Summary
Este protocolo descreve um método comum e viável de induzir lesão hepática aguda (ALI) através da exposição ao ClC4 através de uma sonda orogástrica. A exposição ao CCl4 induz ali através da formação de espécies reativas de oxigênio durante sua biotransformação no fígado. Este método é utilizado para analisar a fisiopatologia da ALI e examinar diferentes estratégias hepatoprotetoras.
Abstract
A lesão hepática aguda (ALI) desempenha um papel crucial no desenvolvimento da insuficiência hepática, que é caracterizada por disfunção hepática grave, incluindo complicações como encefalopatia hepática e síntese proteica prejudicada. Modelos animais adequados são vitais para testar o mecanismo e a fisiopatologia da ALI e investigar diferentes estratégias hepatoprotetoras. Devido à sua capacidade de realizar transformações químicas, o tetracloreto de carbono (CCl4) é amplamente utilizado no fígado para induzir ali através da formação de espécies reativas de oxigênio. A exposição doClC 4 pode ser realizada intraperitonicamente, por inalação ou por sonda nasogástrica ou orogástrica. Aqui, descrevemos um modelo de roedor, no qual ali é induzido pela exposição ccl4 através de uma sonda orogástrica. Este método é barato, facilmente realizado e tem risco mínimo. O modelo é altamente reproduzível e pode ser amplamente utilizado para determinar a eficácia de potenciais estratégias hepatoprotetoras e avaliar marcadores de lesão hepática.
Introduction
A frequência de insultos tóxicos ao fígado, especialmente devido ao abuso de álcool e drogas, está aumentando. A lesão hepática aguda (ALI) está associada a altas taxas de mortalidade e tem causado preocupações clínicas1,2. Lesões tóxicas levam à morte sinalizando caminhos no fígado, resultando em apoptose hepatocito, necrose ou piropose. A ALI desempenha um papel crucial no desenvolvimento da insuficiência hepática, caracterizada por disfunção hepática grave, incluindo complicações como encefalopatia hepática e síntese proteica prejudicada3,4. Embora pesquisas recentes tenham aumentado nosso conhecimento sobre as mudanças fisiológicas e patológicas que acompanham a insuficiência hepática, ela não explicou completamente as características patomoleculares que afetam os mecanismos da morte celular. Além disso, não há medicamentos disponíveis atualmente para reverter a deterioração progressiva em pacientes ali. Atualmente, o único tratamento significativamente eficaz é o transplante hepático5,6.
A fim de investigar o mecanismo e fisiopatologia da ALI e testar diferentes estratégias hepatoprotetoras, diferentes modelos animais são usados para induzir ali. Um modelo animal preferencial da ALI deve imitar o processo patológico da doença por meio de um método confiável, validado, barato e fácil de aplicar. Exemplos de modelos experimentais incluem agentes hepatotóxicos, procedimentos cirúrgicos como hepatectomia total ou parcial, devascularização completa ou transitória e procedimentos infecciosos7,8,9. Substâncias hepatotóxicas conhecidas incluem galactosamina, acetaminofeno, thioacetamina, azoxymetano e ClC4. Destes, o CCl4 é amplamente utilizado, embora ainda não tenha sido bem caracterizado10,11,12,13.
CCl4 é um composto líquido incolor orgânico com um cheiro doce e quase nenhuma inflamabilidade em temperaturas mais baixas. A exposição a altas concentrações de ClC4 pode causar danos ao sistema nervoso central, incluindo deterioração do fígado e rins. CCl4 induz ALI através de sua biotransformação no fígado, que forma espécies reativas de oxigênio. Isso ocorre através da enzima citocromo P450 2E1, formando um metabólito ativo e resultando em dano celular por ligação de macromoléculas, aumento da peroxidação lipídica e perturbação da homeostase de cálcio intracelular14. Além disso, o modelo CCl4 pode ser usado para estimular os astrócitos ao nível da síntese de RNA15. Esta hepatotoxina tem sido administrada pelas rotas intraperitoneal, intraportal, oral e intratragastrica16.
Neste protocolo, descrevemos em detalhes ccl4-induzido ALI em ratos através de uma sonda orogástrica. Este método induz ali robusto e reprodutível que pode ser usado para investigar a patogênese de ALI. A determinação da gravidade da doença hepática é monitorada pela medição do soro glutamato-piruvato transaminase (GPT), enzimas transaminase oxaloacticais glutamicas (GOT) e bilirrubina total (TB), bem como diagnóstico histológico definitivo por hematoxilina e eosina (H&E) tecidos hepáticos manchados. A exposição ao CCl4 através de um acesso intragastric permite um método prático, barato e minimamente invasivo com risco mínimo de risco.
