colônias únicas no extrato de levedura de carvão (CYE) ágar12 contendo 100 μg/mL de estreptomicina e crescer durante 5 dias a 37 °C(Figura 3).
- Raia L. pneumofa em CYE-ágar-estreptomicina e crescer por 2 dias a 37 °C (patch pesado)10. Raia E. coli DH5α transformada com pRK600 assistente plasmid (ajudante)13 no ágar LB contendo 25 μg/mL de clorofenicol. Streak o E. coli DH5αλpir (doador) em ágar LB contendo 50 μg/mL de kanamicina.
- Realizar o acasalamento triparental: incubar uma colônia do ajudante, uma colônia do doador e o receptor sobrepondo manchas das três cepas em uma placa de ágar CYE sem seleção e incubando por 4-8 h a 37 °C. À medida que os controles negativos incubam uma mistura de tensão helper+recipient e uma mistura de cepa doador+receptora pelos mesmos períodos de tempo.
- Resuspender as reações de acasalamento em 500 μL de ddH2O. Placa 20 μL e 50 μL das reações no ágar CYE contendo 100 μg/mL de estreptomicina e 10 μg/mL de kanamicina e crescer por 5 dias a 37 °C. Streak quatro dos clones resultantes no ágar CYE contendo 100 μg/mL de estreptomicina e crescem por 5 dias a 37 °C.
- Estrias de 16 clones no ágar CYE contendo 5% de sacarose e 100 μg/mL de estreptomicina e cresçam por 5 dias a 37 °C. Em seguida, estria 32 desses clones no ágar CYE contendo 100 μg/mL de estreptomicina e em ágar CYE contendo 100 μg/mL de estreptomicina e 10 μg/mL de kanamicina e crescer por 5 dias a 37 °C.
2. Isolamento de Clones que Integraram sfGFP no Cromossomo L. pneumophila
- Clones de raia que eram sensíveis à kanamicina em placas CYE-ágar-estreptomicina e confirmam a inserção de sfGFP no cromossomo com pcr colônia. Use primers complementares ao gene sfGFP e à região de interesse cromossômica para amplificar a junção de inserção.
- Misture 0,5 μL de cada uma das soluções de primers de 10 μM e uma colônia a um volume final de 12,5 μL e desnaturação por 10 min a 95 °C. Esfrie no gelo por 10 min, adicione 12,5 μL de solução master mix 2x PCR e realize uma análise PCR.
- Cultivar manchas pesadas das colônias isoladas em placas CYE-ágar-estreptomicina por 2 dias a 37 °C. Examine os níveis de expressão e a estabilidade das fusões sfGFP por imunoblotting com um anticorpo anti-GFP.
3. Imagem celular viva de L. pneumofa com componentes de ponto/icm marcados fluorescentemente
- Preparação de almofadas de agarose
- Faça cerca de 30 mL de uma solução de agarose de 1% de baixo derretimento na água. Microondas em um frasco de vidro por cerca de 90 s, girando ocasionalmente, até que a agarose seja completamente dissolvida.
- Coloque duas lâminas de vidro 22 x 22 x 22 x 0,15 mm3 na borda de um escorregador de vidro de 25 x 75 x 1,1 mm3, um em cima do outro. Empilhe mais dois slides de vidro 22 x 22 x 22 x 0,15 mm3 na outra borda.
- Pipeta cerca de 1 mL da agarose derretida no deslizamento central entre as duas lâminas de vidro superiores, em seguida, coloque outro deslizamento de 25 x 75 x 1,1 mm3 em cima da agarose derretida. Tente evitar a formação de bolhas de ar. Esfrie os slides a 4 °C por 15 min.
- Usando um bisturi ou lâmina de barbear, corte suavemente a almofada em quadrados pequenos, ~5 x 5 mm2. Fixar um adesivo de dupla lateral 17 x 28 x 0,25 mm3 quadro em um slide de vidro de 25 x 75 x 1,1 mm3 e coloque várias almofadas no slide.
