Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zur Visualisierung des Makrophagenverhaltens und des Todes bei embryonalen Zebrafischen während einer Mycobacterium marinum-Infektion. Schritte zur Herstellung von Bakterien, Infektionder tenatierter Embryonen und intravitale Mikroskopie sind enthalten. Diese Technik kann auf die Beobachtung von Zellverhalten und Tod in ähnlichen Szenarien mit Infektion oder sterile Entzündung angewendet werden.
Abstract
Zebrafish ist ein ausgezeichneter Modellorganismus für die Untersuchung des angeborenen Immunzellverhaltens aufgrund seiner transparenten Natur und der Abhängigkeit ausschließlich von seinem angeborenen Immunsystem während der frühen Entwicklung. Das Infektionsmodell des Zebrafischs Mycobacterium marinum (M. marinum) hat sich bei der Untersuchung der Immunantwort des Wirts gegen mykobakterielle Infektionen etabliert. Es wurde vorgeschlagen, dass verschiedene Makrophagenzell-Todestypen zu den verschiedenen Ergebnissen einer mykobakteriellen Infektion führen werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit Intravital-Mikroskopie, um den Tod von Makrophagenzellen in Zebrafisch-Embryonen nach einer M. marinum-Infektion zu beobachten. Zebrafisch transgene Linien, die speziell Makrophagen und Neutrophile kennzeichnen, werden durch intramuskuläre Mikroinjektion von fluoreszierend M. marinum entweder im Mittelhirn oder im Rumpf infiziert. Infizierte Zebrafisch-Embryonen werden anschließend auf niedrigschmelzender Agarose montiert und durch konfokale Mikroskopie in X-Y-Z-T-Dimensionen beobachtet. Da langzeitige Live-Bildgebung niedrige Laserleistung erfordert, um Photobleichungen und Phototoxizität zu vermeiden, wird eine stark exsemitende transgene empfohlen. Dieses Protokoll erleichtert die Visualisierung der dynamischen Prozesse in vivo, einschließlich Immunzellmigration, Interaktion mit Wirtspathogenen und Zelltod.
Introduction
Eine mykobakterielle Infektion hat gezeigt, dass sie zum Tod von Immunzellenführt 1. Beispielsweise löst ein abgeschwächter Stamm Apoptose in Makrophagen aus und enthält die Infektion. Jedoch, ein virulenter Stamm wird lytische Zelltod auslösen, was bakterielle Verbreitung1,2. In Anbetracht der Auswirkungen dieser verschiedenen Arten von Zelltod auf die antimykobakterielle Reaktion des Wirts ist eine detaillierte Beobachtung des Todesfälles von Makrophagenzellen während einer mykobakteriellen Infektion in vivo erforderlich.
Die herkömmlichen Methoden zur Messung des Zelltodes sind die Verwendung von toten Zellflecken, wie Annnexin V, TUNEL oder Acridin orange/propidiumiodid Färbung3,4,5. Diese Methoden sind jedoch nicht in der Lage, Licht auf den dynamischen Prozess des Zelltodes in vivo zu werfen. Die Beobachtung des Zelltodes in vitro wurdebereits durch Live-Bildgebung 6 erleichtert. Ob die Ergebnisse jedoch die physiologischen Bedingungen genau imitieren, bleibt unklar.
Zebrafische waren ein ausgezeichnetes Modell für die Untersuchung von Host Anti-Mycobacterium Antworten. Es hat ein hochkonserviertes Immunsystem ähnlich dem des Menschen, ein leicht zu manipulierendes Genom, und die frühen Embryonen sind transparent, was eineliveeBildgebung 7,8,9ermöglicht. Nach einer Infektion mit M. marinum bilden erwachsene Zebrafische typische reife Granulomstrukturen, und embryonale Zebrafische bilden frühe Somaulom-ähnliche Strukturen9,10. Der dynamische Prozess der angeborenen Immunzell-Bakterien-Interaktion wurde zuvor im Zebrafisch M. marinum Infektionsmodell11,12untersucht. Aufgrund der hohen räumlich-zeitlichen Auflösung bleiben die Details rund um den Tod der angeborenen Immunzellen jedoch weitgehend undefiniert.
Hier beschreiben wir, wie der Prozess des makrophagenlytischen Zelltodes visualisiert wird, der durch eine mykobakterielle Infektion in vivo ausgelöst wird. Dieses Protokoll kann auch auf die Visualisierung zellulärer Verhalten in vivo während der Entwicklung und Entzündung angewendet werden.
