Summary
Dit protocol beschrijft een gemeenschappelijke en haalbare methode voor het induceren van acute leverschade (ALI) via CCl4 blootstelling via een orogastrische buis. CCl4 blootstelling induceert ALI door de vorming van reactieve zuurstofsoorten tijdens de biotransformatie in de lever. Deze methode wordt gebruikt om de pathofysiologie van ALI te analyseren en verschillende hepatoprotectieve strategieën te onderzoeken.
Abstract
Acute leverschade (ALI) speelt een cruciale rol in de ontwikkeling van leverfalen, dat wordt gekenmerkt door ernstige leverdisfunctie, waaronder complicaties zoals hepatische encefalopathie en verminderde eiwitsynthese. Geschikte diermodellen zijn van vitaal belang om het mechanisme en de pathofysiologie van ALI te testen en verschillende hepatoprotectiestrategieën te onderzoeken. Vanwege zijn vermogen om chemische transformaties uit te voeren, wordt koolstoftetrachloride (CCl4)op grote schaal gebruikt in de lever om ALI te induceren door de vorming van reactieve zuurstofsoorten. CCl4 blootstelling kan intraperitoneally worden uitgevoerd, door inademing, of via een nasogastrische of orogastrische buis. Hier beschrijven we een knaagdiermodel, waarbij ALI wordt geïnduceerd door CCl4-blootstelling via een orogastrische buis. Deze methode is goedkoop, gemakkelijk te uitgevoerd, en heeft een minimaal risico risico. Het model is zeer reproduceerbaar en kan op grote schaal worden gebruikt om de werkzaamheid van potentiële hepatoprotectieve strategieën te bepalen en markers van leverletsel te beoordelen.
Introduction
De frequentie van giftige beledigingen aan de lever, vooral als gevolg van alcohol- en drugsmisbruik, neemt toe. Acuut leverletsel (ALI) wordt geassocieerd met hoge sterftecijfers en heeft klinische problemen veroorzaakt1,2. Giftig letsel leidt tot dodelijke seinen trajecten in de lever, wat resulteert in hepatocyte apoptose, necrose, of pyroptose. ALI speelt een cruciale rol in de ontwikkeling van leverfalen, dat wordt gekenmerkt door ernstige leverdisfunctie, waaronder complicaties zoals hepatische encefalopathie en verminderde eiwitsynthese3,4. Hoewel recent onderzoek onze kennis over de fysiologische en pathologische veranderingen bij leverfalen heeft vergroot, heeft het de pathomoleculaire kenmerken die de mechanismen van celdood beïnvloeden niet volledig verklaard. Bovendien zijn er momenteel geen medicijnen beschikbaar om de progressieve verslechtering van ALI-patiënten om te keren. Momenteel is de enige aanzienlijk effectieve behandeling levertransplantatie5,6.
Om het mechanisme en de pathofysiologie van ALI te onderzoeken en verschillende hepatoprotectiestrategieën te testen, worden verschillende diermodellen gebruikt om ALI te induceren. Een voorkeursdiermodel van ALI moet het pathologische proces van de ziekte nabootsen via een betrouwbare, gevalideerde, goedkope en gemakkelijk toe te passen methode. Voorbeelden van experimentele modellen zijn hepatotoxische middelen, chirurgische ingrepen zoals totale of gedeeltelijke hepatectomie, volledige of voorbijgaande devascularisatie, en infectieve procedures7,8,9. Bekende hepatotoxische stoffen zijn galactosamine, paracetamol, thioacetamide, azoxymethaan en CCl4. Van deze, CCl4 wordt veel gebruikt, hoewel het nog niet goed is gekenmerkt10,11,12,13.
CCl4 is een organische kleurloze vloeibare verbinding met een zoete geur en bijna geen ontvlambaarheid bij lagere temperaturen. Blootstelling aan hoge concentraties CCl4 kan schade aan het centrale zenuwstelsel veroorzaken, waaronder verslechtering van de lever en nieren. CCl4 induceert ALI door zijn biotransformatie in de lever, die reactieve zuurstofsoorten vormt. Dit gebeurt via het P450 cytochroomenzym 2E1, dat een actieve metaboliet vormt en resulteert in celschade door macromolecuulbinding, verbetering van lipideperoxidatie en verstoring van intracellulaire calciumhomeostase14. Daarnaast kan het CCl4 model worden gebruikt om de astrocyten te stimuleren op het niveau van RNA synthese15. Dit hepatotoxine is toegediend door de intraperitoneale, intraportal, orale en intragastrische routes16.
