Summary
פרוטוקול זה מדגים את המדידה המדויקת והניתנת לכימות של צריכת החמצן באיונים שאינם אנושיים הלבלב. שיטות הטעינה של איון וציפוי המיקרופלטה מספקות מסגרת למדידת יעילות של נשימה בסוגים אחרים של הספרואידים מתורבתים.
Abstract
המדידה של צריכת החמצן באשכולות ספרואיד של תאים, כגון איולי לשעבר vivo הלבלב, היסטורית היה מאתגר. אנו להדגים את המדידה של צריכת חמצן של איון באמצעות 96-ובכן מיקרופלייט המיועדים למדידת צריכת החמצן ב spheroids. בתוך מעשה זה, מיקרולוחיות ספרואיד מצופות בדבק תא ורקמה ביום שלפני השיטת הפעולה. אנו מנצלים נפח קטן של הפתרון דבק כדי לעודד הדבקות איון רק בתחתית הבאר. ביום השימוש, 15 איונים נטענים ישירות לבסיס של כל הבאר באמצעות טכניקה המבטיחה מיקום אופטימלי של איונים ומדידה מדויקת של צריכת החמצן. היבטים שונים של נשימה מיטוכונדריאלי מאובטים באופן פרמקולוגית באיונים לא אנושיים, כולל נשימה תלוית ATP, נשימה מירבית ודליפת פרוטון. שיטה זו מאפשרת לתוצאות עקביות, הניתן לשימוש באמצעות מספר קטן של איונים לכל טוב. זה יכול תיאורטית להיות מיושם על כל הרוהרואידים תרבותי בגודל דומה.
Introduction
על מנת לשמור על רמות הגלוקוז בדם נורמלי, התא β הלבלב חייב לחוש את הגבהים בגלוקוז ולהפריש אינסולין בהתאם. צימוד הפרשת האינסולין עם רמות הגלוקוז קשור ישירות לחילוף החומרים של הגלוקוז ולייצור ATP דרך זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי. כך, המיטו, לשחק תפקיד קריטי הפרשות הגירוי צימוד1. הערכת β-מיטוכונדריאלי-תא יכולה לחשוף פגמים המובילים לפגיעה באינסולין. הפרשה של גלוקגון על ידי תאים הלבלב α הוא גם קשור הדוק פונקציה מיטוכונדריאלי2. למרות מונצח קווי התא הוכיחו שימושי עבור סוגים מסוימים של assays הפיזיולוגיה של תאים אלה אינה מדויקת באופן מדויק הפונקציה איון שלם, כפי שמודגם על ידי פוטנציאל של הפרשת אינסולין על ידי גלוקגון3,4 ואת עיכוב הפרשת גלוקגון על ידי אינסולין/סומטוסטטין5,6 ב איים שלמים. זה מדגים את הצורך מדידת צריכת החמצן באמצעות איים שלמים, שלם.
טכניקות עבור המדידה של תא מוריקה של התא איון התפתחו לאורך זמן, מהשימוש של צבעי פלורסנט רגישים חמצן7 כדי חיישנים במצב מוצק כי מדידת ישירות צריכת החמצן8. תוכנן בתחילה עבור monolayer, תאים חסיד, בדרך כלל מערכות השימוש בתרבות התא הוכיחו להיות לא יעילים עבור איולי הלבלב. כמו האיים לא לדבוק באופן טבעי הבארות, הם נוטים להיות נדחף לפריפריה של התרבות היטב וכתוצאה מכך מדידה לא מדויקת של צריכת החמצן9. כדי להילחם בבעיה זו, לוחיות 24-היטב מיוחדות עם דיכאון מרכזי שיכול להכיל איונים פותחו9. עם זאת, הצלחת 24-באר מערכת היה מוגבל על ידי מספר גדול של איונים נדרש (50-80 לכל טוב) ואת מספר התנאים שניתן היה לבדוק בו10. ההתפתחות האחרונה של 96-מיקרולוחיות היטב תוכנן במיוחד עבור ניתוח השטף החילוץ ב spheroids יש להתגבר על המחסומים האלה, המאפשר את המדידה של איון הגז מוריקה עם 20 או פחות איים לכל טוב10.
