Summary
Denne protokol beskriver en teknik til visualisering af makrofag adfærd og død i embryonale Zebra under Mycobacterium Marinum infektion. Trin til fremstilling af bakterier, infektion af embryoner, og intravital mikroskopi er inkluderet. Denne teknik kan anvendes til observation af cellulære adfærd og død i lignende scenarier, der involverer infektion eller steril inflammation.
Abstract
Zebrafish er en fremragende model organisme til at studere medfødte immuncelle adfærd på grund af sin gennemsigtige karakter og afhængighed udelukkende på dens medfødte immunsystem under tidlig udvikling. Den Zebrafish Mycobacterium Marinum (M. Marinum) infektion model har været veletableret i at studere vært immunrespons mod mycobakteriel infektion. Det er blevet foreslået, at forskellige makrofag celledød typer vil føre til de forskellige resultater af mycobakteriel infektion. Her beskriver vi en protokol ved hjælp af intravital mikroskopi til at observere makrofag celledød i Zebra embryoner efter M. Marinum infektion. Zebrafish transgene linjer, der specifikt mærke makrofager og neutrofiler er inficeret via intramuskulær mikroinjektion af fluorescently mærket M. Marinum i enten midthjernen eller stammen. Inficerede Zebra embryoner er efterfølgende monteret på lav smeltende agopstået og observeret af Konfokal mikroskopi i X-Y-Z-T dimensioner. Da langtids levende billeddannelse kræver brug af lav laser effekt for at undgå foto blegning og fototoksicitet, anbefales det stærkt at udtrykke transgene. Denne protokol letter visualisering af de dynamiske processer in vivo, herunder immuncelle migration, vært patogen interaktion, og celledød.
Introduction
Mycobakteriel infektion er blevet påvist at forårsage Host immuncelle død1. For eksempel vil en svækket stamme udløse apoptose i makrofager og indeholde infektionen. Men en virulente stamme vil udløse lytisk celledød, forårsager bakteriel udbredelse1,2. I betragtning af virkningen disse forskellige typer af celledød har på vært anti-mykobakterielle respons, en detaljeret observation af makrofag celledød under mycobakteriel infektion in vivo er nødvendig.
De konventionelle metoder til måling af celledød er at bruge døde celle pletter, såsom annnexin V, Tunel, eller acridin orange/propidium kaliumiodid farvning3,4,5. Men disse metoder er ude af stand til at kaste lys over den dynamiske proces af celledød in vivo. Observation af celledød in vitro er allerede blevet fremmet af Live imaging6. Det er imidlertid uklart, om resultaterne nøjagtigt efterligner fysiologiske forhold.
Zebrafish har været en glimrende model for at studere Host anti-Mycobacterium svar. Det har et stærkt bevaret immunsystem, der ligner det for mennesker, et let manipulerede genom, og de tidlige embryoner er gennemsigtige, hvilket giver mulighed for levende billeddannelse7,8,9. Efter infektion med M. Marinum, voksne Zebra form typiske modne granulom strukturer, og embryonale Zebra danner tidlige granulom som strukturer9,10. Den dynamiske proces af medfødte immuncelle-bakterier interaktion er blevet udforsket tidligere i Zebra M. Marinum infektion model11,12. Men på grund af høj rumlig-temporale opløsning krav, detaljerne omkring død af de medfødte immunceller forbliver stort set udefineret.
Her beskriver vi, hvordan man visualiserer processen med makrofag lytisk celledød udløst af mycobakteriel infektion in vivo. Denne protokol kan også anvendes til at visualisere cellulære adfærd in vivo under udvikling og inflammation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zebrafish blev opdrættet under standardbetingelser i overensstemmelse med laboratoriets dyre retningslinjer for etisk gennemgang af dyrevelfærd (GB/T 35823-2018). Alle Zebra eksperimenter i dette studie blev godkendt (2019-A016-01) og udført på Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University.
