Summary
Dit protocol beschrijft een techniek voor het visualiseren van macrofaag gedrag en overlijden in embryonale zebravis tijdens infectie met Mycobacterium de . Stappen voor de bereiding van bacteriën, infectie van de embryo's, en intravital microscopie zijn opgenomen. Deze techniek kan worden toegepast op de observatie van cellulaire gedrag en overlijden in soortgelijke scenario's met betrekking tot infectie of steriele ontsteking.
Abstract
Zebravis is een uitstekend modelorganisme voor het bestuderen van aangeboren immuun Celgedrag als gevolg van de transparante aard en het vertrouwen uitsluitend op zijn aangeboren immuunsysteem tijdens de vroege ontwikkeling. De zebravis Mycobacterium de (M. de) infectie model is goed opgericht in het bestuderen van gastheer immuunrespons tegen mycobacteriële infectie. Er is gesuggereerd dat verschillende macrofaag celdood types zal leiden tot de diverse uitkomsten van mycobacteriële infectie. Hier beschrijven we een protocol met behulp van intravital microscopie te observeren macrofaag celdood in zebravis embryo's na M. de infectie. Zebravis transgene lijnen die specifiek labelen macrofagen en neutrofielen zijn geïnfecteerd via intramusculaire micro injectie van fluorescently gelabelde M. de in ofwel de veroorzaakt of de romp. Besmette zebravis embryo's worden vervolgens op laag smelt agarose gemonteerd en waargenomen door confocale microscopie in X-Y-Z-T afmetingen. Omdat langdurig Live beeldvorming een laag Laser vermogen vereist om fotobleaching en fototoxiciteit te voorkomen, wordt een sterk uitgesproken transgene aanbevolen. Dit protocol vergemakkelijkt de visualisatie van de dynamische processen in vivo, met inbegrip van immuuncelmigratie, gastheer pathogeen interactie, en celdood.
Introduction
Mycobacteriële infectie is aangetoond dat gastheer immuuncel overlijden1. Bijvoorbeeld, een verzwakte stam zal leiden tot apoptosis in macrofagen en de infectie bevatten. Een virulente stam zal echter leiden tot lytische celdood, waardoorbacteriële verspreiding1,2. Gezien de impact van deze verschillende soorten celdood op host anti-mycobacteriële respons, is een gedetailleerde observatie van macrofaag celdood tijdens mycobacteriële infectie in vivo nodig.
De conventionele methoden voor het meten van celdood zijn het gebruik van dode celvlekken, zoals annnexin V, Tunel of acridine Orange/propidium jodide kleuring3,4,5. Deze methoden kunnen echter geen licht werpen op het dynamische proces van celdood in vivo. De waarneming van celdood in vitro is al vergemakkelijkt door Live Imaging6. Echter, of de resultaten nauwkeurig nabootsen van fysiologische omstandigheden blijft onduidelijk.
Zebrafish zijn een uitstekend model voor het bestuderen van host anti-Mycobacterium reacties. Het heeft een sterk bewaard immuunsysteem vergelijkbaar met dat van mensen, een gemakkelijk gemanipuleerd genoom, en de vroege embryo's zijn transparant, waardoor Live beeldvorming7,8,9mogelijk wordt. Na infectie met M. marinum vormen volwassen zebravis typische rijpe granuloom structuren, en embryonale zebravis vorm vroeg granuloom zoals structuren9,10. Het dynamische proces van aangeboren immuuncelbacteriën interactie is eerder onderzocht in de zebravis M. de infectie model11,12. Echter, als gevolg van hoge ruimtelijke-temporele resolutie eis, de details rond de dood van de aangeboren immuuncellen blijven grotendeels ongedefinieerd.
Hier beschrijven we hoe het proces van macrofaag lytische celdood, veroorzaakt door mycobacteriële infectie in vivo, te visualiseren. Dit protocol kan ook worden toegepast voor het visualiseren van cellulaire gedrag in vivo tijdens de ontwikkeling en ontsteking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zebravis werd onder standaardomstandigheden opgevoed in overeenstemming met de richtlijnen van het laboratorium dier voor ethische toetsing van dierenwelzijn (GB/T 35823-2018). Alle zebravis experimenten in deze studie werden goedgekeurd (2019-A016-01) en uitgevoerd bij Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University.
