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Medicine

Induire des lésions hépatiques aigues chez les rats via le tétrachlorure de carbone (CCl4) Exposition par un tube orogastricrique

doi: 10.3791/60695 Published: April 28, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Ce protocole décrit une méthode commune et faisable d’induire des lésions hépatiques aigues (ALI) par l’intermédiaire de l’exposition CC4 par un tube orogastricrique. L’exposition CC4 induit l’ALI par la formation d’espèces réactives d’oxygène pendant sa biotransformation dans le foie. Cette méthode est utilisée pour analyser la pathophysiologie d’ALI et examiner différentes stratégies hépatoprotectives.

Abstract

Les lésions hépatiques aigues (ALI) jouent un rôle crucial dans le développement de l’échec hépatique, qui se caractérise par un grave dysfonctionnement hépatique comprenant des complications telles que l’encéphalopathie hépatique et une synthèse altérée des protéines. Les modèles animaux appropriés sont essentiels pour tester le mécanisme et la pathophysiologie de l’ALI et étudier différentes stratégies hépatoprotectrices. En raison de sa capacité à effectuer des transformations chimiques, le tétrachlorure de carbone (CCl4) est largement utilisé dans le foie pour induire ALI par la formation d’espèces réactives d’oxygène. L’exposition CC4 peut être effectuée par inhalation, ou par un tube nasogastrique ou orogastricrique. Ici, nous décrivons un modèle de rongeur, dans lequel ALI est induit par l’exposition CCl4 par un tube orogastricrique. Cette méthode est peu coûteuse, facile à exécuter, et a un risque minimal. Le modèle est hautement reproductible et peut être largement utilisé pour déterminer l’efficacité des stratégies hépatoprotective potentielles et évaluer les marqueurs des lésions hépatiques.

Introduction

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La fréquence des insultes toxiques au foie, en particulier en raison de l’abus d’alcool et de drogues, augmente. Les lésions hépatiques aigues (ALI) sont associées à des taux de mortalité élevés et ont causé des préoccupations cliniques1,2. Les dommages toxiques mènent aux voies de signalisation de mort dans le foie, ayant comme conséquence l’apoptosis d’hépatocyte, la nécrose, ou la pyroptose. ALI joue un rôle crucial dans le développement de l’échec hépatique, qui se caractérise par un dysfonctionnement hépatique grave, y compris des complications telles que l’encéphalopathie hépatique et la synthèse des protéines altérées3,4. Bien que la recherche récente ait augmenté nos connaissances sur les changements physiologiques et pathologiques accompagnant l’échec hépatique, elle n’a pas expliqué complètement les dispositifs pathomoléculaires qui affectent les mécanismes de la mort cellulaire. En outre, aucun médicament n’est actuellement disponible pour inverser la détérioration progressive des patients d’ALI. Actuellement, le seul traitement significativement efficace est la transplantation hépatique5,6.

Afin d’étudier le mécanisme et la pathophysiologie de l’ALI et de tester différentes stratégies hépatoprotective, différents modèles animaux sont utilisés pour induire ALI. Un modèle animal préférable d’ALI devrait imiter le processus pathologique de la maladie par l’intermédiaire d’une méthode fiable, validée, peu coûteuse et facile à appliquer. Des exemples de modèles expérimentaux incluent des agents hépatoxiques, des procédures chirurgicales telles que l’hépatectomie totale ou partielle, la dévascularisation complète ou transitoire, et les procédures infectieuses7,8,9. Les substances hépatoxiques connues incluent la galactosamine, l’acétaminophène, le thioacetamide, l’azoxymethane et le CC4. Parmi ceux-ci, CCl4 est largement utilisé, bien qu’il n’ait pas encore été bien caractérisé10,11,12,13.

CC4 est un composé liquide organique incolore avec une odeur sucrée et presque pas d’inflammabilité à des températures plus basses. L’exposition à des concentrations élevées de CC4 peut endommager le système nerveux central, y compris la détérioration du foie et des reins. CCl4 induit ALI par sa biotransformation dans le foie, qui forme des espèces réactives d’oxygène. Ceci se produit par l’enzyme cytochrome de P450 2E1, formant un métabolite actif et ayant pour résultat des dommages de cellules par la liaison de macromolécule, l’amélioration de la peroxydation de lipide et la perturbation de l’homéostasie intracellulaire de calcium14. En outre, le modèle CC4 peut être utilisé pour stimuler les astrocytes au niveau de la synthèse de l’ARN15. Cette hépatotoxine a été administrée par les voies intraperitonéales, intraportaires, orales et intragastriques16.

