Summary
Le curve di svolta (BTC) sono strumenti efficienti per studiare il trasporto di batteri nei mezzi porosi. Qui introduciamo strumenti basati su dispositivi fluidici in combinazione con microscopia e conteggio citometrico del flusso per ottenere I BTC.
Abstract
Comprendere il trasporto, la dispersione e la deposizione di microrganismi nei mezzi porosi è un compito scientifico complesso che comprende argomenti diversi come l'idrodinamica, l'ecologia e l'ingegneria ambientale. La modellazione del trasporto batterico in ambienti porosi su diverse scale spaziali è fondamentale per prevedere meglio le conseguenze del trasporto batterico, ma i modelli attuali spesso non riescono a scalare da laboratorio a condizioni sul campo. Qui introduciamo strumenti sperimentali per studiare il trasporto batterico in mezzi porosi su due scale spaziali. Lo scopo di questi strumenti è quello di ottenere osservabili macroscopici (come curve rivoluzionarie o profili di deposizione) di batteri iniettati in matrici porose trasparenti. Su piccola scala (10-1000 μm), i dispositivi microfluidici sono combinati con la video-microscopia ottica e l'elaborazione delle immagini per ottenere curve rivoluzionarie e, allo stesso tempo, per tracciare singole cellule batteriche alla scala dei pori. Su scala più ampia, la citometria a flusso è combinata con un distributore robotico autoprofeso per ottenere curve rivoluzionarie. Illustriamo l'utilità di questi strumenti per capire meglio come i batteri vengono trasportati in complessi mezzi porosi come la zona iporeica dei corsi d'acqua. Poiché questi strumenti forniscono misurazioni simultanee su scale, aprono la strada a modelli basati su meccanismo, di fondamentale importanza per l'upscaling. L'applicazione di questi strumenti può non solo contribuire allo sviluppo di nuove applicazioni di biorimediazione, ma anche gettare nuova luce sulle strategie ecologiche dei microrganismi che colonizzano substrati porosi.
Introduction
Gli studi volti a comprendere il trasporto di microbi attraverso mezzi porosi sono stati principalmente guidati dapreoccupazioni di contaminazione 1,trasmissione dellamalattia 2 e biorimediazione3. A questo proposito, i batteri sono stati per lo più trattati come particelle neimodelli di trasporto 4 e processi come filtrazione, deformazione, sedimentazione gravitazionale o rimobilitazione da biofilm sono stati identificati come fattori di ritenzione o trasporto di microbi5. Tuttavia, studiare il trasporto di batteri attraverso paesaggi porosi può anche informarci sulle strategie ecologiche alla base del loro successo in questi ambienti complessi. Tuttavia, ciò richiede nuovi esperimenti e modelli matematici che operano a livello di singola cellula, popolazione o comunità microbica.
Gli ambienti porosi naturali, come quelli che si trovano nella zona iporeica di torrenti e fiumi, sono densamente colonizzati da diverse comunità di microbi biofilm-forming6. I biofilm formano strutture che modificano il flusso e quindi il trasporto e la dispersione dei batteri nella faseliquida 7,,8. Il trasporto di batteri su scala porosa dipende dalla limitata disponibilità di spazio nella matrice porosa e la dispersione legata alla motilità può essere un modo efficace per aumentare l'idoneità individuale attraverso una ridotta competizione per le risorse nelle aree meno densamente popolate. D'altra parte, i batteri motili possono anche raggiungere regioni più isolate della matrice porosa e l'esplorazione estesa di tali aree può fornire opportunità ecologiche alle popolazioni mobile10. Su scale spaziali più grandi, la crescita del biofilm devia i percorsi di flusso portando anche all'intasamento (parziale) dei pori e, quindi, alla creazione di condizioni di flusso ancora più canalizzate ed eterogenee11. Ciò ha conseguenze per l'approvvigionamento di nutrienti e la capacità di dispersione, la frequenza e la distanza. Il flusso preferenziale, ad esempio, può generare le cosiddette "corsie preferenziali" e i batteri motili possono raggiungere velocità ancora più elevate rispetto al flusso localelungo questi binari 12. Questo è un modo efficace per aumentare l'esplorazione di nuovi habitat.