- Aquisição de imagens
NOTA: As seguintes etapas são descritas para um microscópio que está o controle do SlideBook 6.0 e equipado com iluminadores de estado sólido, câmera monocromática CCD e uma lente objetiva de 100x (abertura numérica de 1,4). Se necessário, use dispositivos alternativos de microscopia com configurações adequadas de hardware e software que podem ser personalizadas de acordo com as configurações do protocolo.- Dissolva um pedaço pesado de L. pneumophila em 1 mL de ddH2O, vórtice e pipeta 2-3 μL da diluição nas almofadas. Coloque um deslizamento de cobertura de 50 x 24 x 0,15 mm3 suavemente sobre a estrutura do adesivo.
- Na janela de captura ajuste o ND para 180. Ajuste o binning para 2×2 e use o canal de 488 nm para expor a amostra entre 500-1.000 ms. Valide a especificidade do sinal de fluorescência por imagem não marcada L. pneumófilia com os mesmos parâmetros(Figura 4).
4. Quantificação da Localização Polar e Dinâmica dos Componentes Dot/Icm
NOTA: As seguintes etapas são projetadas para imagens com 0,129 μm por pixel que foram adquiridas com 2 x 2 binning.
- Quantificação da polaridade para proteínas de fusão sfGFP (Figura 5)
- Ajuste o contraste da imagem para que as bactérias sejam claramente visíveis. Use a ferramenta de região para colocar um retângulo de 0,25 x 1,3 μm2 começando no pólo e estendendo-se até o citoplasma. O retângulo deve permanecer precisamente dentro das fronteiras bacterianas.
- Marque pelo menos 200 bactérias e use o botão Região para Máscara para criar máscaras para as regiões de interesse. Em Estatísticas de máscara e escopo da máscara,escolha objeto. Em seguida, em Características e Intensidade, marque Intensidade média e variância.
- Exportar os dados e calcular os escores de polaridade de cada bactéria como a razão entre a variância à intensidade média.
- Para aplicações de alto throughput use um objetivo de fase e uma configuração de condensador apropriado para adquirir imagens com a fase e canais de 488 nm. Certifique-se de escolher campos de visão onde as bactérias estão totalmente separadas.
- Ajuste o contraste do canal de fase da imagem a um nível onde as bactérias são claramente visíveis. Abra a imagem de canal duplo, inicie a janela Criar máscara de segmento e mude o canal para fase.
- Ajuste um limiar apropriado e remova pequenos objetos com o botão Definir objetos. Em Refine Mask, escolha Remover bordas objetos e, posteriormente, máscaras separadas de bactérias adjacentes umas às outras.
- Calcule os escores de polaridade do sinal no canal 488 para cada célula, como foi descrito anteriormente nas etapas 4.1.2-4.1.3.
- Quantificação da dinâmica para proteínas de fusão sfGFP (Figura 6)
NOTA: Siga as instruções da seção 3 para preparar uma amostra para aquisição de imagens. A dinâmica é definida como mudanças de intensidade ao longo do tempo e as seguintes etapas são projetadas para curtos períodos de imagem (ou seja, vários minutos). Adicione à almofada os suplementos apropriados se forem desejados períodos de imagem mais longos.- Na janela Captura de imagem, marque Timelapse, digite o tempo dos intervalos na caixa de intervalo e digite 2 na caixa # de Pontos de Tempo. Adquira duas imagens sucessivas de L. pneumophila expressando a proteína fluorescente de interesse.
- Ajuste o contraste da imagem até que as células fiquem claramente visíveis. Siga a Figura 6A e as descrições abaixo para colocar três máscaras diferentes. Use a ferramenta de região para colocar um quadrado de 0,25 x 0,25 μm no meio de pelo menos 400 células.
- Use o botão Região para Máscara para criar uma máscara (máscara 1) dos quadrados de interesse. Crie uma nova máscara vazia (máscara 2) e use a ferramenta pixel ou a ferramenta polígono para marcar toda a área celular de pelo menos 25 células aleatórias, que serão usadas para calcular o branqueamento da fluorescência. Crie uma nova máscara vazia (máscara 3) e use a grande ferramenta de pincel para marcar áreas entre as células, que serão usadas para subtração de fundo.
- Em Mask Statistics e Mask Scope, escolha Objeto para máscara 1 e máscara 2. Em seguida, em Características e Intensidade,escolha Intensidade Média e exporte os dados das duas máscaras. Para a máscara 3, exporte a intensidade média de toda a máscara.