In dit protocol beschrijven we in detail CCl4-geïnduceerde ALI bij ratten via een orogastrische buis. Deze methode induceert robuuste en reproduceerbare ALI die kan worden gebruikt om de pathogenese van ALI te onderzoeken. De bepaling van de ernst van de leverziekte wordt gecontroleerd door meting van serumglutamaat-pyruvaattransaminase (GPT), glutamic oxaloacetische transaminase (GOT) enzymen en totale bilirubine (TB) evenals definitieve histologische diagnose door hematoxylinen en eosine (H&E) gekleurde leverweefsels. Blootstelling aan CCl4 via een intragastrische toegang zorgt voor een praktische, goedkope, minimaal invasieve methode met minimaal risicorisico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De experimenten werden uitgevoerd volgens de aanbevelingen van de verklaringen van Helsinki en Tokio en de richtsnoeren voor het gebruik van proefdieren van de Europese Gemeenschap. De experimenten werden goedgekeurd door het Comité dierverzorging van ben-Gurion Universiteit van negev.
OPMERKING: Het CCl4-model is gegenereerd en gebruikt in een eerdere studie17. De protocoltijdlijn wordt gedemonstreerd in tabel 1.
1. Ratten voorbereiden op de experimentele procedure
LET OP: Selecteer volwassen mannelijke Sprague Dawley ratten met een gewicht van 300−350 g.
- Goedkeuring verkrijgen voor experimenten van het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
- Houd ratten op kamertemperatuur (22 °C ± 1 °C), met 12 uur licht en 12 uur donkere cycli. Zorg voor rat chow en water ad libitum.
- Voer alle experimenten uit tussen 6:00 en 12:00 uur.
- Scheer de rat en desinfecteer de huid met alcohol.
2. Bepaling van serum GOT-, GPT- en TB-basislijnniveaus
- Anesthesie
- Bereid een continu isoflurane toedieningssysteem voor om anesthesie te veroorzaken. Zorg ervoor dat het vaporizersysteem gevuld is met isofluraan.
- Verdoof de rat met 2% isofluraan. Bevestig dat de rat volledig verdoofd is door de beweging en pedaalreflex te observeren in reactie op externe stimuli.
LET OP: Gebruik 1−5% isofluraan voor anesthesie-inductie en -onderhoud.
- Cannulate de staartader met een 22 G katheter.
- Verzamel een bloedmonster van 0,5 mL bij de uitgangswaarde. Zorg ervoor dat het opgehaalde bloedvolume de IACUC-richtlijnen niet overschrijdt.
- Voer bloedbiochemische analyse met inbegrip van de metingen van serum GOT, GPT en TB, zoals eerder beschreven18.
OPMERKING: Onderzoeken van leverenzymen en tbc-niveau werden uitgevoerd in het biochemische laboratorium van het Soroka Medical Center. Bloedmonsters werden geanalyseerd met behulp van een fluorescentiemethode op een chemie analyzer(Table of Materials).
3. Inductie van acuut leverletsel bij ratten
LET OP: Blootstelling aan hoge concentraties ccl4, met inbegrip van absorptie door damp of huid, kan negatieve effecten hebben op het centrale zenuwstelsel en degeneratie van de lever en nieren veroorzaken. Langdurige blootstelling kan coma of de dood veroorzaken.
- Bereid een 50% oplossing van CCl4 (Table of Materials) door ccl4 te mengen met olijfolie als voertuig in een 1:1 verhouding.
OPMERKING: De oplossing moet worden voorbereid volgens de IACUC-richtlijnen voor niet-farmaceutische verbindingen van hoge kwaliteit. - Induceer hepatotoxiciteit in vivo door CCl4 toediening via een orogastrische buis.
- Steek een 16 G orogastrische buis (3 centimeter diep) door de mondholte van de rat.