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Protocol
Zebrafische wurden unter Standardbedingungen in Übereinstimmung mit Labortierrichtlinien zur ethischen Überprüfung des Tierschutzes (GB/T 35823-2018) aufgezogen. Alle Zebrafischexperimente in dieser Studie wurden genehmigt (2019-A016-01) und wurden am Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University, durchgeführt.
1. M. marinum Einzelzell-Inokulum-Vorbereitung (Abbildung 1)
- Cerulean-fluoreszierenden M. Marinumglycerinbestand aus -80 °C auftauen und eine 7H10-Agarplatte mit 10% (v/v) OADC, 0,25% Glycerin und 50 g/ml Hygromycin impfen. Inkubieren Sie die Platte bei 32 °C für etwa 10 Tage.
- Wählen Sie eine Kolonie aus, die positive Fluoreszenz ausdrückt, und impfen Sie 3 ml 7H9-Medium mit 10% OADC, 0,5% Glycerin und 50 g/ml Hygromycin.
- Inkubieren Sie die Inokulation bei 32 °C und 100 Umdrehungen pro Minute (Rpm) für 4–6 Tage, bis die Kultur die logarithmische Phase erreicht (OD600 = 0,6–1,0).
- Subkultur (1:100) in 30 ml frischem 7H9-Medium mit 10% OADC, 0,5% Glycerin, 0,05% Tween-80 und 50 g/ml bis die OD600 1,0 erreicht.
HINWEIS: Für die höchste Kulturqualität wird an dieser Stelle ein Subkulturschritt empfohlen. Nach unserer Erfahrung wird das direkte Hinzufügen des Klons zu einem großen Volumen von Medium zur Bildung von bakteriellen Klumpen führen.
- Sammeln Sie M. marinum Zellen wie unten beschrieben.
- Zentrifuge bei 3.000 x g für 10 min, um das M. marinum als Pellet zu sammeln. Entsorgen Sie alle bis auf 300 L des Überstandes und verwenden Sie es für das Wiederaufsetzen des Pellets.
- Fügen Sie 3 ml 7H9 Medium mit 10% Glycerin, um das Pellet weiter zu suspendieren, dann beschallen Sie die Suspension in einem Wasserbad bei 100 W bei 15 s ON, 15 s OFF für insgesamt 2 min.
HINWEIS: Der Zweck der Beschallung ist es, ein einzelzelliges Homogenat für das Inokulum zu erreichen, das eine Verstopfung der Mikroinjektionsnadel verhindert.
- Übertragen Sie die bakterielle Suspension auf eine 10 ml Spritze, und durchlaufen Sie dann einen 5-m-Filter, um alle bakteriellen Klumpen zu entfernen.
- Messen Sie die optische Dichte (OD) der Suspension mit einem Spektralphotometer und verdünnen Sie sie auf OD600 = 1,0 mit 7H9-Medien, die 10% Glycerin enthalten. Teilen Sie die Suspension in 10 L Aliquots auf und lagern Sie sie bei -80 °C Gefrierschrank für die zukünftige Verwendung.
- Bestätigen Sie die bakterielle Konzentration des Inokulums (cfu/mL) durch serielle Verdünnung und Beschichtung des Bakterienbestands auf einer 7H10-Agarplatte, die 10 % (v/v) OADC, 0,5 % Glycerin und 50 g/ml Hygromycin enthält.
2. Zebrafisch Embryo Vorbereitung
- Einen Tag vor dem Laichen haben Sie In der Brutkammer Zebrafischbrutpaare aufgestellt.
HINWEIS: Fügen Sie jeder Brutkammer nur ein Paar hinzu. - Sammeln Sie Embryonen am nächsten Morgen innerhalb von 1 h nach der Befruchtung (hpf). Waschen Sie die Embryonen vorsichtig mit destilliertem Wasser und übertragen Sie bis zu 100 Embryonen in eine 100 mm Petrischale mit 30 ml E3-Medium. Bei 28,5 °C inkubieren.
- Nach 12 h unter dem Mikroskop beobachten und nicht befruchtete oder beschädigte Eier entsorgen.
- Bei 24 hpf das Medium auf ein frisches E3-Medium mit N-Phenylthiourea (PTU, 0,2 nM Endkonzentration) ändern, um die Pigmententwicklung zu verhindern. Inkubieren Sie die Embryonen bei 28,5 °C, bis die Embryonen für die Mikroinjektion bereit sind.