Dans ce protocole, nous décrivons en détail CCl4-induitALI chez les rats via un tube orogastric. Cette méthode induit l’ALI robuste et reproductible qui peut être utilisé pour étudier la pathogénie d’ALI. La détermination de la sévérité de maladie de foie est surveillée par mesure du transaminase glutamate-pyruvate de sérum (GPT), des enzymes transaminase oxaloacétiques glutamiques (GOT) et de la bilirubin (TB) totale ainsi que par le diagnostic histologique définitif par des foies de tissu souillé d’hématoxyline et d’éosine (H et E). L’exposition au CCl4 par un accès intragastrique permet une méthode pratique, peu coûteuse et peu invasive avec un risque minimal.

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Protocol

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Les expériences ont été menées conformément aux recommandations des Déclarations d’Helsinki et de Tokyo et aux Lignes directrices pour l’utilisation des animaux expérimentaux de la Communauté européenne. Les expériences ont été approuvées par le Comité de soins aux animaux de l’Université Ben-Gourion du Néguev.

REMARQUE : Le modèle CC4 a été généré et utilisé dans une étude précédente17. Le calendrier du protocole est démontré dans le tableau 1.

1. Préparation des rats à la procédure expérimentale

REMARQUE : Sélectionnez des rats Sprague Dawley mâles adultes pesant de 300 à 350 g.

  1. Obtenir l’approbation des expériences du Comité des soins et de l’utilisation des animaux institutionnels (IACUC).
  2. Maintenir les rats à température ambiante (22 oC à 1 oC), avec des cycles légers et 12 h légers et 12 h. Fournir du chow de rat et de l’eau ad libitum.
  3. Effectuer toutes les expériences entre 6 h et 12 h.
  4. Raser le rat et désinfecter la peau avec de l’alcool.

2. Détermination des niveaux de référence du Sérum GOT, du TPG et de la tuberculose

  1. Anesthésie
    1. Préparer un système continu d’administration d’isoflurane pour induire l’anesthésie. Assurez-vous que le système de vaporisateur est rempli d’isoflurane.
    2. Anesthésiez le rat avec 2% d’isoflurane. Confirmez que le rat est entièrement anesthésié en observant le réflexe de mouvement et de pédale en réponse à des stimuli externes.
      REMARQUE : Utilisez 1 à 5 % d’isoflurane pour l’induction et l’entretien de l’anesthésie.
  2. Cannulate la veine de queue avec un cathéter de 22 G.
  3. Recueillir un échantillon de sang de 0,5 ml à la ligne de base. Assurez-vous que le volume sanguin récupéré ne dépasse pas les lignes directrices de l’IACUC.
  4. Effectuer l’analyse biochimique du sang, y compris les mesures du sérum GOT, GPT et TB, comme précédemment décrit18.
    REMARQUE : Des examens des enzymes hépatiques et du niveau de tuberculose ont été effectués dans le laboratoire biochimique du centre médical de Soroka. Des échantillons de sang ont été analysés à l’aide d’une méthode de fluorescence sur un analyseur de chimie(Tableau des matériaux).

3. Induction d’une lésion hépatique aigue chez les rats

CAUTION: L’exposition à des concentrations élevées de CC4, y compris l’absorption par la vapeur ou la peau, peut avoir des effets négatifs sur le système nerveux central et provoquer la dégénérescence du foie et des reins. Une exposition prolongée peut causer le coma ou la mort.

