Inducerende akut leverskade hos rotter via tetrachlormethan (CCl₄₎Eksponering gennem et orogastrisk rør

Summary

Denne protokol beskriver en fælles og gennemførlig metode til at fremkalde akut leverskade (ALI) via CCl₄ eksponering gennem et orogastrisk rør. Cl₄ eksponering inducerer ALI gennem dannelsen af reaktive ilt arter under sin biotransformation i leveren. Denne metode bruges til at analysere patofysiologi af ALI og undersøge forskellige hepatoprotective strategier.

Abstract

Akut leverskade (ALI) spiller en afgørende rolle i udviklingen af leversvigt, som er karakteriseret ved svær leverdysfunktion, herunder komplikationer såsom leverencephalopati og nedsat proteinsyntese. Passende dyremodeller er afgørende for at teste ALI's mekanisme og patofysiologi og undersøge forskellige hepatobeskyttende strategier. På grund af sin evne til at udføre kemiske transformationer, tetrachlormethan (CCl₄₎er meget udbredt i leveren til at fremkalde ALI gennem dannelsen af reaktive ilt arter. CCl₄ eksponering kan udføres intraperitoneally, ved indånding, eller gennem en nasogastrisk eller orogastrisk rør. Her beskriver vi en gnaver model, hvor ALI er induceret af CCl₄ eksponering gennem en orogastrisk rør. Denne metode er billig, let udføres, og har minimal farerisiko. Modellen er meget reproducerbar og kan i vid udstrækning anvendes til at bestemme effekten af potentielle hepatoprotective strategier og vurdere markører for leverskade.

Introduction

Hyppigheden af giftige fornærmelser mod leveren, især på grund af alkohol og stofmisbrug, er stigende. Akut leverskade (ALI) er forbundet med høj dødelighed og har forårsaget kliniske problemer^1,2. Giftig skade fører til død signalering veje i leveren, resulterer i hepatocyt apoptose, nekrose, eller pyrofofonis. ALI spiller en afgørende rolle i udviklingen af leversvigt, som er karakteriseret ved svær leverdysfunktion, herunder komplikationer såsom leverencephalopati og nedsat proteinsyntese^3,4. Selv om nyere forskning har øget vores viden om de fysiologiske og patologiske ændringer, der ledsager leversvigt, har den ikke helt forklaret de patomolekylære træk, der påvirker mekanismerne i celledød. Desuden, ingen medicin er i øjeblikket til rådighed til at vende den progressive forringelse i ALI patienter. I øjeblikket er den eneste signifikant effektive behandling levertransplantation^5,,6.

For at undersøge ALI's mekanisme og patofysiologi og for at teste forskellige hepatobeskyttende strategier anvendes forskellige dyremodeller til at fremkalde ALI. En foretrukken dyremodel af ALI bør efterligne sygdommens patologiske proces via en pålidelig, valideret, billig og let anvendelig metode. Eksempler på eksperimentelle modeller omfatter hepatotoksiske midler, kirurgiske procedurer såsom hel eller delvis hepatektomi, fuldstændig eller forbigående devaskularisering, og infektiøse procedurer^7,8,9. Kendte hepatotoksiske stoffer omfatter galactosamin, acetaminophen, thioacetamid, azoxythan og CCl₄. Af disse er CCl₄ meget udbredt, selv om det endnu ikke har været godt karakteriseret^10,11,12,13.

CCl₄ er en organisk farveløs væskeforbindelse med en sød lugt og næsten ingen brændbarhed ved lavere temperaturer. Udsættelse for høje koncentrationer af CCl₄ kan forårsage skader på centralnervesystemet, herunder forringelse af lever og nyrer. CCl₄ inducerer ALI gennem sin biotransformation i leveren, som danner reaktive iltarter. Dette sker via P450 cytokromenzymet 2E1, der danner en aktiv metabolit og resulterer i celleskader ved makromolekylebinding, forbedring af lipidperoxidation og forstyrrelse af intracellulær calciumhomøostase¹⁴. Desuden kan CCl_4-modellen bruges til at stimulere astrocytterne på niveau med RNA-syntese¹⁵. Dette hepatotoksin er blevet administreret af den intraperitoneale, intraportal, oral, og intragastriske ruter¹⁶.

I denne protokol, Vi beskriver₄i detaljer CCl 4-induceret ALI hos rotter via en orogastrisk rør. Denne metode inducerer robust og reproducerbar ALI, der kan bruges til at undersøge patogenesen af ALI. Bestemmelse af alvorligheden af leversygdommen overvåges ved måling af serumglutamat-pyruvattransaminase (GPT), glutamic oxaloacetic transaminase (GOT) enzymer og total bilirubin (TB) samt endelig histologisk diagnose ved hæmatoxylin og eosin (H&E) farvede levervæv. Eksponering for CCl₄ gennem en intragastrisk adgang giver mulighed for en praktisk, billig, minimalt invasiv metode med minimal risiko for fare.