1. M. Marinum enkelt celle inoculum præparat (figur 1)
- Tø Cerulean-fluorescerende M. Marinum glycerol bestand fra-80 °c og inokulere en 7H10 agar plade med 10% (v/v) OADC, 0,25% glycerol og 50 μg/ml hygromycin. Pladen inkubates ved 32 °C i ca. 10 dage.
- Vælg en koloni, der udtrykker positiv fluorescens og inokulerer 3 mL 7H9 medium med 10% OADC, 0,5% glycerol og 50 μg/mL hygromycin.
- Inokulationen inkubaterer ved 32 °C og 100 omdrejninger pr. minut (rpm) i 4 – 6 dage, indtil kulturen når logaritmisk fase (OD600 = 0,6 – 1,0).
- Subkultur (1:100) i 30 mL frisk 7H9 medium med 10% OADC, 0,5% glycerol, 0,05% Tween-80, og 50 μg/mL indtil OD600 når ~ 1,0.
Bemærk: for den højeste kultur kvalitet anbefales et subkultur trin på dette tidspunkt. I vores erfaring, at tilføje klon direkte til en stor mængde medium vil føre til dannelsen af bakterielle klumper.
- Saml M. Marinum celler som beskrevet nedenfor.
- Centrifugeres ved 3.000 x g i 10 minutter for at samle M. Marinum som en pellet. Kassér alle, men 300 μL af supernatanten, og brug den til at resuspendere pellet.
- Tilsæt 3 mL 7H9 medium med 10% glycerol for yderligere at resuspendere pellet, derefter soniker suspensionen i et vandbad ved 100 W ved 15 s på, 15 s slukket for i alt 2 min.
Bemærk: Formålet med sonikering er at opnå en enkelt celle homogenatet for inoculum, som vil forhindre blokering af mikroinjektionsnål.
- Overfør bakterie suspensionen til en 10 mL sprøjte, og gå derefter gennem et 5 μm filter for at fjerne eventuelle bakterie klumper.
- Måle den optiske tæthed (OD) af suspensionen ved hjælp af et spektrofotometer og fortynde den til OD600 = 1,0 med 7H9 medier indeholdende 10% glycerol. Suspensionen opdeles i 10 μL aliquoter og opbevares ved-80 °C fryser til fremtidig brug.
- Den bakterielle koncentration af inokulum (CFU/ml) bekræftes ved seriel fortynding og plating af bakterie bestanden på en 7h10-agarplade, der indeholder 10% (v/v) af oadc, 0,5% glycerol og 50 μg/ml hygromycin.
2. klargøring af zebrafish-embryoner
- En dag før gydningen, oprette Zebra avl par i avls kammeret.
Bemærk: Tilføj kun ét par til hvert avls kammer. - Indsamle embryoner næste morgen inden for 1 h efter befrugtning (HPF). Embryoner vaskes forsigtigt med destilleret vand og overføres op til 100 embryoner til en 100 mm Petri skål indeholdende 30 mL E3 medium. Inkubere ved 28,5 °C.
- Efter 12 timer, observere under et mikroskop og kassere ikke-befrugtede eller beskadigede æg.
- Ved 24 HPF, ændre medium til frisk E3 medium med N-phenylthiourea (PTU, 0,2 nM endelig koncentration) for at forhindre udviklingen af pigment. Embryonerne inkubates ved 28,5 °C, indtil embryonerne er klar til mikroinjektion.
3. infektion via bakteriel mikroinjektion
- Forbered borosilikat glas mikrokapillær Injektionsnåle som tidligere beskrevet i reference13.
- Zebrafish embryoner montering for infektion
- Mikroovn 100 mL 1% (w/v) og 100 mL 0,5% (w/v) lav smelte agopstod i et autoklaveret E3-medium, indtil agmet er helt smeltet. Opdeles i 1 ml alikvot rør og opbevares ved 4 °c til fremtidig brug.
- Før brug opvarmes agmet i en 95 °C varmeblok, indtil det er helt smeltet. Opretholde agopstået i flydende form ved at placere den i en 45 °C varmeblok (figur 2).
- Montering til intramuskulær infektion i stammen region
- Opret bunden agopstået lag ved at hælde 0,5 mL af 1% (w/v) agopstået jævnt på en glas rutsjebane. Placer på en isboks eller kold overflade i 3 minutter for at størkne.
