Summary
Denne protokollen beskriver en vanlig og gjennomførbar metode for å indusere akutt leverskade (ALI) via CCl4 eksponering gjennom et orogastrisk rør. CCl4 eksponering induserer ALI gjennom dannelsen av reaktive oksygenarter under biotransformasjon i leveren. Denne metoden brukes til å analysere patofysiologien til ALI og undersøke forskjellige hepatoprotektoriske strategier.
Abstract
Akutt leverskade (ALI) spiller en avgjørende rolle i utviklingen av leversvikt, som er preget av alvorlig leverdysfunksjon, inkludert komplikasjoner som hepatisk encefalopati og nedsatt proteinsyntese. Passende dyremodeller er avgjørende for å teste mekanismen og patofysiologien til ALI og undersøke ulike hepatoprotektoriske strategier. På grunn av sin evne til å utføre kjemiske transformasjoner, er karbontetrachlorid (CCl4) mye brukt i leveren for å indusere ALI gjennom dannelsen av reaktive oksygenarter. CCl4 eksponering kan utføres intraperitonealt, ved innånding, eller gjennom et nasogastrisk eller orogastrisk rør. Her beskriver vi en gnagermodell, der ALI induseres av CCl4 eksponering gjennom et orogastrisk rør. Denne metoden er billig, lett utført, og har minimal fare. Modellen er svært reproduserbar og kan brukes mye for å bestemme effekten av potensielle hepatoprotective strategier og vurdere markører for leverskade.
Introduction
Hyppigheten av giftige fornærmelser mot leveren, spesielt på grunn av alkohol og narkotikamisbruk, øker. Akutt leverskade (ALI) er forbundet med høy dødelighet og har forårsaket kliniske bekymringer1,2. Giftig skade fører til dødssignalveier i leveren, noe som resulterer i hepatocytt apoptose, nekrose eller pyroptose. ALI spiller en avgjørende rolle i utviklingen av leversvikt, som er preget av alvorlig leverdysfunksjon, inkludert komplikasjoner som hepatisk encefalopati og nedsatt proteinsyntese3,4. Selv om nyere forskning har økt vår kunnskap om de fysiologiske og patologiske forandringene som følger med leversvikt, har den ikke helt forklart de patogene egenskapene som påvirker mekanismene for celledød. Videre er ingen medisiner for tiden tilgjengeligfor å reversere den progressive forverringen hos ALI-pasienter. Foreløpig er den eneste signifikant effektive behandlingen levertransplantasjon5,6.
For å undersøke mekanismen og patofysiologien til ALI og for å teste forskjellige hepatoprotektoringsstrategier, brukes forskjellige dyremodeller til å indusere ALI. En foretrukket dyremodell av ALI bør etterligne den patologiske prosessen av sykdommen via en pålitelig, validert, billig og lett å bruke metode. Eksempler på eksperimentelle modeller inkluderer hepatotoksiske midler, kirurgiske prosedyrer som total eller delvis hepatectomy, fullstendig eller forbigående devaskularisering, og infeksiøs prosedyrer7,,8,9. Kjente hepatotoksiske stoffer inkluderer galaktosamin, paracetamol, tioacetamid, azoksysan og CCl4. Av disse er CCl4 mye brukt selv om det ennå ikke er godt karakterisert10,11,12,13.
CCl4 er en organisk fargeløs væskeforbindelse med en søt lukt og nesten ingen brennbarhet ved lavere temperaturer. Eksponering for høye konsentrasjoner av Cl4 kan forårsake skade på sentralnervesystemet, inkludert forverring av leveren og nyrene. CCl4 induserer ALI gjennom sin biotransformasjon i leveren, som danner reaktive oksygenarter. Dette skjer via P450 cytokromenzymet 2E1, danner en aktiv metabolitt og resulterer i celleskade ved makromolekylbinding, forbedring av lipidperoksidasjon og forstyrrelse av intracellulær kalsium homeostase14. I tillegg kan CCl4-modellen brukes til å stimulere astrocytter på nivået av RNA-syntese15. Dette hepatotoksin har blitt administrert av intraperitoneal, intraportal, orale og intragastriske ruter16.