Protocol

Forsøgene blev udført i overensstemmelse med anbefalingerne i Helsingfors- og Tokyo-erklæringerne og retningslinjerne for anvendelse af forsøgsdyr i Det Europæiske Fællesskab. Forsøgene blev godkendt af Animal Care Committee af Ben-Gurion University of the Negev.

BEMÆRK: CCl_4-modellen er blevet genereret og anvendt i et tidligere studie¹⁷. Protokoltidslinjen er vist i tabel 1.

1. Forberedelse af rotter til forsøgsproceduren

BEMÆRK: Vælg voksne hanner Sprague Dawley-rotter, der vejer 300−350 g.

1. Få godkendelse til forsøg fra Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
2. Hold rotter ved stuetemperatur (22 °C ± 1 °C) med 12 timers lys og 12 timers mørke cyklusser. Giv rotte chow og vand ad libitum.
3. Udfør alle eksperimenter mellem kl.
4. Barber rotte og desinficere huden med alkohol.

2. Bestemmelse af baselineniveauer for serum GOT, GPT og TB

1. Anæstesi
   1. Forbered et kontinuerligt system til administration af isofluran for at fremkalde anæstesi. Sørg for, at fordampersystemet er fyldt med isofluran.
   2. Bedøve rotten med 2% isofluran. Bekræft, at rotten er fuldt bestøvet ved at observere bevægelsen og pedalrefleksen som reaktion på eksterne stimuli.
      BEMÆRK: Brug 1-5% isofluran til anæstesiinduktion og vedligeholdelse.
2. Kannure halen vene med en 22 G kateter.
3. En 0,5 ml blodprøve indsamles ved baseline. Sørg for, at den hentede blodmængde ikke overstiger Retningslinjerne for IACUC.
4. Udfør biokemiske blodanalyser, herunder målinger af serum GOT, GPT og TB, som tidligere beskrevet¹⁸.
   BEMÆRK: Undersøgelser af leverenzymer og TB-niveau blev udført i det biokemiske laboratorium i Soroka Medical Center. Blodprøver blev analyseret ved hjælp af en fluorescens metode på en kemi analysator (Table of Materials).

3. Induktion af akut leverskade hos rotter

FORSIGTIG: Udsættelse for høje koncentrationer af CCl₄, herunder absorption gennem damp eller hud, kan have negative virkninger på centralnervesystemet og forårsage degeneration af lever og nyrer. Langvarig eksponering kan forårsage koma eller død.

1. Der fremstilles en 50% opløsning af CCl₄ (Materialetabel) ved at blande CCl₄ med olivenolie som køretøj i et 1:1 forhold.
   BEMÆRK: Opløsningen skal fremstilles i overensstemmelse med IACUC's retningslinjer for forbindelser af ikke-farmaceutisk kvalitet.
2. Inducer hepatotoksicitet in vivo ved ccl₄ administration via et orogastrisk rør.
   1. Sæt en 16 G orogastrisk rør (3 inches dyb) gennem mundhulen af rotten.
   2. Anudsætte rotten for forskellige doser CCl₄ ved at injicere en sprøjte med et af følgende fortyndede opløsninger i rottens mave: 1 ml/kg (mild ALI), 2,5 ml/kg (moderat ALI) eller 5 ml/kg (svær ALI) af 50% opløsningen. For den sham-opererede kontrolgruppe eksponeres rotten kun for 5 ml/kg olivenolie.

4. Bestemmelse af serum GOT, GPT, og TB niveauer efter 24 h

1. Anæstesi
   1. Forbered et kontinuerligt system til administration af isofluran for at fremkalde anæstesi. Sørg for, at fordampersystemet er fyldt med isofluran.
   2. Bedøve rotterne med 2% isofluran. Bekræft, at rotten er fuldt bestøvet ved at observere bevægelsen og pedalrefleksen som reaktion på eksterne stimuli.
2. Indsamle blodprøver på 24 h fra CCl₄ eksponering.
3. Udføre blodbiokemisk analyse, herunder målinger af serum GOT, GPT og TB.

