Summary
획기적인 곡선(BtC)은 다공성 미디어에서 박테리아의 운반을 연구하는 효율적인 도구입니다. 여기에서는 현미경 검사법과 유동 세포계 계수와 함께 유체 장치를 기반으로 한 도구를 소개하여 BtC를 획득합니다.
Abstract
다공성 미디어에서 미생물의 운송, 분산 및 증착을 이해하는 것은 유체 역학, 생태 및 환경 공학과 같은 다양한 주제로 구성된 복잡한 과학적 과제입니다. 다양한 공간 비늘에서 다공성 환경에서 세균 수송을 모델링하는 것은 세균 수송의 결과를 더 잘 예측하는 데 매우 중요하지만 현재 모델은 종종 실험실에서 현장 조건으로 확장하지 못합니다. 여기서는 두 개의 공간 비늘에서 다공성 매체의 세균 수송을 연구하는 실험 도구를 소개합니다. 이러한 도구의 목적은 투명 다공성 행렬에 주입 된 박테리아의 거시적 인 관찰물 (예 : 획기적인 곡선 또는 증착 프로파일)을 얻는 것입니다. 작은 규모(10-1000 μm)에서 미세유체 장치는 광학 비디오 현미경 및 이미지 처리와 결합되어 획기적인 곡선을 얻고 동시에 개별 세균 세포를 모공 스케일로 추적합니다. 더 큰 규모로, 유동 세포측정은 획기적인 곡선을 얻기 위해 자체 제작 로봇 디스펜서와 결합됩니다. 우리는 박테리아가 스트림의 저압 영역과 같은 복잡한 다공성 매체에서 어떻게 운반되는지 더 잘 이해하기 위해 이러한 도구의 유용성을 보여줍니다. 이러한 도구는 스케일 전반에 걸쳐 동시 측정을 제공하므로 업스케일링에 매우 중요한 메커니즘 기반 모델을 위한 길을 열어줍니다. 이러한 도구의 적용은 새로운 생물 교정 응용 프로그램의 개발에 기여할뿐만 아니라 다공성 기판을 식민지화 하는 미생물의 생태 전략에 새로운 빛을 발산 할 수 있습니다.
Introduction
다공성 매체를 통한 미생물의 수송을 이해하는 것을 목표로 하는 연구는 주로 오염1,질병2 및 생물 교정3의전염에 대한 우려에 의해 주도되었다. 이와 관련하여, 박테리아는 주로 수송 모델4에서 입자로 취급되고 있으며, 생물막으로부터여비, 긴장, 중력 침전 또는 재동원과 같은 공정은 미생물의 유지 또는 수송의 동인으로 확인되었다5. 그러나 다공성 경관을 통해 박테리아의 수송을 연구하는 것은 또한 이러한 복잡한 환경에서 성공을 뒷받침하는 생태 전략에 알려줄 수 있습니다. 그러나, 이것은 단 하나 세포, 인구 또는 미생물 지역 사회 수준에서 작동하는 새로운 실험 및 수학 모형을 요구합니다.
하천과 하천의 저압 구역에서 발견되는 것과 같은 자연 다공성 환경은 생물막 형성 미생물6의다양한 지역 사회에 의해 조밀하게 식민지화된다. 생물막은 액체 상7,,8에서박테리아의 흐름을 수정하고 따라서 박테리아의 수송 및 분산구조를 형성한다. 모공 규모에서 박테리아의 수송은 다공성 매트릭스및 운동성 관련 분산물의 제한된 공간 가용성에 따라 달라지며, 인구밀도가 낮은 지역에서 자원에 대한 경쟁 감소를 통해 개별 체력을 높이는 효과적인 방법이 될 수 있다. 한편, 운동성 균은 다공성 매트릭스의 더 고립된 영역에 도달할 수 있으며, 이러한 지역의 확장된 탐사는운동인구(10)에생태학적 기회를 제공할 수 있다. 더 큰 공간 비늘에서, 생물막 성장은 또한 모공의 (부분) 막힘으로 이어지는 흐름 경로를 전환하고, 따라서, 더욱 집중화및 이질적인 유량조건(11)의확립에 이르게 한다. 이것은 영양 공급 및 분산 용량, 주파수 및 거리에 대한 결과를 초래합니다. 예를 들어, 우대 흐름은 소위 "패스트 트랙"을 생성할 수 있으며, 운동균은 이트랙(12)을따라 로컬 흐름보다 더 높은 속도를 달성할 수 있다. 이것은 새로운 서식지의 탐험을 증가시키는 효과적인 방법입니다.