I denne protokollen beskriver vi i detalj CCl4-indusert ALI hos rotter via et orogastrisk rør. Denne metoden induserer robust og reproduserbar ALI som kan brukes til å undersøke patogenesen til ALI. Bestemmelse av leversykdom alvorlighetsgrad overvåkes ved måling av serum glutamat-pyruvate transaminase (GPT), glutamic oxaloacetic transaminase (GOT) enzymer og total bilirubin (TB) samt definitiv histologisk diagnose av hematoksyslin og eosin (H & E) farget levervev. Eksponering for CCl4 gjennom en intragastrisk tilgang gir en praktisk, billig, minimal invasiv metode med minimal fare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsøkene ble utført i henhold til anbefalingene fra Helsingfors- og Tokyo-erklæringene og retningslinjene for bruk av eksperimentelle dyr i Det europeiske fellesskap. Eksperimentene ble godkjent av Animal Care Committee of Ben-Gurion University of the Negev.
MERK: CCl4-modellen er generert og brukt i en tidligere studie17. Protokolltidslinjen er demonstrert i tabell 1.
1. Klargjøre rotter for eksperimentell prosedyre
MERK: Velg voksne sprague Dawley rotter som veier 300-350 g.
- Få godkjenning for eksperimenter fra Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
- Vedlikehold rotter ved romtemperatur (22 °C ± 1 °C), med 12 timer lys og 12 timer mørke sykluser. Gi rotte chow og vann ad libitum.
- Utfør alle eksperimenter mellom 06:00 og 12:00
- Barber rotten og desinfiser huden med alkohol.
2. Bestemmelse av serum GOT, GPT og TB baseline nivåer
- Anestesi
- Forbered et kontinuerlig isofluranadministrasjonssystem for å indusere anestesi. Pass på at fordampersystemet er fylt med isofluran.
- Bedøve rotten med 2% isofluran. Kontroller at rotten er fullstendig bedøvet ved å observere bevegelse og pedalrefleks som svar på ytre stimuli.
MERK: Bruk 1–5 % isofluran for anestesiinduksjon og vedlikehold.
- Kanyle halevenen med et 22 G kateter.
- Samle en 0,5 ml blodprøve ved baseline. Sørg for at blodvolumet som hentes ikke overskrider IACUC-retningslinjene.
- Utfør blodbiokjemisk analyse, inkludert målinger av serum GOT, GPT og TB, som tidligere beskrevet18.
MERK: Undersøkelser av leverenzymer og TB-nivå ble utført i det biokjemiske laboratoriet til Soroka Medical Center. Blodprøver ble analysert ved hjelp av en fluorescensmetode på en kjemianalysator (Table of Materials).
3. Induksjon av akutt leverskade hos rotter
FORSIKTIG: Eksponering for høye konsentrasjoner av CCl4, inkludert absorpsjon gjennom damp eller hud, kan ha negative effekter på sentralnervesystemet og forårsake degenerasjon av lever og nyrer. Langvarig eksponering kan forårsake koma eller død.
- Forbered en 50% løsning av CCl4 (Table of Materials) ved å blande Cl4 med olivenolje som et kjøretøy i et 1:1-forhold.
MERK: Løsningen bør fremstilles i henhold til IACUC-retningslinjer for ikke-farmasøytiske grader. - Indukter levertoksisitet in vivo ved administrering av CCl4 via et orogastrisk rør.
- Sett inn et 16 G orogastrisk rør (3 tommer dypt) gjennom rottehulen.
- Utsett rotten for forskjellige doser av CCl4 ved å injisere en sprøyte med en av følgende fortynnede oppløsninger i rottens mage: 1 ml/kg (mild ALI), 2,5 ml/kg (moderat ALI) eller 5 ml/kg (alvorlig ALI) av 50 % oppløsning. For den sham-opererte kontrollgruppen må du kun utsette rotten for 5 ml/kg olivenolje.