5. Leverindsamling til histologisk undersøgelse

1. Afliv rotten ved at erstatte den inspirerede gasblanding med 20% O₂/80% CO₂. Sørg for, at CO₂ leveres med en forudbestemt hastighed i overensstemmelse med IACUC's retningslinjer.
2. Sørg for døden ved at kontrollere for manglende hjerteslag og bekræfte ved en sekundær metode i overensstemmelse med IACUC retningslinjer.
3. Placer rotten på en dissekering bord med sin rygflade vender nedad og maven opad. Barber er maven af rotten.
4. Med en skalpel, incise den fulde længde af ventrum huden fra anus til hagen. Adskil huden. Incise bugvæggen med en skalpel fra anus til xyphoid brusk, udsætter abdominal indvolde.
5. Ved hjælp af saks og pincet, isolere leveren ved at dissekere det fra dens ledbånd og vedhæftede filer. Starter ved leveren hilum, omhyggeligt udføre en hepatektomi ved at frigive alle leveren lapper fra vedhæftede filer. Dissekere og skære alle ledbånd og blodkar.
6. Overfør leveren til en petriskål. Fastgør leveren i en 4% buffered formaldehyd opløsning (Tabel af materialer) i mindst 24 timer.

6. Histologisk undersøgelse

1. Forberedelse af prøver
   1. Efter fikseringen skæres prøven i en tykkelseserie på 5 μm ved mikrotomeskæring.
   2. Placer forsigtigt skiverne på glasglidere med en blød børste, 1 skive pr. dias.
   3. Udfør H&E-farvning som tidligere beskrevet¹⁹.
2. Undersøg skiverne under et mikroskop ved 200x forstørrelse ved hjælp af en 20 mm objektiv (Materialetabel).
   BEMÆRK: Leversektionerne skal klassificeres af en specialiseret patolog, der er blindet til behandlingsprotokollen. En score på 0 indikerer ingen leverabnormiteter, 1-2 indikerer mild leverskade, 3-4 indikerer moderat leverskade, og 5-6 indikerer alvorlig leverskade^20,21,22.

Representative Results

TB-, GOT- og GPT-niveauerne steg betydeligt 24 timer efter at have fået ALI (mere ved højere CCl₄ doser) sammenlignet med fingerede kontroller (p < 0,001) (Figur 1). Niveauet af TB, GOT og GPT ved baseline var normale og var ikke signifikant anderledes end falske kontroller. Ved 24 timer alle tre interventionelle grupper, 1 ml/kg CCl₄ (1, 1−2), 2,5 ml/kg CCl₄ (3, 3-4) og 5 ml/kg CCl₄ (4, 4−5,75), havde en signifikant højere histologisk klassificeringsscore end den fingerede kontrolgruppe (0, 0-0) (p < 0,05, data præsenteret som median, 25-75% interval). H&E-billederne af en fingeret kontrol (figur 2A) og grupper, der eksponeres for forskellige CCl_4-doser (figur 2B-D), viser histopatologiske ændringer 24 timer efter eksponering af CCl_4. Afbrydelse af hepatocellulære arkitektur ved CCl₄ blev påvist ved en høj kvalitet af vævsskade med store fibrøse septa deformation, udvidelse af fibre, kollagen ophobning, og pseudo lap adskillelse i leveren sektioner (Figur 2).

Figur 1: Serum TB (A), GOT (B) og GPT (C) niveauer i blodprøver 24 timer efter udsættelse for forskellige CCl₄ doser sammenlignet med fingeret-opererede kontrol. Blå bjælke: kontrol; rød bjælke: 24 timer efter CCl₄ eksponering. Betydningen af sammenligninger mellem₄CCl 4-eksponerede rotter og ueksponerede rotter bestemmes ved hjælp af Mann-Whitney-testen. En p-værdi på <0,05 blev anset for at være signifikant. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Histopatologiske ændringer i levervæv farves med H & E efter 24 h CCl₄ forgiftning i forskellige doser. aA) sham-opererede kontrol , B) 1 ml/kg CCl₄,c) 2,5 ml/kg CCl₄og (D) 5 ml/kg CCl₄. Skalabar = 50 μm. Fordelingen af de histologiske resultater blev forudsagt af lineær regression. Klik her for at se en større version af dette tal.

Grupper	0 timer	24 timer
Sham (15 rotter)	GOT, GPT, TB baseline niveau	GOT, GPT, TB-niveau
Mild ALI (15 rotter)
Moderat ALI (15 rotter)	CCl4 eksponering for ALI grupper og olivenolie for fingeret gruppe	Histologisk undersøgelse
Svær ALI (18 rotter)

Tabel 1: Demonstration af protokoltidslinjen. De forskellige grupper af rotter på forskellige tidspunkter omfatter en fingeret betjent kontrolgruppe, mild ALI (eksponering for 1 ml/kg CCl_4),moderat ALI (eksponering for 2,5 ml/kg CCl₄) og svær ALI (eksponering for 5 ml/kg CCl₄). På det tidspunkt 24 h blev serum GOT, GPT og TB niveauer målt, og histologisk undersøgelse blev udført for alle fire grupper.