Una varietà di strumenti si avvale dello studio del trasporto di batteri (e particelle) mobile e non mobile in mezzi porosi. I modelli numerici hanno grandi capacità predittive importanti per le applicazioni, tuttavia sono spesso limitati da ipotesi intrinseche4. Gli esperimenti su scaladi laboratorio 13,,14 combinati con la modellazione della curva di svolta (BTC) hanno fornito importanti spunti sull'importanza delle proprietà della superficie cellulare batterica per l'efficienza dell'incollaggio15. Tipicamente, i BTC (cioè, serie volte serie di concentrazione di particelle in un luogo fisso) sono ottenuti attraverso rilasci a velocità costante e misurazione del numero di cellule al deflusso del dispositivo sperimentale. In questo contesto, i BTC riflettono la dinamica di advezione-dispersione dei batteri nella matrice porosa e possono essere estesi da un termine di affondamento che rappresenta l'attaccamento. Tuttavia, la modellazione dei BTC da sola non risolve il ruolo dell'organizzazione spaziale del substrato poroso o del biofilm per i processi di trasporto. Altri osservabili macroscopici come la dispersività o i profili di deposizione hanno dimostrato di fornire informazioni importanti sulla distribuzione spaziale o sulle particelle trattenute o sulle comunità in crescita. La microfluidica è una tecnologia che consente di studiare il trasporto in mezzi porosi mediante indagine di microscopia9,12,16, e ad eccezione di un recente lavoro10, i sistemi sperimentali sono tipicamente vincolati a una singola scala di lunghezza di risoluzione, cioè la scala dei pori o l'intera scala del dispositivo fluido.
Qui, introduciamo una suite di metodi combinati per studiare il trasporto di batteri motili e non motili in paesaggi porosi su diverse scale. Combiniamo le osservazioni del trasporto batterico su scala dei pori con informazioni su larga scala, attraverso l'analisi BTC. I dispositivi microfluidici costruiti con litografia morbida utilizzando polidimetilsilossano (PDMS) sono bio-compatibili, resistenti a una vasta gamma di sostanze chimiche, consentono la replicabilità a bassi costi e forniscono un'eccellente trasparenza ottica e una bassa autofluorescenza critica per l'osservazione microscopica. La microfluidica a base di PDMS è stata precedentemente utilizzata per studiare il trasporto di microbi incanali semplici 17 o in geometrie più complesse12. Tuttavia, tipicamente gli esperimenti di microfluidica si concentrano su orizzonti a breve termine e l'osservazione microscopica dell'epi-fluorescenza delle cellule viventi è comunemente limitata a ceppi geneticamente modificati (ad esempio, ceppi taggati dalla GFP). Qui presentiamo strumenti per studiare il trasporto batterico utilizzando dispositivi microfluidici basati su PDMS in combinazione con microscopia e dispositivi più grandi fabbricati da poli (metacrilato metile) (PMMA, noto anche come plexiglass) in combinazione con citometria a flusso. PDMS e PMMA differiscono per permeabilità al gas e proprietà superficiali, offrendo così opportunità complementari per studiare il trasporto batterico. Mentre il dispositivo microfluidico fornisce un ambiente più controllato, il dispositivo più grande consente esperimenti per lunghi periodi di tempo o utilizzando comunità batteriche naturali. Il conteggio delle microscopie ad alta risoluzione temporale in un'area dedicata viene utilizzato per ottenere BTC nel dispositivo microfluidico basato su PDMS. Per ottenere il conteggio delle celle per la modellazione BTC dal dispositivo basato su PMMA, introduciamo un distributore automatico di liquidi autocostruito in combinazione con la citometria a flusso. In questa configurazione, le cellule passano il dispositivo fluido e vengono erogate consecutivamente in 96 piastre di pozzo. La risoluzione temporale è limitata dal volume minimo che può essere accuratamente eroso e quindi dalla portata media attraverso il dispositivo fluido. Il fissatore nei pozzi previene la crescita e facilita la colorazione del DNA per l'enumerazione citometrica a flusso a valle. Per prevenire la crescita batterica durante gli esperimenti di trasporto utilizziamo un mezzo minimo (termo buffer di motilità).
Poiché i protocolli per la preparazione di dispositivi fluidici su scale diverse sono prontamente disponibili, introduciamo solo brevemente le tecniche per produrre tali dispositivi e ci concentriamo piuttosto sulle procedure sperimentali per registrare i BTC. Allo stesso modo, esistono varie routine per l'enumerazione citometrica del flusso dei microbi e gli utenti richiedono conoscenze esperte per interpretare i risultati ottenuti dalla citometria del flusso. Reportiamo il nuovo uso di dispositivi microfluidici in combinazione con l'imaging microscopico per registrare I BTC di cellule con tag fluorescenti. Alla scala dei pori, le velocità e le traiettorie locali si ottengono attraverso l'elaborazione delle immagini. Inoltre, dimostriamo l'uso di un dispositivo fluido a base di PMMA in combinazione con il conteggio flusso-citometrico per osservare il trasporto batterico di cellule mobili e non mobili in ambienti porosi colonizzati da un biofilm a flusso nativo.