1. M. de -inoculum-voorbereiding met één cel (Figuur 1)
- Ontdooien Cerulean-fluorescerende M. de glycerol voorraad van-80 °c en inoculeren een 7h10 agar plaat met 10% (v/v) oadc, 0,25% glycerol en 50 μg/ml hygromycine. Incuberen de plaat bij 32 °C gedurende ongeveer 10 dagen.
- Selecteer een kolonie die positieve fluorescentie uitdrukt en inoculeren 3 mL 7H9 medium met 10% OADC, 0,5% glycerol, en 50 μg/mL hygromycine.
- Incuberen de inoculatie bij 32 °C en 100 omwentelingen per minuut (rpm) gedurende 4 – 6 dagen totdat de cultuur logaritmische fase bereikt (OD600 = 0,6 – 1,0).
- Subcultuur (1:100) in 30 mL vers 7H9 medium met 10% OADC, 0,5% glycerol, 0,05% Tween-80, en 50 μg/mL tot de OD600 bereikt ~ 1,0.
Opmerking: voor de hoogste cultuur kwaliteit wordt op dit moment een subcultuurstap aanbevolen. In onze ervaring, het toevoegen van de kloon rechtstreeks aan een grote hoeveelheid medium zal leiden tot de vorming van bacteriële klonters.
- Verzamel M. de cellen zoals hieronder beschreven.
- Centrifugeer bij 3.000 x g gedurende 10 minuten om de M. de als pellet te verzamelen. Gooi alle maar 300 μL van het supernatant weg en gebruik het om de pellet opnieuw op te schorten.
- Voeg 3 mL 7H9 medium met 10% glycerol toe om de pellet verder te hervatten en soniceren de suspensie in een waterbad van 100 W bij 15 s aan, 15 s uit voor een totaal van 2 min.
Let op: het doel van sonicatie is het bereiken van een eencellige homogenaat voor het entmateriaal, waardoor verstopping van de micro injectienaald wordt voorkomen.
- Breng de bacteriële suspensie over in een spuit van 10 mL en door een filter van 5 μm om eventuele bacteriële klonters te verwijderen.
- Meet de optische dichtheid (OD) van de suspensie met behulp van een spectrofotometer en Verdun deze tot OD600 = 1,0 met 7H9 media die 10% glycerol bevatten. Verdeel de suspensie in 10 μL aliquots en bewaar bij-80 °C vriezer voor toekomstig gebruik.
- Bevestig de bacteriële concentratie van het entmateriaal (CFU/mL) door middel van seriële verdunning en beplating van de bacteriële kolf op een 7H10 agar-plaat met 10% (v/v) OADC, 0,5% van glycerol en 50 μg/mL hygromycine.
2. embryo voorbereiding van zebravis
- Een dag voor de paai, opzetten zebravis fokken paren in de kweekkamer.
Opmerking: Voeg slechts één paar toe aan elke kweekkamer. - Verzamel embryo's de volgende ochtend binnen 1 uur na de bevruchting (HPF). Was de embryo's zorgvuldig met gedistilleerd water en breng tot 100 embryo's over in een Petri schaaltje van 100 mm met 30 mL E3 medium. Incuberen bij 28,5 °C.
- Na 12 uur observeren onder een microscoop en niet-bevruchte of beschadigde eieren weggooien.
- Bij 24 HPF, verander het medium naar verse E3 medium met N-fenylthiourea (PTU, 0,2 nM uiteindelijke concentratie) om de ontwikkeling van pigment te voorkomen. Inbroed de embryo's op 28,5 °C, totdat de embryo's klaar zijn voor Microinjection.
3. infectie via bacteriële micro injectie
- Bereid borosilicaatglas microcapillaire injectienaalden zoals eerder beschreven in referentie13.
- Zebravis embryo's montage voor infectie
- Magnetron 100 mL 1% (w/v) en 100 mL 0,5% (w/v) laag smelt agarose in een geautoclaveerd E3 medium totdat de agarose volledig gesmolten is. Verdeel in 1 mL aliquot tubes en bewaar bij 4 °C voor toekomstig gebruik.
- Verwarm de agarose voor gebruik in een verwarmingsblok van 95 °C totdat deze volledig is gesmolten. Houd de agarose in vloeibare vorm door deze in een verwarmingsblok van 45 °C te plaatsen (Figuur 2).
