Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Analyse van niet-menselijke Primate pancreatic eilandje zuurstofverbruik

Published: December 18, 2019 doi: 10.3791/60696

Summary

Dit protocol demonstreert de nauwkeurige en reproduceerbare meting van het zuurstofverbruik in niet-humane primaat alvleesklier eilandjes. De laad technieken van het eilandje en de coating van de microplaat bieden een kader voor een efficiënte meting van de ademhaling in andere soorten gekweekte spheroids.

Abstract

De meting van het zuurstofverbruik in spheroid-clusters van cellen, zoals ex-vivo pancreas eilandjes, is van oudsher een uitdaging geweest. We demonstreren de meting van het zuurstofverbruik op het eilandje met behulp van een 96-well microplaat die is ontworpen voor het meten van het zuurstofverbruik in spheroids. In deze test worden spheroid-microplaten op de dag voorafgaand aan de test gecoat met een cel-en weefsellijm. We gebruiken een kleine hoeveelheid lijm oplossing om de hechting van het eilandje aan te moedigen tot alleen de bodem van de put. Op de dag van de assay worden 15 eilandjes direct in de basis van elke put geladen met behulp van een techniek die zorgt voor een optimale positionering van eilandjes en een nauwkeurige meting van het zuurstofverbruik. Verschillende aspecten van de mitochondriale ademhaling zijn geprobed farmacologisch in niet-menselijke primaten eilandjes, met inbegrip van ATP-afhankelijke ademhaling, maximale ademhaling, en Proton lek. Deze methode maakt consistente, reproduceerbare resultaten mogelijk met slechts een klein aantal eilandjes per put. Het kan theoretisch worden toegepast op elke gekweekte sferoïden van vergelijkbare grootte.

Introduction

Om de normale bloedglucosespiegels te handhaven, moet de cel alvleesklier β een verhoging in glucose voelen en insuline dienovereenkomstig afscheiden. De koppeling van insuline secretie met glucoseniveaus is direct gekoppeld aan glucose metabolisme en de productie van ATP via Mitochondriale oxidatieve fosforylering. Dus, mitochondriën spelen een cruciale rol in stimulus-secretie koppeling1. Beoordeling van β-cel mitochondriale functie kan defecten die leiden tot verminderde insuline secretie onthullen. De secretie van glucagon door pancreas α-cellen is ook nauw verbonden met de mitochondriale functie2. Hoewel vereeuwigd eilandje-cellijnen nuttig zijn gebleken voor sommige soorten assays, geeft de Fysiologie van deze cellen niet nauwkeurig de hele eiland functie weer, zoals geïllustreerd door de potentiëring van de insuline secretie door glucagon3,4 en de remming van de glucagonsecretie door insuline/Somatostatine5,6 in intacte eilandjes. Dit toont aan dat het zuurstofverbruik moet worden gemeten met behulp van hele, intacte eilandjes.

Technieken voor het meten van eilandje Cell respirometrie zijn geëvolueerd in de loop van de tijd, van het gebruik van zuurstof gevoelige fluorescerende kleurstoffen7 tot Solid-State sensoren die direct meten van het zuurstofverbruik8. In eerste instantie ontworpen voor monolayer, aanhandige cellen, veelgebruikte cel cultuur plaat systemen hebben bewezen ondoeltreffend te zijn voor pancreas eilandjes. Omdat eilandjes niet van nature aan de putjes hechten, zijn ze gevoelig voor geduwd naar de periferie van de cultuur, wat resulteert in onnauwkeurige meting van zuurstofverbruik9. Om dit probleem te bestrijden, gespecialiseerde 24-put platen met een centrale depressie die kon bevatten eilandjes werden ontwikkeld9. Het 24-goed plaat systeem werd echter beperkt door het grote aantal vereiste eilandjes (50-80 per put) en het aantal voorwaarden dat tegelijkertijd getest kon worden10. De recente ontwikkeling van 96-well microplaten speciaal ontworpen voor extracellulaire flux analyse in sferoïden heeft deze barrières overwonnen, waardoor de meting van het eilandje respirometrie met 20 of minder eilandjes per put10.