3. Infektion über bakterielle Mikroinjektion
- Bereiten Sie Borosilikatglas Mikrokapillar-Injektionsnadeln wie zuvor in Bezug13beschrieben.
- Zebrafisch-Embryonen zur Infektion
- Mikrowelle 100 ml von 1% (w/v) und 100 ml 0,5% (w/v) niedrigschmelzende Agarose in einem autoklavierten E3-Medium, bis die Agarose vollständig geschmolzen ist. In 1 ml Aliquot-Rohre aufteilen und bei 4 °C für die zukünftige Verwendung lagern.
- Vor Gebrauch die Agarose in einem 95 °C Heizblock erhitzen, bis sie vollständig geschmolzen ist. Bewahren Sie die Agarose in flüssiger Form auf, indem Sie sie in einen 45 °C-Heizblock legen (Abbildung 2).
- Montage bei intramuskulären Infektionen im Rumpfbereich
- Erstellen Sie die untere Agaroseschicht, indem Sie 0,5 ml 1% (w/v) Agarose gleichmäßig auf eine Glasrutsche gießen. Auf eine Eisbox oder kalte Oberfläche für 3 min legen, um sich zu erstarren.
- Anästhetisieren Sie die Zebrafisch-Embryonen (48–72 hpf) in Eiwasser mit Tricain (200 g/ml) und PTU für 5 min vor der Montage. Bis zu 60 Zebrafisch-Embryonen auf die untere Agaroseschicht legen und sorgfältig in zwei Reihen legen (Abbildung 2B).
- Entfernen Sie das restliche Wasser auf der unteren Agaroseschicht mit Tissuepapier, bevor Sie 0,3 ml 0,5% (w/v) Agarose hinzufügen, um die obere Schicht zu erstellen. Stellen Sie sicher, dass die Embryonen vollständig in die Agarose eingebettet sind. Geben Sie die Glasrutsche wieder in die Eisbox zurück, um die Agarose zu erstarren und Eine Austrocknung zu verhindern.
- Halten Sie die obere Schicht von Agarose feucht, indem Sie die Oberfläche mit zusätzlichem E3-Eiwasser bedecken.
- Montage bei Mittelhirninfektion
- Bedecken Sie die Nut eines einzelnen Konkavitätsglasmikroskopieschlittens mit 1% (w/v) Agarose, und übertragen Sie dann die 4–6 Tricain-anesthetisierten Embryonen in die Agarose.
- Positionieren Sie den Kopf jedes Embryos vorsichtig mit einer 10 G Nadel nach oben (Abbildung 2C).
- Sobald alle Positionen der Embryonen fixiert sind, übertragen Sie die Glasrutsche auf eine Eisbox oder kalte Oberfläche, um die Agarose erstarren zu lassen.
HINWEIS: Vermeiden Sie die Verdünnung der niedrigschmelzenden Agarose, indem Sie das Volumen des Eiwassertransfers mit den Embryonen minimieren.
- Bakterienpräparat für Infektionen
- Fügen Sie 1 l steril-gefiltertes Phenolrot (10x) zu einem 10-L-Aliquot-Bakterienbestand (in Schritt 1) hinzu und mischen Sie sie kurz.
HINWEIS: Die Endkonzentration kann mit sterilem PBS eingestellt werden. - Sonicate die Vorbereitung mit 100 W bei 10 s ON, 10 s OFF für 1 min, um alle Klumpen zu brechen, die14gebildet haben können.
- Fügen Sie 1 l steril-gefiltertes Phenolrot (10x) zu einem 10-L-Aliquot-Bakterienbestand (in Schritt 1) hinzu und mischen Sie sie kurz.
- Infektion durch Mikroinjektion
- Stellen Sie den Mikroinjektor und den Mikromanipulator an die richtige Position und Einstellung für die Mikroinjektion ein, wie zuvor berichtet13.
- Übertragen Sie 3 l der bakteriellen Präparation mit einem Mikrolader in die vorbereitete Nadel (siehe Schritt 3.1). Pipette langsam und vorsichtig, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.
- Für die Rumpfregion Infektion, injizieren 100 cfu in den Stammbereich (Abbildung 3A). Vermeiden Sie das Injizieren von Bakterien in den Notochord.