כאן, אנו להדגים את השימוש במערכת זו כדי למדוד צריכת חמצן באיים מ מקוק יפני (macaca פאסכאטה), מודל בעל חיים עם ביולוגיה איון דומה לבני אדם11,12. , בפרוטוקול זה. מנתחים 15 מקוק בבאר בידינו, 15 איונים לכל התוצרת הגבוהה בסיסית צריכת החמצן הבסיסית מאשר פחות איונים, עם הפעלה חזקה ודיכוי של נשימה בתגובה טיפול תרופתי. אנו מדגישים את הצעדים להכנה לצורך התמדה, שיטה אפקטיבית להעלאת האיונים העקביים במרכז הבאר, ואתגרים משותפים בעת ביצוע הצורך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת מחסנית מיקרופלייט וסנסור ביום הקודם להפעלת השיטת המחשב
איונים היו מבודדים מקופי-התוכי היפני בן השלוש, כפי שתיאר בעבר13. שיטה זו דומה מאוד לזה ששימש לבידוד איונים אנושיים מתורמים של גופה, אבל שונה מעכברים, שבו pancreata מנופחים לעתים קרובות עם פתרון הקולגן בעוד החיה נמצאת תחת הרגעה לפני הסרת איברים. אחזור איון נערך בהתאם להנחיות של הוועדה לטיפול בעלי חיים מוסדיים (IACUC) של המרכז לחקר הפרימטים הלאומית של אורגון (ONPRC) ואורגון בריאות ומדע האוניברסיטה ואושרו על ידי ה-ONPRC IACUC. ה-ONPRC מבוסס על חוק הרווחה והתקנות הנתמכות על-ידי מחלקת החקלאות של ארצות הברית ומדיניות שירות בריאות הציבור על טיפול הומאני ושימוש בבעלי חיים מעבדתיים בהתאם למדריך לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים שפורסמו על ידי המכון הלאומי לבריאות.
- הכנת מיקרולוחית ספרואיד
- הכינו 3 מ ל של תמיסה של 0.1 מ' מביקרבונט נתרן. המסנן מעקר את הפתרון. אנו משתמשים במסנן 0.45 יקרומטר (טבלת חומרים).
- במכסה של תרבות התא, הוסף 200 μL של הדבקה של תא ורקמה (טבלת חומרים) עד 2.8 מ ל של 0.1 מ' נתרן ביקרבונט. לאחר מכן, להוסיף 20 μL של פתרון זה לחלק התחתון של כל טוב של 96-היטב מיקרולוחית ספרואיד (טבלת חומרים). ודא כי בועות האוויר יוסרו מקצה pipet ורק את החלק התחתון של הצלחת מכוסה. ציפוי המיקרולוח מונע איונים מלהתקדם בצידי הבארות כאשר התרופות מתווספות ומעורבות בבאר במהלך התהליך.
הערה: יש צורך לשים מעיל כמו בארות רבות כפי שישמשו עבור איונים כאשר הצורך מופעל. אם רק מספר בארות ישמשו, ניתן לשנות את הפתרון הדביק את התאים למטה בהתאם. הדבק התאי המשמש בתוך השימוש הוא פתרון חלבון מגובש שהופק מהמוסזל הימי. לחילופין, אימונולוגיה בארות יכול להיות מצופה עם 20 μl של 100 μg/mL פולי-D-ליזין. - מודקת את הצלחת ב 37 ° c, החממה לא שיתוף2 למשך שעה אחת.
- , בסביבה סטרילית. מחצי את התמיסה של דבק התא מלוחית הרישוי לשטוף כל היטב פעמיים עם 400 μL של 37 ° צ' מים סטרילי באמצעות pipet רב-ערוצי. . הרשו לאוויר להתייבש
- לאחר 30-40 דקות, יש לכסות את הצלחת ולאחסן לילה ב -4 ° c.
- הידרציה של מחסנית החיישן
- בסביבה סטרילית, פתח את חבילת מחסנית החיישן (טבלת חומרים) והסר את התוכן. מניחים את מחסנית חיישן הפוך ליד לוחית השירות.
- למלא כל היטב את צלחת השירות עם 200 μL המים סטרילי ולהקטין את מחסנית החיישן בחזרה לתוך צלחת השירות. המקום מורכב מחסנית חיישן ולוחית כלי השירות ב 37 ° c, חממה שאינה CO2 בלילה.