Hier demonstreren we het gebruik van dit systeem voor het meten van het zuurstofverbruik in eilandjes van de Japanse makaak (Macaca fuscata), een diermodel met vergelijkbare eilandje-biologie voor mensen11,12. In dit protocol worden 15 makaak-eilandjes per put geanalyseerd. In onze handen, 15 eilandjes per goed geproduceerd hogere Baseline zuurstofverbruik dan minder eilandjes, met robuuste activering en onderdrukking van de ademhaling in reactie op de farmacologisch manipulatie. We benadrukken de stappen om voor te bereiden op de Assay, een effectieve methode voor het consistent laden van eilandjes in het midden van elke put, en gemeenschappelijke uitdagingen bij het uitvoeren van deze test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bereiding van de microplaat en de sensor cartridge op de dag voorafgaand aan het uitvoeren van de test

Islets werden geïsoleerd van drie jaar oude Japanse makagen zoals eerder beschreven13. Deze methode is zeer vergelijkbaar met die gebruikt voor het isoleren van menselijke eilandjes van kadaver donoren, maar verschilt van muizen, waarin pancreata vaak worden opgeblazen met collagenase oplossing terwijl het dier onder sedatie en voorafgaand aan orgaanverwijdering. Het ophalen van een eilandje werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van het Oregon National Primate Research Center (ONPRC) en de Oregon Health and Science University en werden goedgekeurd door de ONPRC IACUC. De ONPRC houdt zich aan de dierenwelzijns wet en-regelgeving die wordt afgedwongen door het Amerikaanse ministerie van landbouw (USDA) en het beleid inzake de volksgezondheid inzake humane verzorging en het gebruik van proefdieren overeenkomstig de gids voor de verzorging en het gebruik van laboratoriumdieren die door de National Institutes of Health worden gepubliceerd.

  1. Bereiding van Spheroid-microplaat
    1. Bereid 3 mL van een 0,1 M natriumbicarbonaat oplossing. Filter steriliseren de oplossing. We gebruikten een 0,45 μm filter (tabel van materialen).
    2. Voeg in een celkweek-kap 200 μL cel-en weefsellijm (tabel met materialen) toe aan 2,8 ml van 0,1 m natriumbicarbonaat. Voeg vervolgens 20 μL van deze oplossing toe aan de onderzijde van elke put van de 96-well spheroid-microplaat (tabel met materialen). Zorg ervoor dat luchtbellen uit de pipetpunt worden verwijderd en dat alleen de onderkant van de plaat bedekt is. Coating van de microplaat voorkomt dat eilandjes de zijkanten van de putjes omhoog bewegen wanneer geneesmiddelen worden toegevoegd en in de put worden gemengd tijdens de test.
      Opmerking: het is alleen nodig om zoveel putjes te gebruiken als voor eilandjes wanneer de test wordt uitgevoerd. Als er slechts een paar putten zullen worden gebruikt, kan de cellijm oplossing op de juiste manier worden geschaald. De cellijm die in de test wordt gebruikt, is een samengestelde eiwit oplossing die uit de mariene mossel is geëxtraheerd. Als alternatief kunnen microplaat putten worden gecoat met 20 μL van 100 μg/mL poly-D-Lysine.
    3. Incueren van de plaat in een 37 ° c, niet-CO2 incubator gedurende één uur.
    4. In een steriele omgeving, aspiraat cel lijm oplossing van de plaat. Was elke put tweemaal met 400 μL 37 °C steriel water met behulp van een pipet met meerdere kanalen. Laat de lucht drogen.
    5. Bedek na 30-40 minuten de plaat en bewaar deze op 4 °C.
  2. Hydratatie van de sensor cartridge
    1. In een steriele omgeving, open het sensor cartridge pakket (tabel met materialen) en verwijder de inhoud. Plaats de sensor cartridge ondersteboven naast de gebruiks plaat.
    2. Vul elke put van het hulpstuk plaat met 200 μL steriel water en verlaag de sensor cartridge terug in de gebruiks plaat. Plaats geassembleerde sensor cartridge en hulp plaat in een 37 ° c, niet-CO2 incubator 's nachts.
  3. Bereiding van Kalibrerende
    1. Aliquot 25 mL kalibrant (tabel van de materialen) in een conische buis van 50 ml. Plaats de buis in een 37 °C, niet-CO2 -incubator 's nachts.

