Summary
该协议描述了通过CCl4暴露通过奥胃管诱导急性肝损伤（ALI）的一种常见和可行的方法。CCl4暴露在肝脏生物转化过程中通过活性氧物种的形成诱导 ALI。该方法用于分析ALI的病理生理学，并研究不同的肝保护策略。
Abstract
急性肝损伤（ALI）在肝功能衰竭的发展中起着至关重要的作用，肝功能障碍的特点是严重的肝功能障碍，包括肝脑病和蛋白质合成受损等并发症。适当的动物模型对于测试ALI的机制和病理生理学以及研究不同的肝保护策略至关重要。由于其进行化学转化的能力，四氯化碳（CCl4）在肝脏中被广泛用于通过活性氧物种的形成诱导ALI。CCl4暴露可以通过腹内、吸入或通过鼻胃或奥胃管进行。在这里，我们描述了一个啮齿动物模型，其中ALI是由CCl4通过奥胃管暴露诱导的。该方法价格低廉，易于执行，风险最小。该模型具有很高的可重复性，可广泛用于确定潜在的肝保护策略的有效性和评估肝损伤的标记。
Introduction
对肝脏的毒性侮辱的频率正在增加，特别是由于酗酒和吸毒。急性肝损伤（ALI）与高死亡率相关，并引起临床关注11，2。2毒性损伤导致肝脏死亡信号通路，导致肝细胞凋亡、坏死或肺气肿。ALI在肝功能衰竭的发展中起着至关重要的作用，其特征是严重的肝功能障碍，包括肝脑病和蛋白质合成受损等并发症3、4。4虽然最近的研究增加了我们对肝衰竭伴随的生理和病理变化的认识，但它并没有完全解释影响细胞死亡机制的病理分子特征。此外，目前尚无药物来扭转ALI患者的逐渐恶化。目前，唯一有效治疗的是肝移植55、6。6
为了研究ALI的机制和病理生理学，并测试不同的肝保护策略，使用不同的动物模型来诱导ALI。ALI的可取动物模型应该通过可靠、验证、廉价和易于应用的方法模拟疾病的病理过程。实验模型的例子包括肝毒性剂、手术程序，如完全或部分肝切除术，完全或暂时脱血管，以及感染性手术77，8，9。8,9已知的肝毒性物质包括甲酰胺、对乙酰氨基酚、硫酰胺、阿氧西甲烷和CCl4。其中，CCl4虽然尚未得到很好的应用，但其特征尚未得到很好的10、11、12、13。10,11,12,13
CCl4是一种有机无色液体化合物，气味甜美，在低温下几乎无可燃性。暴露于高浓度的CCl4可对中枢神经系统造成损伤，包括肝脏和肾脏的恶化。CCl4通过肝脏的生物转化诱导ALI，形成活性氧物种。这通过P450细胞色素酶2E1发生，形成活性代谢物，通过大分子结合、增强脂质过氧化和细胞内钙平衡扰动14引起细胞损伤。此外，CCl4模型可用于刺激在RNA合成15水平上的星细胞。这种肝毒素由腹腔内、门内、口腔和胃内途径16管理。
在此协议中，我们详细描述了CCl4诱导的ALI在大鼠通过奥胃管。该方法诱导健壮和可重复的ALI，可用于研究ALI的发病机制。通过血清谷氨酸-丙酮酶转氨酶（GPT）、谷胱甘肽转氨酶（GOT）酶和总胆红素（TB）的测量，以及通过血氧林和欧辛（H&E）染色肝组织进行明确的组织学诊断，监测肝病严重程度的确定。通过胃内访问接触 CCl4，可以采用实用、廉价、微创的方法，风险最小。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
这些实验是根据《赫尔辛基和东京宣言》的建议和欧洲共同体《实验动物使用准则》进行的。这些实验得到了内盖夫本-古里安大学动物护理委员会的批准。
注：CCl4模型已经生成并用于以前的研究17。协议时间表在表 1中演示。
1. 为实验程序准备大鼠
注：选择成年雄性斯普拉格道利大鼠体重300~350克。
- 获得机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准实验。
- 在室温（22 °C ± 1 °C）下保持大鼠，12 小时光线和 12 小时暗循环。提供鼠肉和水的盐水。
- 在上午 6：00 到下午 12：00 之间执行所有实验。
- 用酒精对老鼠进行消毒。
2. 确定血清 GOT、GPT 和结核病基线水平
- 麻醉
- 准备连续的麻醉管理系统，诱导麻醉。确保蒸发器系统充满等体。
- 用2%的二氧体麻醉大鼠。通过观察运动和踏板反射来响应外部刺激，确认大鼠完全麻醉。