HINWEIS: Der cfu für die Injektion wird durch die Formel cfu = bakterielle Stoffkonzentration x Verdünnungsfaktor x Injektiontröpfchenvolumen geschätzt. Die eigentliche Cfu wird bestätigt, indem ein Tropfen bakterielles Inokulum auf einer 7H10-Agarplatte plattiert wird, die 10% (v/v) OADC, 0,5% Glycerin und 50 g/ml Hygromycin enthält. - Für die Midbrain-Infektion, injizieren etwa 500 cfu in die Midbrain-Region (Abbildung 3B).
- Nach der Mikroinjektion die Zebrafisch-Embryonen vorsichtig mit einer Plastikpipette in frisches Eiwasser spülen.
HINWEIS: Montieren Sie Embryonen so schnell wie möglich in der Glasbodenschale, um die Beobachtung der sehr frühen angeborenen Immunzellantwort abzudecken.
4. Live Imaging der Infektion
- Fischbefestigung für Live-Bildgebung
- Bis zu 10 tricain-anesthetisierte Embryonen in die Mitte einer Glasunterschale 35 mm übertragen. Entsorgen Sie zusätzliches E3-Medium.
- Bedecken Sie die Schale mit 1% niedrigem Schmelzpunkt Agarose und orientieren Sie die Zebrafisch-Embryonen sorgfältig mit einer 10 G Nadel. Inkubieren Sie die Glasbodenschale auf Eis für 10 s, um die Agarose zu erstarren.
HINWEIS: Bei der Midbrain-Injektion sollten Embryonen in der Agarose mit dem nach oben gerichteten Kopf montiert werden (Abbildung 4A). Für die intramuskuläre Infektion des Rumpfes sollten Embryonen seitlich in der Agarose montiert werden (Abbildung 4B). - Sobald es vollständig verfestigt ist, bedecken Sie die Agarose mit einer Schicht Eiwasser (plus 1 x Tricain und PTU).
- Dreifarbige hochauflösende Zeitraffer-Konfokalmikroskopie
HINWEIS: Die folgenden Schritte werden auf einer konfokalen Mikroskopie mit einer 63,0x 1,40 Öl-UV-Objektivlinse betrieben.- Stellen Sie die Temperatur der Umweltkammer auf 28,5 °C ein. Legen Sie etwas nasses Gewebepapier in die Kammer, um Feuchtigkeit zu gewährleisten und die Verdunstung des Eiwassers zu verhindern (Ergänzungsabbildung 1).
- Legen Sie die 35 mm Glasbodenschale mit dem Zebrafisch in die Umweltkammer.
- Öffnen Sie die konfokale Software, und initialisieren Sie die Bühne. Wechseln Sie zum 63,0 x 1,40 Öl-UV-Objektiv und lokalisieren Sie den Zebrafisch mithilfe des hellen Feldkanals mit einem DIC-Filter (Differential Interference Contrast).
- Öffnen Sie den Laser 405 Diode, Argon (20% Leistung) und DPSS 561 nm. Richten Sie die entsprechenden Laserleistungs- und Spektrumeinstellungen ein.
ANMERKUNG: Die folgenden Spektrumeinstellungen für Cerulean (Erregung = 405 nm; Emission = 456–499 nm), eGFP (Erregung = 488 nm; Emission = 500–550 nm), DsRed2 (Erregung = 561 nm; Emission = 575–645 nm) (Ergänzende Abbildung 2B). - Wählen Sie denErfassungsmodus"XYZ" Sequential Scan " und legen Sie das Bildformat auf "512 x 512 Pixel" (Ergänzende Abbildung 2A) fest.
- Wechseln Sie zu "Live Data Mode". Richten Sie die Position des ersten Zebrafisches und markieren Sie die Position "Begin" und "End" Z. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden der verbleibenden Embryonen. EinePausekann am Ende des Programms hinzugefügt werden (Ergänzende Abbildung 2C).
- Definieren Sie die Schleife und den Zyklus des Programms.
- Speichern Sie die Datei.
5. Einzelzellige UV-Bestrahlung zur Induzieren von Apoptose und Live Imaging
- Bergfische, wie in Schritt 4.1 beschrieben.
- Bildgebung der Midbrain-Region von 3 Tagen nach der Befruchtung (dpf) makrophagenspezifischer transgener Tg(mfap4-eGFP) Embryo15
- Wählen Sie den Interessenbereich eines einzelnen fluoreszierend markierten Makrophagens und scannen Sie mit einer Geschwindigkeit von 400 Hz und einer UV-Laserleistung von 6 % für 50 s.