4. Bestemmelse av serum-GOT-, GPT- og TB-nivåer etter 24 timer
- Anestesi
- Forbered et kontinuerlig isofluranadministrasjonssystem for å indusere anestesi. Pass på at fordampersystemet er fylt med isofluran.
- Bedøve rotter med 2% isofluran. Kontroller at rotten er fullstendig bedøvet ved å observere bevegelse og pedalrefleks som svar på ytre stimuli.
- Samle blodprøver ved 24 timer fra CCl4 eksponering.
- Utfør blodbiokjemisk analyse, inkludert målinger av serum GOT, GPT og TB.
5. Leversamling for histologisk undersøkelse
- Euthanize rotten ved å erstatte den inspirerte gassblandingen med 20% O2/80% CO2. Sørg for at CO2 leveres til en forhåndsbestemt hastighet i henhold til IACUC-retningslinjene.
- Sikre døden ved å se etter mangel på hjerteslag og bekreft ved en sekundær metode i samsvar med IACUC retningslinjer.
- Plasser rotten på et dissekerebrett med sin dorsaloverflate vendt ned og magen vendt opp. Barber magen på rotten.
- Med en skalpell, øk hele lengden av ventrum huden fra anus til haken. Skill huden. Øk bukveggen med en skalpell fra anus til xyphoid brusk, utsette abdominal viscera.
- Ved hjelp av saks og tang, isolere leveren ved å dissekere den fra sine leddbånd og vedlegg. Starter på leveren hilum, forsiktig utføre en hepatectomy ved å frigjøre alle leveren fliker fra vedlegg. Dissekere og kutte bort alle leddbånd og blodårer.
- Overfør leveren til en petriskål. Fest leveren i en 4% bufret formaldehydløsning (Table of Materials) i minst 24 timer.
6. Histologisk undersøkelse
- Prøve forberedelse
- Etter fiksering, kutt prøven i 5 μm tykk skiveserie ved mikrotomsnitting.
- Plasser skivene forsiktig på glasssklier med en myk børste, 1 skive per lysbilde.
- Utfør H&E-farging som tidligere beskrevet19.
- Undersøk skivene under et mikroskop ved 200x forstørrelse ved hjelp av et objektivt objektivobjektiv på 20 mm (Materialtabellen).
MERK: Leverseksjonene skal graderes av en spesialisert patolog blindet til behandlingsprotokollen. En score på 0 indikerer ingen leverabnormiteter, 1-2 indikerer mild leverskade, 3-4 indikerer moderat leverskade, og 5-6 indikerer alvorlig leverskade20,21,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TB-, GOT- og GPT-nivåene økte betydelig 24 timer etter indusert ALI (mer ved høyere CCl4-doser) sammenlignet med sham-opererte kontroller (p < 0,001) ( Figur1). Nivåene av TB, GOT og GPT ved baseline var normale og var ikke signifikant annerledes enn sham-opererte kontroller. Ved 24 timer, alle tre intervensjonsgruppene, 1 ml/kg CCl4 (1, 1−2), 2,5 ml/kg CCl4 (3, 3–4) og 5 ml/kg CCl4 (4, 4–5,75), hadde en signifikant høyere histologisk graderingsscore enn den sham-opererte kontrollgruppen (0, 0–0) (p < 0,05, data presentert som median, 25–75 % rekkevidde). H&E-bildene av en sham-operert kontroll (Figur 2A) og grupper eksponert for forskjellige CCl4 doser (Figur 2B−D) viser histopatologiske endringer 24 timer etter ct4 eksponering. Forstyrrelse av hepatocellulær arkitektur av CCl4 ble demonstrert av en høy grad av vevsskade med stor fibrøst septadeformasjon, forlengelse av fibre, kollagenakkumulering og pseudolobeseparasjon i leverseksjoner (figur 2).