注：使用1~5%的西沙兰用于麻醉诱导和维护。
- 用22 G导管对尾静脉进行加核。
- 在基线处采集 0.5 mL 血液样本。确保检索到的血量不超过 IACUC 指南。
- 执行血液生化分析，包括血清GOT、GPT和结核病的测量，如前所述的18。
注：在索罗卡医疗中心的生化实验室对肝酶和结核病水平进行了检查。在化学分析仪（材料表）上使用荧光方法对血液样本进行了分析。
3. 大鼠急性肝损伤的诱导
注意：暴露于高浓度的CCl4，包括通过蒸汽或皮肤吸收，可能对中枢神经系统产生负面影响，并导致肝脏和肾脏退化。长时间接触可能导致昏迷或死亡。
- 准备CCl4（材料表）的50%溶液，将CCl4与橄榄油混合为1：1的比例。
注：应根据IACUC非药物级化合物指南制备该解决方案。 - 通过CCl4管理通过奥胃管诱导体内肝毒性。
- 通过大鼠的口腔插入一个16 G的胃管（3英寸深）。
- 将带有以下稀释溶液之一的注射器注射到大鼠胃中，将大鼠暴露于不同剂量的CCl4：1 mL/kg（轻度ALI）、2.5 mL/kg（中度ALI）或50%溶液中的5 mL/kg（严重ALI）。对于操作不自明的对照组，仅将大鼠暴露在 5 mL/kg 橄榄油中。
4. 24小时后测定血清GOT、GPT和结核病水平
- 麻醉
- 准备连续的麻醉管理系统，诱导麻醉。确保蒸发器系统充满等体。
- 用2%的二分之一类物麻醉大鼠。通过观察运动和踏板反射来响应外部刺激，确认大鼠完全麻醉。
- 从CCl4暴露中采集24小时的血液样本。
- 进行血液生化分析，包括血清GOT、GPT和结核病的测量。
5. 用于组织学检查的肝脏收集
- 将激发的气体混合物替换为 20% O2/80% CO2，使大鼠安乐死。确保 CO2按照 IACUC 准则以预定速率交付。
- 通过检查心跳不足，并根据IACUC指南通过辅助方法确认死亡。
- 将大鼠放在解剖板上，其背面朝下，腹部朝上。把老鼠的腹部都当过。
- 用手术刀，将腹腔皮肤从anus到下巴的全长切开。分离皮肤。用手术刀从anus到xyphoe软骨切开腹壁，露出腹部内脏。
- 使用剪刀和钳子，通过解剖肝脏的韧带和附件来分离肝脏。从肝高卢开始，通过释放附件中的所有肝叶，仔细进行肝切除术。切除和切断所有韧带和血管。
- 将肝脏转移到培养皿中。将肝脏固定在4%缓冲甲醛溶液中（材料表），至少24小时。
6. 组织学考试
- 样品制备
- 固定后，通过微缩切将样品切成5μm厚切片系列。
- 用软刷轻轻将切片放在玻璃幻灯片上，每张幻灯片 1 片。
- 执行 H&E 染色，如前所述的 19。
- 使用20毫米客观透镜（材料表）在显微镜下以200倍放大倍率检查切片。
注：肝脏部分应由对治疗方案视而不见的专门病理学家分级。评分为0表示无肝异常，1⁄2表示轻度肝损伤，3⁄4表示中度肝损伤，5~6表示严重肝损伤20、21、22。21,2220
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
与假操作对照（p < 0.001）相比，诱导 ALI（在较高CCl 4剂量下更多）后，结核病、GOT 和 GPT 水平显著增加 24小时（更多为较高 CCl4剂量）。基线的结核病、GOT 和 GPT 水平是正常的，与虚假操作的控制没有显著差异。在24小时时，所有三个介入组，1 mL/kg CCl4 （1， 1⁄2）， 2.5 mL/kg CCl4 （3， 3+4） 和 5 mL/kg CCl4 （4， 4， 4+5.75）， 具有明显高于假操作对照组 （0， 0+0） （p < 0.05， 数据作为中位数提供的数据， 25-75% 范围） 。假操作控制的H&E图像（图2A）和暴露于不同CCl4剂量的组（图2B+D）显示CCl4暴露后24小时组织病理学变化。CCl4对肝细胞结构的破坏表现为肝科肝部分大面积组织损伤、纤维隔膜变形、纤维延伸、胶原蛋白积累和假叶分离（图2）。
