Summary
Este protocolo describe un método común y factible para inducir lesiones hepáticas agudas (ALI) a través de la exposición de CCl4 a través de un tubo orogástrico. La exposición a CCl4 induce ALI a través de la formación de especies reactivas de oxígeno durante su biotransformación en el hígado. Este método se utiliza para analizar la fisiopatología de ALI y examinar diferentes estrategias hepatoprotectoras.
Abstract
La lesión hepática aguda (ALI) desempeña un papel crucial en el desarrollo de la insuficiencia hepática, que se caracteriza por una disfunción hepática grave, incluyendo complicaciones como la encefalopatía hepática y la síntesis de proteínas deterioradas. Los modelos animales apropiados son vitales para probar el mecanismo y la fisiopatología de la ALI e investigar diferentes estrategias hepatoprotectoras. Debido a su capacidad para realizar transformaciones químicas, tetracloruro de carbono (CCl4) es ampliamente utilizado en el hígado para inducir ALI a través de la formación de especies reactivas de oxígeno. La exposición a CCl4 se puede realizar por vía intraperitoneal, por inhalación o a través de una sonda nasogástrica u orogástrica. Aquí, describimos un modelo de roedor, en el que la ALI es inducida por la exposición de CCl4 a través de un tubo orogástrico. Este método es barato, fácil de realizar y tiene un riesgo mínimo de peligro. El modelo es altamente reproducible y puede ser ampliamente utilizado para determinar la eficacia de posibles estrategias hepatoprotectoras y evaluar marcadores de lesión hepática.
Introduction
La frecuencia de los insultos tóxicos en el hígado, especialmente debido al abuso de alcohol y drogas, está aumentando. La lesión hepática aguda (ALI) se asocia con altas tasas de mortalidad y ha causado problemas clínicos1,,2. La lesión tóxica conduce a las vías de señalización de la muerte en el hígado, lo que resulta en apoptosis de hepatocitos, necrosis o piroptosis. LA ALI desempeña un papel crucial en el desarrollo de la insuficiencia hepática, que se caracteriza por una disfunción hepática grave que incluye complicaciones como la encefalopatía hepática y el deterioro de la síntesis de proteínas3,4. Aunque investigaciones recientes han aumentado nuestro conocimiento sobre los cambios fisiológicos y patológicos que acompañan a la insuficiencia hepática, no ha explicado completamente las características patomoleculares que afectan los mecanismos de la muerte celular. Además, actualmente no hay medicamentos disponibles para revertir el deterioro progresivo en pacientes con ALA. Actualmente, el único tratamiento significativamente eficaz es el trasplante de hígado5,,6.
Con el fin de investigar el mecanismo y la fisiopatología de ALI y para probar diferentes estrategias hepatoprotectoras, diferentes modelos animales se utilizan para inducir ALI. Un modelo animal preferible de ALI debe imitar el proceso patológico de la enfermedad a través de un método fiable, validado, barato y fácil de aplicar. Algunos ejemplos de modelos experimentales son los agentes hepatotóxicos, los procedimientos quirúrgicos como la hepatectomía total o parcial, la desvascularización completa o transitoria y los procedimientos infecciosos7,,8,,9. Las sustancias hepatotóxicas conocidas incluyen galactosamina, paracetamol, tioacetamida, azoximetano y CCl4. De estos, CCl4 es ampliamente utilizado aunque todavía no ha sido bien caracterizado10,11,12,13.
CCl4 es un compuesto líquido incoloro orgánico con un olor dulce y casi sin inflamabilidad a temperaturas más bajas. La exposición a altas concentraciones de CCl4 puede causar daños en el sistema nervioso central, incluyendo el deterioro del hígado y los riñones. CCl4 induce ALI a través de su biotransformación en el hígado, que forma especies reactivas de oxígeno. Esto ocurre a través de la enzima citocromo P450 2E1, formando un metabolito activo y resultando en daño celular por unión a macromoléculas, mejora de la peroxidación lipídica y alteración de la homeostasis de calcio intracelular14. Además, el modelo CCl4 se puede utilizar para estimular los astrocitos a nivel de síntesis de ARN15. Esta hepatotoxina ha sido administrada por las vías intraperitoneal, intraportal, oral e intragástrica16.
En este protocolo, describimos en detalle la ALI inducida por CCl4en ratas a través de una sonda orogástrica. Este método induce ALI robusto y reproducible que se puede utilizar para investigar la patogénesis de la ALI. La determinación de la gravedad de la enfermedad hepática se controla mediante la medición de glutamato-piruvato transaminasa sérica (GPT), enzimas transaloacéticas oxaloacéticas glutámicas (GOT) y bilirrubina total (TB), así como diagnóstico histológico definitivo por hematoxilina y tejidos hepáticos manchados de hematoxilina y eosina (H&E). La exposición a CCl4 a través de un acceso intragástrico permite un método práctico, barato y mínimamente invasivo con un riesgo mínimo de peligro.