HINWEIS: Scangeschwindigkeit und -zeit sollten basierend auf dem einzelnen Mikroskop optimiert werden. Die Scanzeit sollte optimiert werden, um die umfangreichen DNA-Schäden zu verursachen, die anschließend eine Apoptose der Zielzelle verursachen, aber nicht die gesamte Zelle photobleichen. - Wiederholen Sie den obigen Schritt, um weitere Zielzellen zu bestrahlen.
- Führen Sie eine Zeitraffer-Bildgebung des Mittelhirnbereichs durch, wie in Abschnitt 4 beschrieben.
6. Bildverarbeitung
- Führen Sie "Maximale Projektion" für die erfassten Bilder durch.
- Suchen und markieren Sie die XY-Position und -Zeit der Zielzellen unter der Ansicht"Maximale Projektion".
- Kehren Sie zur Standardansicht zurück, um die Z-Position der Zielzellen zu suchen und zu markieren.
- Schneiden Sie das einschichtige Bild der Zielzellen zu.
- Exportieren Sie den Overlay-Kanal und das helle Feld als Videos im AVI-Format.
- Schneiden Sie den Interessenbereich des Überlagerungskanals und des hellen Feldes in ImageJ zu.
- Kombinieren Sie die beiden Videos im letzten Schritt vertikal und speichern Sie sie als ein Video im AVI-Format in ImageJ.
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Representative Results
Mycobacterium-Infektion kann verschiedene Wirtsreaktionen basierend auf den Infektionswegen auslösen. In diesem Protokoll werden Zebrafischembryonen durch intramuskuläre Mikroinjektion fluoreszierender Bakterien in das Mittelhirn oder den Rumpf infiziert (Abbildung 3) und durch konfokale Live-Bildgebung beobachtet. Eine Infektion über diese beiden Routen wird die Infektion lokal einschränken, die angeborene Immunzellrekrutierung und den anschließenden Zelltod verursacht.
Die Visualisierung der Details des angeborenen Immunzelltodes ist eine Herausforderung. Der Lytische Zelltod tritt über ein sehr kurzes Zeitfenster auf und erfordert eine hochauflösende Mikroskopie, um zu beobachten. Auch die hohe Beweglichkeit angeborener Immunzellen ermöglicht es ihnen, aus dem Beobachtungsgebiet zu wandern. In diesem Protokoll lösen wir dieses Problem, indem wir mehrere Embryonen parallel beobachten. Eine Reihe von Zebrafisch-Embryonen kann auf einem einzigen Glasmikroskop-Dia für Infektionen montiert werden, und bis zu 10 Embryonen können auf der gleichen 35 mm Glasbodenschale für live-Bildgebung montiert werden (Abbildung 4). Durch die Nutzung eines Live-Datenmodells der konfokalen Mikroskopie kann mehr als ein Embryo gleichzeitig beobachtet werden. Dies erhöht die Effizienz der Live-Bildgebung und erhöht die Wahrscheinlichkeit, den gesamten lytischen Zelltodprozess zu erfassen, erheblich.
Das angeborene Immunsystem ist die erste Verteidigungslinie gegen mykobakterielle Infektionen, und zwei Schlüsselkomponenten sind die Makrophagen und die Neutrophilen. Hier verwenden wir zuvor gemeldete Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) und Tg(mpeg1:loxP-DsRedx-loxP-eGFP;lyz:eGFP), um die Makrophagen und die Neutrophilen in vivo16,17,18zu unterscheiden. Ein Makrophagen, das stark mit Bakterien vermischt war, wurde rund und zeigte eine reduzierte Beweglichkeit, mit eventuellen zytoplasmatischen Schwellungen, Bruch der Zellmembran und schneller Verbreitung des zytoplasmatischen Gehalts. Bei diesen Ereignissen handelt es sich um typische morphologische Veränderungen des lytischen Zelltodes, wie zuvor berichtet (Abbildung 5A)16. UV-Bestrahlung wurde verwendet, um Zellen auszulösen, um Apoptose in Zebrafischen20,21zu erleiden. In Übereinstimmung mit diesem Begriff zeigten UV-bestrahlte Makrophagen typische apoptotische Zellphänotypen wie Zellschrumpfung, Kernfragmentierung und Chromatinkondensation (Abbildung 5B)22,23. In Kombination mit der Verwendung von Cerulean-fluoreszierendem M. marinum19wurde in vivo eine dreifarbige Live-Bildgebung der Interaktion zwischen Makrophagen, Neutrophilen und M. marinum erreicht. Wir beobachteten auch, dass Makrophagen aktiv phagozytose und verbreiten können M. marinum (Ergänzende Abbildung 3A). Jedoch, Neutrophile hatten begrenzte phagozytische Fähigkeit und schnell unterzog lytischen Zelltod ohne offensichtliche bakterielle Engorgement (Supplemental Figure 3B). Neutrophile könnten durch die Phagozytose von nur wenigen toten M. marinum ausgelöst werden, die nicht Cerulean-Fluoreszenz ausdrücken, oder einfach durch Phagozytose von begrenzten toten Zellresten.