- Stel de rat bloot aan verschillende doses CCl4 door een spuit met een van de volgende verdunde oplossingen in de maag van de rat te injecteren: 1 mL/kg (milde ALI), 2,5 mL/kg (matige ALI), of 5 mL/kg (ernstige ALI) van de 50% oplossing. Voor de schijnbediende controlegroep stelt u de rat alleen bloot aan 5 mL/kg olijfolie.
4. Bepaling van serum GOT-, GPT- en TB-niveaus na 24 uur
- Anesthesie
- Bereid een continu isoflurane toedieningssysteem voor om anesthesie te veroorzaken. Zorg ervoor dat het vaporizersysteem gevuld is met isofluraan.
- Verdoof de ratten met 2% isofluraan. Bevestig dat de rat volledig verdoofd is door de beweging en pedaalreflex te observeren in reactie op externe stimuli.
- Verzamel bloedmonsters op 24 uur van CCl4 blootstelling.
- Voer bloedbiochemische analyse met inbegrip van metingen van serum GOT, GPT en TB.
5. Leververzameling voor histologisch onderzoek
- Euthanaseer de rat door het geïnspireerde gasmengsel te vervangen door 20% O2/80% CO2. Zorg ervoor dat CO2 wordt geleverd tegen een vooraf bepaald tarief in overeenstemming met de IACUC-richtlijnen.
- Zorg voor de dood door te controleren op gebrek aan hartslag en te bevestigen door een secundaire methode in overeenstemming met iacuc richtlijnen.
- Plaats de rat op een ontleden de raad met zijn dorsale oppervlak naar beneden en buik naar boven gericht. Scheer de buik van de rat.
- Met een scalpel, inciseer de volledige lengte van de ventrum huid van de anus naar de kin. Scheid de huid. Insmeer de buikwand met een scalpel van de anus naar het xyphoid kraakbeen, waardoor de buikingewanden worden blootgelegd.
- Met behulp van schaar en tangen, isoleren van de lever door ontleden van de ligamenten en bijlagen. Beginnend bij het leverhilum, voer zorgvuldig een hepatectomie uit door alle leverkwabben van bijlagen vrij te geven. Ontleden en wegsnijden alle ligamenten en bloedvaten.
- Breng de lever in een petrischaaltje. Fix de lever in een 4% gebufferde formaldehyde oplossing (Tabel van materialen) voor ten minste 24 uur.
6. Histologisch onderzoek
- Bereiding van het monster
- Na fixatie, snijd het monster in 5 μm dikke slice serie door microtome sectie.
- Leg de plakjes voorzichtig op glazen platen met een zachte borstel, 1 plakje per dia.
- Voer H&E-kleuring uit zoals eerder beschreven19.
- Bestudeer de plakjes onder een microscoop bij 200x vergroting met behulp van een 20 mm objectieve lens (Tabel van materialen).
OPMERKING: De leversecties moeten worden beoordeeld door een gespecialiseerde patholoog die blind is voor het behandelingsprotocol. Een score van 0 duidt op geen leverafwijkingen, 1-2 duidt op een lichte leverblessure, 3-4 duidt op een matige leverblessure en 5-6 duidt op ernstig leverletsel20,21,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De TB, GOT, en GPT niveaus aanzienlijk toegenomen 24 uur na het induceren van ALI (meer bij hogere CCl4 doses) in vergelijking met sham-operated controles (p < 0,001) (Figuur 1). De niveaus van tbc, got en GPT bij aanvang waren normaal en waren niet significant verschillend van schijnbediende controles. Om 24 uur hadden alle drie de interventiegroepen, 1 mL/kg CCl4 (1, 1−2), 2,5 mL/kg CCl4 (3, 3−4) en 5 mL/kg CCl4 (4, 4−5,75), een aanzienlijk hogere histologische score dan de schijnbediende controlegroep (0, 0−0) (p < 0,05, gepresenteerde gegevens als mediaan, 25 75% De H&E-beelden van een schijncontrole (figuur 2A) en groepen die zijn blootgesteld aan verschillende CCl4-doses (figuur 2B−D) vertonen histopathologische veranderingen 24 uur na blootstelling aan CL4. Verstoring van de hepatocellulaire architectuur door CCl4 werd aangetoond door een hoge kwaliteit van weefselletsel met grote vezelige septa vervorming, uitbreiding van vezels, collageen accumulatie, en pseudo kwab scheiding in leversecties (Figuur 2).
