Summary
このプロトコルは、オロ胃管を介してCCl4曝露を介して急性肝傷害(ALI)を誘発する一般的かつ実現可能な方法を記述する。CCl4曝露は、肝臓におけるその生体変換中に活性酸素種の形成を通じてALIを誘導する。この方法は、ALIの病態生理を分析し、異なる肝保護戦略を調べるために使用されます。
Abstract
急性肝障害(ALI)は、肝性脳症やタンパク質合成障害などの合併症を含む重度の肝機能障害を特徴とする肝不全の発症に重要な役割を果たしています。適切な動物モデルは、ALIのメカニズムと病態生理をテストし、異なる肝保護戦略を調査するために不可欠です。化学変換を行う能力により、四塩化炭素(CCl4)は、活性酸素種の形成を通じてALIを誘導するために肝臓で広く使用されています。CCl4露光は、腹腔内、吸入、または経胃または口腔胃管を介して行うことができる。ここでは、アリがオロ胃管を介したCCl4曝露によって誘導されるげっ歯類モデルについて述べている。この方法は安価で、容易に実行され、危険有害性を最小限に抑えます。このモデルは再現性が高く、潜在的な肝保護戦略の有効性を判断し、肝臓損傷のマーカーを評価するために広く使用することができます。
Introduction
肝臓に対する毒性侮辱の頻度は、特にアルコールや薬物乱用によるもので、増加している。急性肝障害(ALI)は高い死亡率に関連しており、臨床的な懸念を引き起こしている1,2。毒性傷害は肝臓の死シグナル伝達経路につながり、肝細胞アポトーシス、壊死、またはピロプトーシスを引き起こします。ALIは肝不全の発症において重要な役割を果たしており、肝性脳症やタンパク質合成障害などの合併症を含む重度の肝機能障害を特徴とする33,4。4最近の研究では、肝不全に伴う生理学的および病理学的変化に関する知識が増えているが、細胞死のメカニズムに影響を与える病的分子の特徴を完全に説明しているわけではない。さらに、ALI患者の進行性悪化を逆転させる薬は現在のところ利用できない。現在、唯一の有意に有効な治療法は、肝臓移植55,66である。
ALIのメカニズムと病態生理を調査し、異なる肝保護戦略をテストするために、異なる動物モデルがALIを誘導するために使用される。ALIの好ましい動物モデルは、信頼性の高い、検証済み、安価で適用しやすい方法を介して疾患の病理学的プロセスを模倣すべきである。実験モデルの例としては、肝毒性剤、全肝切除術などの外科的処置、完全または一過性の脱血管検査、および感染性処置77、8、98,9が含まれる。既知の肝毒性物質は、ガラクトサミン、アセトアミノフェン、チオアセアセタミド、アゾキシメタンおよびCCl4を含む。このうち、CCl4は、10、11、12、13,11,12をまだ十分に特徴づけられていないが広く用いられている13。4
CCl4は、甘い香りと低い温度でほとんど燃焼性のない有機無色液体化合物です。CCl4の高濃度への暴露は、肝臓および腎臓の悪化を含む中枢神経系への損傷を引き起こす可能性がある。CCl4は、活性酸素種を形成する肝臓での生体変換を通じてALIを誘導する。これは、P450シトクローム酵素2E1を介して起こり、活性代謝産物を形成し、高分子結合による細胞損傷をもたらし、脂質過酸化の増強および細胞内カルシウム恒常性14の障害をもたらす。また、CCl4モデル4は、RNA合成15のレベルでアストロサイトを刺激するために使用することができる。この肝毒素は、腹腔内、門内、口腔内、および胃内経路16によって投与されている。
このプロトコルでは、我々は、オロ胃管を介してラットにおけるCCl4誘導ALIについて詳細に説明する。この方法は、ALIの病因を調査するために使用できる堅牢で再現性のあるALIを誘導する。肝疾患の重症度の測定は、血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ(GPT)、グルタミン性オキサロア酢酸トランスアミナーゼ(GOT)酵素および総ビリルビン(TB)ならびにヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色された肝臓組織による決定的な組織学的診断によって監視される。胃内アクセスによるCCl4への暴露は、危険を最小限に抑えた実用的で安価で低侵襲的な方法を可能にする。
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Protocol
実験は、ヘルシンキと東京宣言の勧告と欧州共同体の実験動物の使用に関するガイドラインに従って行われました。実験は、ネゲブのベングリオン大学の動物ケア委員会によって承認されました.