  1. Préparer une solution de 50% de CC4 (Tableau des matériaux) en mélangeant CCl4 avec de l’huile d’olive comme véhicule dans un rapport de 1:1.
    REMARQUE : La solution doit être préparée conformément aux lignes directrices de l’IACUC pour les composés non pharmaceutiques.
  2. Induire l’hépatotoxicité in vivo par l’administration CC4 par l’intermédiaire d’un tube orogastric.
    1. Insérez un tube orogastricrique de 16 G (3 pouces de profondeur) à travers la cavité buccale du rat.
    2. Exposez le rat à différentes doses de CC4 en injectant une seringue avec l’une des solutions diluées suivantes dans l’estomac du rat : 1 ml/kg (ALI doux), 2,5 mL/kg (ALI modéré), ou 5 ml/kg (ALI sévère) de la solution de 50 %. Pour le groupe témoin à faux- actionnel, exposez le rat à l’huile d’olive de 5 ml/kg seulement.

4. Détermination des niveaux de GOT, GPT et TB après 24 h

  1. Anesthésie
    1. Préparer un système continu d’administration d’isoflurane pour induire l’anesthésie. Assurez-vous que le système de vaporisateur est rempli d’isoflurane.
    2. Anesthésiez les rats avec 2% d’isoflurane. Confirmez que le rat est entièrement anesthésié en observant le réflexe de mouvement et de pédale en réponse à des stimuli externes.
  2. Recueillir des échantillons de sang à 24 h de l’exposition CC4.
  3. Effectuez l’analyse biochimique du sang comprenant des mesures du sérum GOT, du TPG et de la tuberculose.

5. Collecte de foie pour l’examen histologique

  1. Euthanasiez le rat en remplaçant le mélange de gaz inspiré par 20% O2/80% DE CO2. Veiller à ce que le CO2 soit livré à un taux prédéterminé conformément aux lignes directrices de l’IACUC.
  2. Assurer la mort en vérifiant l’absence de battements de cœur et confirmer par une méthode secondaire conformément aux lignes directrices de l’IACUC.
  3. Placez le rat sur une planche de dissection avec sa surface dorsale face vers le bas et l’abdomen face vers le haut. Rasez l’abdomen du rat.
  4. Avec un scalpel, incisez toute la longueur de la peau ventrique de l’anus au menton. Séparez la peau. Incisez la paroi abdominale avec un scalpel de l’anus au cartilage xyphoïde, exposant les viscères abdominales.
  5. À l’aide de ciseaux et de forceps, isolez le foie en le disséquant de ses ligaments et de ses attachements. À partir du hilum du foie, effectuer soigneusement une hépatectomie en libérant tous les lobes de foie des pièces jointes. Disséquer et couper tous les ligaments et les vaisseaux sanguins.
  6. Transférer le foie dans un plat Petri. Fixer le foie dans une solution de formaldéhyde tampon de 4 %(tableau des matériaux) pendant au moins 24 h.

6. Examen histologique

  1. Préparation de l’échantillon
    1. Après fixation, couper l’échantillon en série de tranches de 5 m d’épaisseur par section de microtomes.
    2. Placer délicatement les tranches sur des toboggans en verre avec une brosse molle, 1 tranche par lame.
    3. Effectuer la coloration de H et E comme décrit précédemment19.
  2. Examinez les tranches au microscope au grossissement 200x à l’aide d’une lentille objective de 20 mm(Tableau des matériaux).
    REMARQUE : Les sections hépatiques doivent être notées par un pathologiste spécialisé aveuglé au protocole de traitement. Un score de 0 n’indique aucune anomalie hépatique, 1-2 indique des lésions hépatiques légères, 3-4 indique des lésions hépatiques modérées, et 5-6 indique des lésions hépatiques graves20,21,22.

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Representative Results

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Les niveaux de tuberculose, de GOT et de TPG ont considérablement augmenté de 24 h après avoir incité l’ALI (plus à des doses plus élevées de CC4) par rapport aux contrôles truqués (p’lt; 0,001)(figure 1). Les niveaux de tuberculose, de GOT et de TPG à la ligne de base étaient normaux et n’étaient pas significativement différents des contrôles truqués. À 24 h, les trois groupes d’intervention, 1 ml/kg CCl4 (1, 1 à 2), 2,5 ml/kg CC4 (3, 3 à 4), et 5 mL/kg CCl4 (4, 4 à 5,75), ont obtenu un score de classement histologique nettement plus élevé que le groupe témoin à faux (0, 0 à 0) (p et lt; 0,05, données présentées comme médianes, 25 à 75 %). Les images H et E d’un contrôle à faux -fonctionnement(figure 2A) et les groupes exposés à différentes doses de CC4 (figure 2B-D) montrent des changements histopathologiques 24 h après l’exposition CC4. La perturbation de l’architecture hépatocellulaire par CC4 a été démontrée par une teneur élevée de dommages de tissu avec la déformation fibreuse grande septa, extension des fibres, accumulation de collagène, et la séparation pseudo lobe dans des sections de foie (figure 2).