Figuur 1: Serum TB (A), GOT (B) en GPT (C) niveaus in bloedmonsters 24 uur na blootstelling aan verschillende CCl4 doses in vergelijking met schijnbediende controles. Blauwe balk: besturingselement; rode balk: 24 uur na blootstelling aan CL4. De betekenis van vergelijkingen tussen CCl4-blootgestelde ratten en onbelichte ratten worden bepaald met behulp van de Mann-Whitney test. Een p-waarde van <0,05 werd als significant beschouwd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Histopathologische veranderingen in leverweefsel gekleurd met H&E na 24 h CCl4 intoxicatie in verschillende doses. a)controle met schijnzijde, (B) 1 mL/kg CCl4,c) 2,5 mL/kg CCl4, end) 5 mL/kg CCl4. Schaalbalk = 50 μm. De verdeling van de histologische uitkomsten werd voorspeld door lineaire regressie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Groepen | 0 uur | 24 uur |
| Sham (15 ratten) | GOT, GPT, TB baseline niveau | GOT, GPT, TB niveau |
| Milde ALI (15 ratten) | ||
| Matige ALI (15 ratten) | CCl4 blootstelling voor ALI groepen en olijfolie voor sham groep | Histologisch onderzoek |
| Ernstige ALI (18 ratten) |
Tabel 1: Demonstratie van de protocoltijdlijn. De verschillende groepen ratten op verschillende tijdstippen omvatten een schijncontrolegroep, milde ALI (blootstelling aan 1 mL/kg CCl4),matige ALI (blootstelling aan 2,5 mL/kg CCl4)en ernstige ALI (blootstelling aan 5 mL/kg CCl4). Op het moment 24 uur werden serum GOT-, GPT- en TB-niveaus gemeten en werd voor alle vier de groepen histologisch onderzoek uitgevoerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol wordt CCl4 gebruikt als levertoxine om ALI bij ratten op te wekken. ALI wordt gekenmerkt door verlies van hepatische parenchyma en daaropvolgende dysregulatie van de metabolische en synthetische functies van de lever. Geneesmiddelen, virussen, toxines, auto-immuunziekten, metabole ziekten en vasculaire aandoeningen veroorzaken allemaal hepatocyte dood, en de daaropvolgende ontstekingsreactie draagt bij aan de pathogenese van ALI.
De eerste belediging van de lever leidt tot cytokine productie, chemokine release, en de daaropvolgende infiltratie van inflammatoire cellen in de lever. Drie van de vaak geteste biomarkers voor ALI-evaluatie zijn GPT-, GOT- en TB-niveaus. GPT en GOT zijn enzymen gemeten op activiteitsniveau, terwijl tb-niveau de leverfunctie meet door serumconcentratie. Wanneer verhoogde, serum enzym activiteit niveaus duiden letsel aan hepatocyten of cholangiocyten23. Snelle spectrofotometrische methode werd voor het eerst gemeld in het werk van Arthur Karmen in 195524, die toegestaan voor de wijdverbreide klinische toepassing van serum enzym meting. Sindsdien zijn got- en GPT-metingen ook toegepast om hepatocyteschade op te sporen. GPT wordt vaker gebruikt, en gelijktijdige GPT-tests onthullen meestal overbodige resultaten. De toename van de activiteitsniveaus van GOT en GPT tussen de afgiftepercentages en de klaringspercentages van gewonde cellen kan worden gebruikt om ongeveer de mate van letsel aan de cellen te meten. Wanneer de gewonde levercellen ervoor zorgen dat de lever niet in zijn normale activiteiten, zoals de verwerking en het verwijderen van bilirubine als gal, dit geeft aan dat de ALI is ernstiger.
