Summary
Denne protokollen beskriver en teknikk for å visualisere macrophage atferd og død i embryonale sebrafisk under Mycobacterium marinum infeksjon. Trinn for utarbeidelse av bakterier, infeksjon av embryo, og intravital mikroskopi er inkludert. Denne teknikken kan brukes til observasjon av cellulære atferd og død i lignende scenarier som involverer infeksjon eller steril betennelse.
Abstract
Sebrafisk er en utmerket modell organisme for å studere medfødt immun celle atferd på grunn av sin gjennomsiktige natur og tillit utelukkende på sin medfødte immunsystem under tidlig utvikling. Den sebrafisk Mycobacterium marinum (M. marinum) infeksjon modellen har vært godt etablert i å studere vert immunrespons mot mykobakterieinfeksjoner infeksjon. Det har blitt antydet at ulike macrophage celle døds typer vil føre til ulike utfall av mykobakterieinfeksjoner infeksjon. Her beskriver vi en protokoll som bruker intravital mikroskopi å observere macrophage celle død i sebrafisk embryo etter M. marinum infeksjon. Sebrafisk transgene linjer som spesielt Label makrofager og nøytrofile er infisert via intramuskulær microinjection av fluorescensmerkete merket M. marinum i enten mellomhjernen eller stammen. Infiserte sebrafisk embryo er senere montert på lavt smelte agarose og observert av konfokalmikroskopi mikroskopi i X-Y-Z-T dimensjoner. Fordi langsiktig Live Imaging krever bruk av lav laser effekt for å unngå photobleaching og Phototoksisitet, er en sterkt uttrykker transgene sterkt anbefalt. Denne protokollen forenkler visualisering av dynamiske prosesser in vivo, inkludert immun celle migrasjon, vert patogen samhandling, og celle død.
Introduction
Mykobakterieinfeksjoner infeksjon har vist å forårsake vert immun cellen død1. For eksempel vil en svekket belastning utløse apoptose i makrofager og inneholde infeksjonen. Imidlertid vil en ondartet belastning utløse lytisk celle død, forårsaker bakteriell formidling1,2. Betenke innvirkningen disse annerledes typer av cellen død ha opp på vert anti-mykobakterieinfeksjoner svaret, en detaljert observasjon av macrophage cellen død i løpet av mykobakterieinfeksjoner infeksjon inne Vivo er behøvde.
De konvensjonelle metodene for å måle celle død er å bruke døde celle flekker, slik som Annnexin V, TUNEL, eller Akridin Orange/propidium iodide farging3,4,5. Men disse metodene er ikke i stand til å belyse den dynamiske prosessen med celle død in vivo. Observasjon av celle død in vitro har allerede blitt tilrettelagt av Live Imaging6. Men om resultatene nøyaktig etterligne fysiologiske forhold forblir uklart.
Sebrafisk har vært en utmerket modell for å studere Host anti-Mycobacterium svar. Den har en svært bevart immunsystem som ligner på mennesker, en lett manipulert Genova, og tidlig embryo er gjennomsiktige, noe som gjør det mulig for Live Imaging7,8,9. Etter smitte med M. marinum, voksen sebrafisk form typisk modne granulom strukturer, og embryonale sebrafisk form tidlig granulom som strukturer9,10. Den dynamiske prosessen med medfødt immun celle-bakterier interaksjon har vært utforsket tidligere i sebrafisk M. marinum infeksjon modell11,12. Men på grunn av høy romlig-Temporal oppløsning kravet, detaljene rundt død av medfødte immunceller fortsatt i stor grad udefinert.
Her beskriver vi hvordan å visualisere prosessen med macrophage lytisk celle død utløst av mykobakterieinfeksjoner infeksjon in vivo. Denne protokollen kan også anvendes for å visualisere cellulær atferd i vivo under utvikling og inflammasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Sebrafisk ble reist under standard forhold i samsvar med laboratorie dyrs retningslinjer for etisk gjennomgang av dyrevelferd (GB/T 35823-2018). Alle sebrafisk eksperimenter i denne studien ble godkjent (2019-A016-01) og gjennomført ved Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University.