- הכנת כהנמלה
- מחלקים 25 מ ל של כלינמלה (שולחן חומרים) לתוך צינורית חרוט 50 mL. מניחים את הצינור ב-37 ° c, חממה שאינה בעלת2 לילה.
2. פרוטוקול הכנה למדיה, טעינת איונים והעמסת מחסנית החיישן ביום העריכה
- הכנת מדיה
- כדי 48.5 mL של מדיה בסיס (DMEM מינימלי, ראה טבלה של חומרים), להוסיף 500 μl כל אחד של נתרן פירובט 1 מ"מ ו 2 מילימטר גלוטמין. בנוסף, להוסיף 496 μL של 200 mg/ml גלוקוז (הריכוז הסופי של גלוקוז במדיה הוא 5.5 mM).
הערה: הריכוז גלוקוז בסיסית נשמר קבוע עבור ניסויים אלה. עם זאת, גלוקוז יכול לשמש גם כדי לעורר נשימה בנוסף המניפולציות הפרמקולוגית תיאר מכה10. - ודא כי ה-pH הוא 7.4 +/-0.1, התאמה במידת הצורך.
- כדי 48.5 mL של מדיה בסיס (DMEM מינימלי, ראה טבלה של חומרים), להוסיף 500 μl כל אחד של נתרן פירובט 1 מ"מ ו 2 מילימטר גלוטמין. בנוסף, להוסיף 496 μL של 200 mg/ml גלוקוז (הריכוז הסופי של גלוקוז במדיה הוא 5.5 mM).
- הכנת מחסנית חיישן
- לקחת מחסנית חיישן מתוך החממה, להסיר מכסה מחסנית חיישן, ולרוקן את המים מבארות. מקום 200 mL של מחמם טרום מחומם לתוך כל טוב להחליף מכסה מחסנית חיישן.
- הניחו את מחסנית החיישן בחממה במשך כשעה אחת (עד לצורך).
- הכנת תרופות לצורך שיטת מצוקה מיטוכונדריאלי
- פתח את ערכת בדיקת הלחץ (טבלת חומרים) ולהסיר את התוכן. להפוך את המלאי ואת פתרונות העבודה עבור Oligomycin, פחמן ציאניד-4-(trifluoromethoxy) פנילהידרלזון (FCCP), ו Rotenone/Antimycin A (AA) כדלקמן.
- Oligomycin: להוסיף 630 μL של מדיה התאספו לצינור כדי להפוך 100 מניות μM. אז, לדלל 45 μM עם מדיה כדי להשיג ריכוז היציאה (הסוף היטב ריכוז לאחר ההזרקה יהיה 4.5 μM)
- FCCP: להוסיף 720 μL של הרכבה מדיה לצינור כדי להפוך 100 μM מניות. לדלל עד 10 μM עם מדיה כדי להשיג ריכוז היציאה (הריכוז האחרון היטב יהיה 1 μM)
הערה: bsa ו/או fbs אין להוסיף למדיה, כמו זה יכול להשפיע על הפעולה של מיטוכונדריאלי uncouplers14. - Rotenone/AA: להוסיף 540 μL של הרכבה מדיה לצינור כדי להפוך 50 μM מניות. לדלל עד 25 μM עם מדיה כדי להשיג ריכוז הנמל (ריכוז היטב הסופי יהיה 2.5 μM)
הערה: הריכוזים הנ ל יצרו תוצאות עקביות בידינו. FCCP נוספים הובילו לעלייה נוספת בנשימה. עם זאת, ריכוזי התרופה עשוי להיות צורך להתאים בהתאם לגודל איון, ובמיוחד עם איונים ממינים שונים או שאינם מסוג spheroids. להתייחסות, הקוטר הממוצע של איון הפרימטים שאינם אנושיים הוא כ 150 יקרומטר15.
- פתח את ערכת בדיקת הלחץ (טבלת חומרים) ולהסיר את התוכן. להפוך את המלאי ואת פתרונות העבודה עבור Oligomycin, פחמן ציאניד-4-(trifluoromethoxy) פנילהידרלזון (FCCP), ו Rotenone/Antimycin A (AA) כדלקמן.