图1：与假操作对照组相比，血液样本中的血清结核（A）、GOT （B） 和 GPT （C） 水平在暴露于不同的 CCl4剂量后 24 小时。蓝条：控制;红条：CCl4曝光后24小时。使用曼恩惠特尼测试确定了CCl4暴露大鼠和未暴露大鼠之间的比较意义。p 值 <0.05 被视为显著值。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 2：肝组织在24 h CCl4不同剂量的中毒后，其组织在H&E染色的病理变化。（A）假操作控制，（B） 1 mL/kg CCl 4、（C） 2.5 mL/kg CCl4和（D）5 mL/kg CCl4。4C刻度柱 = 50 μm。通过线性回归预测了组织学结果的分布。请点击此处查看此图形的较大版本。
| 组 | 0 小时 | 24 小时 |
| 沙姆 （15 只大鼠） | GOT、GPT、TB 基线级别 | GOT， GPT， 结核病水平 |
| 轻度 ALI （15 大鼠） | ||
| 中度ALI（15只大鼠） | CCl4曝光 ALI 组和橄榄油为假组 | 组织学检查 |
| 严重ALI（18只大鼠） |
表 1：协议时间表的演示。不同时期大鼠的不同组包括假操作对照组、轻度ALI（暴露于1 mL/kg CCl4）、中等ALI（暴露于2.5 mL/kg CCl4）和严重ALI（暴露于5 mL/kg CCl4）。在24小时时，测量血清GOT、GPT和结核病水平，对所有四组进行组织学检查。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在此协议中，CCl4用作肝脏毒素，诱导大鼠体内的ALI。ALI的特点是肝胆痛的丧失以及肝脏代谢和合成功能的后续调节。药物、病毒、毒素、自身免疫性疾病、代谢疾病和血管疾病都诱发肝细胞死亡，随后的炎症反应有助于ALI的发病机制。
对肝脏的最初侮辱导致细胞因子的产生，化学基质释放，以及随后炎症细胞渗入肝脏。用于 ALI 评估的三种常见测试的生物标志物是 GPT、GOT 和结核病水平。GPT 和 GOT 是按活动水平测量的酶，而结核病水平则通过血清浓度测量肝脏功能。当升高时，血清酶活性水平表示肝细胞或胆碱23的损伤。快速光谱光度测量方法最早在阿瑟·卡门于1955年24年在工作中报告，使血清酶测量得以广泛临床应用。自那时以来，GOT 和 GPT 测量也用于检测肝细胞损伤。GPT 的使用频率更高，同时使用 GPT 测试通常会显示冗余结果。GOT 和 GPT 的释放率和受伤细胞的清除率之间的活动水平增加可用于测量对细胞的损伤率。当受伤的肝细胞导致肝脏在正常活动，如加工和去除胆汁作为胆汁时，这表明ALI更严重。
协议中有几个步骤至关重要，值得认真考虑。大多数协议要求在接触调查剂之前和之后进行血清生物标志物测试，因为血清酶浓度水平的升高很常见。但是，由于升高 ALT 的时间波动，应定期进行几次测试，以检测任何高程。在此协议中，我们选择在基线和接触毒素后 24 小时测试 GOT、GPT 和结核病水平。根据最近的研究，这些生物标志物的水平与ALI的严重程度在17期间密切相关。如图1所示，在诱导ALI后24小时，所有样本的血液GOT、GPT和结核病水平都升高。这表明该模型在极短的时间间隔内量化了自暴露于 CCl4后的结果。应该考虑到，在严重的ALI，肝脏失去其合成GOT和GPT的能力。因此，在这些情况下，这些酶可能缺乏其预测价值，如文献所示。
接触CCl4的老鼠的组织学发现的特点是细胞膨胀、中枢坏死和议会成员身体的存在25。在这个模型中，有广泛的损害表明与施用的CCl4的剂量成正比。
这种通过奥胃CCl4曝光诱导ALI的方法有许多优点。它简单、便宜，风险最小。该协议在很短的时间内提供了显著的结果。该模型具有很高的可重复性，通常用于确定潜在的肝保护策略的疗效和评估肝损伤的标记。