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Protocol
Os experimentos foram realizados de acordo com as recomendações das Declarações de Helsinque e Tóquio e das Diretrizes para o Uso de Animais Experimentais da Comunidade Europeia. Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Animais da Universidade Ben-Gurion do Negev.
NOTA: O modelo CCL4 foi gerado e utilizado em um estudo anterior17. O cronograma do protocolo é demonstrado na Tabela 1.
1. Preparar ratos para o procedimento experimental
NOTA: Selecione ratos machos adultos sprague Dawley pesando 300-350 g.
- Obter aprovação para experimentos do Comitê de Cuidado e Uso de Animais Institucionais (IACUC).
- Mantenha os ratos em temperatura ambiente (22 °C ± 1 °C), com 12 h de luz e 12 h de ciclos escuros. Forneça comida de rato e água ad libitum.
- Realize todos os experimentos entre 6:00 e 12:00.
- Raspe o rato e desinfete a pele com álcool.
2. Determinação dos níveis de linha de base do soro GOT, GPT e TB
- Anestesia
- Prepare um sistema de administração isoflurano contínuo para induzir anestesia. Certifique-se de que o sistema de vaporizador está cheio de isoflurano.
- Anestesiar o rato com 2% de isoflurano. Confirme que o rato está totalmente anestesiado observando o movimento e o reflexo do pedal em resposta a estímulos externos.
NOTA: Use isoflurano de 1 a 5% para indução e manutenção de anestesia.
- Cannulate a veia traseira com um cateter de 22 G.
- Coletar uma amostra de sangue de 0,5 mL na linha de base. Certifique-se de que o volume sanguíneo recuperado não exceda as diretrizes da IACUC.
- Realizar análises bioquímicas sanguíneas incluindo as medidas do soro GOT, GPT e TB, conforme descrito anteriormente18.
NOTA: Os exames de enzimas hepáticas e nível de TB foram realizados no laboratório bioquímico do Soroka Medical Center. As amostras de sangue foram analisadas utilizando-se um método de fluorescência em um analisador de química (Tabela de Materiais).
3. Indução de lesão hepática aguda em ratos
ATENÇÃO: A exposição a altas concentrações de ClC4, incluindo absorção através de vapor ou pele, pode ter efeitos negativos no sistema nervoso central e causar degeneração do fígado e rins. Exposição prolongada pode causar coma ou morte.
- Prepare uma solução de 50% de CCl4 (Tabela de Materiais) misturando CCl4 com azeite como veículo em uma proporção 1:1.
NOTA: A solução deve ser preparada de acordo com as diretrizes da IACUC para compostos não farmacêuticos. - Induzir hepatotoxicidade in vivo pela administração do CCL4 através de uma sonda orogástrica.
- Insira uma sonda orogástrica de 16 G (3 polegadas de profundidade) através da cavidade oral do rato.
- Exponha o rato a diferentes doses de CCl4 injetando uma seringa com uma das seguintes soluções diluídas no estômago do rato: 1 mL/kg (ALI leve), 2,5 mL/kg (ALI moderado) ou 5 mL/kg (ALI grave) da solução de 50%. Para o grupo de controle falso, exponha o rato apenas a 5 mL/kg de azeite.
4. Determinação dos níveis de soro GOT, GPT e TB após 24 h
- Anestesia
- Prepare um sistema de administração isoflurano contínuo para induzir anestesia. Certifique-se de que o sistema de vaporizador está cheio de isoflurano.
- Anestesiar os ratos com 2% de isoflurano. Confirme que o rato está totalmente anestesiado observando o movimento e o reflexo do pedal em resposta a estímulos externos.
- Coletar amostras de sangue às 24h da exposição ao ClC4.
- Realizar análisebioquímica sanguínea, incluindo medidas de soro GOT, GPT e TB.
5. Coleta de fígado para exame histológico
- Eutanie o rato substituindo a mistura de gás inspirada por 20% O2/80% CO2. Certifique-se de que o CO2 seja entregue a uma taxa pré-determinada de acordo com as diretrizes da IACUC.
- Certifique-se de morte verificando a falta de batimentos cardíacos e confirme por um método secundário de acordo com as diretrizes da IACUC.
- Coloque o rato sobre uma tábua de dissecação com sua superfície dorsal voltada para baixo e abdômen voltado para cima. Raspe o abdômen do rato.