- Bedøve Zebra embryoner (48 – 72 HPF) i ægge vand med tricain (200 μg/ml) og PTU i 5 min før montering. Placer op til 60 Zebra embryoner på bunden agopstået lag og læg dem forsigtigt i to rækker (figur 2B).
- Fjern eventuelt resterende vand på bunden agopstået lag med silkepapir, før du tilføjer 0,3 mL 0,5% (w/v) agopstået for at skabe det øvre lag. Sørg for, at embryonerne er helt indlejret i den agopstået. Returner glaspladen til Indlandsisen igen for at størkne den agopstået og forhindre dehydrering.
- Hold det øverste lag af agopstået fugtig ved at dække overfladen med ekstra E3 ægge vand.
- Montering til mellemhjernens infektion
- Dæk rillen af en enkelt konkætglas mikroskopi slide med 1% (w/v) agopstået, og derefter overføre 4 – 6 tricain-bedøvet embryoner ind i agateret.
- Anbring spidsen af hvert embryo opad med en 10 G nål (figur 2C).
- Når alle embryonerne er fastgjort, skal du overføre glaspladen til en isboks eller en kold overflade for at lade agantet størkne.
Bemærk: undgå fortynding af lav smelte agopstået ved at minimere mængden af ægvands overførsel med embryonerne.
- Bakterier forberedelse til infektion
- Der tilsættes 1 μL sterilfiltreret phenolrød (10x) til en 10 μL alikvot bestand (fremstillet i trin 1) og blandes med vortexning kortvarigt.
Bemærk: den endelige koncentration kan justeres ved hjælp af sterile PBS. - Soniker præparatet ved hjælp af 100 W ved 10 s på, 10 s slukket i 1 min for at bryde op eventuelle klumper, der kan have dannet14.
- Der tilsættes 1 μL sterilfiltreret phenolrød (10x) til en 10 μL alikvot bestand (fremstillet i trin 1) og blandes med vortexning kortvarigt.
- Infektion via mikroinjektion
- Juster mikroinjektoren og micromanipulator til den korrekte position og indstilling til mikroinjektion som tidligere rapporteret13.
- Overfør 3 μL af det bakterielle præparat ved hjælp af en mikroloader i den forberedte nål (Se trin 3,1). Pipetten langsomt og forsigtigt for at undgå dannelse af luftbobler.
- For infektion med trunk-regionen indsprøjtes 100 cfu i bagagerummet (figur 3A). Undgå at injicere bakterier ind i notochord.
Bemærk: CFU til injektion anslås af formlen CFU = bakteriel bestand koncentration x fortyndingsfaktor x injektion dråbe volumen. Den faktiske CFU bekræftes ved plating en dråbe bakteriel inokulum på en 7h10 agar plade indeholdende 10% (v/v) af oadc, 0,5% glycerol, og 50 μg/ml hygromycin. - For hjernen infektion indsprøjtes ca. 500 CFU i hjernen-regionen (figur 3B).
- Efter mikroinjektion skylles Zebra-embryonerne forsigtigt i fersk ægge vand med en plastik pipette.
Bemærk: Monter embryoner i glasset bund skålen så hurtigt som muligt for at dække observation af den meget tidlige medfødte immuncelle respons.
4. levende billeddannelse af infektionen
- Fisk montering til Live imaging
- Overfør op til 10 tricain-bedøvet embryoner til midten af en glasbund 35 mm skål. Kassér ekstra E3-medium.
- Dæk skålen med 1% lavt smeltepunkt agopstået og orientere Zebra embryoner omhyggeligt ved hjælp af en 10 G nål. Inkuber glasbunden skålen på is for 10 s at størkne agantet.
Bemærk: ved injektion i midten af hjernen skal embryonerne monteres i agantet med hovedet rettet opad (figur 4A). For stammen region intramuskulær infektion, skal embryoner monteres sideværts i agopstået (figur 4B). - Når det er helt solidificeret, dække agopstået med et lag af ægge vand (plus 1 x tricain og PTU).