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Protocol
1. Condizioni di coltura batterica
- Lavorando sotto una cappa di flusso laminare, utilizzare 100 μL di uno stock di glicerolo di Pseudomonas putida KT2440 (1 × 107 mL-1,conservato a -80 °C) per inoculare 5 mL di mezzo Luria-Bertani (LB). Incubare a 30 °C mentre si trema a 250 giri/min durante la notte.
- Il giorno successivo, resospend 100 μL della coltura notturna in mezzo LB da 5 mL e incubare nelle stesse condizioni per 5h (fase esponenziale). Campionare un'aliquota di 1 mL in un tubo da 2 ml, lasciare raffreddare a temperatura ambiente (~15 min) e centrifugare (2300 x g per 5 min).
- Rimuovere il supernatante e aggiungere un tampone di motilità da 1 mL al pellet. Vortice brevemente per omogeneizzare il campione. Diluire per raggiungere la concentrazione cellulare desiderata, ad esempio 5 x 105 mL-1.
- Per esperimenti che coinvolgono comunità naturali, come quelle derivate da corsi d'acqua, preparare un mezzo di coltivazione non selettivo. Ad esempio, utilizzare acqua di flusso filtrata sterile e autoclavata o un mezzo d'acqua a flusso artificiale modificato con una complessa fonte di carbonio (mezzo LB).
2. Preparazione di un dispositivo microfluidico in polidimetilsilossano (PDMS)
- Progettare la geometria porosa desiderata tramite il software CAD (Computer-Aided Drafting)18, costituito da una matrice di cerchi (cioè l'ostacolo impermeabile al flusso), descritta dalle dimensioni del raggio e dalle coordinate del centro.
NOTA: Un esempio di geometria porosa con grani e pori randomizzati è fornito nella figura 1A. Un canale di osservazione senza ostacoli vicino all'uscita facilita l'acquisizione di BTC. - In base alla geometria scelta, preparare uno stampo utilizzando la fotolitografia STANDARD SU-818.
NOTA: In alternativa, gli stampi possono anche essere ordinati da un impianto di microfabbricazione dedicato. Per ottenere un flusso di fluido eterogeneo nel piano orizzontale, è importante progettare lo spessore della camera microfluidica dello stesso ordine di grandezza della dimensione media della gola dei pori. Tuttavia, assicurarsi che le dimensioni del dispositivo microfluidico siano adatte per l'osservazione al microscopio (ad esempio, lavorare su diapositive al microscopio). - Preparare 50 g di PDMS aggiungendo il 10% del cross linker (dimetil, metilidrogeno siloxane copolimero) al 90% di elastomero in peso, usando una siringa senza ago. Lavorare in condizioni pulite ed evitare il più possibile la polvere. Mescolare i due reagenti in un contenitore monouso pulito e applicare il vuoto (100 mbar) per 30 minuti per rimuovere l'aria disciolta e le bolle dal PDMS viscoso.
- Posizionare lo stampo in una piastra di Petri (100 mm di diametro, 15 mm di altezza). Versare il PDMS sullo stampo all'altezza desiderata (ad esempio, 2-5 mm). Coprire la piastra di Petri e tenerla a 60 °C per 4 ore (durante la notte per strati più spessi) da curare.
NOTA: Ai fini della visualizzazione, la luce dovrebbe essere in grado di passare attraverso il PDMS, quindi è auspicabile uno strato sottile tra 2 mm e 5 mm. Gli strati più spessi (>5 mm) riducono la trasparenza del dispositivo e quelli più sottili vengono sottoposti a deformazioni durante l'applicazione. - Rimuovere lo stampo dal forno e lasciare raffreddare il dispositivo microfluidico a temperatura ambiente. Una volta raffreddato, rimuovere con cura la porzione desiderata di PDMS con un bisturi.
NOTA: Forti pressioni sullo stampo si traducono in fratture dello stampo. Non toccare il PDMS a mani nude, poiché le impronte digitali influenzeranno la trasparenza ottica. - Sigillare temporaneamente la parte inferiore del canale PDMS (dove è stata incisa la geometria desiderata) con il nastro adesivo. Con un punzonatore per biopsia da 0,5 mm di diametro, perforare il canale microfluidico per creare un'ingresso e una presa che si adattano ai tubi da 0,5 mm (diametro interno).
NOTA: La morbidezza del PDMS garantirà la tenuta una volta inserito il tubo. I canali di ingresso e di uscita non possono essere effettuati dopo che il PDMS è stato sigillato sul vetro. - Sigillare il canale microfluidico tramite incollaggio al plasma di ossigeno utilizzando il generatore ad alta frequenza (legame al plasma, Tabella dei materiali). Per questo, pulire uno scivolo di vetro silicato (25 mm x 75 mm) con etanolo e lasciarlo asciugare. Rimuovere il nastro dal canale PDMS e posizionare il canale con il lato poroso rivolto verso l'alto. Trattare lo scivolo di vetro silicato e le superfici PDMS con plasma per circa 45 s a temperatura ambiente.
- Posizionare il canale PDMS sullo scivolo di vetro silicato e riscaldare a 100 °C per 30 minuti su una piastra calda.
- Rimuovere il dispositivo microfluidico dalla piastra calda e raffreddarlo a temperatura ambiente. Collegare l'ingresso del canale PDMS con i tubi. Applicare il vuoto per 30 minuti per rimuovere l'aria dal PDMS, che è quasi impermeabile ai fluidi ma permeabile al gas.
- Preparare 100 ml di tampone di motilità (fosfato di potassio da 10 mM, 0,1 mM EDTA, integrato con 1% di glucosio, pH 7,0) e iniettarvi 1 ml nel dispositivo microfluidico utilizzando una pompa per siringhe azionata a 10 μL min-1.
NOTA: Poiché il PDMS è sottosaturo di gas (a causa del precedente passaggio sottovuoto), le bolle scompariranno entro ~ 30 minuti.
3. Preparazione di un dispositivo fluido in poli (metacrilato metile)
- Progettare la geometria desiderata con il software CAD. Se del caso, assicurarsi che le dimensioni siano adatte per l'osservazione al microscopio (ad esempio, dimensioni di una piastra standard da 96 pomp porsi in combinazione con un supporto appropriato). Il dispositivo fluido è composto da una base (127 × 127 × 12 mm) e da un coperchio (127 × 127 × 12 mm) di PMMA.
NOTA: Si consiglia l'esperienza con il software CAD. Un disegno tecnico di esempio è fornito nella figura 1A. - Per produrre il vano poro, mediante micromillazione ad alta precisione (WF31SA, Mikron), rimuovere 0,5 mm dallo strato PMMA inferiore e fresare una scanalatura (1,1 × 1,1 mm) per un O-ring in gomma. Praticare 12 fori filettati (M5). Questo servirà come base del dispositivo fluido.
NOTA: Le dimensioni del dispositivo fluido devono essere regolate per adattarsi allo stadio del microscopio e alla distanza focale. Un disegno tecnico è fornito nella figura S1. - Praticare due fori filettati (tipo 1/4-28UNF) per l'ingresso e l'uscita nella parte superiore del dispositivo fluido e 12 fori (5,5 mm) per le viti. Questo servirà come coperchio del dispositivo fluido.
NOTA: È consigliabile l'esperienza nella micro-fresatura; gli autori utilizzano il supporto di un workshop specializzato. - Per pulire e sterilizzare il dispositivo fluido prima e dopo ogni utilizzo, immergere la base e il coperchio del dispositivo fluido in HCl 7% e risciacquare tre volte con acqua deionizzata.
- Vite base e coperchio insieme utilizzando i 12 fori filettati.
4. Installazione del distributore automatico
NOTA: I distributori di liquidi disponibili in commercio sono costosi e spesso non offrono la flessibilità di erogare direttamente dal deflusso del dispositivo fluido. Pertanto, si consiglia di assemblare un sistema di erogazione robotico economico e flessibile da un robot plotter XY (tavolo dei materiali).
- Per erogare il deflusso dal dispositivo fluido in piastre a 96 pozzetti, montare il distributore robotico su una piastra PMMA e cavità di lavorazione di 85,8 x 128 mm con una profondità di 1 mm per contenere diverse piastre di pozzo 96.
- Collegare il tubo di deflusso del dispositivo fluido al braccio robotico del distributore.
- Per utilizzare il distributore robotico scaricare bCNC da github: https://github.com/vlachoudis/bCNC seguire le istruzioni per installare il programma.
- Scarica dispenser.py dal materiale di supporto di questo articolo.
NOTA: Questo codice python fornisce un plug-in a bCNC per un semplice layout di dispenser robotico. - Collegare il distributore robotico al computer che esegue bCNC e identificare la porta COM corretta.
- In bCNC, fare clic sul pulsante Home per riportare il distributore robotico nella posizione di casa.
NOTA: Homing riporta il distributore robotico in una posizione nota (x=0, y=0) e quindi migliora la precisione del distributore. - Prima dell'esperimento, preparare un numero sufficiente di 96 piastre di pozzo, con pozzi contenenti una quantità appropriata di fissivo (ad esempio, concentrazione finale 3,7% formaldeide).
NOTA: Ad esempio, ad una portata di 0,2 mL min-1, 100 μL vengono erogati in ogni pozzo ogni 30 s. Pertanto, aggiungere 10 μL di formaldeide al 37% ad ogni pozzo per raggiungere una concentrazione finale di formaldeide tra il 2 e il 4%. L'utilizzo di otto piastre di pozzo 96 consentirà di far funzionare l'esperimento per più di 6 ore con un totale di 768 punti dati. Inoltre, si noti che le cellule taggate da GFP possono perdere il loro segnale fluorescente dopo la fissazione usando la formaldeide.
5. Analizzare il trasporto batterico utilizzando dispositivi microfluidici PDMS
- Posizionare il dispositivo microfluidico PDMS precedentemente saturo con il buffer di motilità sullo stadio del microscopio. Utilizzare il nastro adesivo per fissare i tubi per ridurre al minimo il disturbo del flusso durante il movimento dello stadio.
- Spostare lo stadio del microscopio nel canale di osservazione vicino alla presa. Utilizzando la microscopia a campo luminoso o il contrasto di fase, mettere a fuoco il centro del canale di osservazione e regolare l'ingrandimento per visualizzare singole cellule batteriche.
- Passare le impostazioni del percorso della luce alla microscopia a fluorescenza e regolare il tempo di esposizione della fotocamera per risolvere singole cellule batteriche (ad esempio 100 ms), o in modo che i segnali di fluorescenza delle cellule siano almeno 3 volte più forti del rumore di fondo.
- Quindi, inserire il tubo di ingresso in un tubo da 2 ml contenente la sospensione batterica. Invertire la direzione della pompa e iniziare a ritirare la sospensione ad una portata di 1 μL min-1.
- Scansiona la sezione trasversale dell'intero canale di osservazione registrando un'immagine composita ogni 2 minuti, per l'intera durata dell'esperimento.
6. Elaborazione di base delle immagini
NOTA: L'obiettivo di queste routine di elaborazione delle immagini di base è contare il numero di batteri nelle immagini registrate. Le procedure di lavorazione ottimali dipendono dalle specifiche tecniche del microscopio e della telecamera, nonché dalle proprietà di fluorescenza del ceppo batterico utilizzato nell'esperimento e devono quindi essere regolate.
- Esportare innanzitutto le immagini in .tiff formato.
- Importa immagini su una piattaforma software desiderata (ad esempio MATLAB, ImageJ, R o Python).
- Rimuovere il rumore della fotocamera, che è una variazione casuale dell'intensità dei pixel nelle immagini e corretto per l'aberrazione ottica. Questo può essere fatto applicando un filtro gaussiano a ogni immagine: la dimensione del filtro dipende dalla qualità del sensore della fotocamera (ad esempio CCD o CMOS). L'aberrazione ottica può essere rimossa normalizzando ogni immagine con un'immagine di riferimento raccolta in assenza del campione con la stessa configurazione ottica.
- Ritagliare le immagini in un'area di interesse.
- Identificare un valore di soglia (intensità in pixel), in modo che i valori al di sopra della soglia includano cellule batteriche.
NOTA: Nel caso in cui le immagini siano illuminate in modo non uniforme (a causa dell'aberrazione ottica o del rumore) può essere utile applicare una soglia adattiva, che sceglie un valore di soglia in base alle intensità media locali. - Sottrarre da ogni immagine la soglia definita sopra.
- Binarizzare l'immagine risultante, in modo che le cellule batteriche prendano un valore pari a 1, mentre lo sfondo assume un valore pari a 0.
- Rimuovere i cluster con un'area più piccola della dimensione più piccola delle cellule batteriche.
- Sommare l'immagine binarizzata per ottenere il numero totale di pixel dei cluster rimanenti. Dividi il numero di pixel per la dimensione media (in pixel) di una cella batterica: fornisce una stima del numero totale di cellule.
- Conoscendo la profondità di vista e l'area di indagine, i conteggi delle trasformazioni in concentrazione (particelle mL-1).
- È fondamentale identificare la concentrazione della sospensione batterica iniettata. Per fare questo, iniettare con una siringa 1 ml di sospensione di coltura batterica nel canale di osservazione di un dispositivo microfluidico pulito. Registrare l'immagine e calcolare la concentrazione batterica influente (C0)come descritto sopra (da 6.1 a 6.10).
- Analizzare i CTC normalizzando la concentrazione batterica degli effluenti (C) con concentrazione batterica influente (C0)e la trama C/C0 rispetto al tempo.
7. Analizzare il trasporto batterico sulla scala dei pori
- Al fine di analizzare le velocità locali e le traiettorie dei batteri trasportati attraverso la matrice porosa, spostare lo stadio del microscopio nella regione di interesse e regolare la messa a fuoco al centro del dispositivo microfluidico.
- Impostare il microscopio sul campo luminoso o sul contrasto di fase.
NOTA: Questo solo nel caso in cui il segnale di fluorescenza della cellula batterica non consenta di registrare immagini a un tempo di esposizione inferiore al tempo batterico medio, altrimenti utilizzare la microscopia a fluorescenza. - Registra immagini time-lapse, al momento dell'esposizione che cattura lo spostamento dei batteri (più breve dello spostamento medio su un numero di pixel inferiore alle dimensioni dell'oggetto) e che ottimizza il rilevamento delle cellule batteriche (ad esempio l'esposizione di 20 ms e le immagini registrate ogni 50 ms). Registrare le immagini in un lasso di tempo sufficiente per registrare abbastanza (per essere statisticamente rappresentativi) delle traiettorie più lente (ad esempio 3 min).
NOTA: assicurarsi che il computer abbia abbastanza spazio su disco. - Per rimuovere il rumore di fondo, sottrarre da ogni immagine la media di tutte le immagini registrate. A tale scopo, creare una matrice il cui risultato è la somma dell'intensità di tutte le immagini, per ogni pixel, e dividerla per il numero di immagini.
- Dall'immagine elaborata (Im), determinare il modulo del gradiente numerico
e normalizzarlo in base al valore massimo (max), come definito di seguito.
- Binarizzare la matrice B tramite soglia di intensità, vedere i passaggi 6.7-6.8.
- Per ogni punto di tempo, registrare le coordinate dei batteri (x, y in pixel o mm) e il tempo di acquisizione dell'immagine in un file a tre colonne.
- Infine, applicare uno script di tracciamento delle particelle per elaborare i dati registrati e calcolare le traiettorie dei batteri. Ad esempio, utilizzare il protocollostabilito 19e il codice di tracciamento delle particelle Matlab liberamente disponibile: (http://site.physics.georgetown.edu/matlab/).
e normalizzarlo in base al valore massimo (max), come definito di seguito.
8. Studiare la filtrazione batterica mediante profili di deposizione
- Per ottenere profili di deposizione di cellule P. putida KT2440 taggate da GFP mediante microscopia a fluorescenza, registrare un'immagine composita dell'intero canale poroso prima, cioè lo sfondo, e dopo l'iniezione di sospensione batterica attraverso il dispositivo microfluidico. Utilizzare un tempo di esposizione che consenta di acquisire segnale fluorescente batterico (ad esempio 100 ms), senza sbiancare il segnale.
- Esportare immagini e importare nella piattaforma software desiderata (vedere 6.1-6.2).
- Rimuovere lo sfondo dalle immagini registrate dopo l'iniezione batterica.
- Integrare il segnale di fluorescenza totale dei batteri trattenuti lungo sezioni trasversali del canale poroso.
- Per calcolare il profilo di deposizione, tracciare il segnale di florescence integrato rispetto alla lunghezza del canale poroso.
9. Analizzare il trasporto batterico utilizzando dispositivi fluidici PMMA e citometria del flusso
- Collegare la pompa peristaltica con l'ingresso utilizzando tubi da 50 cm (1 mm di diametro interno) e il deflusso con il distributore automatico utilizzando lo stesso tubo (50 cm, vedere sezione 4).
NOTA: Utilizzare la pompa per erogare mezzi di coltivazione e per iniettare cellule batteriche. Utilizzare connettori di blocco Luer e valvole a tre vie per spostarsi tra sospensioni medie e batteriche durante il rilascio a velocità costante. - Pompare il mezzo di coltivazione nel dispositivo fluido. Si noti l'arrivo del mezzo al tubo di uscita fissato al distributore robotico.
- Iniziare a iniettare la sospensione batterica attraverso il dispositivo fluido PMMA ad una portata di 0,2 mL min-1,
- Quando i batteri raggiungono l'ingresso del dispositivo fluido, accendere il distributore automatico.