- Com um bisturi, incida o comprimento total da pele ventrum do ânus até o queixo. Separe a pele. Incise a parede abdominal com um bisturi do ânus até a cartilagem xilóide, expondo as vísceras abdominais.
- Usando tesouras e fórceps, isole o fígado dissecando-o de seus ligamentos e fixações. Começando pelo hilum do fígado, realize cuidadosamente uma hepatectomia liberando todos os lóbulos do fígado de anexos. Dissecar e cortar todos os ligamentos e vasos sanguíneos.
- Transfira o fígado para uma placa de Petri. Fixar o fígado em uma solução de formaldeído tampão de 4%(Tabela de Materiais)por pelo menos 24 h.
6. Exame histológico
- Preparação da amostra
- Após a fixação, corte a amostra em uma série de fatias de 5 μm de espessura por secção de microtomes.
- Coloque delicadamente as fatias em lâminas de vidro com um pincel macio, 1 fatia por slide.
- Realizar a coloração de H&E como descrito anteriormente19.
- Examine as fatias sob um microscópio a uma ampliação de 200x usando uma lente objetiva de 20 mm(Tabela de Materiais).
NOTA: As seções hepáticas devem ser classificadas por um patologista especializado cego ao protocolo de tratamento. Um escore de 0 não indica anormalidades hepáticas, 1-2 indica lesão hepática leve, 3-4 indica lesão hepática moderada, e 5-6 indica lesão hepática grave20,21,22.
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Representative Results
Os níveis de TB, GOT e GPT aumentaram significativamente 24 h após induzirem ALI (mais doses de CCl4) em comparação com controles falsos (p < 0,001) (Figura 1). Os níveis de TB, GOT e GPT na linha de base eram normais e não eram significativamente diferentes dos controles operados por fraude. Às 24 horas, todos os três grupos intervencionais, 1 mL/kg CCl4 (1, 1−2), 2,5 mL/kg CCl4 (3, 3−4) e 5 mL/kg CCl4 (4, 4-5,75), apresentaram um escore de classificação histológica significativamente maior do que o grupo de controle falso operado (0, 0-0) (p < 0,05, dados apresentados como mediana, 25-75%). As imagens de H&E de um controle falso(Figura 2A)e grupos expostos a diferentes doses de CCl4 (Figura 2B−D)mostram alterações histopatológicas 24 h após a exposição da CCl4. A interrupção da arquitetura hepatocelular por CCl4 foi demonstrada por um alto grau de lesão tecidual com grande deformação de septo fibroso, extensão de fibras, acúmulo de colágeno e separação pseudo-lóbulo em seções hepáticas(Figura 2).
Figura 1: Níveis de TB sérica (A), GOT (B) e GPT (C) em amostras de sangue 24 h após exposição a diferentes doses de CCl4 em comparação com controles falsos operados. Barra azul: controle; barra vermelha: 24 horas após a exposição do CCl4. O significado das comparações entre ratos expostos ao CCL4e ratos não expostos é determinado usando o teste de Mann-Whitney. Um valor p de <0,05 foi considerado significativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Alterações histopatológicas no tecido hepático manchados com H&E após 24 h de intoxicação ccl4 em várias doses. (A) controle falso, (B) 1 mL/kg CCl4, (C) 2,5 mL/kg CCl4,e(D) 5 mL/kg CCl4. Barra de escala = 50 μm. A distribuição dos desfechos histológicos foi prevista por regressão linear. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Grupos | 0 horas | 24 horas |
| Sham (15 ratos) | GOT, GPT, nível de linha de base da TB | GOT, GPT, nível de TB |
| ALI Leve (15 ratos) | ||
| ALI moderado (15 ratos) | Exposição ccl4 para grupos ALI e azeite de oliva para grupo sham | Exame histológico |
| ALI grave (18 ratos) |
Tabela 1: Demonstração do cronograma do protocolo. Os vários grupos de ratos em diferentes momentos incluem um grupo de controle falso, ALI leve (exposição a 1 mL/kg CCl4), ALI moderado (exposição a 2,5 mL/kg CCl4) e ALI grave (exposição a 5 mL/kg CCl4). Às 24 horas, foram medidos os níveis de soro GOT, GPT e TB, e foi realizado exame histológico para os quatro grupos.
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Discussion
Neste protocolo, CCl4 é usado como uma toxina hepática para induzir ALI em ratos. Ali é caracterizada pela perda de parenchyma hepático e subsequente desregulação das funções metabólicas e sintéticas do fígado. Drogas, vírus, toxinas, doenças autoimunes, doenças metabólicas e doenças vasculares induzem a morte hepatocito, e a resposta inflamatória subsequente contribui para a patogênese da ALI.