- Calcule a mudança na intensidade da fluorescência para cada objeto na máscara 1 usando as seguintes fórmulas:
onde a máscara 1 é um 0,25 μm × 0,25 μm quadrado colocado no centro celular, máscara 2 cobre toda a célula, máscara 3 é o fundo entre as células, t1 é a intensidade média no primeiro ponto de tempo, e t2 é a intensidade média no segundo ponto de tempo.
5. Detecção da densidade de massa sfGFP com Crio-ET
- Preparação de amostras, coleta de dados e reconstrução
- Cultivar um pedaço pesado de L. pneumophila expressando uma proteína Dot/Icm fluorescentemente marcada em placas CYE-ágar-estreptomicina por 48 horas a 37 °C. Resuspender as células em ddH2O para OD600 ~0.7. Adicione 5 μL de partículas de ouro coloidais (BSA Tracer, 10 nm) a 20 μL da suspensão celular.
- Pipeta 5 μL da mistura celular na grade de carbono furada recém-descarregada (R 2/1 na malha 200) e deixe ficar por 1 min. Mancha com papel filtro e congelar em etano líquido usando um aparelho de êmbolo acionado pela gravidade como descrito anteriormente14,15.
- Imagem das amostras hidratadas congeladas com um microscópio eletrônico de transmissão de 300 kV equipado com uma arma de emissão de campo, um filtro de energia, placa de fase Volta e um dispositivo de detecção direta. Coletar séries de inclinação de um eixo único em ampliações de 26.000x e 42.000x, que resultam em tamanhos de pixels no nível da amostra de 5,4 Å/pixel ou 3,4 Å/pixel, respectivamente.
- Use o pacote tomográfico SerialEM para coletar pilhas de imagem a ~0 μm dedefocus, com uma gama de ângulos de inclinação entre -60° e +60° com incremento de 3° de passo e dose acumulada de ~60 e-/Å2,16. Alinhar imagens de filme fracionadas em cada pilha usando MotionCor217. Montar pilhas corrigidas à deriva usando TOMOAUTO14.
- Alinhar pilhas corrigidas à deriva pelo alinhamento dependente do marcador IMOD18. Reconstruir tomogramas com o método SIRT19 para segmentações e análise direta de imagem e o método WBP20.
- Análise de subtomograma de amostras de fusões sfGFP
- Use o pacote tomográfico I3 (0.9.9.3) para análise de subtomograma14,21,22.
NOTA: O alinhamento prossegue iterativamente, com cada iteração composta por três partes nas quais são geradas referências e máscaras de classificação, subtomogramas alinhados e classificados, e as médias de classe alinhadas entre si. - Use 4 x 4 x 4 subtomogramas binados para um alinhamento inicial. Mesclar partículas que pertencem às médias de classe e mostram densidade de elétrons correspondente ao sfGFP. Depois de classificar partículas com fusões sfGFP, use subtomogramas binados 2 x 2 x 2 para um alinhamento focalizado de uma região de interesse (como o complexo ATPase citoplasmático Dot/Icm) para obter uma estrutura de alta resolução.
- Use o pacote tomográfico I3 (0.9.9.3) para análise de subtomograma14,21,22.