注: CCl4モデルは、以前のスタディ17で生成され、使用されています。プロトコルのタイムラインは、表 1に示されています。
実験手順のための1.ラットの準備
注:300-350グラムの体重の成人オスのスプレイグ・ドーレーラットを選択してください。
- 施設動物の世話と使用委員会(IACUC)から実験の承認を得る。
- ラットを室温(22°C±1°C)で12時間、暗サイクル12時間で維持します。ラットチャウと水のアドリビタムを提供します。
- 午前6時から午後12時の間にすべての実験を行います。
- ラットを剃り、アルコールで皮膚を消毒します。
2. 血清GOT、GPT、および結核ベースラインレベルの決定
- 麻酔
- 麻酔を誘発するために連続的なイオブルラン投与システムを準備する。気化器システムがイオブルランで満たされていることを確認してください。
- 2%イオブルランでラットを麻酔します。外部刺激に反応して動きとペダル反射を観察することによって、ラットが完全に麻酔されていることを確認します。
注: 麻酔の誘導および維持のために1-5%のイオブルランを使用してください。
- 22Gカテーテルで尾静脈をカニューレートします。
- ベースラインで0.5 mLの血液サンプルを収集します。取得した血液量が IACUC ガイドラインを超えていないことを確認します。
- 前に述べたように血清GOT、GPTおよびTBの測定を含む血液生化学的分析を行う18.
注:肝酵素と結核レベルの検査は、室岡医療センターの生化学研究所で行われました。血液サンプルは化学分析装置上の蛍光法を用いて分析した(材料表)
ラットにおける急性肝障害の誘導
注意:蒸気や皮膚を介した吸収を含む高濃度のCCl4への暴露は、中枢神経系に悪影響を及ぼし、肝臓および腎臓の変性を引き起こす可能性がある。長時間の暴露は昏睡または死を引き起こす可能性があります。
- CCl4の50%溶液を車両としてオリーブオイルと1:1の比率で混合して、CCl4(材料表)を調製します。4
注:非医薬品グレード化合物のIACUCガイドラインに従って溶液を調製する必要があります。 - CCl4投与により生体内肝毒性を誘発する。
- ラットの口腔を通して16Gの口腔管(3インチの深さ)を挿入する。
- ラットの胃に1 mL/kg(軽度のALI)、2.5 mL/kg(中程度のALI)、または50%溶液の5 mL/kg(重度のALI)の注射器を注入することによって、ラットを異なる用量のCCl4に曝します。シャム操作の対照群の場合、ラットを5 mL/kgオリーブオイルのみに露出してください。
4. 24時間後の血清GOT、GPT、および結核レベルの測定
- 麻酔
- 麻酔を誘発するために連続的なイオブルラン投与システムを準備する。気化器システムがイオブルランで満たされていることを確認してください。
- 2%イオブルランでラットを麻酔します。外部刺激に反応して動きとペダル反射を観察することによって、ラットが完全に麻酔されていることを確認します。
- CCl4曝露から24時間で血液サンプルを採取する。
- 血清GOT、GPTおよびTBの測定を含む血液生化学分析を行う。
5. 組織学的検査用肝臓コレクション
- 20%O 2 /80%CO2に触発された混合気体を置き換えることによってラットを安楽死させる。IACUC ガイドラインに従って、CO2が所定のレートで配信されるようにしてください。
- 心拍の欠如を確認し、IACUCガイドラインに従って二次的な方法で確認することによって死を確認する。
- ラットを、後ろ面を下に向け、腹部を上に向けた解剖板の上に置きます。ネズミの腹部を剃る。
- メスで、アヌスから顎までの心室皮の全長を切開する。皮膚を分離します。腹部の内臓を露出し、アヌスからキシフォイド軟骨にメスで腹壁を切開します。
- はさみと鉗子を使用して、その靭帯および付属品からそれを解剖することによって肝臓を分離する。肝臓のヒラムから始めて、添付ファイルからすべての肝臓葉を放出することによって慎重に肝切除を行う。解剖し、すべての靭帯と血管を切断します。
- ペトリ皿に肝臓を移します。肝臓を4%緩衝したホルムアルデヒド溶液(材料表)で少なくとも24時間固定する。
6. 組織学的検査
- サンプル準備
- 固定後、マイクロトーム断面によりサンプルを5μm厚スライスシリーズに切ります。
- 柔らかいブラシでガラススライドにスライスをそっと置きます, スライドごとに1スライス.