- הכנת לוחית ספרואיד והעברה של איונים
- יד לבחור איונים הלבלב לתוך 60 מ"מ x 15 מ"מ ממנה תרבות תא המכיל מדיה התאספו כדי להשיג ליד 100% טוהר.
הערה: איואיי צריכים להופיע מעוגלים, עם פריפריה מוגדרת בבירור, ולהופיע צפוף יותר מאשר מזהמים רקמות אקסוקרינית. להימנע מאיונים שנראים פגומים או בלויים. בניסוי זה, גודל איון לא נמדד ישירות, למרות שניסינו לבחור איים של בגודל שווה ערך עבור כל טוב ומדגם. - לטעון כל באר של אימונולוגיה מיקרולוחית עם 175 μl של הרכבה מדיה באמצעות פיפטה רב-ערוצי.
- באמצעות P20 מערכת הצינורות מוגדר 15 μL, משחים 15 איים ממנה לתרבות התא. איונים צריכים להיות גלויים. בעצת הפיפטה לעין העירומה
- כדי להעביר איים למיקרואיד microplate, מתיחת צנרת נמוכה יותר לתחתית הבאר, בקושי להרים, והפיפטה לאט החוצה נפח קטן מאוד (~ 5 μL). תאשר שכל האיונים. הותירו את קצה הצינורות כל טוב צריך לקבל 15 איים. מדי פעם לבדוק מיקרואיד מיקרו מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא כי איונים הם בתחתית של כל הבאר ולא תקוע לצדדים.
הערה: להימנע מטעינת בארות הפינה עם איונים. חמצן ו-pH השטף מתוך פלסטיק יכול להתרחש במהלך התהליך, וזה מחמיר את ארבע בארות הפינה. - לאחר כל האיים הועברו המיקרואיד אימונולוגיה, הדגירה המיקרוצלחת ב 37 ° c, לא שיתוף2 בחממה תוך השלמת השלבים הבאים.
- יד לבחור איונים הלבלב לתוך 60 מ"מ x 15 מ"מ ממנה תרבות תא המכיל מדיה התאספו כדי להשיג ליד 100% טוהר.
- טעינת מחסנית החיישן והפעלת המנה
- הסר מחסנית חיישן מהאינקובטור. יציאות A-C עבור כל טוב חייב להיות טעון עם סמים או מדיה. בארות המכילות איונים וארבע הבארות הפינתיות צריכות להיות עמוסות בסמים. אין לטעון בארות שאינן פינתיות ללא איונים במדיה. ניתן להשאיר את Port D ריק. טען יציאה A (למעלה משמאל של כל חיישן) עם 20 μL של oligomycin או מדיה. טען יציאה B (מימין למעלה) עם 22 μL של FCCP או מדיה. טען יציאה C (למטה משמאל) עם 25 μL של Rotenone/AA או מדיה.
- תוכנית שיטת מנתח השטף בלתי מ, עבור 30 דקות הבסיסית הנשימה זמן (5 מחזורים של 3 דקות ערבוב, 3 דקות מידה), 42 דקות מדידה תקופת המדידה (7 מחזורים של 3 דקות ערבוב, 3 דקות מידה), 30 דקות FCCP (5 מחזורים של 3 דקות ערבוב, 3 דקות מדידה), ו 30 דקות Rotenone/AA (5 מחזורים של 3 דקות ערבוב, 3 דקות מידה).
- הפעל את הטיפול ועקוב אחר ההוראות על המסך עבור כיול החיישן והוספת המיקרו-לוחית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לטעון איים לתוך microplate, 15 איונים צריכים להיות משופחת ב 15 μL של מדיה, כפי שמוצג באיור 1א. איונים באופן טבעי להתיישב לקראת החלק התחתון של הטיפ pipet בתוך כמה שניות. לאחר מכן, הקצה התחתון מופחת לתחתית הבאר. הטיפ הוא מוסר מעט מאוד, וכמות קטנה (כ 5 μL) הוא ממוקם החוצה יחד עם איונים. טכניקה זו גורמת למיקום עקבי של איון בחלק התחתון של מיקרופלייט היטב (איור 1B) מתן אפשרות למדידות מדויקות של צריכת חמצן.