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Herstellung von Einzelzellbakterien. Nach dem beschriebenen Prozess wurden Einzelzell-Cerulean-fluoreszierende M. marinum-Bestände erzeugt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Diagramm der Zebrafisch-Embryomontage für die Mikroinjektion. (A) Schematische Darstellung des Montageprozesses. (B) Zebrafischembryonen wurden seitlich zur Infektion des Rumpfes montiert. (C) Zebrafisch-Embryonen wurden mit nach oben gerichteten Köpfen zur Infektion des Mittelhirns montiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Positionierung für Mikroinjektion. (A) Der rote Pfeil zeigt die Injektionsstelle für Infektionen des Stammbereichs an. (B) Der rote Pfeil zeigt die Injektionsstelle für Mittelhirninfektionen an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Montage von Zebrafischembryonen für die Live-Bildgebung. (A) Bei einer Mittelhirninfektion wurden Zebrafisch-Embryonen mit nach unten gerichtetem Kopf montiert. (B) Für die Rumpfregion Infektion wurden Zebrafisch-Embryonen seitlich mit der Injektionsstelle in der Nähe des Bodens der Glasbodenschale montiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Typische morphologische Veränderungen bei der M. marinum-Infektion induzierten makrophagenlytischen Zelltod und UV-induzierte Makrophagen-Apoptose. (A) Zeitraffer-Bildgebung eines Makrophagens (Mac), das sich einem lytischen Zelltod unterzieht, sobald es stark mit M. marinumversunken ist. Das Mittelhirn des 3 dpf Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) Zebrafischembryons wird durch Eine Mikroinjektion mit Cerulean-fluoreszierendem M. marinum (ca. 500 cfu) infiziert. Bilder sowohl für den Overlay-Kanal (oberes Panel) als auch für den DIC-Kanal (unteres Panel) werden bereitgestellt. T 00:00 ist 5 h 20 min nach der Infektion. Weiße gestrichelte Linien = Umriss der Zellmembran; schwarze gestrichelte Linien = Schwellung Zytoplasma; schwarze Pfeile = gebrochene Zellmembran; rote gestrichelte Linien = schnell verlorener zytoplasmatischer Gehalt. (B) Zeitraffer-Bildgebung der UV-bestrahlten Makrophagen. Eine GFP+-Zelle im Mittelhirnbereich von 3 dpf Tg(mfap4:eGFP) wird durch UV bestrahlt und anschließend mit Zeitraffer-Bildgebung. Weiße gestrichelte Linien = Umriss der Zellmembran; schwarze Pfeile = kernnukleare Fragmentierung und Chromatinkondensation. Skalenbalken = 15 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Umweltkammer für Live-Bildgebung eingerichtet. (A) Stellen Sie den digitalen Regler ein, um die Temperatur bei 28,5 °C zu halten. (B) Setzen Sie Feuchttücher in der Kammer, um Feuchtigkeit zu gewährleisten und die Verdunstung von Eiwasser zu verhindern. (C) Schließen Sie die Abdeckung der Kammer und warten Sie mindestens 30 min auf die Temperaturstabilisierung, bevor Sie mit der Live-Bildgebung beginnen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 2: Konfokale Panel-Einstellung für Live-Bildgebung. (A) Darstellung der Einstellung des Erfassungsbereichs. (B) Darstellung der Laserleistung und Spektrumeinstellungen. (C) Darstellung mehrerer Aufträge und Schleifeneinstellung im Live-Datenmodus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 3: Makrophagen verbreiten Infektion und Neutrophile unterziehen lytischen Zelltod nach M. marinum Infektion. (A) Makrophagen, die M. marinum im Stamm eines 2 dpf Tg(coro1a:eGFP;lyz:DsRed2) Zebrafischembryon simert, der mit Cerulean-fluoreszierendem M. marinum infiziert ist(ca. 100 cfu). (B) Neutrophil (Neu) unterziehenlytischen Zelltod ohne offensichtliche M. marinum beladen im Stammbereich von 3 dpf Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) Zebrafisch embryo infiziert durch Cerulean-fluoreszierende M. marinum (ca. 100 cfu) durch Mikroinjektion. Die grüne Farbe wird LRLG und der roten Farbe eGFP zugewiesen, um den lytischen Zelltodprozess besser zu verankern. Pfeile in Cyan zeigen Zielzellen an. Pfeile in rot zeigen auf die Zellen, die im Nächsten Frame Zytoplasma-Inhalte freisetzen. Pfeile in grün zeigen auf die abgestorbenen Zellen, die gerade ihren Zytoplasma-Gehalt verloren haben. Skalenbalken = 25 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Video 1: Ein makrophage stark mit M. marinum beladener Wird lytischer Zelltod, bezogen auf Abbildung 5A. Zeitraffer-Bildgebung (63x Objektiv) für 9 min und 18 s bei 3 Bildern pro Sekunde (fps) des Mittelhirnbereichs eines 3 dpf Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) Zebrafischembryon, der mit Cerulean-fluoreszierendem M. marinuminfiziert ist. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen (Rechtsklick zum Download).