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Protocol
Los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con las recomendaciones de las Declaraciones de Helsinki y Tokio y las Directrices para el uso de animales experimentales de la Comunidad Europea. Los experimentos fueron aprobados por el Comité de Cuidado Animal de la Universidad Ben-Gurion del Negev.
NOTA: El modelo CCl4 se ha generado y utilizado en un estudio anterior17. La escala de tiempo del protocolo se muestra en la Tabla 1.
1. Preparación de ratas para el procedimiento experimental
NOTA: Seleccione ratas macho adultas Sprague Dawley que pesen 300 a 350 g.
- Obtener la aprobación de experimentos del Comité Institucional de Cuidado y Uso animal (IACUC).
- Mantener las ratas a temperatura ambiente (22oC a 1oC), con ciclos de luz de 12 h y 12 h de oscuridad. Proporcione comida para ratas y agua ad libitum.
- Realice todos los experimentos entre las 6:00 a.m. y las 12:00 p.m.
- Afeitar la rata y desinfectar la piel con alcohol.
2. Determinación de los niveles de referencia séricos de GOT, GPT y TB
- Anestesia
- Preparar un sistema de administración continua de isoflurano para inducir anestesia. Asegúrese de que el sistema de vaporizador esté lleno de isoflurano.
- Anestesia rinde a la rata con 2% de isoflurano. Confirme que la rata está completamente anestesiada observando el movimiento y el reflejo del pedal en respuesta a estímulos externos.
NOTA: Utilice 1-5% de isoflurano para la inducción y el mantenimiento de la anestesia.
- Cannute la vena de la cola con un catéter de 22 G.
- Recoger una muestra de sangre de 0,5 ml al inicio. Asegúrese de que el volumen sanguíneo recuperado no exceda las pautas de la IACUC.
- Realizar análisis bioquímicos en sangre, incluidas las mediciones de GOT, GPT y TB séricos, como se describió anteriormente18.
NOTA: Los exámenes de las enzimas hepáticas y el nivel de tuberculosis se llevaron a cabo en el laboratorio bioquímico del Centro Médico Soroka. Se analizaron muestras de sangre utilizando un método de fluorescencia en un analizador de química(Tabla de materiales).
3. Inducción de una lesión hepática aguda en ratas
ADVERTENCIA: La exposición a altas concentraciones de CCl4,incluida la absorción a través de vapor o piel, puede tener efectos negativos en el sistema nervioso central y causar degeneración del hígado y los riñones. La exposición prolongada puede causar coma o la muerte.
- Preparar una solución del 50% de CCl4 (Tabla de Materiales)mezclando CCl4 con aceite de oliva como vehículo en una proporción de 1:1.
NOTA: La solución debe prepararse de acuerdo con las directrices de la IACUC para compuestos de calidad no farmacéutico. - Inducir la hepatotoxicidad in vivo por CCl4 administración a través de una sonda orogástrica.
- Inserte un tubo orogástrico de 16 G (3 pulgadas de profundidad) a través de la cavidad oral de la rata.
- Exponga la rata a diferentes dosis de CCl4 inyectando una jeringa con una de las siguientes soluciones diluidas en el estómago de la rata: 1 ml/kg (ALI leve), 2,5 ml/kg (ALI moderada) o 5 ml/kg (ALI grave) de la solución del 50%. Para el grupo de control accionado por las farsas, exponga la rata únicamente a 5 ml/kg de aceite de oliva.
4. Determinación de los niveles séricos de GOT, GPT y TB después de 24 h
- Anestesia
- Preparar un sistema de administración continua de isoflurano para inducir anestesia. Asegúrese de que el sistema de vaporizador esté lleno de isoflurano.
- Anestesiar a las ratas con 2% de isoflurano. Confirme que la rata está completamente anestesiada observando el movimiento y el reflejo del pedal en respuesta a estímulos externos.
- Recoger muestras de sangre a las 24 h de la exposición a CCl4.
- Realizar análisis bioquímicos de sangre, incluidas mediciones de GOT sérica, GPT y tuberculosis.
5. Recogida de hígado para el examen histológico
- Euthanizar la rata mediante la sustitución de la mezcla de gas inspirado por 20% O2/80% CO2. Asegúrese de que elCO2 se entregue a una tarifa predeterminada de acuerdo con las directrices de la IACUC.
- Asegurar la muerte comprobando la falta de latidos del corazón y confirmar por un método secundario de acuerdo con las directrices de la IACUC.
- Coloque la rata sobre una placa de diseción con su superficie dorsal hacia abajo y el abdomen hacia arriba. Afeitar el abdomen de la rata.