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Representative Results
A recombinação homólogo com dupla seleção em duas etapas foi utilizada para construir a inserção definida do sfGFP. Na primeira etapa, foi realizado o acasalamento triparental, onde o plasmídeo conjugado pRK600 (um plasmid IncP) da cepa auxiliar E. coli MT616 foi mobilizado para o doador E. coli cepa com o vetor suicida pSR47S contendo o gene sfGFP ladeado pelas duas regiões homólogas, a origem da transferência oriT e o bacillus subseleção genética Em seguida, o sistema de conjugação do pRK600 auxiliou a mobilização do derivado pSR47S em L. pneumophila (Lp01, Figura 2A). Clones que integraram com sucesso o pSR47S por um único evento de crossover foram selecionados devido ao gene de resistência a antibióticos KanR e foram propagados para permitir um segundo crossover. Clones que perderam o gene sacB durante o segundo crossover foram selecionados por chapeamento das células na sacarose do agente contrasseletivo (Figura 2, Figura 3). A análise de imunoblot com um anticorpo anti-GFP (α-GFP) foi realizada para determinar se o sfGFP foi cortado e avaliar o nível de estabilidade e expressão da proteína de fusão em um tipo selvagem ou em um mutante de exclusão de dot/icm completo. Além disso, antes de prosseguir para a microscopia, a correta integração do gene sfGFP ao cromossomo foi confirmada pela PCR (Figura 3). Uma vez confirmada a estabilidade e a integração das fusões, foi realizada a microscopia fluorescente de células vivas, e a especificidade do clone do sinal fluorescente foi comparada a uma cepa parental sfGFP-negativo. Além disso, a dupla imagem utilizando-se microscopia de campo ou fase brilhante foi utilizada para examinar a proporção de células que possuíam um sinal fluorescente específico (Figura 4).
Apenas uma fração das células que produziram DotB-sfGFP apresentou localização polar da proteína de fusão(Figura 5A). Para caracterizar a distribuição do sinal de fluorescência de DotB, a intensidade de DotB-sfGFP ao longo do eixo longitudinal nessas células foi quantificada. A intensidade do DotB nos pólos foi cerca de 2x maior do que no citosol(Figura 5B). Como é importante determinar se a localização de proteínas de fusão com marcas fluorescentes tem relevância biológica, perguntamos se a localização polar do DotB-sfGFP dependia de um T4BSS totalmente montado. Portanto, os escores de polaridade de DotB-sfGFP indicando a razão de fluorescência média medida nos pólos em comparação com a fluorescência medida perto do meio da célula foram determinados para células individuais em um tipo selvagem e em um mutante T4BSS(Figura 5C–E). De fato, as supressões de todo o sistema Dot/Icm revogaram o posicionamento polar do DotB-sfGFP, confirmando que os pontuados polares representam a associação do DotB com o T4SS e a importância da máquina Dot/Icm para o recrutamento deste ATPase. Na maioria das células de L. pneumophila, dotB-sfGFP também apresentou movimento citosólico, indicando que está presente em uma população citosólica dinâmica, mas também é capaz de associar-se com o complexo polar Dot/Icm. Para quantificar as diferenças no movimento dinâmico entre o DotO e o DotB ATPases, duas imagens sucessivas foram adquiridas e foram determinadas alterações na intensidade da fluorescência e comparadas com a SFGFP(Figura 6A). Enquanto sfGFP e DotO-sfGFP mostraram pouco ou nenhum padrão dinâmico, as mudanças de intensidade do DotB-sfGFP no citosol foram deslocadas e foram significativamente maiores. Essas observações indicam que o DotB ATPase estava presente em uma população citosólica dinâmica e em uma reação de montagem em estágio final, o DotB ATPase espacialmente dinâmico foi recrutado para o Dot/Icm T4SS(Figura 6B).
Para definir a localização espacial de DotB em relação à máquina Dot/Icm, o crio-ET de alto grau foi utilizado para visualizar o aparelho T4BSS intacto em uma cepa de L. pneumophila expressando DotB-sfGFP. Primeiro, foi realizada a reconstrução de uma célula L. pneumofia expressando DotB-sfGFP e revelou complexos típicos em forma de cone embutidos no envelope celular(Figura 7A, B). Demonstramos anteriormente usando experimentos epistáticos com uma variedade de mutantes doponto/icm, microscopia fluorescente e crio-ET que o DotB está espacialmente localizado abaixo de uma montagem única do ATPase DotO10. A média de subtomograma da cepa expressando DotB-sfGFP determinou o posicionamento geral do DotB em relação à máquina T4BSS intacta. Esta análise revelou uma densidade extra correlacionando-se com a massa adicional de sfGFP (Figura 7C). Finalmente, renderizações de superfície tridimensional de todo o Dot/Icm T4SS indicam que o sfGFP está posicionado abaixo do hexamer DotB, que se monta como um disco na base do complexo ciatoplasmático ATPase(Figura 8)10.