2. protocol voor het voorbereiden van de media, het laden van eilandjes en het laden van de sensor cartridge op de dag van de test

  1. Voorbereiding van media
    1. Tot 48,5 mL basismedia (minimale DMEM, Zie tabel met materialen), voeg 500 μL toe van 1 mm natrium pyruvaat en 2 mm glutamine. Voeg bovendien 496 μL van 200 mg/ml glucose (uiteindelijke concentratie van glucose in de media is 5,5 mM).
      Opmerking: Baseline glucoseconcentratie werd constant gehouden voor deze experimenten. Echter, glucose kan ook worden gebruikt om het stimuleren van de ademhaling naast de farmacologische manipulaties beschreven Blow10.
    2. Bevestig dat de pH 7,4 +/-0,1 is, indien nodig aanpassen.
  2. Voorbereiding van de sensor cartridge
    1. Neem sensor cartridge uit de incubator, verwijder het deksel van de sensor cartridge en stort water uit putten. Plaats 200 mL voorverwarmde kalibrant in elk goed en vervang het deksel van de sensor cartridge.
    2. Plaats de sensor cartridge ongeveer 1 uur terug in de incubator (totdat nodig).
  3. Bereiding van geneesmiddelen voor mitochondriale stress assay
    1. Open de stress testkit (tabel met materialen) en verwijder de inhoud. Make-up voorraad en werkoplossingen voor Oligomycine, carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy) fenylhydrazone (FCCP), en Rotenone/Antimycine A (AA) als volgt.
      1. Oligomycine: Voeg 630 μL geassembleerde media toe aan de buis om 100 μM voorraad te maken. Verdun vervolgens tot 45 μM met media om de poort concentratie te verkrijgen (uiteindelijke goed-concentratie na injectie is 4,5 μM)
      2. FCCP: Voeg 720 μL geassembleerde media toe aan de buis om 100 μM voorraad te maken. Verdun tot 10 μM met media om de haven concentratie te verkrijgen (uiteindelijke goed-concentratie is 1 μM)
        Opmerking: BSA en/of FBS mogen niet worden toegevoegd aan media, omdat dit de werking van mitochondriale uncouplers kan beïnvloeden14.
      3. Rotenone/AA: Voeg 540 μL geassembleerde media toe aan de buis om 50 μM voorraad te maken. Verdun tot 25 μM met media om de haven concentratie te verkrijgen (uiteindelijke goed-concentratie is 2,5 μM)
        Opmerking: de bovenstaande concentraties hebben consistente resultaten in onze handen opgeleverd. Extra FCCP leidde tot geen verdere toename van de ademhaling. Echter, drugs concentraties moeten afhankelijk van de grootte van het eilandje worden aangepast, en vooral met eilandjes van verschillende soorten of niet-eilandje-spheroïden. Ter referentie, de gemiddelde diameter van een niet-menselijk primaten eilandje is ongeveer 150 μm15.
  4. Bereiding van spheroid-plaat en overdracht van eilandjes
    1. Hand-pick alvleesklier eilandjes in een celkweek schaal van 60 mm x 15 mm met geassembleerde media te verkrijgen in de buurt van 100% zuiverheid.
      Opmerking: Islets moeten worden afgerond, met een duidelijk gedefinieerde omtrek, en lijken dichter dan exocriene weefsel contaminanten. Vermijd eilandjes die beschadigd of gerafeld lijken. In dit experiment werd de grootte van het eilandje niet direct gemeten, hoewel we probeerden om eilandjes van ongeveer dezelfde grootte voor elke put en sample te kiezen.