איור 2 מציג את תוצאות הנציג על ידי היטב לצריכת החמצן במהלך השיטת. ניסוי מסוים זה מדגים מה יכול לקרות כאשר הבארות נטענים גרוע, עם הרבה איים תקועים על הצדדים של הבאר ולא בתחתית הבאר. זה יכול להיגרם על ידי ליטוף יותר מדי מדיה לתוך הבאר לאחר האיים כבר מצינורות מתוך הקצה. זרם התקשורת הנוספת דוחף את האיים מתחתית הבאר. כאשר זה קורה, הרמה הבסיסית של צריכת החמצן יהיה נמוך מאוד, והטוב הזה יראה מעט מאוד לא מענה FCCP. קו מודגש באיור 2 מדגים תופעה זו.
איור 3 מראה ניסוי שונה שבו רוב הבארות הראו נשימה בסיסית משמעותית ותגובה לסמים. עם זאת, שתי בארות (עם קווים מודגשים) לא הראו תגובה rotenone/AA. הדבר מרמז על כך שהסם לא שוחרר כראוי לבאר. במקרה זה, כמו עם מקרים של צריכת החמצן הבזליים, בארות אלה ניתן לכלול מניתוח נוסף.
איור 4 מציג את התוצאות של שיטת מוצלחת. כאן אנו מציגים דוגמה של נתוני סיכום מניסוי נפרד שבו בארות נטענו כראוי עם איונים והזריקו בצורה נכונה עם סמים. צריכת חמצן מיטוכונדריאלי מותנית ב-ATP היתה מעכבות באופן יעיל על ידי oligomycin, הנשמה המקסימלית-היטב מעל רמות בסיס-המושרה על ידי FCCP, ונשימה מיטוכונדריאלי היה סגור לחלוטין מתחת oligomycin רמות-על-ידי עיכוב של שרשרת התחבורה אלקטרון עם rotenone/AA.
איור 1: טכניקת ליטוף לטעינת איולי מיקרופלייט. (A) כ 15 איונים (חץ אדום) מחבר עם 15 μl של מדיה. (ב) איונים ממורכזים בתחתית המיקרואיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: השתנות היטב בשל ההפרש בטעינת איון. וולס נטען באופן לא תקין (קו כחול מודגש) להראות מעט לא צריכת החמצן בסיס ותגובה מינימלית הלחץ בדיקת תאים סמים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: כשל בהזרקת סמים. שתי בארות (קווים כחולים מודגשים) לא הוזרקו עם rotenone/AA ולא להראות ירידה משמעותית צריכת החמצן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: נתוני ממוצעים בכל הבארות בניסוי לאחר אי-הכללה של בארות שנטענו או מוזרקים בצורה גרועה. צריכת החמצן הממוצעת לאורך כל הלחץ התא מבחינה בבדיקה בניסוי נפרד כולל 16 משכפל טכני. קווי שגיאה מציגים סטיית תקן עבור n = 16 בארות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המחקר של צריכת חמצן של איון כבר הושפע בעבר על ידי הצורה כדורית של איונים, חוסר הדבקות שלהם משטחי התרבות, ואת מספר איונים נדרש לכל טוב. בפרוטוקול זה, אנו להדגיש את היעילות של 96-היטב מיקרו-לוחית ספרואיד עבור מדידת צריכת החמצן של איון על מספר קטן של איונים ולהדגים טכניקה לטיפול וטעינת איונים שהוא אפשרי מבחינה טכנית ומייצרת עקבית תוצאות.
כדי איונים לדבוק בחלק התחתון של המיקרו לוחית ולהיות מודאג במהלך ערבוב שלבים לאורך הזמן, 96-היטב אימונולוגיה מצופה בפתרון דבק תא יום לפני הצורך. אמנם זה מועיל בדרך כלל, אם האיים אינם טעונים כראוי הם עלולים לדבוק לצד של הבאר ולא בתחתית, ובכך להשפיע או מנעה מדידה מדויקת. כדי להילחם זה, אנו ממליצים ציפוי בארות עם נפח קטן מאוד של הדבק פתרון-רק 20 μL. בנוסף, טכניקת ליטוף אנו מדגימים מבטיח כי איונים הם טעונים בתחתית הבאר ולא דחפו את הצדדים על ידי זרימת מדיה נוספת .