Figura 1: Renderizações de superfície tridimensional de L. pneumophila Dot/Icm T4SS. OM = membrana externa, IM = membrana interna, PG = peptidoglicano. A imagem foi modificada a partir de Chetrit D. et al.10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Visão geral esquemática da recombinação homóloga e troca adélica utilizada para inserir sfGFP no cromossomo L. pneumophila. (A) Acasalamento triparental realizado entre uma cepa auxiliar E. coli MT616 que abriga o plasmídeo conjugado pRK600 (um plasmid IncP), uma cepa de Doador E. coli que é transformada com o vetor suicida pSR47S, e L. pneumofa como receptora. (B) Modelo esquemático que retrata as etapas necessárias para inserir sfGFP no cromossomo L. pneumophila, a fim de gerar proteínas de fusão C-terminal sfGFP. A seleção de mutantes de troca adélica foi realizada em duas etapas, utilizando kanamicina e o saco marcador de contra-selecionável . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: O fluxo de trabalho do ensaio de troca adélica. L. pneumophila foi traçada nas seleções e tempos de crescimento apropriados (ver a seção de protocolo para detalhes). Posteriormente, a inserção de sfGFP no cromossomo foi confirmada com pcr colônia utilizando primers complementares ao gene sfGFP e à região cromossômica flanqueando o local de inserção. A estabilidade da proteína de fusão foi examinada pela análise de imunoblot utilizando um anticorpo anti-GFP. Painéis inferiores esquerdos: Faixa 1 = Lp01não marcado , Lane2 = sfGFP expresso a partir de dotB operon, Lane 3 = DotB-sfGFP expresso em um mutante de exclusão de ponto/icm completo, Lane 4 = DotB-sfGFP expresso em um tipo selvagem de fundo. WB = mancha ocidental. O número de clones analisados em cada etapa é indicado entre parênteses. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagem celular viva de L. pneumophila expressando subunidades dot/icm marcadas fluorescentemente. (A) L. pneumophila de um patch pesado de dois dias foi resuspensa em ddH2O e colocada em cima de almofadas de agarose de fusão baixa de 1%. (B) A especificidade do sinal de fluorescência de uma cepa que codifica cromossomicamente DotB-sfGFP foi comparada com a cepa Lp01 gfp-negativa parental. Barra de escala = 3 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Quantificação da localização polar das subunidades do sistema Dot/Icm. (A) A Visualização em tempo real do DotB-sfGFP expressa em Lp01 mostrou localização polar. O DotB-sfGFP exibiu um padrão difuso quando expresso em uma cepa onde todo o cluster genético dot/icm foi excluído (:T4SS). SfGFP não fundido expresso a partir do operon dotB mostrou um padrão citosólico difuso e serviu como controle. Barra de escala = 3 μm. (B) Quantificação da intensidade de fluorescência dotB-sfGFP ao longo do eixo longitudinal das células com padrões polares ou difusos. Os tamanhos das amostras foram n = 20 células para células polares e não polares. *p = 0,02, **p ≤ 0,0001. A significância foi calculada pelo teste t de dois caudas do aluno e comparada com a intensidade no pólo. (C) Modelo esquemático das máscaras utilizadas para quantificar a polaridade. (D) DotB-sfGFP como mostrado na Figura 5A com as máscaras usadas para quantificar a polaridade. (E) A abundância de DotB-sfGFP nos pólos, quando expressa em um fundo de tipo selvagem ou quando todo o cluster genético dot/icm foi excluído, é exibida como curvas de freqüência. Os tamanhos das amostras foram n = 200 células para cada cepa. * p < 0.0001. A significância foi calculada pelo teste de Mann Whitney de duas caudas e comparada com o sfGFP expresso a partir do operon dotB. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Quantificação da dinâmica das fusões fluorescentes Dot/Icm. (A) Um modelo esquemático representando as máscaras utilizadas para quantificar as alterações na intensidade da fluorescência para uma proteína de fusão sfGFP dinâmica ou estática. T1,2 são os pontos de tempo da primeira e segunda vez e m1,2,3 são máscara 1, máscara 2 e máscara 3. (B) A dinâmica do DotB-sfGFP, DotO-sfGFP e sfGFP expressa do operon dotB são exibidas como curvas de freqüência. Os tamanhos das amostras foram n = 400 células para cada cepa. *p = 3,4 × 10-12, ***p = 1,0 × 10-147. A significância foi calculada pelo teste t do aluno de duas caudas em comparação com o sfGFP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: A média do subtomograma é usada para determinar a densidade de sfGFP de DotB-sfGFP. (A) Uma fatia tomográfica adquirida com ampliação de 26.000x de uma célula representativa L. pneumophila