    2. Laad elke put van spheroid-microplaat met 175 μL geassembleerde media met behulp van een multikanaalspipet.
    3. Gebruik een P20-pipet ingesteld op 15 μL, aspiraat 15 eilandjes van celkweek schotel. Islets moeten zichtbaar zijn in de pipetpunt tot het blote oog.
    4. Om eilandjes over te brengen naar spheroid-microplaat, verlaagt u de pipetpunt naar de onderkant van de put, gaat u nauwelijks omhoog en Pipetteer u langzaam een zeer klein volume (~ 5 μL). Bevestig dat alle eilandjes de pipetpunt hebben verlaten. Elk goed moet 15 eilandjes ontvangen. Controleer af en toe de spheroid-microplaat onder de Microscoop om te controleren of de eilandjes zich aan de onderkant van elk goed bevinden in plaats van vast te zitten aan de zijkanten.
      Opmerking: Vermijd het laden van de hoek putten met eilandjes. Zuurstof en pH-flux uit het plastic kan optreden tijdens de bepaling, en dit wordt verergerd in de vierhoek putten.
    5. Zodra alle eilandjes zijn overgebracht naar de spheroid-microplaat, incueren de microplaat in een incubator van 37 °c, niet-co2 , terwijl u de onderstaande stappen uitvoert.
  5. Het laden van de sensor cartridge en het uitvoeren van de test
    1. Verwijder de sensor cartridge uit de incubator. Poorten A-C voor elke put moeten worden geladen met een van beide geneesmiddelen of media. Putten met eilandjes en de vierhoek putten moeten worden geladen met geneesmiddel. Niet-hoek putten zonder eilandjes moeten worden geladen met media. Poort D kan leeg worden gelaten. Laadpoort A (linksboven van elke sensor) met 20 μL oligomycine of media. Laadpoort B (rechtsboven) met 22 μL FCCP of media. Laadpoort C (linksonder) met 25 μL Rotenone/AA of media.
    2. Program meer een extracellulaire flux Analyzer test voor een ademhalings periode van 30 minuten Baseline (5 cycli van 3 minuten mix, 3 minuten maat), 42 minuten oligomycine meetperiode (7 cycli van 3 minuten mix, 3 minuten maat), 30 minuten FCCP (5 cycli van 3 minuten mix, 3 minuten maat), en 30 minuten Rotenone/AA (5 cycli van 3 minuten mix, 3 minuten maat).
    3. Voer de test uit en volg de instructies op het scherm voor het kalibreren van de sensor en het plaatsen van de microplaat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Om eilandjes in microplaat te laden, moeten 15 μL media worden aangezuigen, zoals weergegeven in Figuur 1A. Islets zullen zich binnen enkele seconden natuurlijk in de richting van de onderkant van de pipetpunt vestigen. Vervolgens wordt de pipetpunt naar de bodem van de put verlaagd. De punt is zeer licht opgeheven en een klein volume (ongeveer 5 μL) wordt samen met de eilandjes uitgelicht. Deze techniek resulteert in een consistente plaatsing van het eilandje aan de onderkant van de microplaat goed (Figuur 1B), waardoor nauwkeurige metingen van het zuurstofverbruik mogelijk zijn.