1. M. marinum enkelt celle inokulum forberedelse (figur 1)
- Tin Cerulean-fluorescerende M. marinum glyserol lager fra-80 ° c og vaksinere en 7H10 agar plate med 10% (v/v) OADC, 0,25% glyserol og 50 μg/ml hygromycin. Ruge platen ved 32 ° c i ca. 10 dager.
- Velg en koloni som uttrykker positiv fluorescens og vaksinere 3 mL 7H 9 medium med 10% OADC, 0,5% glyserol, og 50 μg/mL hygromycin.
- Ruge inoculation ved 32 ° c og 100 omdreininger per minutt (rpm) i 4 – 6 dager til kulturen når logaritmisk fase (OD600 = 0,6 – 1,0).
- Under kultur (1:100) i 30 mL friskt 7H 9 medium med 10% OADC, 0,5% glyserol, 0,05% mellom-80 og 50 μg/mL til OD600 når ~ 1,0.
Merk: for høyest kultur kvalitet anbefales et under trinn på dette punktet. I vår erfaring, legge til klone direkte til et stort volum av medium vil føre til dannelse av bakterielle klumper.
- Samle M. marinum celler som beskrevet nedenfor.
- Sentrifuger på 3 000 x g i 10 min for å samle M. marinum som pellets. Kast alle unntatt 300 μL av supernatanten og bruk den til blanding av pellet.
- Tilsett 3 mL 7H 9 medium med 10% glyserol til ytterligere resuspend pellet, deretter sonikere suspensjonen i et vannbad på 100 W ved 15 s ON, 15 s OFF for totalt 2 min.
Merk: formålet med sonikering er å oppnå en enkelt celle homogenate for inokulum, som vil hindre blokkering av microinjection nålen.
- Overfør bakteriell suspensjonen til en 10 mL sprøyte, og gå deretter gjennom et filter på 5 μm for å fjerne bakterie klumper.
- Mål den optiske tettheten (OD) av suspensjonen ved hjelp av en spektrofotometer og fortynne den til OD600 = 1,0 med 7h 9 medier som inneholder 10% glyserol. Del fjæringen i 10 μL alikvoter og oppbevar ved-80 ° c fryseboks for fremtidig bruk.
- Bekreft bakteriell konsentrasjon av inokulum (CFU/mL) ved seriell fortynning og plating av bakteriell lager på en 7H10 agar plate som inneholder 10% (v/v) av OADC, 0,5% av glyserol, og 50 μg/mL hygromycin.
2. forberedelse av sebrafisk embryo
- En dagen før gyting, sette opp sebrafisk avl parene i avl kammeret.
Merk: Legg bare ett par i hvert avl kammer. - Samle embryo neste morgen innen 1 t innleggs befruktning (hpf). Vask embryo forsiktig med destillert vann og overføre opp til 100 embryo inn i en 100 mm Petri parabolen inneholder 30 mL av E3 medium. Ruge ved 28,5 ° c.
- Etter 12 timer, Observer under et mikroskop og kast nonfertilized eller ødelagte egg.
- Ved 24 hpf, endre medium til fersk E3 medium med N-phenylthiourea (PTU, 0,2 nM endelig konsentrasjon) for å hindre utvikling av pigment. Ruge embryo ved 28,5 ° c til embryo er klar for microinjection.
3. infeksjon via bakteriell Microinjection
- Forbered Borosilikatglass glass microcapillary sprøyte pinner som tidligere beskrevet i referanse13.
- Sebrafisk embryo montering for infeksjon
- Mikrobølgeovn 100 mL 1% (w/v) og 100 mL 0,5% (w/v) lav smeltende agarose i et autoklaveres E3 medium til agarose er helt smeltet. Del i 1 mL alikvot rør og oppbevar ved 4 ° c for fremtidig bruk.
- Før bruk, varm opp agarose i en 95 ° c varme blokk til den er helt smeltet. Oppretthold agarose i flytende form ved å plassere den i en 45 varme blokk (figur 2).
- Montering for intramuskulær infeksjon i bagasjerommet regionen
- Lag bunnen agarose laget ved å helle 0,5 mL 1% (w/v) agarose jevnt på et glass lysbilde. Plasser på en is boks eller kald overflate i 3 min å stivne.