expressando DotB-sfGFP, mostrando várias máquinas Dot/Icm embutidas no envelope celular. (B) Uma fatia tomográfica adquirida com uma ampliação de 42.000x do mesmo pólo celular L. pneumófilo mostrado em A. OM = membrana externa, IM = membrana interna. (C) Uma reconstrução de uma cepa expressando DotB-sfGFP mostra densidades correspondentes a DotB e sfGFP (setas amarelas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Renderizações de superfície tridimensional do complexo citosólico Dot/ICM. Renderizações de superfície tridimensional de toda a cepa Dot-Icm T4SS de ¥dotB (A),tipo selvagem(B),e dotB-gfp (C) L. pneumophila cepas. (D) A estrutura do complexo citosólico mostra o posicionamento de DotB (roxo) e sfGFP (verde). A estrutura de raios-X do DotB (PDB: 6GEB23) foi ancorada no mapa DotB. IM = membrana interna. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Elucidar as funções dos sistemas de secreção bacteriana é a chave para uma compreensão completa das interações hospedeira-patógena. Os sistemas de secreção são máquinas complexas que podem injetar proteínas de efeitos em células hospedeiras, e em alguns casos promovem o estabelecimento de um nicho subcelular que suporta a replicação bacteriana. O método acima fornece novas ferramentas importantes para estudar o sistema de secreção Dot/ICM do patógeno respiratório Legionella pneumophila, dando pistas sobre os mecanismos de translocação de efeitos que são essenciais para sua patogenicidade. Esta abordagem pode ser aplicada a outros sistemas de secreção, empregando imagens de células bacterianas vivas e estudos estruturais para dissecar sua atividade a nível molecular. Isso pode ser feito estudando a dinâmica espacial dos componentes do sistema de secreção marcados fluorescentemente usando microscopia de vídeo time-lapse.
Construímos mutações limpas e não marcadas, onde um gene foi marcado ou substituído por um alelo modificado, que é uma abordagem fundamental para a compreensão da patogenicidade em nível molecular, bem como para a definição de relações estrutura-função que podem levar à produção de terapias medicamentosas24,25. Cepas de L. pneumophila que foram geneticamente modificadas para eliminar proteínas individuais de Dot e Icm podem ser usadas para determinar a estrutura do sistema Dot/Icm por crio-ET. Um passo importante no protocolo é comparar a funcionalidade das proteínas tagged N-terminus e C-terminus. Portanto, as cepas que codificam as fusões devem ser testadas para replicação em células hospedeiras eucarióticas, visualizadas por microscopia para determinar se a localização de proteínas marcadas na célula bacteriana depende de uma máquina de secreção totalmente montada, e avaliadas para estabilidade de proteínas expressas a partir de genes a montante e a jusante.
Este protocolo utiliza experimentos de microscopia celular viva, que são amplamente utilizados para estudar processos biológicos complexos, como transdução de sinais, automontagem, tráfico ativo e regulação genética. Compreender a dinâmica, trajetórias e interações de partículas únicas nas células representa uma abordagem fundamental na biologia celular26. No entanto, dado que o rastreamento de partículas individuais pode nem sempre ser possível devido ao movimento molecular rápido ou baixa relação sinal-ruído, avaliar mudanças na intensidade da fluorescência pode servir como uma abordagem simples para quantificar diferenças nos padrões dinâmicos. Além disso, como são necessários apenas dois pontos de tempo para a análise, essa metodologia garante apenas a exposição mínima da amostra à luz fluorescente e, portanto, previne o branqueamento maior da intensidade de fluorescência do sfGFP. Como as almofadas de agarose não contêm nenhuma fonte de nutrientes, é importante notar que a imagem ao vivo deve ser realizada imediatamente após a retirada das células das placas de ágar CYE. Se forem necessários períodos mais longos de tempo de imagem, então suplementos que suportam a sobrevivência e o crescimento da pneumofilia L. devem ser adicionados às almofadas. Determinar a polaridade de proteínas marcadas fluorescentemente também pode ser modificado para aplicações de alto throughput. Se forem necessários, uma configuração de fase objetiva e um condensador apropriado devem ser usadas para adquirir imagens de dois canais (ou seja, canais de fase e fluorescentes). É crucial escolher campos onde as bactérias estão totalmente separadas. Use o canal de fase para mascarar células inteiras e quantificar a proporção de intensidades conforme descrito acima.