Figure 1
Figure 1 : Taux de tuberculose sérique (A), GOT (B) et GPT (C) dans les échantillons de sang 24 h après exposition à différentes doses de CC4 par rapport aux contrôles truqués. Barre bleue : contrôle; barre rouge: 24 h après l’exposition CC4. L’importance des comparaisons entre les rats exposés à CC4et les rats non exposés sont déterminées à l’aide du test Mann-Whitney. Une valeur p de lt;0.05 a été considérée comme importante. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Changements histopathologiques dans le tissu hépatique taché avec H et E après 24 h CCl4 intoxication dans diverses doses. (A) sham-operated control, (B) 1 mL/kg CCl4, (C) 2.5 mL/kg CCl4, et (D) 5 mL/kg CCl4. Barre d’échelle à 50 m. La distribution des résultats histologiques a été prédite par régression linéaire. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Groupes 0 heures 24 heures
Sham (15 rats) GOT, GPT, niveau de base de la tuberculose GOT, GPT, niveau de tuberculose
Mild ALI (15 rats)
Ali modéré (15 rats) Exposition CC4 pour les groupes ALI et l’huile d’olive pour groupe fictif Examen histologique
ALI sévère (18 rats)

Tableau 1 : Démonstration du calendrier du protocole. Les différents groupes de rats à différents moments comprennent un groupe témoin à faux-opéré, ALI doux (exposition à 1 mL/kg CCl4), ALI modérée (exposition à 2,5 mL/kg CCl4), et ALI sévère (exposition à 5 mL/kg CCl4). À l’époque 24 h, des niveaux de GOT, de GPT et de tuberculose ont été mesurés, et l’examen histologique a été exécuté pour chacun des quatre groupes.

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Discussion

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Dans ce protocole, CCl4 est utilisé comme une toxine hépatique pour induire ALI chez les rats. ALI est caractérisé par la perte de parenchyme hépatique et la dysrégulation subséquente des fonctions métaboliques et synthétiques du foie. Les médicaments, les virus, les toxines, les maladies auto-immunes, les maladies métaboliques et les troubles vasculaires induisent tous la mort hépatocyte, et la réponse inflammatoire suivante contribue à la pathogénie d’ALI.

L’insulte initiale au foie mène à la production de cytokine, à la libération de chimiokine, et à l’infiltration subséquente des cellules inflammatoires dans le foie. Trois des biomarqueurs couramment testés pour l’évaluation ALI sont les niveaux de GPT, GOT et TB. GPT et GOT sont des enzymes mesurées par niveau d’activité tandis que le niveau de tuberculose mesure la fonction hépatique par concentration de sérum. Lorsqu’ils sont élevés, les niveaux d’activité enzymatiques sériques dénotent des dommages aux hépatocytes ou cholangiocytes23. La méthode spectrophotométrique rapide a été rapportée pour la première fois dans les travaux d’Arthur Karmen en 195524, qui a permis l’application clinique répandue de la mesure d’enzyme de sérum. Depuis lors, des mesures GOT et GPT ont également été appliquées pour détecter les blessures aux hépatocytes. GPT est utilisé plus fréquemment, et les tests simultanés GPT révèle généralement des résultats redondants. L’augmentation des niveaux d’activité du GOT et du TPG entre les taux de libération et les taux de dégagement des cellules blessées peut être utilisée pour mesurer approximativement le taux de blessures dans les cellules. Lorsque les cellules hépatiques blessées causent le foie à l’échec dans ses activités normales, telles que le traitement et l’élimination de la bilirubine comme bile, cela indique que l’ALI est plus grave.