Er zijn verschillende stappen in het protocol die kritisch zijn en een zorgvuldige afweging verdienen. De meeste protocollen vereisen serum biomarker testen voor en na blootstelling aan het onderzoeksmiddel, als verhogingen in serum enzym concentratieniveaus komen vaak voor. Echter, als gevolg van schommelingen in de timing van verhoogde ALT, moeten verschillende tests periodiek worden uitgevoerd om eventuele hoogte te detecteren. In dit protocol hebben we ervoor gekozen om GOT-, GPT- en TB-niveaus te testen bij de basislijn en 24 uur na blootstelling aan het toxine. Volgens recente studies correleerden de niveaus van deze biomarkers goed met de ernst van ALI tijdens dit tijdsinterval17. Zoals blijkt uit figuur 1, niveaus van bloed GOT, GPT, en TB werden verhoogd in alle monsters 24 uur na het induceren van ALI. Dit geeft aan dat het model resultaten heeft gekwantificeerd in een zeer kort tijdsinterval sinds blootstelling aan CCl4. Men moet er rekening mee houden dat in ernstige ALI de lever verliest zijn vermogen om got en GPT synthetiseren. Daarom kunnen deze enzymen in deze gevallen hun voorspellende waarde missen, zoals aangetoond in de literatuur.
Histologische bevindingen van ratten blootgesteld aan CCl4 worden gekenmerkt door ballonvaren van cellen, centrilobaire necrose en de aanwezigheid van raadslid organen25. In dit model was er wijdverspreide schade aangetoond evenredig te zijn met de dosis ccl4 toegediend.
Deze methode van het induceren van ALI via orogastrische CCl4 blootstelling heeft tal van voordelen. Het is eenvoudig, goedkoop, en met een minimum aan risico.It is simple, cheap, and with minimum hazard risk. Het protocol levert significante resultaten in een zeer kort tijdsinterval. Het model is zeer reproduceerbaar en kan vaak worden gebruikt om de werkzaamheid van potentiële hepatoprotectieve strategieën te bepalen en markers van leverletsel te beoordelen.
Het is belangrijk op te merken dat CCl4 vooral de centrale zone van de lever beïnvloedt, wat niet overeenkomt met de enorme necrose die meestal wordt gezien bij menselijk leverfalen. Bovendien is CCl4 niet volledig gemetaboliseerd in de lever, en sommige van de niet-metaboliseerde CCl4 kan andere organen beschadigen, waaronder longen en nieren16. Bovendien is er, als gevolg van verschillende niveaus van cytochroom P450-ontwikkeling en werkzaamheid, een grote variatie in gevoeligheid afhankelijk van de soort en de leeftijdvan 26jaar. Ondanks deze beperkingen, de methode van4orogastrische CCl 4-geïnduceerde ALI dient nog steeds als een waardevol knaagdier model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen dankbaar Bertha Delgado, afdeling Pathologie, Soroka Medical Center, Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, voor haar hulp in het laboratorium en in de histologieanalyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G catheter BD Neoflon TM | Becton Dickinson Infusion Therapy AB | ||
| 4% buffered formaldehyde solution | Sigma - Aldrich lab materials technologies | ||
| BD Microtainer SST TM Tubes | Becton Dickinson and Company | ||
| Carbone tetrachloride | Sigma - Aldrich lab materials technologies | CAS 56-23-5 | |
| Isofluran, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | ||
| Olympus AU2700 Chemistry-Immuno Analyzer | Olympus (MN, USA) | Analysis of blood samples was done by the fluorescence method | |
| Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
| RAT Feeding Needles | ORCHID SCIENTIFICS | ||
| SYRINGE SET 1 and 2 ml MEDI -PLUS | Shandong Zibo Shanchuan Medical Instruments Co., Ltd |
References
- Hoofnagle, J. H., Carithers, R. L., Shapiro, C., Ascher, N. Fulminant hepatic failure: Summary of a workshop. Hepatology. 21 (1), 240-252 (1995).
- Rakela, J., Lange, S. M., Ludwig, J., Baldus, W. P. Fulminant hepatitis: Mayo clinic experience with 34 cases. Mayo Clinic Proceedings. 60 (5), 289-292 (1985).
- Riordan, S. M., Williams, R. Treatment of hepatic encephalopathy. New England Journal of Medicine. 337, 473-479 (1997).
- Bernuau, J., Rueff, B., Benhamou, J. Fulminant and subfulminant liver failure: Definitions and causes. Seminars in Liver Disease. 6 (2), 97-106 (1986).
- Lidofsky, S. D. Liver transplantation for fulminant hepatic failure. Gastroenterology Clinics of North America. 22 (2), 257-269 (1993).