- Bedøve sebrafisk embryo (48 – 72 hpf) i egg vann med tricaine (200 μg/mL) og PTU i 5 minutter før montering. Plasser opp til 60 sebrafisk embryo på bunnen agarose lag og legge dem ut forsiktig i to rader (figur 2B).
- Fjern eventuelle gjenværende vann på bunnen agarose lag med silkepapir før du legger 0,3 mL av 0,5% (w/v) agarose å skape det øvre laget. Sørg for at embryo er helt innebygd i agarose. Returner glasset Skyv til isen boksen igjen for å stivne i agarose og forebygge dehydrering.
- Hold det øverste laget av agarose fuktig ved å dekke overflaten med ekstra E3 egg vann.
- Montering for mellomhjernen infeksjon
- Dekk sporet av en enkelt Concavity glass mikroskopi lysbilde med 1% (w/v) agarose, og deretter overføre de 4-6 tricaine-anesthetized embryo inn i agarose.
- Plasser hodet på hvert embryo oppover forsiktig med en 10 G nål (figur 2C).
- Når alle embryo posisjoner er faste, overføre glasset lysbildet til en is-boks eller kald overflate for å la agarose stivne.
Merk: unngå fortynning av lav smelte agarose ved å minimere volumet av egg vann overføring med embryo.
- Bakterie forberedelse for infeksjon
- Tilsett 1 μL steril-filtrert fenol rød (10x) til 10 μL alikvot (laget i trinn 1) og bland med virvlingen kort.
Merk: den endelige konsentrasjonen kan justeres ved hjelp av steril PBS. - Sonikere preparatet med 100 W ved 10 s ON, 10 s OFF i 1 min for å bryte opp noen klumper som kan ha dannet14.
- Tilsett 1 μL steril-filtrert fenol rød (10x) til 10 μL alikvot (laget i trinn 1) og bland med virvlingen kort.
- Infeksjon via microinjection
- Juster microinjector og micromanipulator til riktig posisjon og innstilling for microinjection som tidligere rapportert13.
- Overfør 3 μL av bakteriell tilberedning ved hjelp av en mikro loader i den preparerte nålen (se trinn 3,1). Pipetter langsomt og forsiktig for å unngå dannelse av luftbobler.
- For stammen regionen infeksjon, injisere 100 CFU inn i stammen regionen (Figur 3A). Unngå å injisere bakterier i notochord.
Merk: CFU for injeksjon er anslått av formelen CFU = bakteriell Stock konsentrasjon x fortynning faktor x injeksjon dråpe volum. Den faktiske CFU bekreftes av plating en dråpe bakteriell inokulum på en 7H10 agar plate som inneholder 10% (v/v) av OADC, 0,5% av glyserol, og 50 μg/mL hygromycin. - For mellomhjernen infeksjon, injisere ca 500 CFU i mellomhjernen regionen (Figur 3B).
- Etter microinjection, forsiktig skylle sebrafisk embryo i friskt egg vann med en plast pipette.
Merk: Mount embryo i glasset bunnen parabolen så snart som mulig for å dekke observasjon av svært tidlig medfødt immun celle respons.
4. live Imaging av infeksjonen
- Fiske montering for levende bilder
- Overfør opp til 10 tricaine-anesthetized embryo til midten av en glassbunn 35 mm parabolen. Forkast ekstra E3-medium.
- Dekk fatet med 1% lavt Smeltepunkt agarose og orientere sebrafisk embryo nøye ved hjelp av en 10 G nål. Ruge glasset bunn parabolen på isen for 10 s å stivne i agarose.
Merk: for mellomhjernen injeksjon, bør embryo monteres i agarose med hodet rettet oppover (Figur 4A). For stammen regionen intramuskulær infeksjon, bør embryo monteres sidelengs i agarose (Figur 4B). - Når den har helt befestet, dekker agarose med et lag av egg vann (pluss 1 x tricaine og PTU).