O insulto inicial ao fígado leva à produção de citocina, liberação de quimiocina e posterior infiltração de células inflamatórias no fígado. Três dos biomarcadores comumente testados para avaliação de ALI são os níveis de GPT, GOT e TB. GPT e GOT são enzimas medidas pelo nível de atividade, enquanto o nível de TB mede a função hepática pela concentração do soro. Quando elevados, os níveis de atividade enzimática do soro denotam lesões em hepatócitos ou colangiocitos23. O método espectrofotométrico rápido foi relatado pela primeira vez no trabalho de Arthur Karmen em 195524,o que permitiu a aplicação clínica generalizada da medição da enzima sérilha. Desde então, as medidas GOT e GPT também foram aplicadas para detectar lesões hepatocitos. O GPT é usado com mais freqüência, e os testes gpt simultâneos geralmente revelam resultados redundantes. O aumento dos níveis de atividade de GOT e GPT entre as taxas de liberação e as taxas de liberação de células feridas pode ser usado para medir aproximadamente a taxa de lesão nas células. Quando as células hepáticas feridas fazem com que o fígado falhe em suas atividades normais, como o processamento e a remoção da bilirrubina como bile, isso indica que o ALI é mais grave.
Existem várias etapas no protocolo que são críticas e merecem uma consideração cuidadosa. A maioria dos protocolos requer testes de biomarcadores de soro antes e depois da exposição ao agente investigativo, já que elevações nos níveis de concentração de enzimas sérgicas são comuns. No entanto, devido a flutuações no tempo de ALT elevado, vários testes devem ser realizados periodicamente para detectar qualquer elevação. Neste protocolo, optamos por testar os níveis got, GPT e TB na linha de base e 24 h após a exposição à toxina. De acordo com estudos recentes, os níveis desses biomarcadores correlacionaram-se bem com a gravidade da ALI durante este intervalo de tempo17. Conforme mostrado na Figura 1,os níveis de sangue GOT, GPT e TB foram elevados em todas as amostras 24h após induzir ali. Isso indica que o modelo quantificou os resultados em um intervalo de tempo muito curto desde a exposição à CCl4. Deve-se levar em conta que em ALI grave o fígado perde sua capacidade de sintetizar GOT e GPT. Portanto, nesses casos essas enzimas podem não ter seu valor preditivo como demonstrado na literatura.
Os achados histológicos de ratos expostos à CCL4 são caracterizados pelo balonismo de células, necrose centrilobular e a presença de corpos de vereador25. Neste modelo houve dano generalizado que se mostrou proporcional à dose de CCl4 administrada.
Este método de induzir ali através da exposição orogástrica CCl4 tem inúmeras vantagens. É simples, barato e com risco mínimo. O protocolo fornece resultados significativos em um intervalo de tempo muito curto. O modelo é altamente reproduzível e pode ser comumente utilizado para determinar a eficácia de potenciais estratégias hepatoprotetoras e avaliar marcadores de lesão hepática.
É importante notar que o CCl4 afeta principalmente a zona central do fígado, que não corresponde à necrose maciça tipicamente vista na insuficiência hepática humana. Além disso, o CCl4 não é completamente metabolizado no fígado, e alguns dos CCl4 não metabolizados podem danificar outros órgãos, incluindo pulmões e rins16. Além disso, devido aos diferentes níveis de desenvolvimento e eficácia citocromo P450, há uma grande variação de sensibilidade dependendo das espécies e idade26. Apesar dessas limitações, o método de Ali induzido pelo CCl4ainda serve como um modelo valioso de roedores.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem bertha Delgado, Departamento de Patologia, Soroka Medical Center, Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade Ben-Gurion do Negev, por sua ajuda no laboratório, bem como na análise histologia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G catheter BD Neoflon TM | Becton Dickinson Infusion Therapy AB | ||
| 4% buffered formaldehyde solution | Sigma - Aldrich lab materials technologies | ||
| BD Microtainer SST TM Tubes | Becton Dickinson and Company | ||
| Carbone tetrachloride | Sigma - Aldrich lab materials technologies | CAS 56-23-5 | |
| Isofluran, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | ||
| Olympus AU2700 Chemistry-Immuno Analyzer | Olympus (MN, USA) | Analysis of blood samples was done by the fluorescence method | |
| Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
| RAT Feeding Needles | ORCHID SCIENTIFICS | ||
| SYRINGE SET 1 and 2 ml MEDI -PLUS | Shandong Zibo Shanchuan Medical Instruments Co., Ltd |
References
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