- Bevestiging voor intramusculaire infectie in het kofferbak gebied
- Maak de onderste agarose laag door het gieten van 0,5 mL van 1% (w/v) agarose gelijkmatig op een glazen glijbaan. Plaats op een ijsbak of een koud oppervlak gedurende 3 minuten om te stollen.
- Anesthetiseer de zebravis embryo's (48 – 72 HPF) in eiwater met tricaïne (200 μg/mL) en PTU gedurende 5 minuten voorafgaand aan de montage. Plaats tot 60 zebravis embryo's op de onderste agarose laag en leg ze voorzichtig in twee rijen (Figuur 2B).
- Verwijder eventueel resterend water op de onderste agarose-laag met tissuepapier voordat u 0,3 mL 0,5% (w/v) agarose toevoegt om de bovenste laag te maken. Zorg ervoor dat de embryo's volledig in de agarose zijn ingebed. Keer de glazen schuif terug naar de ijsbak om de agarose te stollen en uitdroging te voorkomen.
- Houd de bovenste laag van agarose vochtig door het oppervlak te bedekken met extra E3 Eier water.
- Montage voor veroorzaakt infectie
- Bedek de groef van een enkele concaaf glas microscopie dia met 1% (w/v) agarose, en breng vervolgens de 4 – 6 tricaïne-anesthetized embryo's in de agarose.
- Plaats het hoofd van elk embryo voorzichtig omhoog met een 10 G naald (Figuur 2C).
- Als alle embryo's zijn gefixeerd, breng de glazen schuif dan over naar een ijsbak of een koud oppervlak om de agarose te laten stollen.
Opmerking: Vermijd verdunning van laag smelt agarose door het volume van de overdracht van het eiwater met de embryo's te minimaliseren.
- Bacteriën voorbereiding op infectie
- Voeg 1 μL steriel gefilterd fenolrood (10x) toe aan een hoeveelheid bacterie bestand van 10 μL (in stap 1) en meng door grondig kort.
NB: de uiteindelijke concentratie kan worden aangepast met behulp van steriele PBS. - Sonicate de bereiding met behulp van 100 W bij 10 s aan, 10 s uit voor 1 minuut om eventuele klonters die14hebben gevormd, op te splitsen.
- Voeg 1 μL steriel gefilterd fenolrood (10x) toe aan een hoeveelheid bacterie bestand van 10 μL (in stap 1) en meng door grondig kort.
- Infectie via micro Injection
- Stel de micro injector en micro manipulator in op de juiste positie en instelling voor micro injectie zoals eerder gerapporteerd13.
- Breng 3 μL van de bacteriële bereiding met behulp van een micro lader in de voorbereide naald (zie stap 3,1). Pipetteer langzaam en zorgvuldig om te voorkomen dat er luchtbellen worden gevormd.
- Voor de infectie van de romp regio injecteert u 100 CFU in de kofferbak (Figuur 3A). Vermijd het injecteren van bacteriën in de notochord.
Opmerking: de CFU voor injectie wordt geschat door de formule CFU = bacteriële voorraad concentratie x verdunningsfactor x injectie druppel volume. De werkelijke kve wordt bevestigd door een druppel bacterieel entmateriaal op een 7H10 agar-plaat met 10% (v/v) OADC, 0,5% van glycerol en 50 μg/mL hygromycine te beplating. - Injecteer voor de midhersen infectie ongeveer 500 CFU in de midhersen regio (Figuur 3B).
- Spoel de zebravis embryo's na micro injectie voorzichtig om in vers Eier water met een plastic pipet.
Opmerking: Monteer embryo's in de glazen bodem schotel zo snel mogelijk om de waarneming van de zeer vroege aangeboren immuuncelrespons te bedekken.
4. live beeldvorming van de infectie
- Vis montage voor Live beeldvorming
- Overdracht tot 10 tricaïne-anesthetized embryo's in het midden van een glazen bodem 35 mm schotel. Gooi extra E3 medium weg.
- Bedek de schaal met 1% laag smeltpunt agarose en oriënteer de zebravis embryo's voorzichtig met een 10 G naald. Inbroed de glazen bodem schotel op ijs voor 10 sec. om de agarose te stollen.