Video 2: Ein Makrophagen erleidet Apoptose nach UV-Bestrahlung, bezogen auf Abbildung 5B. Zeitraffer-Bildgebung (63x Objektiv) von 74 min bei 6 fps der Mittelhirnregion eines 3 dpf Tg(mfap4:eGFP) Zebrafischembryons. Eine GFP+-Zelle im Mittelhirnbereich der Embryonen wird durch UV bestrahlt und anschließend mit Zeitraffer-Bildgebung. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen (Rechtsklick zum Download).
Video 3: Ein Makrophagen verbreitet M. marinum, bezogen auf die ergänzende Abbildung 3A. Zeitraffer-Bildgebung (63x Objektiv) von 24 min bei 3 fps des Stammbereichs von 2 dpf Tg(coro1a:eGFP;lyz:DsRed2) Zebrafisch-Embryo, der mit Cerulean-fluoreszierendem M. marinuminfiziert ist. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen (Rechtsklick zum Download).
Video 4: Ein Neutrophiler erleidet einen lytischen Zelltod ohne offensichtliche M. marinum engorgement, bezogen auf die ergänzende Figur 3B. Zeitraffer-Bildgebung (63x Objektiv) von 7 min 30 s bei 3 fps des Stammbereichs von 3 dpf Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) Zebrafisch-Embryo mit Cerulean-fluoreszierendem M. marinuminfiziert. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen (Rechtsklick zum Download).
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die Visualisierung des Makrophagensterbens während einer mykobakteriellen Infektion. Basierend auf Faktoren wie der Integrität der Zellmembran kann der infektionsgetriebene Zelltod in Apoptose und lytischen Zelltod24,25unterteilt werden. Lytischer Zelltod ist für den Organismus stressiger als Apoptose, weil er eine starke Entzündungsreaktion auslöst 24,25. Die Beobachtung des lytischen Zellsterbens in vivo ist aufgrund der Anforderung einer hohen räumlich-zeitlichen Auflösung, der richtigen konfokalen Mikroskopieundung und der starken transgenen Expression schwierig.
Die richtige Mikroinjektion erfordert mehrere kritische Schritte. Der Bakterienbestand muss gründlich beschallt werden, um alle Klumpen vor der Injektion zu entfernen. Wir haben die Zebrafischmontage für die Mikroinjektion verbessert, indem wir sie auf einem Glasschlitten zwischen zwei Schichten niedrigschmelzender Agarose einbetten. Nach dem Auftragen der zweiten Agaroseschicht wird der Schlitten auf eine Eisbox oder kalte Oberfläche übertragen, um die Erstarrung zu beschleunigen und eine Austrocknung der Agarose zu verhindern. Wenn die Embryonen auf verschiedenen Dias montiert werden müssen, stellen Sie sicher, dass die obere Schicht der Agarose feucht bleibt, indem Sie zusätzliches Eiwasser hinzufügen.