96-ובכן מיקרו לוחית ספרואיד יש להתגבר על מגבלות קודמות של מדידת צריכת החמצן של איון, כולל מספר גבוה של איונים הנדרש ואת מספר התנאים שניתן לבדוק בו זמנית. אכן, מחקר שנערך לאחרונה10 הפגינו שימוש במערכת זו עם איון אנושי יחיד לכל טוב. עם זאת, מדידת צריכת החמצן באמצעות איונים יחיד הביא מדידות בסיס נמוך מאוד של צריכת החמצן, אשר היו באופן משמעותי מעל הרקע רק איונים הגדול ביותר (קוטר מעל 290 μm). האיים nhp נוטים להיות קטנים יותר מאשר איונים אנושיים, עם קוטר ממוצע של רק 150 יקרומטר15. בידינו, 15 האיים NHP הראה גם בסיסית גבוהה יותר פרופיל תגובה יותר במהלך מבחן לחץ התא מאשר פחות איים. בדקנו גם חמישה ועשרה איונים לכל טוב, אבל מצאו כי צריכת החמצן בסיס האות לרעש הופחת באופן משמעותי.
בנוסף ליכולת להשתמש במספר נמוך של איונים לבאר, 96-ובכן מיקרופלייט מאפשר בדיקה של מספר מצבים שונים בבת אחת. זה מועיל במקרים בהם איונים מטופלים עם תרכובות שונות או מניפולציות גנטית. עם זאת, בעת השוואת קבוצות של איונים אנושיים או לא אנושיים שהגיעו ממקורות שונים (למשל, סוכרתיים לעומת איונים לא סוכרתית), הדגימות מתקבלות לעתים קרובות בימים שונים. לכן, במקרים אלה לא ניתן לנצל את מלוא היתרונות של המערכת.
על מנת לכמת היבטים שונים של צריכת חמצן מיטוכונדריאלי, אנו מניפולציה היבטים שונים של נשימה פרמקולוגית. ריכוזי הסמים ששימשו בשימוש התבססו על מחקר חסינה באיי האדם10. מינון ה-FCCP ס היה מיטבי כדי לגרום לנשימה מיטוכונדריאלי מירבית בידינו. במיוחד, הריכוז של oligomycin היה 4.5 μM, FCCP ס היה 1 μM, ו rotenone/AA היה 2.5 μM. עם זאת, כנראה שריכוזים אלה צריכים להיות מכוילים עבור יישומים שונים של פרוטוקול זה.
ניתן לנתח את הנתונים באופן ישיר או מנורמל באמצעות מספר שיטות. בניסוי זה, מספר שווה של איים בגדלים דומים שימשו עבור כל מדגם, והנתונים לא מנורמל על-ידי מספרי תאים או גודל איון, אשר יכול להיות קשה לכמת ישירות. שיטה חלופית לנורמליזציה היא החלבון התאי הכולל, הכרוך בתהליכי ליסינג, לאחר הביצוע והרמת החלבון. ניתן גם לנרמל את הנתונים לרמות הנשימה הבזליים. הדבר עשוי להיות אינפורמטיבי במקרים מסוימים, כגון כימות קיבולת שימור כאחוז של רמות בסיס. עם זאת, עם שיטות הנורמליזציה ואחרים, ניתן לאבד את המידע במהלך הנורמליזציה כמתואר לעיל16.