Opmerking: bij injectie in de middenhersenen moeten de embryo's in de agarose worden gemonteerd met het hoofd naar boven gericht (Figuur 4A). Voor de intramusculaire infectie van het kofferbak gebied moeten de embryo's lateraal in de agarose worden gemonteerd (Figuur 4B). - Als het eenmaal volledig is verstevigd, bedek de agarose met een laagje Eier water (plus 1 x tricaïne en PTU).
- Driekleurige hoge-resolutie time lapse confocale microscopie
Opmerking: de volgende stappen worden uitgevoerd op een confocale microscopie uitgerust met een 63.0 x 1,40 olie UV objectief objectief.- Stel de temperatuur van de milieu kamer in op 28,5 °C. Plaats wat nat tissuepapier in de kamer om vochtigheid te leveren en verdamping van het Eier water te voorkomen (aanvullend figuur 1).
- Leg de glazen bodem schotel van 35 mm met de zebravis in de milieu kamer.
- Open de confocale software en Initialiseer het podium. Schakel over naar de 63,0 x 1,40 Oil UV-doelstelling en lokaliseer de zebravis met behulp van het heldere veld kanaal met een differentieel interferentie contrast (DIC) filter.
- Open de 405 diode, argon (20% vermogen) en DPSS 561 nm laser. Stel de juiste Laser voeding en spectrum instellingen in.
Opmerking: de volgende zijn de spectrum instellingen voor Cerulean (excitatie = 405 nm; emissie = ~ 456 – 499 nm), eGFP (excitatie = 488 nm; emissie = ~ 500 – 550 nm), DsRed2 (excitatie = 561 nm; emissie = ~ 575 – 645 nm) (aanvullende figuur 2b). - Kies de "xyz" "sequentiële scan" acquisitie modus en stel het formaat van de afbeeldingen in op "512 x 512 pixels" (aanvullend Figuur 2a).
- Schakel over naar "Live-Gegevensmodus". Richt de positie van de eerste zebravis in en markeer de Z-positie "begin" en "End". Herhaal dit proces voor elk van de overgebleven embryo's. Een "pauze" kan worden toegevoegd aan het einde van het programma (aanvullende figuur 2c).
- Definieer de lus en de cyclus van het programma.
- Sla het bestand op.
5. UV-bestraling van één cel om apoptosis en live Imaging te induceren
- Monteer de vis zoals beschreven in stap 4,1.
- Imaging de veroorzaakt regio van 3 dagen na de bevruchting (DPF) macrofaag specifieke transgene TG (mfap4-EGFP) embryo15
- Selecteer de regio van belang van een enkele fluorescently gelabeld macrofaag en scan op 400 Hz snelheid en 6% UV-laser vermogen voor 50 s.
Opmerking: scansnelheid en-tijd moeten worden geoptimaliseerd op basis van de afzonderlijke Microscoop. Scantijd moet worden geoptimaliseerd om de uitgebreide DNA-schade die vervolgens zal leiden tot doelcel apoptosis veroorzaken, maar niet fotobleek middel de hele cel. - Herhaal de bovenstaande stap om meer doelcellen te bestreren.
- Voer timelapse-beeldvorming uit van de veroorzaakt regio zoals beschreven in rubriek 4.
6. beeldverwerking
- Voer "maximale projectie" uit voor de verkregen beelden.
- Zoek en markeer de XY-positie en-tijd van de doelcellen onder de "maximale projectie"-weergave.
- Ga terug naar de standaardweergave om de Z-positie van de doelcellen te vinden en te markeren.
- Snijd de enkellaags afbeelding van de doelcellen bij.
- Exporteer het overlay-kanaal en het heldere veld als Video's in AVI-indeling.
- Snijd het interessegebied van het overlay-kanaal en het heldere veld in ImageJ bij.
- Combineer de twee Video's in de laatste stap verticaal en sla op als één AVI-formaat video in ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mycobacterium infectie kan leiden tot verschillende gastheer reacties op basis van de routes van de infectie. In dit protocol worden zebravis-embryo's geïnfecteerd door intramusculaire micro injectie van fluorescently gelabelde bacteriën in de midhersenen of romp (Figuur 3) en waargenomen door confocale Live beeldvorming. Infectie via deze twee routes zal lokaal de infectie waardoor aangeboren immuuncelwerving en daaropvolgende celdood beperken.