Figur 1: Serum TB (A), GOT (B) og GPT (C) nivåer i blodprøver 24 timer etter eksponering for ulike CCl4 doser sammenlignet med sham-opererte kontroller. Blå linje: kontroll; rød bar: 24 timer etter CCl4 eksponering. Betydningen av sammenligninger mellom CCl4-eksponertrotter og ueksponerte rotter bestemmes ved hjelp av Mann-Whitney-testen. En p-verdi på <0,05 ble ansett som signifikant. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Histopatologiske forandringer i levervev farget med H&E etter 24 h CCl4 forgiftning i ulike doser. (A) sham-operert kontroll, (B) 1 ml/kg CCl4, (C) 2,5 ml/kg CCl4og (D) 5 ml/kg CCl4. Skalabar = 50 μm. Fordelingen av de histologiske resultatene ble spådd ved lineær regresjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Grupper | 0 timer | 24 timer |
| Sham (15 rotter) | GOT, GPT, TB baseline nivå | GOT, GPT, TB-nivå |
| Mild ALI (15 rotter) | ||
| Moderat ALI (15 rotter) | CCl4 eksponering for ALI grupper og olivenolje for sham gruppe | Histologisk undersøkelse |
| Alvorlig ALI (18 rotter) |
Tabell 1: Demonstrasjon av protokolltidslinjen. De ulike gruppene av rotter til forskjellige tider inkluderer en sham-operert kontrollgruppe, mild ALI (eksponering for 1 ml/kg CCl4),moderat ALI (eksponering for 2,5 ml/kg CCl4)og alvorlig ALI (eksponering for 5 ml/kg ccl4). På tiden 24 timer ble serum GOT, GPT- og TB-nivåer målt, og histologisk undersøkelse ble utført for alle fire gruppene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen brukes CCl4 som levertoksin for å indusere ALI hos rotter. ALI er preget av tap av leverparenchyma og påfølgende dysregulering av leverens metabolske og syntetiske funksjoner. Legemidler, virus, toksiner, autoimmune sykdommer, metabolske sykdommer og vaskulære lidelser induserer alle hepatocytdød, og den påfølgende inflammatoriske responsen bidrar til patogenese av ALI.
Den første fornærmelse naven fører til cytokinproduksjon, chemokinfrigjøring og påfølgende infiltrasjon av inflammatoriske celler i leveren. Tre av de vanlige biomarkørene for ALI-evaluering er GPT-, GOT- og TB-nivåer. GPT og GOT er enzymer målt etter aktivitetsnivå, mens TB-nivå måler leverfunksjon etter serumkonsentrasjon. Når forhøyet, serum enzym aktivitetsnivåer betegner skade på hepatocytter eller cholangiocytes23. Rask spektrotometrisk metode ble først rapportert i arbeidet til Arthur Karmen i 195524, noe som tillot den utbredte kliniske anvendelsen av serumenzymmåling. Siden da har GOT- og GPT-målinger også blitt brukt for å oppdage hepatocyttskade. GPT brukes oftere, og samtidig GPT-testing avslører vanligvis overflødige resultater. Økningen i aktivitetsnivået til GOT og GPT mellom frigjøringsratene og klaringsratene fra skadde celler kan brukes til å måle omtrent skadehastigheten på cellene. Når de skadede levercellene forårsaker at leveren svikter i sine normale aktiviteter, for eksempel behandling og fjerning av bilirubin som galle, indikerer dette at ALI er mer alvorlig.
Det er flere trinn i protokollen som er kritisk og fortjener nøye vurdering. De fleste protokoller krever serum biomarkørtesting før og etter eksponering for det undersøkende middel, da økninger i serumenzymkonsentrasjonsnivåer er vanlige. Men på grunn av svingninger i tidspunktet for forhøyet ALAT, bør flere tester utføres med jevne mellomrom for å oppdage eventuelle høyder. I denne protokollen valgte vi å teste GOT-, GPT- og TB-nivåer ved baseline og 24 timer etter eksponering for toksinet. Ifølge nyere studier korrelerte nivåene av disse biomarkører godt med alvorlighetsgraden av ALI i dette tidsintervallet17. Som vist i figur 1,nivåer av blod GOT, GPT, og TB ble forhøyet i alle prøver 24 timer etter indusere ALI. Dette indikerer at modellen har kvantifisert resultater i et svært kort tidsintervall siden eksponering for CCl4. Man bør ta hensyn til at i alvorlig ALI leveren mister sin evne til å syntetisere GOT og GPT. Derfor, i disse tilfellene kan disse enzymene mangle sin prediktive verdi som vist i litteraturen.