Figuur 2 toont representatieve resultaten door individuele put voor zuurstofverbruik gedurende de test. Dit specifieke experiment laat zien wat er kan gebeuren wanneer putten slecht worden geladen, met veel eilandjes vast te zitten aan de zijkanten van de put in plaats van aan de onderkant van de put. Dit kan worden veroorzaakt door te veel media te pipetteren in de put nadat de eilandjes al uit de tip zijn uitgepipetteren. De stroom van extra media duwt de eilandjes uit de bodem van de put. Wanneer dit gebeurt, zal het Baseline niveau van het zuurstofverbruik zeer laag zijn, en dit goed zal weinig tot geen reactie op FCCP vertonen. De vetgedrukt lijn in Figuur 2 toont dit fenomeen.

Figuur 3 toont een ander experiment waarin de meeste putjes een significante respiratie van de baseline en respons op drugs vertonen. Echter, twee putten (met vetgedrukt lijnen) toonde geen reactie op rotenone/AA. Dit suggereert dat de drug niet goed werd vrijgegeven in de put. In dit geval, zoals bij gevallen van geen basale zuurstofverbruik, kunnen deze putten worden uitgesloten van verdere analyse.

Figuur 4 toont de resultaten van een geslaagde test. Hier tonen we een voorbeeld van samenvattingsgegevens van een afzonderlijk experiment waarin putten goed werden geladen met eilandjes en correct geïnjecteerd met drugs. ATP-afhankelijke mitochondriale zuurstofverbruik werd effectief geremd door oligomycine, maximale ademhaling-ruim boven de basale niveaus-werd geïnduceerd door FCCP, en mitochondriale ademhaling was volledig stilgelegd-onder de oligomycine niveaus-door remming van de elektronentransport keten met rotenone/AA.

Figure 1
Figuur 1: pipetteertechniek voor het laden van eilandjes in microplaat. (A) ongeveer 15 eilandjes (rode pijl) met 15 μL media. B) eilandjes gecentreerd onderaan de spheroid-microplaat. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: goed-naar-goed variabiliteit als gevolg van het verschil in het laden van het eilandje. Putten onjuist geladen (vet blauwe lijn) vertonen weinig tot geen basale zuurstofverbruik en minimale respons op cel stresstest drugs. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: falen van de injectie met geneesmiddelen. Twee putjes (vet blauwe lijnen) werden niet geïnjecteerd met rotenone/AA en vertonen geen significante afname van het zuurstofverbruik. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: gemiddelde gegevens over alle putten in een experiment na uitsluiting van slecht geladen of ingespoten putten. Gemiddeld zuurstofverbruik gedurende de celstress test assay in een afzonderlijk experiment, inclusief 16 technische replicaten. Foutbalken tonen standaarddeviatie voor n = 16 Wells. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De studie van het zuurstofverbruik in het eiland is eerder belemmerd door de bolvormige vorm van eilandjes, hun gebrek aan naleving van cultuur oppervlakken en het aantal vereiste eilandjes per put. In dit protocol benadrukken we de werkzaamheid van de 96-well spheroid-microplaat voor het meten van het zuurstofverbruik op het eilandje op een klein aantal eilandjes en demonstreren we een techniek voor het hanteren en laden van eilandjes die technisch haalbaar is en consistente Resultaten.

Om te voorkomen dat eilandjes zich aan de onderkant van de microplaat kunnen houden en tijdens het mengen van de test ondoorstroomd worden, wordt de 96-well microplaat op de dag vóór de bepaling gecoat met een cellijm oplossing. Hoewel dit in het algemeen gunstig is, als eilandjes niet goed worden geladen, kunnen ze zich aan de zijkant van de put in plaats van de bodem vasthouden, waardoor nauwkeurige metingen worden aangetast of in de hand worden gehouden. Om dit te bestrijden, raden we coating putten met een zeer kleine hoeveelheid lijm oplossing-slechts 20 μL. Bovendien zorgt de pipetteertechniek die we aantonen ervoor dat de eilandjes naar de bodem van de put worden geladen en niet aan de zijkanten worden geduwd door de stroom van extra media .

De 96-well spheroid-microplaat heeft eerdere beperkingen van het meten van het zuurstofverbruik in het eilandje overwonnen, inclusief het hoge aantal vereiste eilandjes en het aantal voorwaarden dat tegelijkertijd kan worden getest. Een recente studie10 toonde immers het gebruik van dit systeem met een enkel menselijk eilandje per put. Het meten van het zuurstofverbruik met behulp van enkele eilandjes resulteerde echter in zeer lage basale metingen van het zuurstofverbruik, die significant boven de achtergrond waren in slechts de grootste eilandjes (diameter boven 290 μm). NHP eilandjes zijn meestal kleiner dan menselijke eilandjes, met een gemiddelde diameter van slechts 150 μm15. In onze handen vertoonden 15 NHP eilandjes per well een hogere baseline en een responsiever profiel tijdens de Cell stresstest dan minder eilandjes. We testten ook vijf en tien eilandjes per put, maar ontdekten dat het basale zuurstofverbruik en het signaal aan lawaai aanzienlijk werden verlaagd.