המערכת המתוארת כאן מספקת כלי ייחודי כדי להבין טוב יותר את הפיזיולוגיה של איון. אכן, את החשיבות של צריכת החמצן בריאות איון מומחש על ידי התצפית כי שיעורי הצריכה חמצן איון קשורים היטב עם בריאות איון ואת ההסתברות של השתלת איון מוצלחת17. מערכת זו מספקת פלטפורמה מעולה עבור כימות עקבית של צריכת חמצן של איון אשר יכול, בתאוריה, גם להיות מיושם על כל בגודל דומה מספרי הגידולים המתורבית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחברים רוצים להכיר את הליבה של תפוקה גבוהה של ואנדרבילט ההקרנה לשימוש המתקנים שלהם, Agilent Biotechnologies, ד ר. פול Kievit (אורגון בריאות ומדע האוניברסיטה) עבור הפרימטים שאינם אנושיים, ו אריק דונהיו (אוניברסיטת ואנדרבילט) לסיוע עם איור 1. J.M.E. של המכון הלאומי לבריאות תחת מספר הפרס T32GM007347. מ היה נתמך על ידי NIH/NIDDK (R24DK090964-06) ואת המחלקה לעניינים ותיקי (BX003744).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style | Corning | 430166 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | Corning | 354240 | |
| Conical tube, 50 mL | Falcon | 352070 | |
| Dextrose anhydrous | Fisher Scientific | BP350-1 | For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered |
| Disposable reservoirs (sterile), 25 ML | Vistalab | 3054-1033 | for loading multichannel pipet |
| EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm | Foxx Life Sciences | 371-3115-OEM | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM (100x) |
| Multichannel pipette tips | ThermoFisher Scientific | 94410810 | |
| Multichannel pipette, 15-1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672100BT | Recommended |
| P20, P200, and P1000 pipettes | Eppendorf | 2231000602 | |
| pH Probe | Hanna Instruments | HI2210-01 | |
| Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL | Olympus | 24-404, 24-412, 24-430 | |
| Seahorse XF Base Media | Agilent | 103334-100 | |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | S7800B | Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator |
| Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini | Agilent | 102905-100 | Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | 100 mM (100x) |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX9 | |
| Syringe (sterile), 5 mL | BD | 309603 | For sterile filtration |
| Water (sterile) | Sigma | W3500-500mL |
References
- Mulder, H. Transcribing β-cell mitochondria in health and disease. Molecular Metabolism. 6 (9), 1040-1051 (2017).
- Maechler, P., Wollheim, C. B. Mitochondrial signals in glucose-stimulated insulin secretion in the beta cell. The Journal of Physiology. 529 (Pt 1), 49-56 (2000).
- Curry, D. L. Glucagon Potentiation of Insulin Secretion by the Perfused Rat Pancreas. Diabetes. 19 (6), 420 (1970).
- Song, G., Pacini, G., Ahrén, B., D'Argenio, D. Z. Glucagon Increases Insulin Levels by Stimulating Insulin Secretion Without Effect on Insulin Clearance in Mice. Peptides. 88, 74-79 (2017).
- Vergari, E., et al. Insulin inhibits glucagon release by SGLT2-induced stimulation of somatostatin secretion. Nature Communications. 10 (1), 139 (2019).
- Watts, M., Ha, J., Kimchi, O., Sherman, A. Paracrine regulation of glucagon secretion: the β/α/δ model. American Journal of Physiology--Endocrinology and Metabolism. 310 (8), E597-E611 (2016).
- Sweet, I. R., et al. Continuous measurement of oxygen consumption by pancreatic islets. Diabetes Technology & Therapeutics. 4 (5), 661-672 (2002).
- Agilent Seahorse XF Instruments Overview and Selection Guide. , Agilent Technologies. https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/seahorse-xf-instruments-selection-guide (2019).
- Wikstrom, J. D., et al. A novel high-throughput assay for islet respiration reveals uncoupling of rodent and human islets. PLoS One. 7 (5), e33023 (2012).
- Taddeo, E. P., et al. Individual islet respirometry reveals functional diversity within the islet population of mice and human donors. Molecular Metabolism. 16, 150-159 (2018).
- Conrad, E., et al. The MAFB transcription factor impacts islet alpha-cell function in rodents and represents a unique signature of primate islet beta-cells. American Journal of Physiology--Endocrinology and Metabolism. 310 (1), E91-E102 (2016).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Elsakr, J. M., et al. Maternal Western-style diet affects offspring islet composition and function in a non-human primate model of maternal over-nutrition. Molecular Metabolism. , (2019).
- Soutar, M. P. M., et al. FBS/BSA media concentration determines CCCP's ability to depolarize mitochondria and activate PINK1-PRKN mitophagy. Autophagy. , 1-10 (2019).
- Hirshberg, B., et al. Pancreatic Islet Transplantation Using the Nonhuman Primate (Rhesus) Model Predicts That the Portal Vein Is Superior to the Celiac Artery as the Islet Infusion Site. Diabetes. 51 (7), 2135-2140 (2002).
- Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
- Papas, K. K., et al. Islet Oxygen Consumption Rate (OCR) Dose Predicts Insulin Independence in Clinical Islet Autotransplantation. PLoS One. 10 (8), e0134428 (2015).