Histologiske funn av rotter utsatt for CCl4 er preget av ballonger av celler, centrilobulær nekrose og tilstedeværelsen av rådsmann organer25. I denne modellen var det utbredt skade vist seg å være proporsjonal med dosen av CCl4 administrert.
Denne metoden for å indusere ALI via orogastrisk CCl4 eksponering har mange fordeler. Det er enkelt, billig, og med minimal farerisiko. Protokollen gir betydelige resultater i et svært kort tidsintervall. Modellen er svært reproduserbar og kan ofte brukes til å bestemme effekten av potensielle hepatoprotective strategier og vurdere markører for leverskade.
Det er viktig å merke seg at CCl4 hovedsakelig påvirker den sentrale sonen i leveren, som ikke samsvarer med den massive nekrose vanligvis sett i menneskelig leversvikt. Videre er CCl4 ikke helt metabolisert i leveren, og noen av de ikke-metaboliserte CCl4 kan skade andre organer, inkludert lunger og nyrer16. I tillegg, på grunn av ulike nivåer av cytokrom P450 utvikling og effekt, er det en stor variasjon i følsomhet avhengig av arter og alder26. Til tross for disse begrensningene fungerer metoden for orogastrisk CCl4-indusert ALI fortsatt som en verdifull gnagermodell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner takknemlig Bertha Delgado, Institutt for patologi, Soroka Medical Center, Fakultet for helsevitenskap, Ben-Gurion University of the Negev, for hennes hjelp i laboratoriet så vel som i histologianalysen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G catheter BD Neoflon TM | Becton Dickinson Infusion Therapy AB | ||
| 4% buffered formaldehyde solution | Sigma - Aldrich lab materials technologies | ||
| BD Microtainer SST TM Tubes | Becton Dickinson and Company | ||
| Carbone tetrachloride | Sigma - Aldrich lab materials technologies | CAS 56-23-5 | |
| Isofluran, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | ||
| Olympus AU2700 Chemistry-Immuno Analyzer | Olympus (MN, USA) | Analysis of blood samples was done by the fluorescence method | |
| Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
| RAT Feeding Needles | ORCHID SCIENTIFICS | ||
| SYRINGE SET 1 and 2 ml MEDI -PLUS | Shandong Zibo Shanchuan Medical Instruments Co., Ltd |
References
- Hoofnagle, J. H., Carithers, R. L., Shapiro, C., Ascher, N. Fulminant hepatic failure: Summary of a workshop. Hepatology. 21 (1), 240-252 (1995).
- Rakela, J., Lange, S. M., Ludwig, J., Baldus, W. P. Fulminant hepatitis: Mayo clinic experience with 34 cases. Mayo Clinic Proceedings. 60 (5), 289-292 (1985).
- Riordan, S. M., Williams, R. Treatment of hepatic encephalopathy. New England Journal of Medicine. 337, 473-479 (1997).
- Bernuau, J., Rueff, B., Benhamou, J. Fulminant and subfulminant liver failure: Definitions and causes. Seminars in Liver Disease. 6 (2), 97-106 (1986).
- Lidofsky, S. D. Liver transplantation for fulminant hepatic failure. Gastroenterology Clinics of North America. 22 (2), 257-269 (1993).
- Auzinger, G., Wendon, J. Intensive care management of acute liver failure. Current opinion in critical care. 14 (2), 179-188 (2008).