- Con un bisturí, incise toda la longitud de la piel del ventrum desde el ano hasta la barbilla. Separe la piel. Incise la pared abdominal con un bisturí desde el ano hasta el cartílago xifoide, exponiendo las vísceras abdominales.
- Usando tijeras y fórceps, aislar el hígado disectinglo de sus ligamentos y accesorios. Comenzando en el hilum hepático, realiza cuidadosamente una hepatectomía liberando todos los lóbulos hepáticos de los accesorios. Diseccionar y cortar todos los ligamentos y vasos sanguíneos.
- Transfiera el hígado a un plato de Petri. Fijar el hígado en una solución de formaldehído tampón 4%(Tabla de materiales) durante al menos 24 h.
6. Examen histológico
- Preparación de muestras
- Después de la fijación, corte la muestra en una serie de rodajas de 5 m de espesor mediante la sección de microtome.
- Coloque suavemente las rodajas en los portaobjetos de vidrio con un cepillo suave, 1 rebanada por diapositiva.
- Realice la tinción de H&E como se describió anteriormente19.
- Examine las rodajas bajo un microscopio con un aumento de 200x utilizando una lente objetivo de 20 mm(Tabla de materiales).
NOTA: Las secciones hepáticas deben ser calificadas por un patólogo especializado cegado al protocolo de tratamiento. Una puntuación de 0 indica que no hay anomalías hepáticas, 1-2 indica lesión hepática leve, 3–4 indica lesión hepática moderada, y 5-6 indica lesión hepática grave20,21,22.
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Representative Results
Los niveles de TB, GOT y GPT aumentaron significativamente 24 h después de inducir ALI (más adosis más altas de CCl 4) en comparación con los controles accionados por falsos (p < 0.001)(Figura 1). Los niveles de TB, GOT y GPT al inicio eran normales y no eran significativamente diferentes de los controles falsos operados. A las 24 h, los tres grupos de intervención, 1 mL/kg CCl4 (1, 1x2), 2,5 mL/kg CCl4 (3, 3x4) y 5 mL/kg CCl4 (4, 4 x 5,75), tenía una puntuación histológica significativamente mayor que el grupo de control operado por la farsa (0, 0-0) (p < 0,05, datos presentados como medianas, rango de 25 a 75%). Las imágenes de H&E de un control accionado por falsos(Figura 2A)y grupos expuestos a diferentes dosis de CCl4 (Figura 2B-D)muestran cambios histopatológicos 24 h después de la exposición a CCl4. La interrupción de la arquitectura hepatocelular por CCl4 se demostró por un alto grado de lesión tisular con gran deformación fibrosa de septo, extensión de fibras, acumulación de colágeno y separación pseudo lóbulo en secciones hepáticas(Figura 2).
Figura 1: Niveles de TB sérico (A), GOT (B) y GPT (C) en muestras de sangre 24 h después de la exposición a diferentes dosis de CCl4 en comparación con los controles atravesados por falsos. Barra azul: control; barra roja: 24 h después de la exposición aCCl 4. La importancia de las comparaciones entre ratas expuestas cCl4y ratas no expuestas se determina utilizando la prueba Mann-Whitney. Un valor p de <0.05 se consideró significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Cambios histopatológicos en el tejido hepático teñido con H&E después de 24 h CCl4 intoxicación en varias dosis. (A) control accionado por farsa, (B) 1 mL/kg CCl4, (C) 2,5 ml/kg CCl4y (D) 5 ml/kg CCl4. Barra de escala a 50 m. La distribución de los resultados histológicos fue predicha por regresión lineal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Grupos | 0 horas | 24 horas |
| Sham (15 ratas) | Nivel de referencia de GOT, GPT, TB | Nivel de GOT, GPT, TB |
| AlI suave (15 ratas) | ||
| ALI moderado (15 ratas) | Exposición CCl4 para grupos de ALI y aceite de oliva para grupo falso | Examen histológico |
| ALI grave (18 ratas) |
Tabla 1: Demostración de la línea de tiempo del protocolo. Los diversos grupos de ratas en diferentes momentos incluyen un grupo de control accionado por las farsas, ALI leve (exposición a 1 ml/kg CCl4),ALI moderado (exposición a 2,5 ml/kg CCl4)y ALI grave (exposición a 5 ml/kg CCl4). En el tiempo 24 h, se midieron los niveles séricos de GOT, GPT y TB, y se realizó un examen histológico para los cuatro grupos.
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Discussion
En este protocolo, CCl4 se utiliza como una toxina hepática para inducir ALI en ratas. LA ALI se caracteriza por la pérdida de parénquima hepático y la posterior desregulación de las funciones metabólicas y sintéticas del hígado. Los medicamentos, virus, toxinas, enfermedades autoinmunes, enfermedades metabólicas y trastornos vasculares inducen la muerte de hepatocitos, y la posterior respuesta inflamatoria contribuye a la patogénesis de la ALI.