Discussion

I denne protokol, CCl₄ bruges som en lever toksin til at fremkalde ALI i rotter. ALI er karakteriseret ved tab af hepatisk parenkym og efterfølgende dysregulering af leverens metaboliske og syntetiske funktioner. Narkotika, vira, toksiner, autoimmune sygdomme, metaboliske sygdomme, og vaskulære lidelser alle fremkalde hepatocyt død, og den efterfølgende inflammatoriske reaktion bidrager til patogenesen af ALI.

Den første fornærmelse mod leveren fører til cytokin produktion, chemokine frigivelse, og efterfølgende infiltration af inflammatoriske celler i leveren. Tre af de almindeligt testede biomarkører for ALI evaluering er GPT, GOT og TB niveauer. GPT og GOT er enzymer målt på aktivitetsniveau, mens TB-niveauet måler leverfunktionen ved serumkoncentration. Når forhøjede, serum enzym aktivitetsniveauer betegner skade på hepatocytter eller cholangiocytter²³. Hurtig spektrofotometrisk metode blev først rapporteret i arbejdet i Arthur Karmen i 1955²⁴, som gjorde det muligt for den udbredte kliniske anvendelse af serum enzym måling. Siden da, GOT og GPT målinger er også blevet anvendt til at opdage hepatocyt skade. GPT bruges oftere, og samtidig GPT test normalt afslører overflødige resultater. Stigningen i aktivitetsniveauet for GOT og GPT mellem frigivelsesraterne og clearanceraterne fra skadede celler kan bruges til at måle ca. antallet af skader på cellerne. Når de sårede leverceller forårsage leveren til at mislykkes i sin normale aktiviteter, såsom behandling og fjerne bilirubin som galde, Dette indikerer, at ALI er mere alvorlig.

Der er flere trin i protokollen, der er kritiske og fortjener nøje overvejelse. De fleste protokoller kræver serumbiomarkørtest før og efter eksponering for efterforskningsmidlet, da stigninger i serumenzymkoncentrationsniveauerne er almindelige. Men på grund af udsving i timingen af forhøjet ALT, flere tests bør udføres med jævne mellemrum for at opdage enhver højde. I denne protokol valgte vi at teste GOT, GPT og TB niveauer ved baseline og 24 h efter eksponering for toksinet. Ifølge de seneste undersøgelser, niveauerne af disse biomarkører korreleret godt med sværhedsgraden af ALI i løbet af denne tidsinterval¹⁷. Som vist i figur 1, niveauer af blod GOT, GPT, og TB blev forhøjet i alle prøver 24 h efter inducerende ALI. Dette indikerer , at modellen har kvantificeret resultaterne inden for et meget kort tidsinterval siden eksponeringen for CCl₄. Man bør tage hensyn til, at i svær ALI leveren mister sin evne til at syntetisere GOT og GPT. Derfor kan disse enzymer i disse tilfælde mangle deres prædiktive værdi som påvist i litteraturen.

Histologiske fund af rotter udsat for CCl₄ er karakteriseret ved ballooning af celler, centrilobular nekrose og tilstedeværelsen af rådmand organer²⁵. I denne model var der udbredt skade, der viste sig at være proportional med dosis af CCl₄ administreret.

Denne metode til at fremkalde ALI via orogastrisk CCl₄ eksponering har mange fordele. Det er simpelt, billigt, og med minimal farerisiko. Protokollen giver betydelige resultater i en meget kort tidsinterval. Modellen er meget reproducerbar og kan være almindeligt anvendt til at bestemme effekten af potentielle hepatoprotective strategier og vurdere markører for leverskade.

Det er vigtigt at bemærke, at CCl₄ primært påvirker den centrale zone af leveren, som ikke matcher den massive nekrose typisk ses i human leversvigt. Desuden, CCl₄ er ikke helt metaboliseres i leveren, og nogle af de ikke-metaboliserede CCl₄ kan skade andre organer, herunder lunger og nyrer¹⁶. Hertil kommer, på grund af forskellige niveauer af cytokrom P450 udvikling og effekt, der er en stor variation i følsomhed afhængigt af arter og alder²⁶. På trods af disse begrænsninger, metoden til₄orogastrisk CCl 4-induceret ALI stadig fungerer som en værdifuld gnaver model.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G catheter BD Neoflon TM	Becton Dickinson Infusion Therapy AB
4% buffered formaldehyde solution	Sigma - Aldrich lab materials technologies
BD Microtainer SST TM Tubes	Becton Dickinson and Company
Carbone tetrachloride	Sigma - Aldrich lab materials technologies	CAS 56-23-5
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc
Olympus AU2700 Chemistry-Immuno Analyzer	Olympus (MN, USA)		Analysis of blood samples was done by the fluorescence method
Olympus BX 40 microscope	Olympus
RAT Feeding Needles	ORCHID SCIENTIFICS
SYRINGE SET 1 and 2 ml MEDI -PLUS	Shandong Zibo Shanchuan Medical Instruments Co., Ltd