- Per effettuare un'iniezione di impulsi, iniettare sospensioni batteriche per alcuni volumi di pori (ad esempio 30), quindi passare l'iniezione ai mezzi di coltivazione fino alla fine dell'esperimento.
NOTA: il volume dei pori del dispositivo fluido è di circa 0,2 mL, quindi alla portata prosa ogni minuto viene scambiato un intero volume di pori. - Una volta completata una piastra di 96 pozzeri, coprire la piastra per ridurre l'evaporazione e conservarla a 4 °C.
- Analizzare l'abbondanza batterica tramite citometria del flusso, seguendo i protocollistabiliti 20.
NOTA: Ad esempio, aggiungere 25 μL della macchia di acido nucleico verde-fluorescente (Tabella dei materiali) a 0,025 mM (in acqua ultrapura) a ciascun pozzo. Macchia il DNA batterico, permettendo così di quantificare per citometria del flusso l'abbondanza batterica. Incubare campioni per 15 minuti al buio e quindi analizzare utilizzando un citometro a flusso dotato di un laser a 488 nm e rivelatori a 515 nm. - Prima dell'analisi BTC, considerare la diluizione del campione dovuta all'aggiunta di fissante e macchia. Correggere l'abbondanza batterica di un fattore di 1,35 per tenere conto della fissazione e della macchia.
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Representative Results
Per illustrare la funzionalità del flusso di lavoro presentato, abbiamo eseguito esperimenti utilizzando Pseudomonas putida KT2440 geneticamente modificato, un batterio motile gram negativo importante per la bioremediazione e la biotecnologia. Le versioni geneticamente modificate di questo ceppo che esprimono la produzione di FPG sono disponibili in commercio. È disponibile anche un ceppo non mobile di P. putida KT2440 che manca dei geni strutturali e regolatori rilevanti per la motilità. Utilizzando sia P. putida KT2440 taggato GFP mobile che non mobile, abbiamo eseguito esperimenti sequenziali in dispositivi microfluidici PDMS con una serie casuale di pilastri (Figura 1B) e CTC registrati (Figura 2A). I BTC sono stati normalizzati alla concentrazione di cellule iniettate (C0). Contemporaneamente, le traiettorie batteriche sulla scala dei pori sono state visualizzate attraverso l'elaborazione delle immagini e il tracciamento delle particelle come descritto sopra (Figura 2B).
Successivamente, abbiamo eseguito esperimenti con dispositivi fluidici su larga scala fresati dal PMMA (Figura 1A). Motile e non-motile P. putida KT2440 (non fluorescente) sono stati iniettati in una matrice porosa regolarmente distanziata e i BTC sono stati ottenuti utilizzando il distributore di liquidi e il conteggio della citometria del flusso come descritto sopra (Figura 3A). Sorprendentemente, in un ambiente poroso privo di biofilm, p. putida KT2440 mobile e non mobile ha mostrato un comportamento di trasporto marcatamente diverso. In una matrice porosa colonizzata per 48h con una complessa comunità di biofilm a flusso, queste differenze nel BTC tra motile e non-motile P. putida KT2440 scomparvero(Figura 3B.)
Figura 1: Dispositivi fluidici per lo studio del trasporto microbico in mezzi porosi (A) Illustrazione di un dispositivo fluido fresato dal PMMA. La matrice porosa viene fresata nello strato di base del dispositivo, il coperchio viene chiuso utilizzando viti. Una sezione trasversale mostra la disposizione dei pilastri all'interno del dispositivo fluidico. L'inserto mostra una matrice porosa con una griglia regolare di pilastri distanziati e il rispettivo campo di flusso di velocità. (B) Il dispositivo PDMS è montato su un vetrino al microscopio. Sono indicati rispettivamente l'afflusso e il deflusso, collegati rispettivamente al serbatoio medio e alla pompa della siringa. La camera di osservazione per il conteggio microscopico è posta come una camera separata senza una matrice porosa sullo stesso vetrino del microscopio. L'inserto mostra una matrice porosa con una matrice casuale di pilastri (di diametro e spaziatura). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Trasporto batterico su scala di canali e pori nel dispositivo fluido PDMS (A)BTC di motile e non mobile P. putida KT2440 (tagGFP) ottenuto con un dispositivo microfluidico PDMS e conteggio microscopico. (B) Traiettorie di cellule non motili alla scala dei pori. I colori vengono scelti per migliorare la differenziazione delle traiettorie. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3:Trasporto batterico su scala di canalie pori nel dispositivo fluido PMMA (A)CCI di motile e non motile P. putida KT2440 (non taggato) ottenuti utilizzando un dispositivo fluido PMMA e il conteggio flusso-citometria. (B) Il dispositivo fluido è stato colonizzato da una comunità di flusso naturale per 2 giorni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura complementare 1: Disegni tecnici del dispositivo fluido PMMA. Il dispositivo è composto da un'unità di base contenente la matrice porosa e da un coperchio con i fori per l'ingresso e l'uscita. Il dispositivo è sigillato utilizzando 12 viti e un O-ring. Clicca qui per scaricare questa cifra.