- Tre-farvet høj opløsning tidsforskudt Konfokal mikroskopi
Bemærk: følgende trin betjenes på en Konfokal mikroskopi udstyret med en 63.0 x 1,40 olie UV objektiv linse.- Indstil temperaturen på miljøkammeret til 28,5 °C. Placer noget vådt silkepapir inde i kammeret for at give fugt og undgå fordampning af ægge vandet (supplerende figur 1).
- Placer 35 mm glasbund skålen med Zebra i miljøkammeret.
- Åbn konfokale-softwaren, og Initialiser scenen. Skift til 63,0 x 1,40 olie UV-målet, og Find Zebra ved hjælp af den lyse felt kanal med et differens interferens kontrast filter (dic).
- Åbn 405 diode, argon (20% Power) og DPSS 561 nm laser. Indstil de relevante laser effekt-og frekvensindstillinger.
Bemærk: følgende er frekvensindstillinger for Cerulean (excitation = 405 nm; emission = ~ 456-499 nm), eGFP (excitation = 488 nm; emission = ~ 500-550 nm), DsRed2 (excitation = 561 nm; emission = ~ 575 – 645 nm) (supplerende figur 2b). - Vælg "XYZ" "sekventiel scanning" erhvervelse tilstand og sæt billeder format til "512 x 512 pixels" (supplerende figur 2a).
- Skift til "Live data mode". Mål positionen af den første Zebra og markere "BEGIN" og "end" Z position. Gentag denne proces for hver af de resterende embryoner. En "pause" kan tilføjes i slutningen af programmet (supplerende figur 2c).
- Definer loop og cyklus af programmet.
- Gem filen.
5. enkelt celle UV-bestråling for at inducere apoptose og levende billeddannelse
- Monter fiskene som beskrevet i trin 4,1.
- Imaging hjernen-regionen på 3 dage efter befrugtning (DPF) makrofag specifik transgene TG (mfap4-egfp) embryo15
- Vælg det område af interesse for en enkelt fluorescently mærket makrofag og Scan ved 400 Hz hastighed og 6% UV laser effekt for 50 s.
Bemærk: scanningshastigheden og-tiden skal optimeres baseret på det individuelle mikroskop. Scanningstid skal optimeres for at forårsage den omfattende DNA-skade, der efterfølgende vil forårsage målcellens apoptose, men ikke foto blegemiddel hele cellen. - Gentag ovenstående trin for at irradiere flere målceller.
- Udfør tidsforskudt billeddannelse af hjernen-regionen som beskrevet i afsnit 4.
6. billedbehandling
- Udfør "maksimal projektion" for de erhvervede billeder.
- Find og marker XY-position og-tidspunkt for målcellerne under "maksimal projektion"-visningen.
- Gå tilbage til standardvisningen for at finde og markere Z-positionen for målcellerne.
- Beskær det enkelte lags billede af målcellerne.
- Eksporter overlay-kanalen og det lyse felt som videoer i AVI-format.
- Beskær interesseområdet for overlay-kanalen og det lyse felt i ImageJ.
- Kombiner de to videoer i det sidste trin lodret og Gem som en AVI format video i ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mycobacterium infektion kan udløse forskellige vært svar baseret på ruterne af infektion. I denne protokol, er Zebra embryoner inficeret med intramuskulær mikroinjektion af fluorescently mærkede bakterier i midthjernen eller stammen (figur 3) og observeret af konfokale Live imaging. Infektion via disse to ruter vil lokalt begrænse infektionen forårsager medfødte immuncelle rekruttering og efterfølgende celledød.
Visualisering af detaljerne i medfødte immun celledød er udfordrende. Lytisk celledød sker over en meget kort tid vindue og kræver høj opløsning mikroskopi at observere. Også den høje motilitet af medfødte immunceller giver dem mulighed for at migrere ud af observationsområdet. I denne protokol løser vi dette problem ved at observere flere embryoner parallelt. En række Zebra embryoner kan monteres på et enkelt glas mikroskop slide til infektion, og op til 10 embryoner kan monteres på den samme 35 mm glasbund skål for levende billeddannelse (figur 4). Ved at drage fordel af en levende datamodel af Konfokal mikroskopi, kan mere end et embryo observeres samtidigt. Dette øger effektiviteten af Live Imaging og øger sandsynligheden for at fange hele lytisk celledød processen.