- 前述の19のように H&E 染色を実行します。
- 20mmの対物レンズ(材料表)を用いて、200倍の倍率で顕微鏡でスライスを調べる。
注:肝臓のセクションは、治療プロトコルに盲目の専門の病理学者によって採点する必要があります。スコア 0 は肝臓異常がないことを示し、1 ~ 2 は軽度の肝臓損傷を示し、3-4 は中等度の肝臓損傷を示し、5-6 は重度の肝障害20、21、22を示します。
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Representative Results
TB、GOT、およびGPTレベルは、恥操作コントロール(p< 0.001)と比較してALI(より高いCCl4用量でより多く)を誘導した後、有意に24時間増加した(図1)。ベースラインにおける結核、GOT、GPTのレベルは正常であり、シャム操作のコントロールと有意に異なっていなかった。24時間で、 1 mL/kg CCl 4(1,1-2),2.5 mL/kg CCl 4(3,3-4),5 mL/kg CCl4 4(4,4-5.75)の3つの介入群はいずれも、シャム操作対照群(0,0-0)(p-0;0.05,75)よりも有意に高い組織学的採点スコアを有していた。.4シャム作動制御のH&E画像(図2A)および異なるCCl 4用量(図2B−D)に曝露された群は、CCl4曝露後の24時間の4組織病理学的変化を示す。4CCl4による肝細胞アーキテクチャの破壊は、大きな線維性中隔筋変形、繊維の伸展、コラーゲン蓄積、および肝切片における疑似葉分離を伴う高グレードの組織損傷によって実証された(図2)。
図1:血清結核(A)、GOT(B)、およびGPT(C)レベルは、シャム作動対照と比較して異なるCCl4用量に曝された後の血液サンプル24時間。青いバー:コントロール;赤いバー:CCl 4露光後24時間。CCl4-暴露ラットと未暴露ラットとの比較の意義は、マン・ホイットニー検定を用いて決定される。p 値 <0.05 は重要であると考えられていました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:様々な用量で24時間CCl4中毒後にH&Eで染色された肝組織の病理組織学的変化。(A) シャム操作制御、 (B) 1 mL/kg CCl4、 (C) 2.5 mL/kg CCl4、 および (D) 5 mL/kg CCl4。スケールバー= 50 μm組織学的結果の分布を線形回帰で予測した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| グループ | 0時間 | 24時間 |
| シャム (15匹) | GOT、GPT、TBベースラインレベル | 得た、GPT、結核レベル |
| 軽度のアリ (15 ラット) | ||
| 中程度のアリ (15 ラット) | アリグループのCCl4エクスポージャーとシャムグループ用オリーブオイル | 組織学的検査 |
| 重度のアリ (18 ラット) |
表1:プロトコルタイムラインのデモンストレーション異なる時期のラットの様々なグループには、シャム作動型対照群、軽度のALI(1 mL/kg CCl4への曝露)、中程度のALI(2.5 mL/kg CCl4への暴露)、および重度のALI(5 mL/kgCCl4への曝露)が含まれる。24時間時点で、血清GOT、GPTおよびTBレベルを測定し、4群すべてについて組織学的検査を行った。
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Discussion
このプロトコルにおいて、CCl4は、ラットにおいてアリを誘導する肝臓毒素として用いられる。ALIは、肝臓の代謝および合成機能の肝性パレンチマの喪失とその後の調節不整合によって特徴付けられる。薬物、ウイルス、毒素、自己免疫疾患、代謝性疾患、および血管障害はすべて肝細胞死を誘発し、その後の炎症反応はALIの病因に寄与する。
肝臓に対する最初の侮辱は、サイトカイン産生、ケモカイン放出、および肝臓への炎症細胞のその後の浸潤をもたらす。ALI評価のための一般的にテストされたバイオマーカーの3つは、GPT、GOTおよび結核レベルである。GPTとGOTは、結核レベルが血清濃度によって肝機能を測定しながら、活性レベルによって測定される酵素である。上昇した場合、血清酵素活性レベルは、肝細胞または胆管球23への傷害を示す。急速分光光法は、1955年24年のアーサー・カルメンの研究で最初に報告され、血清酵素測定の広範な臨床応用を可能にした。それ以来、GOTとGPTの測定も肝細胞損傷を検出するために適用されています。GPT はより頻繁に使用され、同時に GPT テストは通常冗長な結果を明らかにする。放出率と負傷した細胞からのクリアランス率との間のGOTおよびGPTの活性レベルの増加は、細胞への傷害のおよその率を測定するために使用することができる。負傷した肝細胞が肝臓を通常の活動に失敗させる場合, 胆汁としてビリルビンを処理し、除去するなど, これはALIがより重篤であることを示しています.