- Trefargers høyoppløselig tidsforløp konfokalmikroskopi mikroskopi
Merk: følgende trinn er operert på en konfokalmikroskopi mikroskopi utstyrt med en 63.0 x 1,40 Oil UV objektiv linse.- Still inn temperaturen på miljøkammeret til 28,5 ° c. Plasser litt vått papir i kammeret for å gi fuktighet og hindre fordampning av egg vann (supplerende figur 1).
- Plasser glassbunn parabolen på 35 mm med sebrafisk i miljøkammeret.
- Åpne konfokalmikroskopi programvare og initialisere scenen. Bytt til 63,0 x 1,40 olje-objektiv, og Finn sebrafisk ved hjelp av den lyse felt kanalen med et filter for differensial forstyrrelser (DIC).
- Åpne 405 diode, Argon (20% strøm), og DPSS 561 NM laser. Konfigurer de riktige innstillingene for laser strøm og spektrum.
Merk: følgende er spektrum innstillinger for Cerulean (eksitasjon = 405 NM; utslipp = ~ 456 – 499 NM), eGFP (eksitasjon = 488 NM; utslipp = ~ 500 – 550 NM), DsRed2 (eksitasjon = 561 NM; utslipp = ~ 575 – 645 NM) (supplerende figur 2b). - Velg "XYZ"sekvensiell skanning"anskaffelses modus og sett bildeformat til"512 x 512 piksler"(supplerende figur 2a).
- Bytt til "Live data Mode". Målrett plasseringen av den første sebrafisk og merk "Start" og "end" Z posisjon. Gjenta denne prosessen for hver av de resterende embryo. En "pause" kan legges på slutten av programmet (supplerende figur 2C).
- Definer sløyfen og syklusen for programmet.
- Lagre filen.
5. enkelt celle UV-bestråling for å indusere apoptose og live Imaging
- Monter fisken som beskrevet i trinn 4,1.
- Imaging den mellomhjernen regionen på 3 dager etter befruktning (DPF) macrophage spesifikke transgene TG (mfap4-eGFP) embryo15
- Velg regionen av interesse for en enkelt fluorescensmerkete merket macrophage og skanne ved 400 Hz hastighet og 6% UV laser effekt for 50 s.
Merk: skannehastighet og-tid må optimaliseres basert på det enkelte mikroskopet. Skanning tid burde være optimert å anledning det innholdsrik DNA skade det vill heretter anledning målcellen apoptose, bortsett fra ikke photobleach det hel cellen. - Gjenta trinnet ovenfor for å irradiate flere målceller.
- Utfør tidsforløp avbildning av mellomhjernen området som beskrevet i avsnitt 4.
6. image bearbeiding
- Utfør "maksimal projeksjon" for de mottatte bildene.
- Finn og Merk XY posisjon og tid for målcellene under "maksimal projeksjon" visning.
- Gå tilbake til standardvisningen for å finne og merke Z-posisjonen til målcellene.
- Beskjær ett lags bilde av målcellene.
- Eksport det overlappe kanalen og lys åker idet video inne AVI formatter.
- Beskjær interesseområdet for overleggs kanalen og det lyse feltet i ImageJ.
- Kombiner de to videoene i det siste trinnet vertikalt og lagre som en AVI-format video i ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mycobacterium infeksjon kanne avtrekker annerledes vert svar basert på veiene av infeksjon. I denne protokollen, sebrafisk embryo er smittet av intramuskulær microinjection av fluorescensmerkete merket bakterier i mellomhjernen eller trunk (Figur 3) og observert av konfokalmikroskopi Live Imaging. Infeksjon via disse to rutene vil lokalt begrense infeksjonen forårsaker medfødt immun celle rekruttering og påfølgende celle død.
Visualisere detaljene i medfødt immun celle død er utfordrende. Lytisk cellen død hender over en meget kort tid vindu og behøver høy-resolution mikroskopi å observere. Dessuten tillater høy motilitet i medfødt immunceller dem til å migrere ut av observasjons området. I denne protokollen løser vi dette problemet ved å observere flere embryo parallelt. En rekke sebrafisk embryo kan monteres på en enkelt glass mikroskop lysbilde for smitte, og opp til 10 embryo kan monteres på samme 35 mm glassbunn parabolen for Live Imaging (Figur 4). Ved å dra nytte av en live datamodell av konfokalmikroskopi mikroskopi, kan mer enn ett embryo observeres samtidig. Dette øker effektiviteten til live Imaging og øker sannsynligheten for å fange hele lytisk celle døds prosessen.