Det medfødte immunsystem er den første forsvarslinje mod mycobakteriel infektion, og to nøglekomponenter er makrofag og neutrofile. Her bruger vi tidligere rapporterede TG (coro1a: egfp; lyzDsRed2) og TG (MPEG1: loxp-dsredx-loxp-egfp; lyz: egfp) til at skelne makrofager og neutrofiler in vivo16,17,18. En makrofag stærkt engorged med bakterier blev runde og viste reduceret motilitet, med senere cytoplasmisk hævelse, rupturering af cellemembranen, og hurtig udbredelse af cytoplasmisk indhold. Disse hændelser er typiske morfologiske ændringer af lytisk celledød som tidligere rapporteret (figur 5a)16. UV bestråling er blevet brugt til at udløse celler til at gennemgå apoptose i Zebra20,21. I overensstemmelse med dette begreb viste UV-bestrålede makrofager typiske apoptotiske celle fænotyper, såsom celle svind, nuklear fragmentering og kromatin kondensation (figur 5b)22,23. Kombineret med brugen af Cerulean-fluorescerende M. Marinum19, tre farve levende billeddannelse af samspillet mellem makrofag, neutrofile, og m. Marinum blev opnået in vivo. Vi bemærkede også, at makrofager kan aktivt fagocytere og formidle M. Marinum (supplerende figur 3a). Men, neutrofiler havde begrænset Fagocytisk kapacitet og hurtigt gennemgik lytisk celledød uden indlysende bakteriel opblødning (supplerende figur 3b). Neutrofiler kan udløses af fagocytose af kun et par døde M. Marinum , der ikke udtrykker Cerulean-fluorescens, eller blot ved fagocytose af begrænset døde celleaffald.
Figur 1: skematisk diagram af enkelt celle bakterier forberedelse. Enkelt celle-Cerulean-fluorescerende M. Marinum bestande blev genereret efter den beskrevne proces. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: diagram over Zebra embryo montage til mikroinjektion. (A) skematisk diagram af monteringsprocessen. B) zebrafish-embryonerne blev monteret sideværts med henblik på infektion i stamme regionen. C) der blev monteret zebrafish-embryoner med hovedet rettet opad mod infektion i midthjernen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: positionering til mikroinjektion. (A) den røde pil indikerer injektionsstedet for infektion i stammen regionen. B) den røde pil indikerer injektionsstedet for infektion i midthjernen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: montering af Zebra-embryoner til levende billeddannelse. (A) for hjernen infektion, zebra embryoner blev monteret med deres hoveder rettet nedad. (B) for infektion i stammen region, zebra embryoner blev monteret sideværts med injektionsstedet tæt på bunden af glasset bund skålen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: typiske morfologiske ændringer i M. Marinum infektion induceret makrofag lytisk celledød og UV-induceret makrofag apoptose. (A) tidsforskudt billeddannelse af en makrofag (Mac), der gennemgår lytisk celledød, når det er stærkt opfodet med M. Marinum. Midthjernen af 3 DPF TG (coro1a: egfp; lyzDsRed2) Zebra embryo er inficeret med Cerulean-fluorescerende M. Marinum (~ 500 CFU) via mikroinjektion. Der leveres billeder til både overlay-kanalen (øverste panel) og DIC-kanal (nederste panel). T 00:00 er 5 h 20 min efter infektion. Hvide stiplede linjer = kontur af cellemembranen; sorte stiplede linjer = hævelse cytoplasma; sorte pile = ruptureret celle membran; røde stiplede linjer = hurtigt tabt cytoplasmisk indhold. B) tidsforskudt billeddannelse af UV-bestrålet makrofag. En gfp +-celle i hjernen-regionen på 3 DPF TG (mfap4: egfp) bestråles af UV og efterfølges af tidsforskudt billeddannelse. Hvide stiplede linjer = kontur af cellemembranen; sorte pile = nuklear fragmentering og kromatin kondensation. Skala