- Auzinger, G., Wendon, J. Intensive care management of acute liver failure. Current opinion in critical care. 14 (2), 179-188 (2008).
- Wu, Q., et al. Protection of regenerating liver after partial hepatectomy from carbon tetrachloride hepatotoxicity in rats: Roles of mitochondrial uncoupling protein 2 and ATP stores. Digestive Diseases and Sciences. 54 (9), 1918-1925 (2009).
- Tuñón, M. J., Alvarez, M., Culebras, J. M., González-Gallego, J. An overview of animal models for investigating the pathogenesis and therapeutic strategies in acute hepatic failure. World Journal of Gastroenterologyl. 15 (25), 3086-3098 (2009).
- van de Kerkhove, M. P., Hoekstra, R., van Gulik, T. M., Chamuleau, R. A. Large animal models of fulminant hepatic failure in artificial and bioartificial liver support research. Biomaterials. 25 (9), 1613-1625 (2004).
- Butterworth, R. F., et al. Experimental models of hepatic encephalopathy: ISHEN guidelines. Liver International. 29 (6), 783-788 (2009).
- Zhang, B., Gong, D., Mei, M. Protection of regenerating liver after partial hepatectomy from carbon tetrachloride hepatotoxicity in rats: Role of hepatic stimulator substance. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 14 (10), 1010-1017 (1999).
- Ugazio, G., Danni, O., Milillo, P., Burdino, E., Congiu, A. M. Mechanism of protection against carbon tetrachloride toxicity. I. prevention of lethal effects by partial surgical hepatectomy. Drug and Chemical Toxicology. 5 (2), 115-124 (1982).
- Taniguchi, M., Takeuchi, T., Nakatsuka, R., Watanabe, T., Sato, K. Molecular process in acute liver injury and regeneration induced by carbon tetrachloride. Life Science. 75 (13), 1539-1549 (2004).
- Gordis, E. Lipid metabolites of carbon tetrachloride. Journal of Clinical Investigation. 48 (1), 203-209 (1969).
- Albrecht, J. Cerebral RNA synthesis in experimental hepatogenic encephalopathy. Journal of Neuroscience Research. 6 (4), 553-558 (1981).
- Terblanche, J., Hickman, R. Animal models of fulminant hepatic failure. Digestive Diseases and Sciences. 36 (6), 770-774 (1991).
- Gruenbaum, B. F., et al. Cell-free DNA as a potential marker to predict carbon tetrachloride-induced acute liver injury in rats. Hepatology International. 7 (2), 721-727 (2013).
- Juricek, J., et al. Analytical evaluation of the clinical chemistry analyzer Olympus AU2700 plus. Biochemia Medica. 20 (3), 334-340 (2010).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Wang, T., et al. Protective effects of dehydrocavidine on carbon tetrachloride-induced acute hepatotoxicity in rats. Journal of Ethnopharmacology. 117 (2), 300-308 (2008).
- Ye, X., et al. Hepatoprotective effects of coptidis rhizoma aqueous extract on carbon tetrachloride-induced acute liver hepatotoxicity in rats. Journal of Ethnopharmacology. 124 (1), 130-136 (2009).
- Wills, P. J., Asha, V. V. Protective effect of lygodium flexuosum (L.) sw. extract against carbon tetrachloride-induced acute liver injury in rats. Journal of Ethnopharmacology. 108 (3), 320-326 (2006).
- Senior, J. R. Monitoring for hepatotoxicity: What is the predictive value of liver "function" tests. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 85 (3), 331-334 (2009).
- Karmen, A. A note on the spectrometric assay of glutamic-oxalacetic transaminase in human blood serum. Journal of Clinical Investigation. 34 (1), 131-133 (1955).
- Hubner, G. Ultrastructural liver damage caused by direct action of carbon tetrachloride in vivo and in vitro. Virchows Archiv fur Pathologische Anatomie und Physiologie und fur Klinische Medizin. 339 (3), 187-197 (1965).
- Newsome, P. N., Plevris, J. N., Nelson, L. J., Hayes, P. C. Animal models of fulminant hepatic failure: A critical evaluation. Liver Transplantation. 6 (1), 21-31 (2000).