Det medfødte immunsystemet er den første forsvarslinjen mot mykobakterieinfeksjoner infeksjon, og to nøkkelkomponenter er macrophage og nøytrofile. Her bruker vi tidligere rapporterte TG (coro1a: eGFP; lyzDsRed2) og TG (MPEG1: loxP-DsRedx-loxP-eGFP; Lyz: eGFP) for å skille makrofager og nøytrofile in vivo16,17,18. En macrophage tungt engorged med bakterier ble rund og vist redusert motilitet, med eventuell cytoplasmatiske hevelse, rupturing av cellemembranen, og rask formidling av cytoplasmatiske innhold. Disse hendelsene er typiske morfologiske endringer av lytisk celle død som tidligere rapportert (figur 5a)16. UV bestråling har blitt brukt til å utløse celler til å gjennomgå apoptose i sebrafisk20,21. I samsvar med denne oppfatningen viste UV bestrålt makrofager typiske apoptotisk celle fenotyper, som celle krymping, kjernefysisk fragmentering og kromatin kondens (figur 5B)22,23. Kombinert med bruk av Cerulean-fluorescerende M. marinum19, tre farger Live Imaging av samspillet mellom macrophage, nøytrofile, og M. marinum ble oppnådd in vivo. Vi observerte også at makrofager kan aktivt fagocyttere og spre M. marinum (supplerende figur 3a). Imidlertid, nøytrofile fikk begrenset phagocytic evnen og rask gjennomgikk lytisk cellen død uten tydelig bakteriell overfylling (supplerende skikkelsen 3b). Nøytrofile kan utløses av fagocytose av bare noen få døde M. marinum som ikke uttrykker Cerulean-fluorescens, eller bare ved fagocytose av begrenset død celle rusk.
Figur 1: skjematisk diagram av enkelt celle bakterier forberedelse. Enkelt celle Cerulean-fluorescerende M. marinum aksjer ble generert etter den beskrevne prosessen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: diagram over sebrafisk embryo montering for microinjection. (A) skjematisk diagram av monteringsprosessen. (B) sebrafisk embryo ble montert sideveis for smitte av stammen regionen. (C) sebrafisk embryo ble montert med hodene rettet oppover for smitte av mellomhjernen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Bilde 3: posisjonering for microinjection. (A) den røde pilen indikerer injeksjonsstedet for smitte av stammen regionen. (B) den røde pilen indikerer injeksjonsstedet for mellomhjernen infeksjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: montering sebrafisk embryo for Live Imaging. (A) for mellomhjernen infeksjon ble sebrafisk embryo montert med hodene rettet nedover. (B) for stammen regionen infeksjon, sebrafisk embryo ble montert sidelengs med injeksjonsstedet nær bunnen av glasset bunn parabolen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: typiske morfologiske endringer i M. marinum infeksjon indusert macrophage lytisk celle død og UV indusert macrophage apoptose. (A) tid lapse Imaging av en macrophage (Mac) gjennomgår lytisk celle død når den er tungt engorged med M. marinum. Mellomhjernen av 3 DPF TG (coro1a: eGFP; lyzDsRed2) sebrafisk embryo er infisert av Cerulean-fluorescerende M. marinum (~ 500 CFU) via microinjection. Bilder for både overleggs kanalen (øvre panel) og DIC-kanalen (nedre panel) er tilgjengelig. T 00:00 er 5 t 20 min innlegg infeksjon. Hvite stiplede linjer = omrisset av cellemembranen; svarte stiplede linjer = hevelse cytoplasma; svarte piler = sprukket celle membran; røde stiplede linjer = raskt tapt cytoplasmatiske innhold. (B) tidsforløp AVBILDNING av UV-bestrålt macrophage. En GFP + celle i mellomhjernen regionen av 3 DPF TG (mfap4: eGFP) er BESTRÅLT av UV og etterfulgt av tidsforløp Imaging. Hvite stiplede linjer = omrisset av cellemembranen; sorte piler = kjernefysisk fragmentering og kromatin kondens. Scale bar = 15 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1: miljøkammer satt opp for Live Imaging. (A) sett den digitale kontrolleren for å holde temperaturen på 28,5 ° c. (B) sett våte kluter inne i kammeret for å gi fuktighet og hindre fordampning av egg vann. (C) lukke dekselet på kammeret og vente i minst 30 min for temperaturstabilisering før du begynner Live Imaging. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 2: konfokalmikroskopi panel innstilling for Live bildebehandling. (A) representasjon av innstillinger for anskaffelses panel. (B) representasjon av innstillinger for laser kraft og spektrum. (C) representasjon av flere jobber og sløyfe innstilling i sanntidsdata modus. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 3: makrofager spre infeksjon og nøytrofile gjennomgå lytisk celle død etter M. marinum infeksjon. (A) macrophage spre M. marinum i bagasjerommet på en 2 DPF TG (coro1a: eGFP; Lyz: DsRed2) sebrafisk embryo smittet av Cerulean-fluorescerende M. marinum (~ 100 CFU). (B) nøytrofile (Neu) gjennomgår lytisk celle død uten åpenbare M. marinum Laden i stammen regionen av 3 DPF TG (MPEG1: LRLG; Lyz: eGFP) sebrafisk embryo smittet av Cerulean-fluorescerende M. marinum (~ 100 CFU) via microinjection. Grønn farge er tildelt LRLG og rød farge er tildelt eGFP for bedre visualisering av lytisk celle døds prosessen. Piler i cyan indikerer målceller. Piler i rødt peker til cellene som er i ferd med å frigi cytoplasma innhold i neste delbilde. Piler i grønt peker til de døde cellene som nettopp har mistet sitt cytoplasma innhold. Scale bar = 25 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Video 1: en macrophage tungt ladet med M. marinum gjennomgår lytisk celle død, relatert til figur 5a. Time-lapse Imaging (63x objektiv) for 9 min og 18 s på 3 bilder per sekund (FPS) av mellomhjernen regionen av en 3 DPF TG (coro1a: eGFP; lyzDsRed2) sebrafisk embryo smittet med Cerulean-fluorescerende M. marinum. Vennligst klikk her for å se denne videoen (Høyreklikk for å laste ned).
Video 2: en macrophage gjennomgår apoptose etter UV-bestråling, relatert til figur 5B. Time-lapse Imaging (63x objektiv) på 74 min på 6 fps av mellomhjernen regionen av en 3 DPF TG (mfap4: eGFP) sebrafisk embryo. En GFP + celle i mellomhjernen regionen av embryo er bestrålt av UV og etterfulgt av tid forfalle Imaging. Vennligst klikk her for å se denne videoen (Høyreklikk for å laste ned).
Video 3: en macrophage sprer M. marinum, knyttet til supplerende figur 3a. Time-lapse Imaging (63x objektiv) på 24 min på 3 fps av stammen regionen av 2 DPF TG (coro1a: eGFP; Lyz: DsRed2) sebrafisk embryo smittet med Cerulean-fluorescerende M. marinum. Vennligst klikk her for å se denne videoen (Høyreklikk for å laste ned).
Video 4: en nøytrofile gjennomgår lytisk celle død uten åpenbare M. marinum overfylling, knyttet til supplerende figur 3b. Time-lapse Imaging (63x objektiv) på 7 min 30 s på 3 fps av stammen regionen av 3 DPF TG (MPEG1: LRLG; Lyz: eGFP) sebrafisk embryo smittet med Cerulean-fluorescerende M. marinum. Vennligst klikk her for å se denne videoen (Høyreklikk for å laste ned).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver visualisering av macrophage død under mykobakterieinfeksjoner infeksjon. Basert på faktorer som integriteten til cellemembranen, kan smitte drevet celle død deles inn i apoptose og lytisk celle død24,25. Lytisk celle død er mer stressende for organismen enn apoptose, fordi det utløser en sterk inflammatorisk respons 24,25. Observasjon av lytisk celle død in vivo er vanskelig, på grunn av behovet for høy romlig-Temporal oppløsning, riktig konfokalmikroskopi mikroskopi innstillinger, og sterkt transgene uttrykk.
Riktig microinjection krever flere kritiske trinn. Bakterie massen må være grundig sonikert for å fjerne alle klumper før injeksjon. Vi forbedret sebrafisk montering for microinjection ved å bygge dem på et glass lysbilde mellom to lag med lav smelte agarose. Etter påføring av det andre laget av agarose, blir raset overført til en is boks eller kald overflate for å akselerere herding og forhindre dehydrering av agarose. Hvis embryo må monteres på forskjellige lysbilder, sørg for å holde det øverste laget av agarose fuktig ved å legge ekstra egg vann.
For Live Imaging, et høyoppløselig objektiv objektiv er nødvendig for å observere detaljene i cellen død. Dette kravet er alltid ledsaget av kort arbeidsavstand, og dermed krever posisjonering infeksjonen området nær dekselet lysbilde. En lang arbeidsavstand vann linse er ideell for Imaging den dypere vev og vil gi rom for mer plass til riktig embryo montering. Forlenget Live Imaging ved hjelp av en laser med høy intensitet vil føre til vevskader eller død av fosteret. Dermed er det svært viktig å holde intensiteten av laseren så lavt som mulig for å unngå photobleaching og toksisitet. En sterkt uttrykt transgene kan forenkle observasjon ved hjelp av en laser med lav intensitet. Fordi GFP uttrykk er sterkere i TG (coro1a: eGFP) enn TG (MPEG1: eGFP), brukte vi TG (coro1a: eGFP; Lyz: DsRed2) istedenfor TG (MPEG1: eGFP; Lyz: DsRed2) i denne studien. Sette opp en mobil arbeidsstasjon for microinjection nær konfokalmikroskopi maskinen er best for å observere raske svar. Chilling den lave smeltende agarose på isen for å akselerere herding tid kan også bidra til å redusere tiden mellom injeksjon og live Imaging.
I denne protokollen, fokuserer vi på å observere macrophage atferd. Imidlertid, det detaljert studere av nøytrofile opptreden i løpet av mykobakterieinfeksjoner infeksjon kanne likeledes være opplysende. For eksempel, hvordan nøytrofile ekstracellulære feller (NETs) er involvert i å drepe ekstracellulære Mycobacterium fortsatt i stor grad udefinert. Ved å kombinere bilde teknikken som er beskrevet i denne protokollen med en histone protein merking transgene vil i stor grad forenkle visualisering av NETs in vivo.
Foreløpig er sebrafisk anerkjent som et svært robust system for å studere medfødt immun celle atferd. Statistiske data for fagocytose og celle død kan oppnås ved hjelp av denne protokollen. Kombinert med den kraftige gen redigeringsverktøy tilgjengelig i dag, denne protokollen kan gi en effektiv plattform for videre forståelse effekten av en rekke faktorer på verts-patogen interaksjon in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Zilong Wen for deling sebrafisk stammer, Dr. Stefan Oehlers og Dr. David Tobin for deling M. marinum relaterte ressurser, Yuepeng han for hjelp i figuren forberedelse. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation i Kina (81801977) (B.Y.), fremragende Youth Training program av Shanghai Municipal Health Commission (2018YQ54) (B.Y.), Shanghai Sailing program (18YF1420400) (B.Y.), og Open Fund of Shanghai nøkkel laboratorium for tuberkulose (2018KF02) (B.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Tween-80 | Sigma | P1379 | |
| 10 mL syringe | Solarbio | YA0552 | |
| 10% OADC | BD | 211886 | |
| 3-aminobenzoic acid | Sigma | E10521 | |
| 5 μm filter | Mille X | SLSV025LS | |
| 50 μl/ml hygromycin | Sangon Biotech | A600230 | |
| 7H10 | BD | 262710 | |
| 7H9 | BD | 262310 | |
| A glass bottom 35 mm dish | In Vitro Scientific | D35-10-0-N | |
| Agarose | Sangon Biotech | A60015 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Enviromental Chamber | Pecon | temp control 37-2 digital | |
| Eppendorf microloader | Eppendorf | No.5242956003 | |
| Glass microscope slide | Bioland Scientific LLC | 7105P | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854 | |
| Incubator | Keelrein | PH-140(A) | |
| M.marinum | ATCC BAA-535 | ||
| Microinjection needle | World Precision Instruments | IB100F-4 | |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulator | NARISHIGE | MN-151 | |
| msp12:cerulean | Ref.: PMID 25470057; 27760340 | ||
| Phenol red | Sigma | P3532 | |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Single concavity glass microscope slide | Sail Brand | 7103 | |
| Sonicator | SCICNTZ | JY92-IIDN | |
| Spectrophotometer (OD600) | Eppendorf AG | 22331 Hamburg | |
| Stereo Microscope | OLYMPUS | SZX10 | |
| Tg(mfap4:eGFP) | Ref.: PMID 30742890 | ||
| Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) | Ref.: PMID 31278008 | ||
| Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) | Ref.: PMID 27424497; 17477879 |
References
- Behar, S. M., Divangahi, M., Remold, H. G. Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 668-674 (2010).
- Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Manipulation of host cell death pathways during microbial infections. Cell Host Microbe. 8 (1), 44-54 (2010).
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Scott, A. P., Waterhouse, N. J. Quantitation of Apoptosis and Necrosis by Annexin V Binding, Propidium Iodide Uptake, and Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (11), (2016).
- Crowley, L. C., Marfell, B. J., Waterhouse, N. J. Detection of DNA Fragmentation in Apoptotic Cells by TUNEL. Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (10), (2016).
- Chan, L. L., McCulley, K. J., Kessel, S. L. Assessment of Cell Viability with Single-, Dual-, and Multi-Staining Methods Using Image Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1601, 27-41 (2017).
- Rathkey, J. K., et al. Live-cell visualization of gasdermin D-driven pyroptotic cell death. Journal of Biological Chemistry. 292 (35), 14649-14658 (2017).
- Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 633-642 (2013).
- Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 523-537 (2015).
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current Opinion Microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
- Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).
- Clay, H., et al. Dichotomous role of the macrophage in early Mycobacterium marinum infection of the zebrafish. Cell Host Microbe. 2 (1), 29-39 (2007).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Maglione, P. J., Xu, J., Chan, J. B. cells moderate inflammatory progression and enhance bacterial containment upon pulmonary challenge with Mycobacterium tuberculosis. Journal of Immunology. 178 (11), 7222-7234 (2007).
- Wang, Z., et al. Neutrophil plays critical role during Edwardsiella piscicida immersion infection in zebrafish larvae. Fish Shellfish Immunology. 87, 565-572 (2019).
- Wang, T., et al. Nlrc3-like is required for microglia maintenance in zebrafish. Journal of Genetics and Genomics. 46 (6), 291-299 (2019).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Xu, J., Wang, T., Wu, Y., Jin, W., Wen, Z. Microglia Colonization of Developing Zebrafish Midbrain Is Promoted by Apoptotic Neuron and Lysophosphatidylcholine. Developmental Cell. 38 (2), 214-222 (2016).
- Oehlers, S. H., et al. Interception of host angiogenic signalling limits mycobacterial growth. Nature. 517 (7536), 612-615 (2015).
- Kulms, D., Schwarz, T. Molecular mechanisms of UV-induced apoptosis. Photodermatology, Photoimmunology and Photomedicine. 16 (5), 195-201 (2000).
- van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. Live imaging of apoptotic cells in zebrafish. FASEB Journal. 24 (11), 4336-4342 (2010).
- Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. Plasma membrane changes during programmed cell deaths. Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).
- Lu, Z., Zhang, C., Zhai, Z. Nucleoplasmin regulates chromatin condensation during apoptosis. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (8), 2778-2783 (2005).
- Ashida, H., et al. Cell death and infection: a double-edged sword for host and pathogen survival. Journal of Cell Biology. 195 (6), 931-942 (2011).
- Traven, A., Naderer, T. Microbial egress: a hitchhiker's guide to freedom. PLoS Pathogens. 10 (7), 1004201 (2014).