プロトコルには、重要でメリットのあるいくつかのステップがあります。ほとんどのプロトコルは、血清酵素濃度レベルの上昇が一般的であるとして、調査剤への暴露の前後に血清バイオマーカー検査を必要とする。ただし、ALTのタイミングが変動するため、標高を検出するために定期的にいくつかのテストを実施する必要があります。このプロトコルでは、ベースラインでGOT、GPT、TBレベルをテストし、毒素にさらされた24時間後にテストすることを選択しました。最近の研究によると、これらのバイオマーカーのレベルは、この時間間隔17の間にALIの重症度とよく相関した。図1に示すように、血液GOT、GPTおよびTBのレベルは、ALIを誘導した後、全てのサンプル24時間で上昇した。これは、CCl4に曝露してから、モデルが非常に短い時間間隔で結果を定量化したことを示しています。重度のALIでは肝臓がGOTとGPTを合成する能力を失うことを考慮に入れるべきです.したがって、これらの場合には、これらの酵素は文献に示されるように、それらの予測値を欠く可能性があります。
CCl4に曝露されたラットの組織学的所見は、細胞のバルーン化、中心球状壊死および議員の身体25の存在によって特徴付けられる。このモデルでは、投与されたCCl4の投与量に比例することが示された広範囲にわたる損傷があった。
この方法は、腹胃CCl4露光を介してALIを誘導する多くの利点を有する。それは簡単で、安価で、危険が最小です。プロトコルは非常に短い時間間隔で有意な結果を提供する。このモデルは再現性が高く、潜在的な肝保護戦略の有効性を判断し、肝臓損傷のマーカーを評価するために一般的に使用することができます。
CCl4は主に肝臓の中央ゾーンに影響を与え、ヒト肝不全に典型的に見られる大規模な壊死と一致しないことに注意することが重要である。また、CCl44 は肝臓において完全に代謝されず、また、代謝されないCCl4の一部は、肺および腎臓16を含む他の器官に損傷を与える可能性がある。また、シトクロムP450の開発および効力のレベルが異なるために、26歳の種や年齢によって感度に大きなばらつきがある。これらの制限にもかかわらず、オロ胃CCl4誘導ALIの方法は依然として貴重なげっ歯類モデルとして機能する。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、ネゲブのベングリオン大学保健学部ソロカ医療センター病理学部ベルタ・デルガドが、研究室や組織学分析に協力してくれたことを感謝している。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G catheter BD Neoflon TM | Becton Dickinson Infusion Therapy AB | ||
| 4% buffered formaldehyde solution | Sigma - Aldrich lab materials technologies | ||
| BD Microtainer SST TM Tubes | Becton Dickinson and Company | ||
| Carbone tetrachloride | Sigma - Aldrich lab materials technologies | CAS 56-23-5 | |
| Isofluran, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | ||
| Olympus AU2700 Chemistry-Immuno Analyzer | Olympus (MN, USA) | Analysis of blood samples was done by the fluorescence method | |
| Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
| RAT Feeding Needles | ORCHID SCIENTIFICS | ||
| SYRINGE SET 1 and 2 ml MEDI -PLUS | Shandong Zibo Shanchuan Medical Instruments Co., Ltd |
References
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