Für die Live-Bildgebung ist eine hochauflösende Objektivlinse erforderlich, um die Details des Zelltodes zu beobachten. Diese Anforderung wird immer von einem kurzen Arbeitsabstand begleitet und erfordert daher die Positionierung der Infektionsstelle in der Nähe des Deckschlittens. Eine Wasserlinse mit langer Arbeitsdistanz ist ideal für die Abbildung des tieferen Gewebes und bietet mehr Platz für eine ordnungsgemäße Embryomontage. Eine erweiterte Live-Bildgebung mit einem Laser mit hoher Intensität führt zu Gewebeschäden oder zum Tod des Embryos. Daher ist es sehr wichtig, die Intensität des Lasers so gering wie möglich zu halten, um Photobleichungen und Toxizität zu vermeiden. Eine stark exättige transgene kann die Beobachtung mit einem Laser mit geringer Intensität erleichtern. Da die GFP-Expression in Tg(coro1a:eGFP) stärker ist als tg(mpeg1:eGFP), haben wir in dieser Studie Tg(coro1a:eGFP;lyz:DsRed2) anstelle von Tg(mpeg1:eGFP;lyz:DsRed2) verwendet. Das Einrichten einer mobilen Workstation für die Mikroinjektion in der Nähe der Konfokalmaschine eignet sich am besten für die Beobachtung schneller Reaktionen. Das Kühlen der niedrig schmelzenden Agarose auf Eis, um die Erstarrungszeit zu beschleunigen, kann auch dazu beitragen, die Zeit zwischen Injektion und Live-Bildgebung zu reduzieren.
In diesem Protokoll konzentrieren wir uns auf die Beobachtung des Makrophagenverhaltens. Jedoch, die detaillierte Studie des neutrophilen Verhaltens während der mykobakteriellen Infektion kann auch informativ sein. Zum Beispiel, wie neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) bei der Tötung von extrazellulärem Mykobacterium beteiligt sind, bleibt weitgehend undefiniert. Die Kombination der in diesem Protokoll beschriebenen bildgebenden Technik mit einer histonenprotein-Etikettierung transgen wird die Visualisierung von NETs in vivo erheblich erleichtern.
Derzeit sind Zebrafische als ein sehr robustes System zur Untersuchung des angeborenen Immunzellverhaltens anerkannt. Mit diesem Protokoll konnten statistische Daten über Phagozytose und Zelltod erreicht werden. In Kombination mit den leistungsstarken Gen-Editing-Tools, die heute verfügbar sind, kann dieses Protokoll eine effektive Plattform bieten, um die Auswirkungen einer Vielzahl von Faktoren auf die Wirts-Pathogen-Interaktion in vivo weiter zu verstehen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Zilong Wen für die gemeinsame Nutzung von Zebrafischstämmen, Dr. Stefan Oehlers und Dr. David Tobin für die gemeinsame Nutzung der Ressourcen von M. marinum, Yuepeng He für die Unterstützung bei der Figurenvorbereitung. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81801977) (B.Y.), dem Outstanding Youth Training Program of Shanghai Municipal Health Commission (2018YQ54) (B.Y.), Shanghai Sailing Program (18YF1420400) (B.Y.) und Open Fund of Shanghai Key Laboratory of Tuberculosis (2018YQ54) (B.Y.) (B.Y.) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Tween-80 | Sigma | P1379 | |
| 10 mL syringe | Solarbio | YA0552 | |
| 10% OADC | BD | 211886 | |
| 3-aminobenzoic acid | Sigma | E10521 | |
| 5 μm filter | Mille X | SLSV025LS | |
| 50 μl/ml hygromycin | Sangon Biotech | A600230 | |
| 7H10 | BD | 262710 | |
| 7H9 | BD | 262310 | |
| A glass bottom 35 mm dish | In Vitro Scientific | D35-10-0-N | |
| Agarose | Sangon Biotech | A60015 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Enviromental Chamber | Pecon | temp control 37-2 digital | |
| Eppendorf microloader | Eppendorf | No.5242956003 | |
| Glass microscope slide | Bioland Scientific LLC | 7105P | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854 | |
| Incubator | Keelrein | PH-140(A) | |
| M.marinum | ATCC BAA-535 | ||
| Microinjection needle | World Precision Instruments | IB100F-4 | |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulator | NARISHIGE | MN-151 | |
| msp12:cerulean | Ref.: PMID 25470057; 27760340 | ||
| Phenol red | Sigma | P3532 | |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Single concavity glass microscope slide | Sail Brand | 7103 | |
| Sonicator | SCICNTZ | JY92-IIDN | |
| Spectrophotometer (OD600) | Eppendorf AG | 22331 Hamburg | |
| Stereo Microscope | OLYMPUS | SZX10 | |
| Tg(mfap4:eGFP) | Ref.: PMID 30742890 | ||
| Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) | Ref.: PMID 31278008 | ||
| Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) | Ref.: PMID 27424497; 17477879 |
References
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