Naast de mogelijkheid om een laag aantal eilandjes per put te gebruiken, maakt de 96-well micro Plate het mogelijk om meerdere verschillende omstandigheden tegelijk te testen. Dit is gunstig in gevallen waarin eilandjes worden behandeld met verschillende verbindingen of genetisch gemanipuleerd. Echter, bij het vergelijken van groepen van menselijke of niet-menselijke primaat eilandjes die afkomstig zijn uit verschillende bronnen (bijvoorbeeld diabetische versus niet-diabetische eilandjes), monsters worden vaak ontvangen op verschillende dagen. In deze gevallen is het dus niet mogelijk om optimaal gebruik te maken van dit systeem.

Om verschillende aspecten van het mitochondriale zuurstofverbruik te kwantificeren, hebben we de verschillende aspecten van respiratie farmacologisch gemanipuleerd. Gebruikte geneesmiddelconcentraties waren gebaseerd op een pervieuze studie in menselijke eilandjes10. De dosis FCCP werd geoptimaliseerd voor het induceren van maximale mitochondriale ademhaling in onze handen. Specifiek, de concentratie van oligomycine was 4,5 μM, FCCP was 1 μM, en rotenone/AA was 2,5 μM. Deze concentraties moeten echter waarschijnlijk worden gekalibreerd voor verschillende toepassingen van dit protocol.

De geproduceerde gegevens kunnen ofwel direct worden geanalyseerd of genormaliseerd met behulp van een aantal methoden. In dit experiment werden gelijke aantallen eilandjes van vergelijkbare grootten gebruikt voor elk monster en werden de gegevens niet genormaliseerd door het celnummer of de grootte van het eilandje, wat moeilijk kan zijn om direct te kwantificeren. Een alternatieve methode van normalisatie is door het totale cellulaire eiwit, waarbij lyserende cellen worden betrokken nadat de test is uitgevoerd en de eiwit niveaus worden gekwantificeert. Gegevens kunnen ook worden genormaliseerd naar basale respiratie niveaus. Dit kan in bepaalde gevallen informatief zijn, zoals de kwantificering van de reservecapaciteit als percentage van de basale niveaus. Echter, met deze normalisatie methoden en anderen, informatie kan verloren gaan tijdens normalisatie zoals eerder beschreven16.