Het visualiseren van de details van aangeboren immuunceldood is uitdagend. Lytische celdood komt voor in een zeer kort tijdvenster en vereist een microscopie met een hoge resolutie om te observeren. Ook kunnen de hoge beweeglijkheid van aangeboren immuuncellen hen migreren uit het observatie gebied. In dit protocol lossen we dit probleem op door meerdere embryo's parallel te observeren. Een array van zebravis embryo's kan worden gemonteerd op een enkele glazen Microscoop-dia voor infectie, en tot 10 embryo's kunnen worden gemonteerd op dezelfde 35 mm glazen bodem schotel voor Live beeldvorming (Figuur 4). Door gebruik te maken van een live data model van confocale microscopie kan meer dan één embryo gelijktijdig worden waargenomen. Dit verhoogt de efficiëntie van de Live beeldvorming en verhoogt de kans op het vastleggen van het gehele lytische Cell Death proces aanzienlijk.
Het aangeboren immuunsysteem is de eerste verdedigingslinie tegen mycobacteriële infectie en twee belangrijke componenten zijn de macrofaag en het neutrofielen. Hier gebruiken we eerder gerapporteerde TG (coro1a: EGFP; lyzDsRed2) en TG (MPEG1: loxp-dsredx-loxp-EGFP; lyz: EGFP) om de macrofagen en de neutrofielen in vivo16,17,18te onderscheiden. Een macrofaag zwaar met bacteriën werd rond en weergegeven verminderde beweeglijkheid, met uiteindelijke cytoplasma zwelling, scheuren van de celmembraan, en snelle verspreiding van het cytoplasmische inhoud. Deze bijwerkingen zijn typische morfologische veranderingen van lytische celdood zoals eerder gerapporteerd (figuur 5a)16. UV-bestraling is gebruikt om cellen te triggeren om apoptosis te ondergaan in zebravis20,21. In overeenstemming met deze notie toonden UV-bestraalde macrofagen typische apoptotische celfenotypes, zoals celkrimp, nucleaire fragmentatie en chromatine condensatie (Figuur 5b)22,23. In combinatie met het gebruik van Cerulean-fluorescerende M. de19werd in vivo drie kleuren Live beeldvorming van de interactie tussen macrofaag, neutrofielen en M. de bereikt. We hebben ook geconstateerd dat macrofagen actief fagocytose kunnen en M. de verspreiden (aanvullend Figuur 3a). Echter, neutrofielen had beperkte fagocytische vermogen en snel onderging lytische celdood zonder duidelijke bacteriële stuwing (aanvullende Figuur 3b). Neutrofielen kunnen worden veroorzaakt door de fagocytose van slechts een paar dode M. de die niet Cerulean-fluorescentie uitdrukken, of gewoon door fagocytose van beperkte dode cellen puin.
Figuur 1: Schematisch diagram van de voorbereiding van één cel bacteriën. Eencellige Cerulean-fluorescerende M. de voorraden werden gegenereerd na het beschreven proces. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: diagram van zebravis embryo montage voor micro injectie. (A) schematisch diagram van het montage proces. B) zebravis-embryo's zijn lateraal voor infectie van de kofferbak streek gemonteerd. C) zebravis-embryo's werden met hun hoofd naar boven gericht voor infectie van het middenbrein. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: positionering voor micro injectie. (A) de rode pijl geeft de injectieplaats aan voor infectie van het kofferbak gebied. B) de rode pijl geeft de injectieplaats aan voor infectie van de midhersenen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: het monteren van zebravis embryo's voor Live beeldvorming. A) voor midhersen infectie werden zebravis-embryo's met hun hoofd naar beneden gemonteerd. B) voor de infectie van de kofferbak streek werden zebravis-embryo's lateraal met de injectieplaats in de buurt van de bodem van de schotel met glazen bodem gemonteerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: typische morfologische veranderingen in M. de infectie veroorzaakte macrofaag lytische celdood en UV-geïnduceerde macrofaag apoptosis. A)timelapse-beeldvorming van een macrofaag (Mac) die een lytische celdood ondergaat zodra het zwaar is overstroomd met M. de. Het middenbrein van de 3 DPF TG (coro1a: EGFP; lyzDsRed2) zebravis embryo is geïnfecteerd door Cerulean-fluorescerende M. de (~ 500 CFU) via micro Injection. Afbeeldingen voor zowel het overlay-kanaal (bovenste paneel) als het DIC-kanaal (onderste paneel) worden meegeleverd. T 00:00 is 5 h 20 min. na infectie. Witte streepjeslijnen = omtrek van de celmembraan; zwarte