需要注意的是，CCl4主要影响肝脏的中心区域，这与人类肝衰竭中常见的大规模坏死不相符。此外，CCl4在肝脏中尚未完全代谢，一些非代谢的CCl4会损害其他器官，包括肺和肾脏16。此外，由于不同级别的细胞色素P450的发育和疗效，有一个很大的敏感性变化取决于物种和年龄26。尽管存在这些限制，奥胃CCl4诱导ALI的方法仍然作为有价值的啮齿动物模型。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢内盖夫大学索罗卡医学中心病理学系的伯莎·德尔加多在实验室和组织学分析方面的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G catheter BD Neoflon TM | Becton Dickinson Infusion Therapy AB | ||
| 4% buffered formaldehyde solution | Sigma - Aldrich lab materials technologies | ||
| BD Microtainer SST TM Tubes | Becton Dickinson and Company | ||
| Carbone tetrachloride | Sigma - Aldrich lab materials technologies | CAS 56-23-5 | |
| Isofluran, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | ||
| Olympus AU2700 Chemistry-Immuno Analyzer | Olympus (MN, USA) | Analysis of blood samples was done by the fluorescence method | |
| Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
| RAT Feeding Needles | ORCHID SCIENTIFICS | ||
| SYRINGE SET 1 and 2 ml MEDI -PLUS | Shandong Zibo Shanchuan Medical Instruments Co., Ltd |
References
- Hoofnagle, J. H., Carithers, R. L., Shapiro, C., Ascher, N. Fulminant hepatic failure: Summary of a workshop. Hepatology. 21 (1), 240-252 (1995).
- Rakela, J., Lange, S. M., Ludwig, J., Baldus, W. P. Fulminant hepatitis: Mayo clinic experience with 34 cases. Mayo Clinic Proceedings. 60 (5), 289-292 (1985).
- Riordan, S. M., Williams, R. Treatment of hepatic encephalopathy. New England Journal of Medicine. 337, 473-479 (1997).
- Bernuau, J., Rueff, B., Benhamou, J. Fulminant and subfulminant liver failure: Definitions and causes. Seminars in Liver Disease. 6 (2), 97-106 (1986).
- Lidofsky, S. D. Liver transplantation for fulminant hepatic failure. Gastroenterology Clinics of North America. 22 (2), 257-269 (1993).
- Auzinger, G., Wendon, J. Intensive care management of acute liver failure. Current opinion in critical care. 14 (2), 179-188 (2008).