Il y a plusieurs étapes dans le protocole qui sont critiques et méritent un examen minutieux. La plupart des protocoles nécessitent des tests de biomarqueur sérique avant et après l’exposition à l’agent d’enquête, car les élévations dans les niveaux de concentration enzymatiques sériques sont fréquentes. Cependant, en raison des fluctuations dans le calendrier de l’ALT élevée, plusieurs tests devraient être effectués périodiquement pour détecter toute élévation. Dans ce protocole, nous avons choisi de tester les niveaux DEA, GPT et TB à la ligne de base et 24 h après l’exposition à la toxine. Selon des études récentes, les niveaux de ces biomarqueurs se sont bien corrélés avec la sévérité de l’ALI au cours de cet intervalle de temps17. Comme le montre la figure 1, les niveaux de SANG GOT, GPT, et TB ont été élevés dans tous les échantillons 24 h après avoir induisant ALI. Cela indique que le modèle a quantifié les résultats dans un intervalle de temps très court depuis l’exposition à CCl4. Il faut tenir compte du fait que dans l’ALI sévère, le foie perd sa capacité à synthétiser GOT et GPT. Par conséquent, dans ces cas, ces enzymes peuvent manquer de leur valeur prédictive comme démontré dans la littérature.

Les résultats histologiques des rats exposés au CC4 sont caractérisés par l’aérostication des cellules, la nécrose centrilobulaire et la présence des corps de conseiller25. Dans ce modèle, il y avait des dommages étendus qui se sont avérés proportionnels à la dose de CCl4 administrée.

Cette méthode d’induire ALI via orogastric CC4 exposition a de nombreux avantages. Il est simple, peu coûteux, et avec un risque minimum. Le protocole donne des résultats significatifs dans un intervalle de temps très court. Le modèle est hautement reproductible et peut être couramment utilisé pour déterminer l’efficacité des stratégies hépatoprotective potentielles et évaluer les marqueurs des lésions hépatiques.

Il est important de noter que le CC4 affecte principalement la zone centrale du foie, qui ne correspond pas à la nécrose massive généralement observée dans l’insuffisance hépatique humaine. En outre, CCl4 n’est pas complètement métabolisé dans le foie, et certains des CCl4 non métabolisés peuvent endommager d’autres organes, y compris les poumons et les reins16. En outre, en raison de différents niveaux de développement et d’efficacité de cytochrome P450, il y a une grande variation de sensibilité selon les espèces et l’âge26. Malgré ces limitations, la méthode de l’ALI orogastric CC4-induitsert toujours de modèle précieux de rongeur.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs remercient Bertha Delgado, Département de pathologie, Centre médical de Soroka, Faculté des sciences de la santé, Université Ben Gourion du Néguev, pour son aide en laboratoire ainsi que dans l’analyse histologique.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
22 G catheter BD Neoflon TM Becton Dickinson Infusion Therapy AB
4% buffered formaldehyde solution Sigma - Aldrich lab materials technologies
BD Microtainer SST TM Tubes Becton Dickinson and Company
Carbone tetrachloride Sigma - Aldrich lab materials technologies CAS 56-23-5
Isofluran, USP 100% Piramamal Critical Care, Inc
Olympus AU2700 Chemistry-Immuno Analyzer Olympus (MN, USA) Analysis of blood samples was done by the fluorescence method
Olympus BX 40 microscope Olympus
RAT Feeding Needles ORCHID SCIENTIFICS
SYRINGE SET 1 and 2 ml MEDI -PLUS Shandong Zibo Shanchuan Medical Instruments Co., Ltd

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Induire des lésions hépatiques aigues chez les rats via le tétrachlorure de carbone (CCl<sub>4</sub>) Exposition par un tube orogastricrique
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Frank, D., Savir, S., Gruenbaum, B. F., Melamed, I., Grinshpun, J., Kuts, R., Knyazer, B., Zlotnik, A., Vinokur, M., Boyko, M. Inducing Acute Liver Injury in Rats via Carbon Tetrachloride (CCl4) Exposure Through an Orogastric Tube. J. Vis. Exp. (158), e60695, doi:10.3791/60695 (2020).More

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