bjælke = 15 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: miljøkammer oprettet til live Imaging. A) Indstil den digitale controller til at holde temperaturen ved 28,5 °c. (B) sæt vådservietter inde i kammeret for at give fugt og forhindre fordampning af ægge vand. C) Luk dækslet på kammeret, og vent mindst 30 minutter på temperatur stabilisering, før du påbegynder levende billeddannelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 2: indstilling af Konfokal panel til live Imaging. (A) repræsentation af erhvervelse panel indstilling. (B) repræsentation af laser effekt og frekvensindstillinger. (C) repræsentation af flere job og loop indstilling i live data mode. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 3: makrofager sprede infektion og neutrofiler undergår lytisk celledød efter M. Marinum infektion. A) makrofag, der formidler m. Marinum i stammen af en 2 DPF TG (coro1a: egfp; lyz: DsRed2) Zebra embryo inficeret med Cerulean-fluorescerende M. Marinum (~ 100 CFU). B) neutrofile (Neu), som gennemgår lytisk celledød uden åbenlys m. Marinum laden i bagagerummet på 3 DPF TG (MPEG1: lrlg; lyz: egfp) Zebra embryo inficeret med Cerulean-fluorescerende m. Marinum (~ 100 CFU) via mikroinjektion. Grøn farve er tildelt LRLG og rød farve er tildelt eGFP for bedre visualisering af lytisk celle død proces. Pilene i cyan angiver målcellerne. Pile i rødt punkt til de celler, der er ved at frigive cytoplasma indhold i den næste ramme. Pile i grønt punkt til de døde celler, der netop har mistet deres cytoplasma indhold. Scale bar = 25 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: en makrofag tungt lastet med M. Marinum gennemgår lytisk celledød, relateret til figur 5a. Tidsforskudt billeddannelse (63x-mål) for 9 min og 18 s ved 3 billeder pr. sekund (fps) i hjernen-regionen på et 3 DPF TG (coro1a: egfp; lyzDsRed2) Zebra embryo inficeret med Cerulean-fluorescerende M. Marinum. Venligst klik her for at se denne video (Højreklik for at downloade).
Video 2: en makrofag gennemgår apoptose efter UV-bestråling, relateret til figur 5b. Tidsforskudt billeddannelse (63x-mål) på 74 min ved 6 FPS af hjernen-regionen i et 3 DPF TG (mfap4: egfp) Zebra-embryon. En gfp +-celle i hjernen-regionen af embryonerne bestråles af UV og efterfølges af tidsforskudt billeddannelse. Venligst klik her for at se denne video (Højreklik for at downloade).
Video 3: en makrofag formidler M. Marinum, relateret til supplerende figur 3a. Tidsforskudt billeddannelse (63x-mål) på 24 min ved 3 fps i stammen-regionen på 2 DPF TG (coro1a: egfp; lyz: DsRed2) Zebra embryo inficeret med Cerulean-fluorescerende M. Marinum. Venligst klik her for at se denne video (Højreklik for at downloade).
Video 4: et neutrofile gennemgår lytisk celledød uden indlysende M. Marinum engorgement, relateret til supplerende figur 3b. Tidsforskudt billeddannelse (63x mål) på 7 min 30 s ved 3 fps af stammen region 3 DPF TG (MPEG1: lrlg; lyz: egfp) Zebra embryo inficeret med Cerulean-fluorescerende M. Marinum. Venligst klik her for at se denne video (Højreklik for at downloade).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver visualisering af makrofag død under mykobakterielle infektion. Baseret på faktorer såsom integriteten af cellemembranen, kan infektion drevet celledød opdeles i apoptose og lytisk celle død24,25. Lytisk celledød er mere stressende for organismen end apoptose, fordi det udløser en stærk inflammatorisk respons 24,25. Observation af lytisk celledød in vivo er vanskelig, på grund af kravet om høj rumlig-tidsmæssig opløsning, korrekt Konfokal mikroskopi indstillinger, og stærkt transgene udtryk.