onderbroken lijnen = zwelling cytoplasma; zwarte pijlen = gescheurde celmembraan; rode onderbroken lijnen = snel verloren cytoplasmatische inhoud. B) timelapse-beeldvorming van door UV bestraalde macrofaag. Een GFP +-cel in de veroorzaakt regio van 3 DPF TG (mfap4: EGFP) wordt bestraald door UV en gevolgd door timelapse-beeldvorming. Witte streepjeslijnen = omtrek van de celmembraan; zwarte pijlen = nucleaire fragmentatie en chromatine condensatie. Schaalbalk = 15 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 1: milieu kamer opgezet voor Live beeldvorming. A) Stel de digitale controller zo in dat de temperatuur bij 28,5 °c blijft. B) natte doekjes in de kamer instellen om vochtigheid te leveren en de verdamping van eiwater te voorkomen. (C) Sluit de afdekking van de kamer en wacht ten minste 30 minuten voor temperatuur stabilisatie voordat u begint met Live beeldvorming. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 2: confocale paneel instelling voor Live Imaging. A) weergave van de instelling van het acquisitie panel. B) weergave van de laser-en spectrum instellingen. (C) weergave van meerdere taken en lusinstelling in Live-Gegevensmodus. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 3: macrofagen die infectie en neutrofielen verspreiden ondergaan lytische celdood na M. de infectie. A) macrofaag die m. de verspreidt in de stam van een 2 DPF TG (coro1a: EGFP; lyz: DsRed2) zebravis embryo geïnfecteerd door Cerulean-fluorescerende M. de (~ 100 CFU). B) neutrofielen (Neu) die een lytische celdood ondergaan zonder duidelijk m. de laden in de kofferbak van 3 DPF TG (MPEG1: lrlg; lyz: EGFP) zebravis embryo geïnfecteerd door Cerulean-fluorescerende m. de (~ 100 CFU) via micro Injection. Groene kleur is toegewezen aan LRLG en rode kleur is toegewezen aan eGFP voor een betere visualisatie van de lytische cel dood proces. Pijlen in cyaan geven doelcellen aan. Pijlen in het rood wijzen op de cellen die op het punt staan om cytoplasma-inhoud in het volgende frame vrij te geven. Pijlen in het groen verwijzen naar de dode cellen die net hun cytoplasma-inhoud hebben verloren. Schaalbalk = 25 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Video 1: een macrofaag zwaar beladen met M. de ondergaat lytische celdood, gerelateerd aan figuur 5a. Time-lapse Imaging (63x objectief) voor 9 min en 18 s bij 3 frames per seconde (fps) van de veroorzaakt regio van een 3 DPF TG (coro1a: EGFP; lyzDsRed2) zebravis embryo geïnfecteerd met Cerulean-fluorescerende M. de. Klik hier om deze video te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Video 2: een macrofaag ondergaat apoptosis na UV-bestraling, gerelateerd aan Figuur 5b. Time-lapse Imaging (63x objectief) van 74 min bij 6 fps van de veroorzaakt regio van een 3 DPF TG (mfap4: EGFP) zebravis embryo. Een GFP +-cel in het middenhersen gebied van de embryo's wordt bestraald door UV en gevolgd door timelapse-beeldvorming. Klik hier om deze video te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Video 3: een macrofaag verspreidt M. de, gerelateerd aan aanvullende Figuur 3a. Time-lapse Imaging (63x objectief) van 24 min bij 3 fps van de kofferbak regio van 2 DPF TG (coro1a: EGFP; lyz: DsRed2) zebravis embryo geïnfecteerd met Cerulean-fluorescerende M. de. Klik hier om deze video te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Video 4: een neutrofiele ondergaat lytische celdood zonder duidelijke M. de engorgement, gerelateerd aan aanvullende Figuur 3b. Time-lapse Imaging (63x objectief) van 7 min 30 s bij 3 fps van de romp regio van 3 DPF TG (MPEG1: lrlg; lyz: EGFP) zebravis embryo geïnfecteerd met Cerulean-fluorescerende M. de. Klik hier om deze video te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft de visualisatie van macrofaag sterfte tijdens mycobacteriële infectie. Op basis van factoren zoals de integriteit van het celmembraan, kan infectie gedreven celdood worden onderverdeeld in apoptosis en lytische celdood24,25. Lytic Cell Death is meer stressvol voor het organisme dan apoptosis, omdat het een sterke ontstekingsreactie veroorzaakt, 24,25. Observatie van lytische celdood in vivo is moeilijk, als gevolg van de eis van hoge ruimtelijke-temporele resolutie, goede confocale microscopie instellingen, en sterke transgene expressie.