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Discussion
Qui suggeriamo due mezzi per studiare il trasporto di microbi attraverso sistemi porosi a livello di singola cellula e popolazione. Mentre lo studio dei fenomeni di trasporto mediante modellazione BTC ha fornito preziose informazioni sulla diffusione di agenti patogeni o contaminanti su scala ecosistemica, esistono ancora difficoltà da scalare dagli esperimenti di laboratorio alle condizioni sul campo. Gli strumenti qui descritti consentono ai ricercatori di risolvere sperimentalmente le scale spaziali e temporali al fine di comprendere meglio le strategie ecologiche dei microbi rilevanti per il trasporto in ambienti porosi. Gli sperimentatori possono usare o modificare questi sistemi per studiare altri tratti microbici oltre alla motilità, come la chemiotassi o il rilevamento del quorum o modificare la geometria o altre caratteristiche dell'habitat della matrice porosa. Inoltre, utilizzando questi sistemi il comportamento di trasporto batterico può essere facilmente accoppiato ai profili di deposizione, che forniscono importanti informazioni sui modelli di colonizzazione e sono fondamentali per capire come i biofilm modificano i campi di flusso locali. Prevediamo che una migliore comprensione delle strategie microbiche per disperdere e colonizzare i mezzi porosi migliorerà le previsioni del modello e contribuirà quindi alla gestione della diffusione degli agenti patogeni o del contenimento dei contaminanti. Ulteriori modifiche del sistema possono anche contribuire allo sviluppo di nuovi dispositivi di filtrazione o strumenti biotecnologici in cui le cellule devono essere fisicamente separate.
Consigliamo dispositivi basati su PMMA per esperimenti di grandi dimensioni e a lungo termine e dispositivi basati su PDMS per esperimenti più piccoli e a breve termine o quando l'alta risoluzione temporale è fondamentale. Va tenuto presente che i due materiali hanno proprietà diverse. Ad esempio il PDMS è permeabile al gas come l'ossigeno, mentre il PMMA è a tenuta di gas. Questa differenza potrebbe essere utilizzata per studiare il consumo di gas nello scenario PMMA, mentre il PDMS potrebbe essere più adatto per sperimentare dove le limitazioni di ossigeno legate alla respirazione batterica sono indesiderate.
In generale, i protocolli qui descritti sono facilmente riproducibili e i dati ottenuti utilizzando questi strumenti rivelano costantemente differenze nel trasporto di batteri motili e non motili. Il distributore di liquidi autoprodito può essere sostituito da un'alternativa disponibile in commercio. Tuttavia, per motivi di versatilità ed economicità consigliamo quello descritto qui. Le fasi critiche del protocollo riguardano principalmente la gestione dei dispositivi fluidici e l'esperienza con l'elaborazione delle immagini. La qualità dei dati ottenuti attraverso l'analisi delle immagini dipende in modo critico dalla qualità dell'immagine (determinata principalmente dalla messa a fuoco e dal tempo di esposizione) e da un'adeguata strategia di soglia. La qualità dei dati ottenuta dal conteggio flusso-citometrico dipende in modo critico da un efficace fissaggio e colorazione delle cellule e dall'esperienza nell'interpretazione dei risultati flusso-citometria.
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Disclosures
Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Riconosciamo l'aiuto di Antoine Wiedmer con l'installazione del distributore robotico e la dispenser.py script.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA | Sigma | ||
| Elastomer Sylgard 184 | Dowsil | 101697 | |
| Flow cytometer NovoCyte | Acea | ||
| Glucose | Sigma | https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit | |
| LB broth | BD | ||
| Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit | makeblock | ||
| Microscope Axio Imager | Zeiss | ||
| Microscope AxioZoom v16 | Zeiss | ||
| Microscope slides, 75 mm × 25 mm | Corning | ||
| Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | ||
| Plasma bonder Corona SB | BlackHole Lab | ||
| Potassium phosphate | Sigma | ||
| Syringe pump New Era NE 4000 | New Era | ||
| Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | Molecular Probes, Invitrogen | ||
| Tygon tubing | Ismatec | ||
| WF31SA universal milling machine | Mikron |
References
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