El insulto inicial al hígado conduce a la producción de citoquinas, liberación de quimioquina, y posterior infiltración de células inflamatorias en el hígado. Tres de los biomarcadores comúnmente probados para la evaluación de la ALI son los niveles de TGP, GOT y TB. GPT y GOT son enzimas medidas por nivel de actividad, mientras que el nivel de tuberculosis mide la función hepática por concentración sérica. Cuando son elevados, los niveles de actividad enzimática sérica denotan lesiones a hepatocitos o colangiocitos23. El método espectrofotométrico rápido se notificó por primera vez en el trabajo de Arthur Karmen en 195524,lo que permitió la aplicación clínica generalizada de la medición de enzimas séricas. Desde entonces, las mediciones gota y GPT también se han aplicado para detectar lesiones por hepatocitos. GPT se utiliza con más frecuencia, y las pruebas simultáneas de GPT generalmente revelan resultados redundantes. El aumento en los niveles de actividad de GOT y GPT entre las tasas de liberación y las tasas de aclaramiento de las células lesionadas se puede utilizar para medir aproximadamente la tasa de lesiones a las células. Cuando las células hepáticas lesionadas hacen que el hígado falle en sus actividades normales, como procesar y eliminar la bilirrubina como bilis, esto indica que la ALI es más grave.
Hay varios pasos en el protocolo que son críticos y merecen una cuidadosa consideración. La mayoría de los protocolos requieren pruebas de biomarcadores séricos antes y después de la exposición al agente investigativo, ya que las elevaciones en los niveles de concentración de enzimas séricas son comunes. Sin embargo, debido a las fluctuaciones en el tiempo de ALT elevado, se deben realizar varias pruebas periódicamente para detectar cualquier elevación. En este protocolo, elegimos probar los niveles de GOT, GPT y TB al inicio y 24 h después de la exposición a la toxina. Según estudios recientes, los niveles de estos biomarcadores se correlacionaron bien con la gravedad de la ALI durante este intervalo de tiempo17. Como se muestra en la Figura 1, los niveles de GOT de sangre, GPT y tuberculosis fueron elevados en todas las muestras 24 h después de inducir ALI. Esto indica que el modelo ha cuantificado los resultados en un intervalo de tiempo muy corto desde la exposición a CCl4. Uno debe tener en cuenta que en ALI grave el hígado pierde su capacidad para sintetizar GOT y GPT. Por lo tanto, en estos casos estas enzimas pueden carecer de su valor predictivo como se muestra en la literatura.
Los hallazgos histológicos de ratas expuestas a CCl4 se caracterizan por el globo de células, la necrosis centrilobular y la presencia de cuerpos deconcejales 25. En este modelo hubo un daño generalizado demostrado que es proporcional a la dosis de CCl4 administrada.
Este método de inducir ALI a través de la exposición orogástrica CCl4 tiene numerosas ventajas. Es simple, barato y con un riesgo mínimo. El protocolo proporciona resultados significativos en un intervalo de tiempo muy corto. El modelo es altamente reproducible y se puede utilizar comúnmente para determinar la eficacia de posibles estrategias hepatoprotectoras y evaluar marcadores de lesión hepática.
Es importante tener en cuenta que CCl4 afecta principalmente a la zona central del hígado, que no coincide con la necrosis masiva que normalmente se ve en la insuficiencia hepática humana. Por otra parte, CCl4 no está completamente metabolizado en el hígado, y algunos de los No metabolizados CCl4 pueden dañar otros órganos, incluyendo pulmones y riñones16. Además, debido a los diferentes niveles de desarrollo y eficacia del citocromo P450, hay una gran variación en la sensibilidad dependiendo de la especie y la edad26. A pesar de estas limitaciones, el método de alambique orogástrico CCl4-inducido ALI todavía sirve como un modelo valioso de roedores.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Bertha Delgado, Departamento de Patología, Centro Médico Soroka, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Ben-Gurion del Negev, por su ayuda en el laboratorio, así como en el análisis de histología.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G catheter BD Neoflon TM | Becton Dickinson Infusion Therapy AB | ||
| 4% buffered formaldehyde solution | Sigma - Aldrich lab materials technologies | ||
| BD Microtainer SST TM Tubes | Becton Dickinson and Company | ||
| Carbone tetrachloride | Sigma - Aldrich lab materials technologies | CAS 56-23-5 | |
| Isofluran, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | ||
| Olympus AU2700 Chemistry-Immuno Analyzer | Olympus (MN, USA) | Analysis of blood samples was done by the fluorescence method | |
| Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
| RAT Feeding Needles | ORCHID SCIENTIFICS | ||
| SYRINGE SET 1 and 2 ml MEDI -PLUS | Shandong Zibo Shanchuan Medical Instruments Co., Ltd |
References
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