Voor een goede micro injectie zijn verschillende kritieke stappen vereist. De bacterie kolf moet grondig worden gesoniceerd om alle klonters vóór de injectie te verwijderen. We verbeterden de zebravis montage voor micro injectie door ze in te sluiten op een glazen glijbaan tussen twee lagen laag smelt agarose. Na het aanbrengen van de tweede laag agarose, wordt de glijbaan overgebracht naar een ijsbak of een koud oppervlak om stollen te versnellen en uitdroging van de agarose te voorkomen. Als de embryo's op verschillende glijbanen gemonteerd moeten worden, zorg er dan voor dat de bovenste laag van agarose vochtig blijft door extra Eier water toe te voegen.
Voor Live Imaging is een objectief objectief met een hoge resolutie nodig om de details van de celdood te observeren. Deze eis gaat altijd gepaard met korte werkafstand, en dus vereist positionering van de infectie site dicht bij de cover Slide. Een lange werkafstand water lens is ideaal voor het beeldvorming van het diepere weefsel en zorgt voor meer ruimte voor een goede embryo montage. Verlengde Live beeldvorming met behulp van een laser met hoge intensiteit zal weefselbeschadiging of de dood van het embryo veroorzaken. Het is dus erg belangrijk om de intensiteit van de laser zo laag mogelijk te houden om fotobleaching en toxiciteit te voorkomen. Een sterk uitdrukken transgene kan de observatie met behulp van een laser met lage intensiteit te vergemakkelijken. Omdat GFP expressie sterker is in TG (coro1a: eGFP) dan TG (MPEG1: EGFP), gebruikten we TG (coro1a: EGFP; lyz: DsRed2) in plaats van TG (MPEG1: EGFP; lyz: DsRed2) in deze studie. Het instellen van een mobiel werkstation voor Microinjection dicht bij de confocale machine is het beste voor het observeren van snelle reacties. Koelen van de lage smelt agarose op ijs te versnellen stollen tijd kan ook helpen verkorten tijd tussen injectie en live beeldvorming.
In dit protocol richten we ons op het observeren van macrofaag gedrag. Echter, de gedetailleerde studie van neutrofielen gedrag tijdens mycobacteriële infectie kan ook informatief zijn. Bijvoorbeeld, hoe neutrofiele extracellulaire vallen (netten) zijn betrokken bij het doden van extracellulaire Mycobacterium blijft grotendeels ongedefinieerd. Het combineren van de beeldvormings techniek die in dit protocol wordt beschreven met een Histon-eiwit labeling transgene zal de visualisatie van netten in vivo aanzienlijk vergemakkelijken.
Momenteel, zebravis worden erkend als een zeer robuust systeem voor het bestuderen van aangeboren immuun Celgedrag. Statistische gegevens van fagocytose en celdood kunnen worden bereikt met behulp van dit protocol. In combinatie met de krachtige genediting tools die vandaag beschikbaar zijn, kan dit protocol een effectief platform bieden om het effect van een verscheidenheid aan factoren op het gebied van host-pathogen in vivo verder te begrijpen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We bedanken Dr. zilong Wen voor het delen van zebravis stammen, Dr. Stefan oehlers en Dr. David Tobin voor het delen van M. de gerelateerde middelen, yuepeng hij voor hulp in de voorbereiding van de figuur. Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (81801977) (B.Y.), het uitstekende opleidingsprogramma voor jongeren van Shanghai Municipal Health Commission (2018YQ54) (B.Y.), Shanghai Sailing Program (18YF1420400) (B.Y.) en het open fonds van Shanghai Key Laboratory of tuberculose (2018KF02) (B.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Tween-80 | Sigma | P1379 | |
| 10 mL syringe | Solarbio | YA0552 | |
| 10% OADC | BD | 211886 | |
| 3-aminobenzoic acid | Sigma | E10521 | |
| 5 μm filter | Mille X | SLSV025LS | |
| 50 μl/ml hygromycin | Sangon Biotech | A600230 | |
| 7H10 | BD | 262710 | |
| 7H9 | BD | 262310 | |
| A glass bottom 35 mm dish | In Vitro Scientific | D35-10-0-N | |
| Agarose | Sangon Biotech | A60015 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Enviromental Chamber | Pecon | temp control 37-2 digital | |
| Eppendorf microloader | Eppendorf | No.5242956003 | |
| Glass microscope slide | Bioland Scientific LLC | 7105P | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854 | |
| Incubator | Keelrein | PH-140(A) | |