Microscopia crio-elétron (crio-EM) e crio-ET oferecem visualização robusta de nanopartículas. Essas técnicas envolvem a imagem da amostra em estado congelado, permitindo a visualização de nanopartículas essencialmente como existem em seu ambiente celular27. Como a resolução é limitada pela espessura da amostra, as estruturas obtidas pelo crio-ET têm resolução menor do que as obtidas pelo crio-EM. No entanto, como em cada imagem as máquinas de tomogram tipo IV estão presentes em várias cópias, a resolução aumentada pode ser obtida aumentando o tamanho da amostra para a média do subtomograma. Uma grande vantagem do crio-ET é que a visualização de conjuntos complexos em células bacterianas intactas pode preservar melhor sua estrutura, que pode sofrer mudanças drásticas após a extração de seu ambiente natural.
Em conclusão, o estudo de processos dinâmicos e localização de moléculas estão entre os primeiros passos para a compreensão da função dos sistemas biológicos. A força e o foco do método descrito aqui é a visualização direta de componentes do ponto/Icm em bactérias vivas, o que proporciona a possibilidade de descobrir processos dinâmicos que regem as funções das máquinas tipo IVB ou outros conjuntos multiproteínas. Além disso, o acoplamento de imagens ao vivo ao crio-ET é uma estratégia que permite a caracterização de componentes-chave na máquina Dot/Icm em relação à maior estrutura do sistema de secreção de pneumofilia Legionella, e compreensão de como eles montam e direcionam mudanças conformacionais no aparelho. Uma limitação das etiquetas proteicas fluorescentes usadas para estudar o comportamento proteico em células vivas é seu tamanho relativamente grande, o que pode influenciar a função e as propriedades da proteína marcada. Posteriormente, é necessária a avaliação da estabilidade e funcionalidade. Outra limitação dessa abordagem é que as estruturas atômicas atualmente não podem ser obtidas devido à resolução limitada resultante da espessura da amostra. Modelagem e montagem podem ser uma forma eficaz de analisar as densidades, permitindo assim a localização de subunidades ou avaliação de mudanças conformacionais. Investigações futuras e uma maior compreensão dessa abordagem levarão a uma melhor compreensão de como diferentes subconjuntos compõem um aparelho funcional tipo IV.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
D.C. e C.R.R. foram apoiados pelo NIH (R37AI041699 e R21AI130671). D.P., B.H., e J.L foram apoiados pelos Institutos Nacionais de Saúde (R01AI087946 e R01GM107629).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 nm colloidal gold particles | Aurion | 25486 | |
| 100x Plan Apo objective (1.4 NA) | Nikon | ||
| ACES | Sigma-Aldrich | A9758 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C5510 | |
| Agaroze GPG/LMP, low melt | American bioanalytical | AB00981 | |
| Bacto dehydrated agar | BD | 214010 | |
| CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera | Photometrics | ||
| Gene Frame, 1.7x2.8 cm, 125 µL | Fisher Scientific | AB-0578 | |
| Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh | Quantifoil | Q225-CR1 | |
| Iron(III) nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | 216828 | |
| K2 Summit camera for cryo-EM | GATAN | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| Microscope cover slides 22x22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope cover slides 24x50 mm | Fisher Scientific | 12-545K | |
| Microscope slides 25x75x1 mm | Globe Scientific | 1380 | |
| SlideBook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Spectra X light engine | Lumencor | ||
| Taq 2X Master Mix | New England BioLabs | M0270 | |
| Titan Krios | Thermo Fisher Scientific | ||
| Yeast Extract | BD | 212750 |
References
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