Korrekt mikroinjektion kræver flere kritiske trin. Den bakterielle bestand skal være grundigt soniseret for at fjerne alle klumper før injektion. Vi forbedrede Zebra-monteringen til mikroinjektion ved at indlejre dem på et glas skred mellem to lag af lav smelte agre. Efter påføring af det andet lag af agopstået, er diaset overført til en isboks eller kold overflade for at fremskynde størkning og forhindre dehydrering af agopstået. Hvis embryonerne skal monteres på forskellige slides, skal du sørge for at holde det øverste lag af agopstået fugtig ved at tilføje ekstra ægge vand.
For levende billeddannelse, en høj opløsning objektiv linse er forpligtet til at observere detaljerne i celledød. Dette krav er altid ledsaget af korte arbejdsafstand, og dermed kræver positionering infektionsstedet tæt på forsiden dias. En lang arbejdsafstand vand linse er ideel til billeddannelse den dybere væv og vil give mulighed for mere plads til korrekt embryo montering. Forlænget Live imaging ved hjælp af en laser med høj intensitet vil forårsage vævsskader eller død af embryonet. Således er det meget vigtigt at holde intensiteten af laseren så lav som muligt for at undgå foto blegning og toksicitet. En stærkt ekspmere transgene kan lette observation ved hjælp af en laser med lav intensitet. Da GFP-udtryk er stærkere i TG (coro1a: egfp) end TG (Mpeg1: egfp), brugte vi TG (coro1a: Egfp; lyz: DsRed2) i stedet for TG (MPEG1: egfp; lyz: DsRed2) i dette studie. Opsætning af en mobil arbejdsstation til mikroinjektion tæt på confokal maskinen er bedst til at observere hurtige svar. Chilling den lave smeltende agopstået på isen for at fremskynde størkningstiden kan også medvirke til at reducere tiden mellem injektion og levende billeddannelse.
I denne protokol fokuserer vi på at observere makrofag adfærd. Men, den detaljerede undersøgelse af neutrofilopførsel under mycobakteriel infektion kan også være informativ. For eksempel, hvordan neutrofile ekstracellulære fælder (NETs) er involveret i at dræbe ekstracellulære mycobacterium tuberculosis forbliver stort set udefineret. Kombinationen af billedbehandlings teknikken beskrevet i denne protokol med en Histon-protein mærkning transgen vil i høj grad lette visualisering af net in vivo.
I øjeblikket er Zebra anerkendt som et meget robust system til at studere medfødte immuncelle adfærd. Statistiske data om fagocytose og celledød kan opnås ved hjælp af denne protokol. Kombineret med de kraftfulde genredigerings værktøjer, der er tilgængelige i dag, kan denne protokol udgøre en effektiv platform for yderligere forståelse af effekten af en række faktorer på vært-patogen interaktion in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. zilong Wen for at dele Zebra stammer, Dr. Stefan oehlers og Dr. David Tobin for at dele M. Marinum relaterede ressourcer, yuepeng han for assistance i figur forberedelse. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81801977) (B.Y.), det udestående ungdoms uddannelses program af Shanghai Municipal Health Commission (2018YQ54) (B.Y.), Shanghai Sailing program (18YF1420400) (B.Y.), og åben fond af Shanghai Key Laboratory of tuberkulose (2018KF02) (B.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Tween-80 | Sigma | P1379 | |
| 10 mL syringe | Solarbio | YA0552 | |
| 10% OADC | BD | 211886 | |
| 3-aminobenzoic acid | Sigma | E10521 | |
| 5 μm filter | Mille X | SLSV025LS | |
| 50 μl/ml hygromycin | Sangon Biotech | A600230 | |
| 7H10 | BD | 262710 | |
| 7H9 | BD | 262310 | |
| A glass bottom 35 mm dish | In Vitro Scientific | D35-10-0-N | |
| Agarose | Sangon Biotech | A60015 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Enviromental Chamber | Pecon | temp control 37-2 digital | |
| Eppendorf microloader | Eppendorf | No.5242956003 | |
| Glass microscope slide | Bioland Scientific LLC | 7105P | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854 | |
| Incubator | Keelrein | PH-140(A) | |
| M.marinum | ATCC BAA-535 | ||
| Microinjection needle | World Precision Instruments | IB100F-4 | |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulator | NARISHIGE | MN-151 | |
| msp12:cerulean | Ref.: PMID 25470057; 27760340 | ||
| Phenol red | Sigma | P3532 | |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Single concavity glass microscope slide | Sail Brand | 7103 | |
| Sonicator | SCICNTZ | JY92-IIDN | |
| Spectrophotometer (OD600) | Eppendorf AG | 22331 Hamburg | |
| Stereo Microscope | OLYMPUS | SZX10 | |
| Tg(mfap4:eGFP) | Ref.: PMID 30742890 | ||
| Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) | Ref.: PMID 31278008 | ||
| Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) | Ref.: PMID 27424497; 17477879 |
References
- Behar, S. M., Divangahi, M., Remold, H. G. Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 668-674 (2010).
- Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Manipulation of host cell death pathways during microbial infections. Cell Host Microbe. 8 (1), 44-54 (2010).
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Scott, A. P., Waterhouse, N. J. Quantitation of Apoptosis and Necrosis by Annexin V Binding, Propidium Iodide Uptake, and Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (11), (2016).
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Waterhouse, N. J. Detection of DNA Fragmentation in Apoptotic Cells by TUNEL. Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (10), (2016).
- Chan, L. L., McCulley, K. J., Kessel, S. L. Assessment of Cell Viability with Single-, Dual-, and Multi-Staining Methods Using Image Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1601, 27-41 (2017).
- Rathkey, J. K., et al. Live-cell visualization of gasdermin D-driven pyroptotic cell death. Journal of Biological Chemistry. 292 (35), 14649-14658 (2017).
- Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 633-642 (2013).
- Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 523-537 (2015).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current Opinion Microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
- Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).
- Clay, H., et al. Dichotomous role of the macrophage in early Mycobacterium marinum infection of the zebrafish. Cell Host Microbe. 2 (1), 29-39 (2007).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Maglione, P. J., Xu, J., Chan, J. B. cells moderate inflammatory progression and enhance bacterial containment upon pulmonary challenge with Mycobacterium tuberculosis. Journal of Immunology. 178 (11), 7222-7234 (2007).
- Wang, Z., et al. Neutrophil plays critical role during Edwardsiella piscicida immersion infection in zebrafish larvae. Fish Shellfish Immunology. 87, 565-572 (2019).
- Wang, T., et al. Nlrc3-like is required for microglia maintenance in zebrafish. Journal of Genetics and Genomics. 46 (6), 291-299 (2019).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Xu, J., Wang, T., Wu, Y., Jin, W., Wen, Z. Microglia Colonization of Developing Zebrafish Midbrain Is Promoted by Apoptotic Neuron and Lysophosphatidylcholine. Developmental Cell. 38 (2), 214-222 (2016).
- Oehlers, S. H., et al. Interception of host angiogenic signalling limits mycobacterial growth. Nature. 517 (7536), 612-615 (2015).
- Kulms, D., Schwarz, T. Molecular mechanisms of UV-induced apoptosis. Photodermatology, Photoimmunology and Photomedicine. 16 (5), 195-201 (2000).
- van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. Live imaging of apoptotic cells in zebrafish. FASEB Journal. 24 (11), 4336-4342 (2010).
- Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. Plasma membrane changes during programmed cell deaths. Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).
- Lu, Z., Zhang, C., Zhai, Z. Nucleoplasmin regulates chromatin condensation during apoptosis. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (8), 2778-2783 (2005).
- Ashida, H., et al. Cell death and infection: a double-edged sword for host and pathogen survival. Journal of Cell Biology. 195 (6), 931-942 (2011).
- Traven, A., Naderer, T. Microbial egress: a hitchhiker's guide to freedom. PLoS Pathogens. 10 (7), 1004201 (2014).