| M.marinum | ATCC BAA-535 | ||
| Microinjection needle | World Precision Instruments | IB100F-4 | |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulator | NARISHIGE | MN-151 | |
| msp12:cerulean | Ref.: PMID 25470057; 27760340 | ||
| Phenol red | Sigma | P3532 | |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Single concavity glass microscope slide | Sail Brand | 7103 | |
| Sonicator | SCICNTZ | JY92-IIDN | |
| Spectrophotometer (OD600) | Eppendorf AG | 22331 Hamburg | |
| Stereo Microscope | OLYMPUS | SZX10 | |
| Tg(mfap4:eGFP) | Ref.: PMID 30742890 | ||
| Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) | Ref.: PMID 31278008 | ||
| Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) | Ref.: PMID 27424497; 17477879 |
References
- Behar, S. M., Divangahi, M., Remold, H. G. Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 668-674 (2010).
- Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Manipulation of host cell death pathways during microbial infections. Cell Host Microbe. 8 (1), 44-54 (2010).
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Scott, A. P., Waterhouse, N. J. Quantitation of Apoptosis and Necrosis by Annexin V Binding, Propidium Iodide Uptake, and Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (11), (2016).
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Waterhouse, N. J. Detection of DNA Fragmentation in Apoptotic Cells by TUNEL. Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (10), (2016).
- Chan, L. L., McCulley, K. J., Kessel, S. L. Assessment of Cell Viability with Single-, Dual-, and Multi-Staining Methods Using Image Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1601, 27-41 (2017).
- Rathkey, J. K., et al. Live-cell visualization of gasdermin D-driven pyroptotic cell death. Journal of Biological Chemistry. 292 (35), 14649-14658 (2017).
- Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 633-642 (2013).
- Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 523-537 (2015).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current Opinion Microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
- Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).
- Clay, H., et al. Dichotomous role of the macrophage in early Mycobacterium marinum infection of the zebrafish. Cell Host Microbe. 2 (1), 29-39 (2007).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Maglione, P. J., Xu, J., Chan, J. B. cells moderate inflammatory progression and enhance bacterial containment upon pulmonary challenge with Mycobacterium tuberculosis. Journal of Immunology. 178 (11), 7222-7234 (2007).
- Wang, Z., et al. Neutrophil plays critical role during Edwardsiella piscicida immersion infection in zebrafish larvae. Fish Shellfish Immunology. 87, 565-572 (2019).
- Wang, T., et al. Nlrc3-like is required for microglia maintenance in zebrafish. Journal of Genetics and Genomics. 46 (6), 291-299 (2019).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Xu, J., Wang, T., Wu, Y., Jin, W., Wen, Z. Microglia Colonization of Developing Zebrafish Midbrain Is Promoted by Apoptotic Neuron and Lysophosphatidylcholine. Developmental Cell. 38 (2), 214-222 (2016).
- Oehlers, S. H., et al. Interception of host angiogenic signalling limits mycobacterial growth. Nature. 517 (7536), 612-615 (2015).
- Kulms, D., Schwarz, T. Molecular mechanisms of UV-induced apoptosis. Photodermatology, Photoimmunology and Photomedicine. 16 (5), 195-201 (2000).
- van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. Live imaging of apoptotic cells in zebrafish. FASEB Journal. 24 (11), 4336-4342 (2010).
- Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. Plasma membrane changes during programmed cell deaths. Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).
- Lu, Z., Zhang, C., Zhai, Z. Nucleoplasmin regulates chromatin condensation during apoptosis. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (8), 2778-2783 (2005).
- Ashida, H., et al. Cell death and infection: a double-edged sword for host and pathogen survival. Journal of Cell Biology. 195 (6), 931-942 (2011).
- Traven, A., Naderer, T. Microbial egress: a hitchhiker's guide to freedom. PLoS Pathogens. 10 (7), 1004201 (2014).