- Wu, Q., et al. Protection of regenerating liver after partial hepatectomy from carbon tetrachloride hepatotoxicity in rats: Roles of mitochondrial uncoupling protein 2 and ATP stores. Digestive Diseases and Sciences. 54 (9), 1918-1925 (2009).
- Tuñón, M. J., Alvarez, M., Culebras, J. M., González-Gallego, J. An overview of animal models for investigating the pathogenesis and therapeutic strategies in acute hepatic failure. World Journal of Gastroenterologyl. 15 (25), 3086-3098 (2009).
- van de Kerkhove, M. P., Hoekstra, R., van Gulik, T. M., Chamuleau, R. A. Large animal models of fulminant hepatic failure in artificial and bioartificial liver support research. Biomaterials. 25 (9), 1613-1625 (2004).
- Butterworth, R. F., et al. Experimental models of hepatic encephalopathy: ISHEN guidelines. Liver International. 29 (6), 783-788 (2009).
- Zhang, B., Gong, D., Mei, M. Protection of regenerating liver after partial hepatectomy from carbon tetrachloride hepatotoxicity in rats: Role of hepatic stimulator substance. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 14 (10), 1010-1017 (1999).
- Ugazio, G., Danni, O., Milillo, P., Burdino, E., Congiu, A. M. Mechanism of protection against carbon tetrachloride toxicity. I. prevention of lethal effects by partial surgical hepatectomy. Drug and Chemical Toxicology. 5 (2), 115-124 (1982).
- Taniguchi, M., Takeuchi, T., Nakatsuka, R., Watanabe, T., Sato, K. Molecular process in acute liver injury and regeneration induced by carbon tetrachloride. Life Science. 75 (13), 1539-1549 (2004).
- Gordis, E. Lipid metabolites of carbon tetrachloride. Journal of Clinical Investigation. 48 (1), 203-209 (1969).
- Albrecht, J. Cerebral RNA synthesis in experimental hepatogenic encephalopathy. Journal of Neuroscience Research. 6 (4), 553-558 (1981).
- Terblanche, J., Hickman, R. Animal models of fulminant hepatic failure. Digestive Diseases and Sciences. 36 (6), 770-774 (1991).
- Gruenbaum, B. F., et al. Cell-free DNA as a potential marker to predict carbon tetrachloride-induced acute liver injury in rats. Hepatology International. 7 (2), 721-727 (2013).
- Juricek, J., et al. Analytical evaluation of the clinical chemistry analyzer Olympus AU2700 plus. Biochemia Medica. 20 (3), 334-340 (2010).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Wang, T., et al. Protective effects of dehydrocavidine on carbon tetrachloride-induced acute hepatotoxicity in rats. Journal of Ethnopharmacology. 117 (2), 300-308 (2008).
- Ye, X., et al. Hepatoprotective effects of coptidis rhizoma aqueous extract on carbon tetrachloride-induced acute liver hepatotoxicity in rats. Journal of Ethnopharmacology. 124 (1), 130-136 (2009).
- Wills, P. J., Asha, V. V. Protective effect of lygodium flexuosum (L.) sw. extract against carbon tetrachloride-induced acute liver injury in rats. Journal of Ethnopharmacology. 108 (3), 320-326 (2006).
- Senior, J. R. Monitoring for hepatotoxicity: What is the predictive value of liver "function" tests. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 85 (3), 331-334 (2009).
- Karmen, A. A note on the spectrometric assay of glutamic-oxalacetic transaminase in human blood serum. Journal of Clinical Investigation. 34 (1), 131-133 (1955).
- Hubner, G. Ultrastructural liver damage caused by direct action of carbon tetrachloride in vivo and in vitro. Virchows Archiv fur Pathologische Anatomie und Physiologie und fur Klinische Medizin. 339 (3), 187-197 (1965).
- Newsome, P. N., Plevris, J. N., Nelson, L. J., Hayes, P. C. Animal models of fulminant hepatic failure: A critical evaluation. Liver Transplantation. 6 (1), 21-31 (2000).