Het hier beschreven systeem biedt een uniek hulpmiddel om de Fysiologie van het eilandje beter te begrijpen. Sterker nog, het belang van zuurstofverbruik in de gezondheid van het eilandje wordt geïllustreerd door de constatering dat de zuurstof consumptie in het eilandje nauw verbonden is met de gezondheid van het eilandje en de kans op succesvolle eiland transplantatie17. Dit systeem biedt een uitstekend platform voor een consistente kwantificering van het zuurstofverbruik in het eilandje, dat in theorie ook kan worden toegepast op op gelijke grootte gekweekte spheroïden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs willen de Vanderbilt High throughput screening core voor het gebruik van hun faciliteiten, Agilent Biotechnologies, Dr. Paul Kievit (Oregon Health and Science University) voor niet-menselijke primaten-eilandje-isolaties en Eric Donahue (Vanderbilt University) voor hulp bij figuur 1, erkennen. J.M.E. werd gesteund door NIGMS van de National Institutes of Health onder het awardnummer T32GM007347. M.G. werd gesteund door de NIH/NIDDK (R24DK090964-06) en het departement Veterans Affairs (BX003744).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style Corning 430166
Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive Corning 354240
Conical tube, 50 mL Falcon 352070
Dextrose anhydrous Fisher Scientific BP350-1 For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered
Disposable reservoirs (sterile), 25 ML Vistalab 3054-1033 for loading multichannel pipet
EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm Foxx Life Sciences 371-3115-OEM
L-glutamine Gibco 25030-081 200 mM (100x)
Multichannel pipette tips ThermoFisher Scientific 94410810
Multichannel pipette, 15-1250 μL ThermoFisher Scientific 4672100BT Recommended
P20, P200, and P1000 pipettes Eppendorf 2231000602
pH Probe Hanna Instruments HI2210-01
Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL Olympus 24-404, 24-412, 24-430
Seahorse XF Base Media Agilent 103334-100
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit Agilent 103015-100 Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A
Seahorse XFe96 Analyzer Agilent S7800B Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator
Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini Agilent 102905-100 Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant
Sodium bicarbonate Fisher Scientific BP328-500
Sodium pyruvate Gibco 11360-070 100 mM (100x)
Stereo Microscope Olympus SZX9
Syringe (sterile), 5 mL BD 309603 For sterile filtration
Water (sterile) Sigma W3500-500mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mulder, H. Transcribing β-cell mitochondria in health and disease. Molecular Metabolism. 6 (9), 1040-1051 (2017).
  2. Maechler, P., Wollheim, C. B. Mitochondrial signals in glucose-stimulated insulin secretion in the beta cell. The Journal of Physiology. 529 (Pt 1), 49-56 (2000).
  3. Curry, D. L. Glucagon Potentiation of Insulin Secretion by the Perfused Rat Pancreas. Diabetes. 19 (6), 420 (1970).
  4. Song, G., Pacini, G., Ahrén, B., D'Argenio, D. Z. Glucagon Increases Insulin Levels by Stimulating Insulin Secretion Without Effect on Insulin Clearance in Mice. Peptides. 88, 74-79 (2017).
  5. Vergari, E., et al. Insulin inhibits glucagon release by SGLT2-induced stimulation of somatostatin secretion. Nature Communications. 10 (1), 139 (2019).
  6. Watts, M., Ha, J., Kimchi, O., Sherman, A. Paracrine regulation of glucagon secretion: the β/α/δ model. American Journal of Physiology--Endocrinology and Metabolism. 310 (8), E597-E611 (2016).
  7. Sweet, I. R., et al. Continuous measurement of oxygen consumption by pancreatic islets. Diabetes Technology & Therapeutics. 4 (5), 661-672 (2002).
  8. Agilent Seahorse XF Instruments Overview and Selection Guide. , Agilent Technologies. https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/seahorse-xf-instruments-selection-guide (2019).
  9. Wikstrom, J. D., et al. A novel high-throughput assay for islet respiration reveals uncoupling of rodent and human islets. PLoS One. 7 (5), e33023 (2012).
  10. Taddeo, E. P., et al. Individual islet respirometry reveals functional diversity within the islet population of mice and human donors. Molecular Metabolism. 16, 150-159 (2018).
  11. Conrad, E., et al. The MAFB transcription factor impacts islet alpha-cell function in rodents and represents a unique signature of primate islet beta-cells. American Journal of Physiology--Endocrinology and Metabolism. 310 (1), E91-E102 (2016).
  12. Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
  13. Elsakr, J. M., et al. Maternal Western-style diet affects offspring islet composition and function in a non-human primate model of maternal over-nutrition. Molecular Metabolism. , (2019).
  14. Soutar, M. P. M., et al. FBS/BSA media concentration determines CCCP's ability to depolarize mitochondria and activate PINK1-PRKN mitophagy. Autophagy. , 1-10 (2019).
  15. Hirshberg, B., et al. Pancreatic Islet Transplantation Using the Nonhuman Primate (Rhesus) Model Predicts That the Portal Vein Is Superior to the Celiac Artery as the Islet Infusion Site. Diabetes. 51 (7), 2135-2140 (2002).
  16. Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
  17. Papas, K. K., et al. Islet Oxygen Consumption Rate (OCR) Dose Predicts Insulin Independence in Clinical Islet Autotransplantation. PLoS One. 10 (8), e0134428 (2015).

Tags

Ontwikkelingsbiologie uitgave 154 eilandje zuurstofverbruik spheroid mitochondriën β-cel alvleesklier niet-menselijke primaat
Analyse van niet-menselijke Primate pancreatic eilandje zuurstofverbruik
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Elsakr, J. M., Deeter, C.,More

Elsakr, J. M., Deeter, C., Ricciardi, V., Gannon, M. Analysis of Non-Human Primate Pancreatic Islet Oxygen Consumption. J. Vis. Exp. (154), e60696, doi:10.3791/60696 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter