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स्थानिक तराजू में असुरक्षित मीडिया में माइक्रोबियल परिवहन का अध्ययन करने के लिए माइक्रोस्कोपी और फ्लो साइटोमेट्री के साथ द्रव उपकरणों का संयोजन

Published: November 25, 2020 doi: 10.3791/60701
Automatic Translation
1,2, 2, 1, 1
1Stream Biofilm and Ecosystem Research Laboratory, École Polytechnique Fédérale de Lausanne, 2Institute of Earth Sciences, University of Lausanne, CH-1015

Summary

सफलता घटता (BTCs) असुरक्षित मीडिया में बैक्टीरिया के परिवहन का अध्ययन करने के लिए कुशल उपकरण हैं । यहां हम बीटीसी प्राप्त करने के लिए माइक्रोस्कोपी और फ्लो साइटोमेट्रिक काउंटिंग के साथ संयोजन में तरल उपकरणों के आधार पर उपकरण पेश करते हैं।

Abstract

असुरक्षित मीडिया में सूक्ष्मजीवों के परिवहन, फैलाव और जमाव को समझना एक जटिल वैज्ञानिक कार्य है जिसमें हाइड्रोडायनामिक्स, पारिस्थितिकी और पर्यावरण इंजीनियरिंग के रूप में विविध विषय शामिल हैं । विभिन्न स्थानिक तराजू पर असुरक्षित वातावरण में जीवाणु परिवहन मॉडलिंग बेहतर बैक्टीरियल परिवहन के परिणामों की भविष्यवाणी करने के लिए महत्वपूर्ण है, अभी तक वर्तमान मॉडल अक्सर प्रयोगशाला से क्षेत्र की स्थिति के लिए बड़े पैमाने पर करने के लिए असफल । यहां, हम दो स्थानिक तराजू पर असुरक्षित मीडिया में जीवाणु परिवहन का अध्ययन करने के लिए प्रायोगिक उपकरण पेश करते हैं । इन उपकरणों का उद्देश्य पारदर्शी छिद्रपूर्ण मैट्रिस में इंजेक्ट किए गए बैक्टीरिया के स्थूल अवलोकन (जैसे सफलता घटता या जमाव प्रोफाइल) प्राप्त करना है। छोटे पैमाने पर (10-1000 माइक्रोन) पर, माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को ऑप्टिकल वीडियो-माइक्रोस्कोपी और छवि प्रसंस्करण के साथ जोड़ा जाता है ताकि सफलता घटता प्राप्त किया जा सके और साथ ही, ताकना पैमाने पर व्यक्तिगत जीवाणु कोशिकाओं को ट्रैक किया जा सके। बड़े पैमाने पर, प्रवाह साइटोमेट्री को सफलता घटता प्राप्त करने के लिए एक स्वयं निर्मित रोबोट डिस्पेंसर के साथ जोड़ा जाता है। हम इन उपकरणों की उपयोगिता को बेहतर ढंग से समझने के लिए वर्णन करते हैं कि कैसे बैक्टीरिया को जटिल असुरक्षित मीडिया में ले जाया जाता है जैसे कि धाराओं के हाइपोहेइक क्षेत्र। चूंकि ये उपकरण तराजू में एक साथ माप प्रदान करते हैं, इसलिए वे तंत्र आधारित मॉडलों के लिए मार्ग प्रशस्त करते हैं, जो अपस्केलिंग के लिए गंभीर रूप से महत्वपूर्ण हैं। इन उपकरणों के आवेदन से न केवल उपन्यास बायोरेमेडिएशन अनुप्रयोगों के विकास में योगदान हो सकता है बल्कि असुरक्षित सब्सट्रेट्स को उपनिवेश बनाने वाले सूक्ष्मजीवों की पारिस्थितिक रणनीतियों पर नई रोशनी भी आ सकती है।

Introduction

असुरक्षित मीडिया के माध्यम से रोगाणुओं के परिवहन को समझने के उद्देश्य से किए गए अध्ययन मुख्य रूप से संदूषण1, रोग2 और बायोरेमेडिएशन3के संचरण की चिंताओं से प्रेरित हैं । इस संबंध में, बैक्टीरिया को ज्यादातर परिवहन मॉडल4 में कणों के रूप में माना गया है और बायोफिल्म्स से छानने, तनाव, गुरुत्वाकर्षण निपटान या पुनर्मोबिलीकरण जैसी प्रक्रियाओं को रोगाणुओं के प्रतिधारण या परिवहन के ड्राइवरों के रूप में पहचाना गया है5। हालांकि, असुरक्षित परिदृश्य के माध्यम से बैक्टीरिया के परिवहन का अध्ययन भी हमें इन जटिल वातावरण में उनकी सफलता को रेखांकित पारिस्थितिक रणनीतियों पर सूचित कर सकते हैं । फिर भी, इसके लिए एकल कोशिका, जनसंख्या या माइक्रोबियल समुदाय स्तर पर काम करने वाले उपन्यास प्रयोगों और गणितीय मॉडलों की आवश्यकता होती है।

प्राकृतिक छिद्रपूर्ण वातावरण, जैसे कि धाराओं और नदियों के हाइपोहिक क्षेत्र में पाए जाते हैं, बायोफिल्म बनाने वाले रोगाणुओं के विविध समुदायों द्वारा घनी उपनिवेश हैं6। बायोफिल्म्स ऐसी संरचनाएं बनाती हैं जो प्रवाह को संशोधित करती हैं और इस प्रकार तरल चरण7,8में बैक्टीरिया का परिवहन और फैलाव होती है । ताकना पैमाने पर बैक्टीरिया का परिवहन असुरक्षित मैट्रिक्स में विवश अंतरिक्ष उपलब्धता पर निर्भर करता है और गतिशीलता से संबंधित फैलाव कम घनी आबादी वाले क्षेत्रों में संसाधनों के लिए कम प्रतिस्पर्धा के माध्यम से व्यक्तिगत फिटनेस को बढ़ाने का एक प्रभावी तरीका हो सकता है। दूसरी ओर, मोटिवल बैक्टीरिया असुरक्षित मैट्रिक्स के अधिक अलग-अलग क्षेत्रों तक भी पहुंच सकते हैं और ऐसे क्षेत्रों की विस्तारित खोज10 आबादीको पारिस्थितिक अवसर प्रदान कर सकती है। बड़े स्थानिक तराजू पर, बायोफिल्म विकास प्रवाह पथों को भी बदल देता है जिससे छिद्रों का (आंशिक) अवरुद्ध होता है और इस प्रकार, और भी अधिक चैनलाइज्ड और विषम प्रवाह की स्थिति11की स्थापना के लिए। यह पोषक तत्वों की आपूर्ति और फैलाव क्षमता, आवृत्ति और दूरी के लिए परिणाम है । उदाहरण के लिए, तरजीही प्रवाह तथाकथित "फास्ट-ट्रैक" उत्पन्न कर सकता है और मोटिव बैक्टीरिया इन पटरियों12के साथ स्थानीय प्रवाह की तुलना में और भी अधिक वेग प्राप्त कर सकता है। यह उपन्यास आवासों की खोज को बढ़ाने का एक प्रभावी तरीका है।

असुरक्षित मीडिया में मोती और गैर-मोती बैक्टीरिया (और कणों) के परिवहन के अध्ययन के लिए विभिन्न प्रकार के उपकरण खुद को लाभ उठाते हैं। संख्यात्मक मॉडल में अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण महान भविष्य कहनेवाला क्षमताएं होती हैं, हालांकि अक्सर अंतर्निहित मान्यताओं द्वारा सीमित होती हैं4। प्रयोगशाला-पैमाने पर प्रयोग13,14 सफलता वक्र (बीटीसी) मॉडलिंग के साथ संयुक्त रूप से चिपके हुए दक्षता15के लिए बैक्टीरियल सेल सतह गुणों के महत्व में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है । आमतौर पर, BTCs (यानी, एक निश्चित स्थान पर कण एकाग्रता की समय श्रृंखला) लगातार दर विज्ञप्ति और प्रयोगात्मक डिवाइस के बहिर्वाह पर सेल संख्या के माप के माध्यम से प्राप्त कर रहे हैं । इस संदर्भ में, BTCs असुरक्षित मैट्रिक्स में बैक्टीरिया के advection-फैलाव गतिशीलता को प्रतिबिंबित और लगाव के लिए एक सिंक शब्द लेखांकन द्वारा बढ़ाया जा सकता है । हालांकि, अकेले बीटीसी के मॉडलिंग परिवहन प्रक्रियाओं के लिए असुरक्षित सब्सट्रेट या बायोफिल्म के स्थानिक संगठन की भूमिका को हल नहीं करता है। फैलाव या बयान प्रोफाइल जैसे अन्य स्थूल नमूदार अवलोकन स्थानिक वितरण या बनाए गए कणों या बढ़ते समुदायों के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करने के लिए सिद्ध किए गए हैं । माइक्रोफ्लुइडिक्स एक ऐसी तकनीक है जो माइक्रोस्कोपी जांच,9,12, 16द्वारा असुरक्षित मीडिया में परिवहन का अध्ययन करने की अनुमति देती है, और हाल के काम को छोड़कर,10,प्रयोगात्मक प्रणालियां आम तौर पर संकल्प के एक लंबाई पैमाने पर बाधित होती हैं, यानी, पोर स्केल या पूरे तरल उपकरण पैमाने।16

यहां, हम विभिन्न तराजू पर असुरक्षित परिदृश्य में मोती और गैर-मोती बैक्टीरिया के परिवहन का अध्ययन करने के लिए संयुक्त तरीकों का एक सूट पेश करते हैं। हम बीटीसी विश्लेषण के माध्यम से बड़े पैमाने पर जानकारी के साथ ताकना पैमाने पर जीवाणु परिवहन की टिप्पणियों को जोड़ते हैं। पॉलीडिमेथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) का उपयोग करके नरम लिथोग्राफी से निर्मित माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण जैव-संगत हैं, रसायनों की एक श्रृंखला के लिए प्रतिरोधी हैं, कम लागत पर प्रतिकूलता की अनुमति देते हैं और सूक्ष्म अवलोकन के लिए उत्कृष्ट ऑप्टिकल पारदर्शिता के साथ-साथ कम ऑटोफ्लोरेसेंस महत्वपूर्ण प्रदान करते हैं। पीडीएमएस पर आधारित माइक्रोफ्लुइडिक्स का उपयोग पहले सरल चैनलों17 या अधिक जटिल ज्यामिति12में रोगाणुओं के परिवहन का अध्ययन करने के लिए किया जाता रहा है। हालांकि, आमतौर पर माइक्रोफ्लुइडिक्स प्रयोग अल्पकालिक क्षितिज और जीवित कोशिकाओं के एपीआई-फ्लोरेसेंस सूक्ष्म अवलोकन पर ध्यान केंद्रित करते हैं, आमतौर पर आनुवंशिक रूप से संशोधित उपभेदों (जैसे, जीएफपी-टैग किए गए उपभेदों) तक सीमित है। यहां हम प्रवाह साइटोमेट्री के संयोजन में पॉली (मिथाइल मेथाक्रिलेट) (पीएमएमए, जिसे प्लेक्सीग्लास के रूप में भी जाना जाता है) से निर्मित माइक्रोस्कोपी और बड़े उपकरणों के संयोजन में पीडीएमएस आधारित माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का उपयोग करके बैक्टीरियल परिवहन का अध्ययन करने के लिए उपकरण पेश करते हैं। पीडीएमएस और पीएमएमए गैस पारमेबिलिटी और सतह गुणों में भिन्न होते हैं, इस प्रकार बैक्टीरियल परिवहन का अध्ययन करने के लिए पूरक अवसर प्रदान करते हैं। जबकि माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस अधिक नियंत्रित वातावरण प्रदान करता है, बड़ा डिवाइस समय की विस्तारित अवधि में प्रयोगों के लिए या प्राकृतिक जीवाणु समुदायों का उपयोग करने की अनुमति देता है । एक समर्पित क्षेत्र में उच्च लौकिक संकल्प पर माइक्रोस्कोपी गिनती पीडीएमएस आधारित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में बीटीसी प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है । पीएमएमए-आधारित डिवाइस से बीटीसी मॉडलिंग के लिए सेल काउंट प्राप्त करने के लिए, हम प्रवाह साइटोमेट्री के संयोजन में एक स्व-निर्मित स्वचालित तरल मशीन पेश करते हैं। इस सेटअप में, कोशिकाएं तरल उपकरण से गुजरती हैं और लगातार 96 अच्छी प्लेटों में तिरस्कृत होती हैं। लौकिक संकल्प न्यूनतम मात्रा है कि सही तिरस्कृत किया जा सकता है और इस तरह तरल उपकरण के माध्यम से मध्यम प्रवाह दर द्वारा प्रतिबंधित है । कुओं में फिक्सेटिव विकास को रोकता है और डाउनस्ट्रीम फ्लो-साइटोमेट्रिक गणना के लिए डीएनए धुंधला होने की सुविधा प्रदान करता है । परिवहन प्रयोगों के दौरान बैक्टीरियल विकास को रोकने के लिए हम एक न्यूनतम माध्यम (जिसे मोटिविटी बफर कहा जाता है) का उपयोग करते हैं।

चूंकि विभिन्न पैमानों पर तरल उपकरणों की तैयारी के लिए प्रोटोकॉल आसानी से उपलब्ध हैं, इसलिए हम केवल संक्षेप में ऐसे उपकरणों का उत्पादन करने और बीटीसी रिकॉर्ड करने के लिए प्रायोगिक प्रक्रियाओं पर ध्यान केंद्रित करने की तकनीकों को पेश करते हैं। इसी प्रकार, रोगाणुओं के प्रवाह साइटोमेट्रिक गणना के लिए विभिन्न दिनचर्या मौजूद है और उपयोगकर्ताओं को प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा प्राप्त परिणामों की व्याख्या करने के लिए विशेषज्ञ ज्ञान की आवश्यकता होती है। हम फ्लोरोसेंटली-टैग की गई कोशिकाओं के बीटीसी को रिकॉर्ड करने के लिए सूक्ष्म इमेजिंग के साथ संयोजन में माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के उपन्यास उपयोग की रिपोर्ट करते हैं। ताकना पैमाने पर, स्थानीय वेग और प्रक्षेप पथ छवि प्रसंस्करण के माध्यम से प्राप्त कर रहे हैं। इसके अलावा, हम एक देशी धारा बायोफिल्म द्वारा उपनिवेश छिद्रण वातावरण में मोती और गैर-मोती कोशिकाओं के जीवाणु परिवहन का निरीक्षण करने के लिए प्रवाह-साइटोमेट्रिक गिनती के साथ संयोजन में पीएमएमए-आधारित तरल उपकरण के उपयोग को प्रदर्शित करते हैं।

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Protocol

1. बैक्टीरियल कल्चर की स्थिति

  1. एक लैमिनार फ्लो हुड के तहत काम करते हुए, लुरिया-बर्टानी (एलबी) माध्यम के 5 एमएल को टीका लगाने के लिए जीएफपी-टैग किए गए स्यूडोमोनास पुटिडा केटी2440 (1 ×10 7 एमएल-1) के ग्लाइसरोल स्टॉक के100माइक्रोन का उपयोग करें। रात 250 आरपीएम पर मिलाते हुए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. अगले दिन, 5 मिलीएल पौंड माध्यम में रातोंरात संस्कृति के 100 माइक्रोन को फिर से खर्च करें और 5h (घातीय चरण) के लिए एक ही शर्तों के तहत इनक्यूबेट करें। 2 एमएल ट्यूब में 1 एमएल एलिकोट का नमूना लें, कमरे के तापमान (~ 15 मिनट) और अपकेंद्रित्र (5 मिनट के लिए 2300 x ग्राम) को ठंडा करने की अनुमति दें।
  3. सुपरनेट निकालें और गोली में 1 एमएल मोटिविटी बफर जोड़ें। भंवर संक्षेप में नमूना समरूप करने के लिए। वांछित कोशिका एकाग्रता तक पहुंचने के लिए पतला, उदाहरण के लिए, 5 x 105 एमएल-1।
  4. प्राकृतिक समुदायों से जुड़े प्रयोगों के लिए, जैसे धाराओं से प्राप्त, एक गैर-चयनात्मक खेती माध्यम तैयार करते हैं । उदाहरण के लिए, बाँझ-फ़िल्टर और ऑटोक्लेवित स्ट्रीम पानी या एक कृत्रिम स्ट्रीम पानी माध्यम का उपयोग करें जो एक जटिल कार्बन स्रोत (एलबी माध्यम) के साथ संशोधित किया गया है।

2. पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) में माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस तैयार करना

  1. कंप्यूटर-एडेड ड्राफ्टिंग (सीएडी) सॉफ्टवेयर18के माध्यम से वांछित छिद्रपूर्ण ज्यामिति डिजाइन करें, जिसमें हलकों का मैट्रिक्स होता है (जो प्रवाह के लिए अभेद्य बाधा है), त्रिज्या आकार और केंद्र निर्देशांक द्वारा वर्णित है।
    नोट: चित्रा 1Aमें यादृच्छिक अनाज और ताकना आकार के साथ एक छिद्रपूर्ण ज्यामिति का एक उदाहरण प्रदान किया गया है । आउटलेट के करीब बाधाओं के बिना एक अवलोकन चैनल BTCs के अधिग्रहण की सुविधा ।
  2. चुनी हुई ज्यामिति के आधार पर, मानक एसयू-8-फोटोलिथोग्राफी18का उपयोग करके एक मोल्ड तैयार करें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, मोल्डों को समर्पित माइक्रोफैब्रिकेशन सुविधा से भी ऑर्डर किया जा सकता है। क्षैतिज विमान में विषम द्रव प्रवाह प्राप्त करने के लिए, औसत ताकना गले के आकार के समान क्रम के माइक्रोफ्लुइडिक्स कक्ष की मोटाई को डिजाइन करना महत्वपूर्ण है। हालांकि, सुनिश्चित करें कि माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के आयाम माइक्रोस्कोप के तहत अवलोकन के लिए उपयुक्त हैं (उदाहरण के लिए, माइक्रोस्कोप स्लाइड पर काम करते हैं)।
  3. 10% क्रॉस लिंकर (डाइमिथाइल, मिथाइलहाइड्रोजन साइलॉक्सेन कोपॉलिमर) को वजन से 90% इलास्टोमर में जोड़कर, सुई के बिना सिरिंज का उपयोग करके 50 ग्राम पीडीएमएस तैयार करें। साफ परिस्थितियों में काम करें और जितना हो सके धूल से बचें। एक साफ डिस्पोजेबल कंटेनर में दो अभिकर्मकों को मिलाएं और चिपचिपा पीडीएमएस से घुलित हवा और बुलबुले को हटाने के लिए 30 मिनट के लिए वैक्यूम (100 mbar) लागू करें।
  4. मोल्ड को पेट्री डिश (व्यास में 100 मिमी, 15 मिमी उच्च) में रखें। वांछित ऊंचाई (जैसे, 2-5 मिमी) के लिए मोल्ड पर पीडीएमएस डालो। पेट्री डिश को कवर करें और इसे इलाज के लिए 4 घंटे (मोटी परतों के लिए रातभर) के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    नोट: दृश्य उद्देश्य के लिए, प्रकाश पीडीएमएस के माध्यम से पारित करने में सक्षम होना चाहिए, इस प्रकार, 2 मिमी से 5 मिमी के बीच एक पतली परत वांछनीय है। मोटी परतें (>5 मिमी) डिवाइस पारदर्शिता को कम करती हैं और पतले लोगों को आवेदन के दौरान विकृतियों के अधीन किया जाता है।
  5. ओवन से मोल्ड निकालें और माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस को कमरे के तापमान तक ठंडा करने की अनुमति दें। एक बार जब यह ठंडा हो जाता है, तो ध्यान से एक स्केलपेल के साथ पीडीएमएस के वांछित हिस्से को हटा दें।
    नोट: मोल्ड फ्रैक्चर में मोल्ड परिणाम पर मजबूत दबाव। पीडीएमएस को नंगे हाथों से न छुएं, क्योंकि उंगलियों के निशान ऑप्टिकल पारदर्शिता को प्रभावित करेंगे ।
  6. टेप के साथ अस्थायी रूप से पीडीएमएस चैनल (जहां वांछित ज्यामिति उत्कीर्ण की गई है) के नीचे सील करें। 0.5 मिमी व्यास बायोप्सी छिद्रक के साथ, एक इनलेट बनाने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक चैनल को छेदें और 0.5 मिमी (आंतरिक व्यास) ट्यूबिंग को फिट करने वाला आउटलेट।
    नोट: पीडीएमएस की नरम प्रकृति एक बार टयूबिंग डाला जाएगा जकड़न सुनिश्चित करेगा । पीडीएमएस के शीशे को सील करने के बाद इनलेट और आउटलेट चैनल नहीं बनाए जा सकते।
  7. उच्च आवृत्ति जनरेटर (प्लाज्मा बोंडर, सामग्री की तालिका)का उपयोग करके ऑक्सीजन प्लाज्मा बॉन्डिंग के माध्यम से माइक्रोफ्लुइडिक चैनल को सील करें। इसके लिए सिलिटे ग्लास स्लाइड (25 एमएम x 75 एमएम) को इथेनॉल से साफ करें और उसे सूखने दें। पीडीएमएस चैनल से टेप निकालें और चैनल को असुरक्षित पक्ष के साथ रखें। कमरे के तापमान पर लगभग 45 एस के लिए प्लाज्मा के साथ सिलिकेट ग्लास स्लाइड और पीडीएमएस सतहों का इलाज करें।
  8. पीडीएमएस चैनल को सिलिकेट ग्लास स्लाइड पर रखें और गर्म प्लेट पर 30 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।
  9. गर्म प्लेट से माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस निकालें और इसे कमरे के तापमान में ठंडा करें। पीडीएमएस चैनल इनलेट को ट्यूबिंग से कनेक्ट करें। पीडीएमएस से हवा को हटाने के लिए 30 मिनट के लिए वैक्यूम लागू करें, जो तरल पदार्थ के लिए लगभग अभेद्य है लेकिन गैस के लिए पारगर है।
  10. 100 एमएल मोटिविटी बफर (10 एमएम पोटेशियम फॉस्फेट, 0.1 एमएम ईडीटीए, 1% डब्ल्यू/वी ग्लूकोज, पीएच 7.0 के साथ पूरक) तैयार करें और 10 माइक्रोल मिनट -1 पर संचालित सिरिंज पंप का उपयोग करके माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में इसका1मिलियन लगाएं।
    नोट: चूंकि पीडीएमएस गैस में संतृप्त है (पिछले वैक्यूम चरण के कारण), बुलबुले ~ 30 मिनट के भीतर गायब हो जाएंगे।

3. पाली में एक तरल उपकरण की तैयारी (मिथाइल मेथाक्रिलेट)

  1. सीएडी सॉफ्टवेयर के साथ वांछित ज्यामिति डिजाइन करें। यदि लागू हो, तो सुनिश्चित करें कि आयाम माइक्रोस्कोप के तहत अवलोकन के लिए उपयुक्त हैं (उदाहरण के लिए, एक उपयुक्त धारक के साथ संयोजन में एक मानक 96 अच्छी तरह से प्लेट के आयाम)। फ्लूइड डिवाइस एक आधार (127 × 127 × 12 मिमी) और एक ढक्कन (127 × 127 × 12 मिमी) द्वारा रचित है।
    नोट: सीएडी सॉफ्टवेयर के साथ विशेषज्ञता की सिफारिश की है। एक उदाहरण तकनीकी ड्राइंग चित्रा 1Aमें आपूर्ति की जाती है ।
  2. उच्च सटीक माइक्रोमिलिंग (WF31SA, मिक्रॉन) के माध्यम से पोर डिब्बे का उत्पादन करने के लिए, नीचे पीएमएमए परत से 0.5 मिमी निकालें और रबर ओ-रिंग के लिए एक नाली (1.1 × 1.1 मिमी) मिल। ड्रिल 12 पिरोया छेद (M5) । यह फ्लूइड डिवाइस के बेस के रूप में काम करेगा।
    नोट: तरल उपकरण के आयामों को माइक्रोस्कोप चरण और फोकल दूरी को फिट करने के लिए समायोजित करने की आवश्यकता है। चित्रा S1में एक तकनीकी ड्राइंग की आपूर्ति की जाती है।
  3. तरल उपकरण के शीर्ष भाग में और आउटलेट के लिए दो पिरोया छेद (प्रकार 1/4-28UNF) ड्रिल करें, और शिकंजा के लिए 12 छेद (5.5 मिमी)। यह फ्लूइड डिवाइस के ढक्कन के रूप में काम करेगा।
    नोट: माइक्रो मिलिंग में विशेषज्ञता की सलाह दी जाती है; लेखक एक विशेष कार्यशाला से समर्थन का उपयोग करते हैं।
  4. प्रत्येक उपयोग से पहले और बाद में तरल उपकरण को साफ और निष्फल करने के लिए, एचसीएल 7% में तरल उपकरण के आधार और ढक्कन को सोख लें और तीन बार डिएकाइज्ड पानी के साथ कुल्ला करें।
  5. पेंच आधार और ढक्कन एक साथ 12 पिरोया छेद का उपयोग कर।

4. स्वचालित डिस्पेंसर का सेटअप

नोट: व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तरल डिस्पेंसर महंगे होते हैं और अक्सर तरल उपकरण के बहिर्वाह से सीधे बांटने के लिए लचीलापन प्रदान नहीं करते हैं। इसलिए, एक्सवाई प्लॉटर रोबोट (सामग्री की तालिका) से एक सस्ते और लचीले रोबोट डिस्पेंसर सिस्टम को कोडांतरण करने की सिफारिश की जाती है।

  1. 96 अच्छी प्लेटों में तरल उपकरण से बहिर्वाह को वितरित करने के लिए, रोबोट डिस्पेंसर को पीएमएमए प्लेट पर माउंट करें और 85.8 x 128 मिमी की चक्की गुहाओं को 1 मिमी की गहराई के साथ कई 96 अच्छी तरह से प्लेटें पकड़ें।
  2. डिस्पेंसर के रोबोटिक आर्म में फ्लूइड डिवाइस की बहिर्वाह ट्यूब संलग्न करें।
  3. Github से रोबोट मशीन डाउनलोड बीसीएनसी संचालित करने के लिए: https://github.com/vlachoudis/bCNC और कार्यक्रम स्थापित करने के निर्देशों का पालन करें ।
  4. इस लेख की सहायक सामग्री से dispenser.py डाउनलोड करें।
    नोट: यह अजगर कोड एक साधारण रोबोट डिस्पेंसर लेआउट के लिए बीसीएनसी को प्लगइन प्रदान करता है।
  5. रोबोटिक डिस्पेंसर को बीसीएनसी चलाने वाले कंप्यूटर से कनेक्ट करें और सही कॉम पोर्ट की पहचान करें।
  6. बीसीएनसी में रोबोटिक डिस्पेंसर को घर की स्थिति में लौटाने के लिए होम बटन पर क्लिक करें।
    नोट: होमिंग रोबोट डिस्पेंसर को एक ज्ञात स्थिति (एक्स = 0, वाई = 0) में देता है और इसलिए डिस्पेंसर की सटीकता में सुधार करता है।
  7. प्रयोग से पहले, पर्याप्त संख्या में 96 अच्छी प्लेटें तैयार करें, जिनमें उचित मात्रा में फिक्सेटिव (उदाहरण के लिए, अंतिम एकाग्रता 3.7% फॉर्मलडिहाइड) शामिल है।
    नोट: उदाहरण के लिए, 0.2 मिलील मिनट-1की प्रवाह दर पर, 100 माइक्रोन प्रत्येक अच्छी तरह से हर 30 एस में तिरस्कृत हैं। इसलिए, 2 और 4% के बीच फॉर्मेल्डिहाइड की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए प्रत्येक कुएं में 37% फॉर्मलडिहाइड के 10 माइक्रोन जोड़ें। ८ ९६ अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग करने के लिए ७६८ डेटा अंक की कुल के साथ 6 घंटे से अधिक के लिए प्रयोग संचालित करने की अनुमति होगी । इसके अलावा, ध्यान दें कि GFP-टैग कोशिकाओं फॉर्मेल्डिहाइड का उपयोग कर निर्धारण के बाद अपने फ्लोरोसेंट संकेत खो सकते हैं ।

5. पीडीएमएस माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का उपयोग करके बैक्टीरियल परिवहन का विश्लेषण करें

  1. पीडीएमएस माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस को पहले माइक्रोस्कोप चरण पर गतिशीलता बफर के साथ संतृप्त रखें। चरण आंदोलन के दौरान प्रवाह की अशांति को कम करने के लिए ट्यूबिंग को ठीक करने के लिए टेप का उपयोग करें।
  2. माइक्रोस्कोप चरण को आउटलेट के करीब अवलोकन चैनल पर ले जाएं। उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी या चरण विपरीत का उपयोग करना, अवलोकन चैनल के केंद्र पर ध्यान केंद्रित करें और व्यक्तिगत बैक्टीरियल कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए आवर्धन को समायोजित करें।
  3. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए प्रकाश पथ सेटिंग्स स्विच करें और व्यक्तिगत बैक्टीरियल कोशिकाओं (जैसे 100 एमएस) को हल करने के लिए कैमरा एक्सपोजर समय को समायोजित करें, या जैसे कि कोशिकाओं के फ्लोरेसेंस सिग्नल पृष्ठभूमि शोर की तुलना में कम से कम 3x मजबूत हैं।
  4. इसके बाद, इनलेट ट्यूबिंग को 2 एमएल ट्यूब में डालें जिसमें बैक्टीरियल सस्पेंशन होता है। रिवर्स पंप दिशा और 1 μL मिनट-1की प्रवाह दर पर निलंबन वापस लेने शुरू करते हैं ।
  5. प्रयोग की पूरी अवधि में, हर 2 मिनट में एक समग्र तस्वीर रिकॉर्डिंग पूरे अवलोकन चैनल के क्रॉस सेक्शन को स्कैन करें।

6. बेसिक इमेज प्रोसेसिंग

नोट: इन बुनियादी छवि प्रसंस्करण दिनचर्या का लक्ष्य दर्ज छवियों में बैक्टीरिया की संख्या गिनती करने के लिए है । इष्टतम प्रसंस्करण प्रक्रियाएं माइक्रोस्कोप और कैमरे के तकनीकी विनिर्देशों के साथ-साथ प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले जीवाणु तनाव के फ्लोरेसेंस गुणों पर निर्भर करती हैं और इसलिए उन्हें समायोजित करने की आवश्यकता है।

  1. .tiff प्रारूप में पहली निर्यात छवियां।
  2. एक वांछित सॉफ्टवेयर प्लेटफॉर्म (जैसे, मैटलैब, इमेजजे, आर या पायथन) के लिए छवियों का आयात करें।
  3. कैमरा शोर निकालें, जो छवियों में पिक्सेल तीव्रता का एक यादृच्छिक भिन्नता है और ऑप्टिकल विचलन के लिए सही है। यह प्रत्येक चित्र पर गॉसियन फ़िल्टर लागू करने के लिए किया जा सकता है: फ़िल्टर का आकार कैमरा सेंसर (जैसे सीसीडी या सीएमओएस) की गुणवत्ता पर निर्भर करता है। ऑप्टिकल विपथन एक ही ऑप्टिकल विन्यास के साथ नमूना के अभाव में एकत्र एक संदर्भ छवि द्वारा प्रत्येक चित्र को सामान्य करके हटाया जा सकता है।
  4. ब्याज के क्षेत्र में छवियों को क्रॉप करें।
  5. एक सीमा मूल्य (पिक्सेल तीव्रता) की पहचान करें, जैसे कि सीमा से ऊपर के मूल्यों में बैक्टीरियल कोशिकाएं शामिल हैं।
    नोट: यदि छवियां असमान रूप से प्रकाशित होती हैं (ऑप्टिकल विपथन या शोर के कारण) एक अनुकूली सीमा लागू करना उपयोगी हो सकता है, जो स्थानीय मतलब तीव्रता के आधार पर एक सीमा मूल्य चुनता है।
  6. प्रत्येक चित्र से ऊपर परिभाषित सीमा को घटाएं।
  7. जिसके परिणामस्वरूप छवि को बिनारिंग करें, जैसे कि बैक्टीरियल कोशिकाएं 1 का मूल्य लेती हैं, जबकि पृष्ठभूमि 0 का मूल्य लेती है।
  8. सबसे छोटे बैक्टीरियल सेल आकार से छोटे क्षेत्र वाले समूहों को हटा दें।
  9. शेष समूहों के पिक्सेल की कुल संख्या प्राप्त करने के लिए बिनारिजेड छवि को योग करें। एक बैक्टीरियल सेल के औसत आकार (पिक्सल में) द्वारा पिक्सल की संख्या को विभाजित करें: यह कोशिकाओं की कुल संख्या का अनुमान प्रदान करता है।
  10. देखने की गहराई और जांच के क्षेत्र को जानते हुए, एकाग्रता में मायने रखता है (कणोंmL-1)में बदलना ।
  11. इंजेक्शन बैक्टीरिया निलंबन की एकाग्रता की पहचान करना मौलिक है। ऐसा करने के लिए, एक साफ माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के अवलोकन चैनल में बैक्टीरिया संस्कृति निलंबन की एक सिरिंज 1 एमएल के साथ इंजेक्ट करें। छवि रिकॉर्ड करें और ऊपर वर्णित इन्फ्लूएंट बैक्टीरियल एकाग्रता (सी0)की गणना करें (6.1 से 6.10)।
  12. इन्फ्लूएंट बैक्टीरियल कंसंट्रेशन (सी0)और प्लॉटसी/सी 0 बनाम समय के साथ बहिस्त्राव बैक्टीरियल एकाग्रता (सी) को सामान्य करके बीटीसी का विश्लेषण करें ।

7. ताकना पैमाने पर जीवाणु परिवहन का विश्लेषण

  1. असुरक्षित मैट्रिक्स के माध्यम से ले जाए गए बैक्टीरिया के स्थानीय वेग और प्रक्षेप पथ का विश्लेषण करने के लिए, माइक्रोस्कोप चरण को ब्याज के क्षेत्र में ले जाएं और फोकस को माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के केंद्र में समायोजित करें।
  2. चमकीले क्षेत्र या चरण विपरीत करने के लिए माइक्रोस्कोप सेट करें।
    नोट: यह केवल उस स्थिति में है जब बैक्टीरियल सेल का फ्लोरेसेंस सिग्नल औसत बैक्टीरियल समय से कम एक्सपोजर समय पर छवियों को रिकॉर्ड करने की अनुमति नहीं देता है, अन्यथा फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें।
  3. रिकॉर्ड समय-चूक छवियां, एक्सपोजर समय पर जो बैक्टीरिया विस्थापन को कैप्चर करती है (ऑब्जेक्ट आकार से छोटे कई पिक्सेल पर औसत विस्थापन से कम), और जो बैक्टीरियल सेल डिटेक्शन को अनुकूलित करती है (उदाहरण के लिए 20 एमएस का एक्सपोजर और हर 50 एमएस रिकॉर्ड की गई छवियां)। धीमी गति (जैसे 3 मिनट) के पर्याप्त (सांख्यिकीय प्रतिनिधि होने के लिए) रिकॉर्ड करने के लिए पर्याप्त समय पर चित्र रिकॉर्ड करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि कंप्यूटर में पर्याप्त डिस्क स्थान है।
  4. पृष्ठभूमि शोर को हटाने के लिए, प्रत्येक छवि से सभी रिकॉर्ड की गई छवियों का औसत घटाएं। ऐसा करने के लिए, एक मैट्रिक्स बनाएं जिसका परिणाम प्रत्येक पिक्सेल के लिए सभी छवियों की तीव्रता का योग है, और इसे छवियों की संख्या से विभाजित करें।
  5. प्रसंस्कृत छवि (आईएम) से, संख्यात्मक ढाल के मॉड्यूलस का निर्धारण करें और इसे नीचे परिभाषित अपने Equation 1 अधिकतम मूल्य(अधिकतम)द्वारा सामान्य करें।
    Equation 2 
    Equation 3
  6. बिनायराइज मैट्रिक्स बी को तीव्रता के माध्यम से, चरण 6.7-6.8 देखें।
  7. हर समय बिंदु के लिए, रिकॉर्ड बैक्टीरिया निर्देशांक (एक्स, वाई पिक्सेल या मिमी में) और छवि अधिग्रहण के समय को तीन कॉलम फ़ाइल में।
  8. अंत में, रिकॉर्ड किए गए डेटा को संसाधित करने और बैक्टीरिया के प्रक्षेप-पथ की गणना करने के लिए एक कण ट्रैकिंग स्क्रिप्ट लागू करें। उदाहरण के लिएस्थापित प्रोटोकॉल 19,और स्वतंत्र रूप से उपलब्ध मतलैब पार्टिकल ट्रैकिंग कोड का उपयोग करें: (http://site.physics.georgetown.edu/matlab/)।

8. जमाव प्रोफाइल के माध्यम से बैक्टीरियल फिल्ट्रेशन का अध्ययन करें

  1. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा जीएफपी-टैग पी पुटिडा KT2440 कोशिकाओं के जमाव प्रोफाइल प्राप्त करने के लिए, पहले पूरे छिद्रपूर्ण चैनल की एक समग्र छवि रिकॉर्ड, कि पृष्ठभूमि है, और microfluidic डिवाइस के माध्यम से जीवाणु निलंबन के इंजेक्शन के बाद । एक एक्सपोजर समय का उपयोग करें जो सिग्नल को ब्लीच किए बिना बैक्टीरियल फ्लोरोसेंट सिग्नल (जैसे 100 एमएस) प्राप्त करने की अनुमति देता है।
  2. वांछित सॉफ्टवेयर प्लेटफ़ॉर्म में निर्यात छवियां और आयात (6.1-6.2 देखें)।
  3. बैक्टीरियल इंजेक्शन के बाद दर्ज छवियों से पृष्ठभूमि निकालें।
  4. असुरक्षित चैनल के ट्रांसवर्सल वर्गों के साथ बनाए गए बैक्टीरिया के कुल फ्लोरेसेंस सिग्नल को एकीकृत करें।
  5. बयान प्रोफ़ाइल की गणना करने के लिए, एकीकृत फ्लोरेसेंस सिग्नल बनाम असुरक्षित चैनल लंबाई की साजिश करें।

9. पीएमएमए तरल उपकरणों और प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके बैक्टीरियल परिवहन का विश्लेषण करें

  1. 50 सेमी (1 मिमी आंतरिक व्यास) ट्यूबिंग का उपयोग करके इनलेट के साथ पेरिस्टाल्टिक पंप को कनेक्ट करें, और एक ही ट्यूबिंग (50 सेमी, धारा 4 देखें) का उपयोग करके स्वचालित डिस्पेंसर के साथ बहिर्वाह करें।
    नोट: खेती मीडिया बांटना करने के लिए पंप का उपयोग करें, और जीवाणु कोशिकाओं सुई । लगातार दर रिलीज के दौरान मध्यम और बैक्टीरियल निलंबन के बीच बदलाव करने के लिए Luer-लॉक कनेक्टर और तीन तरह के वाल्व का उपयोग करें ।
  2. फ्लूइड डिवाइस में पंप खेती माध्यम। रोबोट मशीन के लिए तय आउटलेट ट्यूबिंग पर माध्यम के आगमन पर ध्यान दें ।
  3. 0.2 मिलील मिन-1की प्रवाह दर पर पीएमएमए फ्लूइड डिवाइस के माध्यम से बैक्टीरियल सस्पेंशन इंजेक्ट करना शुरू करें,
  4. जब बैक्टीरिया तरल उपकरण इनलेट तक पहुंचने स्वचालित मशीन पर बारी।
  5. पल्स इंजेक्शन बनाने के लिए, कुछ पोर वॉल्यूम (जैसे 30) के लिए बैक्टीरियल सस्पेंशन इंजेक्ट करें, और फिर प्रयोग के अंत तक खेती मीडिया में इंजेक्शन स्विच करें।
    नोट: तरल उपकरण की पोर मात्रा लगभग 0.2 मिली हुई है, इस प्रकार पेशेवर प्रवाह दर पर हर मिनट एक पूरे पोर मात्रा का आदान-प्रदान किया जाता है।
  6. एक बार 96 अच्छी प्लेट पूरी हो जाने के बाद, वाष्पीकरण को कम करने के लिए प्लेट को कवर करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  7. स्थापित प्रोटोकॉल20के बाद, प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से बैक्टीरियल बहुतायत का विश्लेषण करें।
    नोट: उदाहरण के लिए, प्रत्येक कुएं में 0.025 m m m (अल्ट्रापुरे पानी में) पर हरे-फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड दाग (सामग्री की तालिका) के 25 माइक्रोन जोड़ें। यह बैक्टीरियल डीएनए को दाग देता है, इस प्रकार प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा बैक्टीरियल बहुतायत की मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देता है। अंधेरे में 15 मिनट के लिए नमूने इनक्यूबेट और फिर ५१५ एनएम पर एक ४८८ एनएम लेजर और डिटेक्टरों से लैस एक प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग कर विश्लेषण ।
  8. बीटीसी विश्लेषण से पहले, फिक्सेटिव और दाग के अलावा के कारण नमूने के कमजोर पड़ने पर विचार करें। फिक्सेटिव और दाग के लिए खाते में 1.35 के कारक द्वारा बैक्टीरियल बहुतायत को सही करें।

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Representative Results

प्रस्तुत कार्यप्रवाह की कार्यक्षमता को समझाने के लिए, हमने आनुवंशिक रूप से संशोधित स्यूडोमोनास पुटिडा KT2440 का उपयोग करके प्रयोग किए, जो बायोरेमेडिएशन और जैव प्रौद्योगिकी के लिए महत्वपूर्ण ग्राम नकारात्मक मोती जीवाणु है। इस तनाव के आनुवंशिक रूप से संशोधित संस्करण जो जीएफपी उत्पादन को व्यक्त करते हैं, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। पी पुटिडा KT2440 का एक गैर-मोटिवल तनाव जिसमें गतिशीलता के लिए प्रासंगिक संरचनात्मक और नियामक जीन का अभाव है, भी उपलब्ध है। दोनों का उपयोग करते हुए, मोती और गैर-मोती जीएफपी ने पी पुटिडा KT2440 को टैग किया, हमने पीडीएमएस माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में खंभे(चित्रा 1 बी)और रिकॉर्ड किए गए बीटीसीएस(चित्रा 2 ए)की एक यादृच्छिक सरणी के साथ अनुक्रमिक प्रयोग किए। बीटीसी को इंजेक्शन कोशिकाओं (सी0)की एकाग्रता के लिए सामान्यीकृत किया गया है। इसके साथ ही, पोर पैमाने पर बैक्टीरियल प्रक्षेप पथ छवि प्रसंस्करण और कण ट्रैकिंग के माध्यम से कल्पना के रूप में ऊपरवर्णित (चित्रा 2B)थे ।

इसके बाद, हमने पीएमएमए(चित्रा 1A)से बड़े पैमाने पर तरल उपकरणों के साथ प्रयोग किए। मोती और गैर-मोटिवल पी पुटिडा KT2440 (गैर-फ्लोरोसेंट) को नियमित रूप से दूरी वाले छिद्रित मैट्रिक्स में इंजेक्ट किया गया था और बीटीसी को तरल डिस्पेंसर और प्रवाह साइटोमेट्री गिनती का उपयोग करके प्राप्त किया गया था जैसा कि ऊपर वर्णित है(चित्रा 3 ए)। आश्चर्यजनक रूप से, बायोफिल्म से रहित एक छिद्रपूर्ण वातावरण में, मोटिवल और गैर-मोटिवल पी पुटिडा KT2440 ने एक स्पष्ट रूप से अलग परिवहन व्यवहार दिखाया। एक जटिल स्ट्रीम बायोफिल्म समुदाय के साथ 48h के लिए उपनिवेश एक असुरक्षित मैट्रिक्स में, मोती और गैर-मोती पी पुटिडा KT2440 के बीच बीटीसी में ये अंतर गायब हो गया(चित्रा 3 बी.)

Figure 1
चित्रा 1:तरल उपकरणों असुरक्षित मीडिया में माइक्रोबियल परिवहन का अध्ययन करने के लिए(A)पीएमएमए से मिल्ड एक तरल उपकरण का चित्रण। असुरक्षित मैट्रिक्स डिवाइस के आधार परत में मिल्ड है, ढक्कन शिकंजा का उपयोग कर बंद कर दिया है। एक क्रॉस सेक्शन तरल उपकरण के भीतर खंभे की व्यवस्था दिखाता है। सम्षित स्तंभों की एक नियमित दूरी ग्रिड और संबंधित वेग प्रवाह क्षेत्र के साथ एक छिद्रपूर्ण मैट्रिक्स से पता चलता है। (ख)पीडीएमएस डिवाइस एक माइक्रोस्कोपी ग्लास स्लाइड पर रखा गया है । दिखाया गया है कि क्रमशः मध्यम जलाशय और सिरिंज पंप से जुड़े इन-एंड आउटफ्लो हैं। सूक्ष्म गिनती के लिए अवलोकन कक्ष एक ही माइक्रोस्कोप स्लाइड पर एक छिद्रपूर्ण मैट्रिक्स के बिना एक अलग कक्ष के रूप में रखा गया है । डालने खंभे की एक यादृच्छिक सरणी (व्यास और रिक्ति में) के साथ एक असुरक्षित मैट्रिक्स से पता चलता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:पीडीएमएस फ्लूइडिक डिवाइस में चैनल और पोर स्केल पर बैक्टीरियल परिवहन (ए)मोटिवल के बीटीसीएस और गैर-मोटिवल पी पुटिडा केटी2440 (जीएफपी टैग) पीडीएमएस माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस और सूक्ष्म गणना के साथ प्राप्त किया गया। (ख)पोर पैमाने पर गैर-मोटिवल कोशिकाओं के प्रक्षेप-पथ। रंग प्रक्षेप पथ के भेदभाव को बढ़ाने के लिए चुना जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3::पीएमएमए फ्लूइडिक डिवाइस (ए)मोटिवल और नॉन-मोटिवल पी पुटिडा केटी2440 (नॉन टैग) में चैनल और पोर स्केल पर बैक्टीरियल ट्रांसपोर्ट पीएमएमए फ्लूइडिक डिवाइस और फ्लो-साइटोमेट्री काउंटिंग का उपयोग करके प्राप्त किया गया । (ख) तरल उपकरण को प्राकृतिक धारा समुदाय द्वारा 2 दिनों के लिए उपनिवेशित किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । 

अनुपूरक चित्रा 1: पीएमएमए फ्लूइड डिवाइस के तकनीकी चित्र। डिवाइस एक आधार असुरक्षित मैट्रिक्स और एक ढक्कन इनलेट और आउटलेट के लिए छेद की विशेषता इकाई युक्त इकाई से बना है । डिवाइस 12 शिकंजा और एक ओ-रिंग का उपयोग कर बंद है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां हम एकल सेल और जनसंख्या स्तर पर असुरक्षित प्रणालियों के माध्यम से रोगाणुओं के परिवहन का अध्ययन करने के लिए दो साधन सुझाते हैं । जबकि बीटीसी मॉडलिंग का उपयोग कर परिवहन घटनाओं के अध्ययन पारिस्थितिकी तंत्र तराजू पर रोगजनकों या प्रदूषकों के प्रसार में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है, प्रयोगशाला प्रयोगों से क्षेत्र की स्थिति के लिए पैमाने पर कठिनाइयों अभी भी मौजूद हैं । यहां वर्णित उपकरण शोधकर्ताओं को सूक्ष्म वातावरण में परिवहन के लिए प्रासंगिक रोगाणुओं की पारिस्थितिक रणनीतियों को बेहतर ढंग से समझने के लिए स्थानिक और लौकिक तराजू को व्यवस्थित रूप से हल करने की अनुमति देते हैं। प्रयोगकर्ता इन प्रणालियों का उपयोग या संशोधित कर सकते हैं ताकि गतिशीलता की तुलना में अन्य माइक्रोबियल लक्षणों का अध्ययन किया जा सके, जैसे कि केमोटैक्सिस या कोरम संवेदन या असुरक्षित मैट्रिक्स की ज्यामिति या अन्य आवास विशेषताओं को संशोधित करना। इसके अलावा, इन प्रणालियों का उपयोग कर बैक्टीरियल परिवहन व्यवहार आसानी से जमाव प्रोफाइल के लिए युग्मित किया जा सकता है, जो उपनिवेशीकरण पैटर्न में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं और यह समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं कि बायोफिल्म स्थानीय प्रवाह क्षेत्रों को कैसे संशोधित करते हैं। हम आशा करते हैं कि असुरक्षित मीडिया को तितर-बितर करने और उपनिवेश बनाने के लिए माइक्रोबियल रणनीतियों की बेहतर समझ मॉडल भविष्यवाणियों में सुधार करेगी और इस प्रकार रोगजनक प्रसार या संदूषक रोकथाम के प्रबंधन में योगदान देगी। प्रणाली के आगे संशोधन भी उपन्यास निस्पंदन उपकरणों या जैव प्रौद्योगिकी उपकरणों जिसमें कोशिकाओं को शारीरिक रूप से अलग करने की जरूरत के विकास में योगदान कर सकते हैं ।

हम बड़े और दीर्घकालिक प्रयोगों के लिए पीएमएमए आधारित उपकरणों और छोटे, छोटे अवधि के प्रयोगों के लिए पीडीएमएस आधारित उपकरणों की सलाह देते हैं या जब उच्च लौकिक संकल्प महत्वपूर्ण होता है। इस बात का ध्यान रखना होगा कि दोनों सामग्रियों में अलग-अलग गुण हों। उदाहरण के लिए पीडीएमएस ऑक्सीजन की तरह गैस के लिए पार पार करने योग्य है, जबकि पीएमएमए गैस तंग है । इस अंतर का उपयोग पीएमएमए परिदृश्य में गैस की खपत का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, जबकि पीडीएमएस प्रयोग के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है जहां बैक्टीरियल श्वसन से संबंधित ऑक्सीजन सीमाएं अवांछित हैं।

सामान्य तौर पर, यहां वर्णित प्रोटोकॉल आसानी से प्रजनन योग्य होते हैं और इन उपकरणों का उपयोग करके प्राप्त डेटा लगातार मोती और गैर-मोती बैक्टीरिया के परिवहन में अंतर का पता चलता है। स्व-निर्मित तरल डिस्पेंसर को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विकल्प द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है। हालांकि, बहुमुखी प्रतिभा और लागत प्रभावशीलता के कारणों के लिए हम यहां वर्णित एक की सिफारिश करते हैं। प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम मुख्य रूप से तरल उपकरणों की हैंडलिंग और छवि प्रसंस्करण के साथ अनुभव से संबंधित हैं। छवि विश्लेषण के माध्यम से प्राप्त डेटा की गुणवत्ता गंभीर रूप से छवि की गुणवत्ता (मुख्य रूप से फोकस और एक्सपोजर समय द्वारा निर्धारित) और एक उपयुक्त थ्रेसहोल्डिंग रणनीति पर निर्भर करती है। प्रवाह-साइटोमेट्रिक गिनती द्वारा प्राप्त डेटा गुणवत्ता गंभीर रूप से कोशिकाओं के प्रभावी फिक्सिंग और धुंधला और प्रवाह-साइटोमेट्री परिणामों की व्याख्या में विशेषज्ञता पर निर्भर करता है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

हम रोबोट मशीन और dispenser.py स्क्रिप्ट के सेटअप के साथ एंटोनी Wiedmer की मदद स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EDTA Sigma
Elastomer Sylgard 184 Dowsil 101697
Flow cytometer NovoCyte Acea
Glucose Sigma https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit
LB broth BD
Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit makeblock
Microscope Axio Imager Zeiss
Microscope AxioZoom v16 Zeiss
Microscope slides, 75 mm × 25 mm Corning
Minipuls 3 peristaltic pump Gilson
Plasma bonder Corona SB BlackHole Lab
Potassium phosphate Sigma
Syringe pump New Era NE 4000 New Era
Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain Molecular Probes, Invitrogen
Tygon tubing Ismatec
WF31SA universal milling machine Mikron

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References

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Scheidweiler, D., De Anna, P., Battin, T. J., Peter, H. Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales. J. Vis. Exp. (165), e60701, doi:10.3791/60701 (2020).

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