- Wu, Q., et al. Protection of regenerating liver after partial hepatectomy from carbon tetrachloride hepatotoxicity in rats: Roles of mitochondrial uncoupling protein 2 and ATP stores. Digestive Diseases and Sciences. 54 (9), 1918-1925 (2009).
- Tuñón, M. J., Alvarez, M., Culebras, J. M., González-Gallego, J. An overview of animal models for investigating the pathogenesis and therapeutic strategies in acute hepatic failure. World Journal of Gastroenterologyl. 15 (25), 3086-3098 (2009).
- van de Kerkhove, M. P., Hoekstra, R., van Gulik, T. M., Chamuleau, R. A. Large animal models of fulminant hepatic failure in artificial and bioartificial liver support research. Biomaterials. 25 (9), 1613-1625 (2004).
- Butterworth, R. F., et al. Experimental models of hepatic encephalopathy: ISHEN guidelines. Liver International. 29 (6), 783-788 (2009).
- Zhang, B., Gong, D., Mei, M. Protection of regenerating liver after partial hepatectomy from carbon tetrachloride hepatotoxicity in rats: Role of hepatic stimulator substance. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 14 (10), 1010-1017 (1999).
- Ugazio, G., Danni, O., Milillo, P., Burdino, E., Congiu, A. M. Mechanism of protection against carbon tetrachloride toxicity. I. prevention of lethal effects by partial surgical hepatectomy. Drug and Chemical Toxicology. 5 (2), 115-124 (1982).
- Taniguchi, M., Takeuchi, T., Nakatsuka, R., Watanabe, T., Sato, K. Molecular process in acute liver injury and regeneration induced by carbon tetrachloride. Life Science. 75 (13), 1539-1549 (2004).
- Gordis, E. Lipid metabolites of carbon tetrachloride. Journal of Clinical Investigation. 48 (1), 203-209 (1969).
- Albrecht, J. Cerebral RNA synthesis in experimental hepatogenic encephalopathy. Journal of Neuroscience Research. 6 (4), 553-558 (1981).
- Terblanche, J., Hickman, R. Animal models of fulminant hepatic failure. Digestive Diseases and Sciences. 36 (6), 770-774 (1991).
- Gruenbaum, B. F., et al. Cell-free DNA as a potential marker to predict carbon tetrachloride-induced acute liver injury in rats. Hepatology International. 7 (2), 721-727 (2013).
- Juricek, J., et al. Analytical evaluation of the clinical chemistry analyzer Olympus AU2700 plus. Biochemia Medica. 20 (3), 334-340 (2010).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Wang, T., et al. Protective effects of dehydrocavidine on carbon tetrachloride-induced acute hepatotoxicity in rats. Journal of Ethnopharmacology. 117 (2), 300-308 (2008).
- Ye, X., et al. Hepatoprotective effects of coptidis rhizoma aqueous extract on carbon tetrachloride-induced acute liver hepatotoxicity in rats. Journal of Ethnopharmacology. 124 (1), 130-136 (2009).
- Wills, P. J., Asha, V. V. Protective effect of lygodium flexuosum (L.) sw. extract against carbon tetrachloride-induced acute liver injury in rats. Journal of Ethnopharmacology. 108 (3), 320-326 (2006).
- Senior, J. R. Monitoring for hepatotoxicity: What is the predictive value of liver "function" tests. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 85 (3), 331-334 (2009).
- Karmen, A. A note on the spectrometric assay of glutamic-oxalacetic transaminase in human blood serum. Journal of Clinical Investigation. 34 (1), 131-133 (1955).
- Hubner, G. Ultrastructural liver damage caused by direct action of carbon tetrachloride in vivo and in vitro. Virchows Archiv fur Pathologische Anatomie und Physiologie und fur Klinische Medizin. 339 (3), 187-197 (1965).
- Newsome, P. N., Plevris, J. N., Nelson, L. J., Hayes, P. C. Animal models of fulminant hepatic failure: A critical evaluation. Liver Transplantation. 6 (1), 21-31 (2000).