다양한 도구는 다공성 매체에서 운동및 비운동성 박테리아(및 입자)의 수송을 연구하기 위해 이용합니다. 수치 모델은 응용 프로그램에 중요한 훌륭한 예측 능력을 가지고 있지만, 종종 고유의 가정4에의해 제한됩니다. 실험실 규모 실험13,,14와 획기적인 곡선(BTC) 모델링이 결합되어 고착효율(15)을위한 세균세포 표면 특성의 중요성에 중요한 통찰력을 제공한다. 전형적으로, BtC(즉, 고정된 위치에서 입자 농도의 시간 시리즈)는 실험 장치의 유출시 셀 번호의 일정 속도 방출 및 측정을 통해 얻어진다. 이러한 맥락에서, BtC는 다공성 매트릭스내 박테리아의 흡착-분산 역학을 반영하고 부착을 고려한 싱크 용어에 의해 확장될 수 있다. 그러나, 혼자 BtC의 모델링은 운송 공정을 위한 다공성 기질 또는 생물막의 공간 조직의 역할을 해결하지 못합니다. 분산성 또는 증착 프로파일과 같은 다른 거시적 관찰은 공간 분포 또는 유지된 입자 또는 성장하는 커뮤니티에 대한 중요한 정보를 제공하는 것으로 입증되었습니다. 미세유체는 현미경 조사9,12,,16에의해 다공성 미디어에서 수송을 연구할 수 있는 기술이며, 최근작업(10)을제외하고, 실험 시스템은 전형적으로 단일 길이의 해상도, 즉, 기공 스케일 또는 전체 유체 장치 스케일로 제한된다.,
여기서는 다양한 비늘의 다공성 풍경에서 모틸류 와 비 운동성 박테리아의 수송을 연구하는 결합 된 방법의 제품군을 소개합니다. 우리는 BTC 분석을 통해 더 큰 규모의 정보와 모공 규모에서 세균 수송의 관찰을 결합합니다. 폴리디메틸실록산(PDMS)을 사용하여 연약한 리소그래피로 제작된 미세유체 장치는 다양한 화학 물질에 대한 생체 적합성, 낮은 비용으로 복제성을 허용하며, 미세한 관찰에 중요한 낮은 광학 적 투명성뿐만 아니라 낮은 광학 적 투명성을 제공합니다. PDMS에 기초한 미세 유체학은 이전에 간단한채널(17) 또는 더 복잡한 기하학(12)에서 미생물의 수송을 연구하는 데 사용되어 왔다.12 그러나, 전형적으로 미세유체학 실험은 살아있는 세포의 단기 지평선 및 에피 형광 현미경 관측에 초점을 맞추고 일반적으로 유전자 변형 균주(예를 들어, GFP 태그된 균주)로 제한됩니다. 여기서 우리는 유동 세포측정과 함께 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA, 플렉시유리라고도 함)에서 제작된 현미경 검사법과 더 큰 장치와 함께 PDMS 기반 의 미세 유체 장치를 사용하여 세균 수송을 연구하는 도구를 제시합니다. PDMS와 PMMA는 가스 투과성 및 표면 특성이 다르므로 세균 수송을 연구할 수 있는 보완적인 기회를 제공합니다. 미세 유체 장치는 보다 통제된 환경을 제공하지만, 더 큰 장치는 장기간 또는 자연 세균 커뮤니티를 사용하여 실험을 할 수 있습니다. 전용 영역에서 고시간 분해능에서 계산되는 현미경 은 PDMS 기반 미세 유체 장치에서 BTC를 획득하는 데 사용됩니다. PMMA 기반 장치에서 BTC 모델링에 대한 셀 카운트를 얻기 위해 유동 세포 측정과 결합하여 자체 제작 된 자동화 된 액체 디스펜서를 소개합니다. 이 설정에서, 세포는 유체 장치를 통과하고 연속적으로 96 웰 플레이트로 분배된다. 측두해상도는 유체 장치를 통해 정확하게 분배될 수 있는 최소 부피에 의해 제한되고 따라서 중간 유량에 의해 제한됩니다. 우물의 고정은 성장을 방지하고 다운스트림 흐름- 사이토메트릭 열거에 대한 DNA 염색을 용이하게합니다. 운송 실험 중 세균 성장을 방지하기 위해 최소한의 중간(운동완 완충이라고 불임)을 사용합니다.
다양한 비늘에서 유체 장치 제조를 위한 프로토콜을 쉽게 사용할 수 있기 때문에 이러한 장치를 생산하고 오히려 BtC를 기록하는 실험 절차에 집중하는 기술을 간단히 소개합니다. 유사하게, 미생물의 유동 세포측정 열거에 대한 다양한 루틴이 존재하며 사용자는 유동 세포측정에 의해 얻은 결과를 해석하기 위해 전문가 지식을 필요로 한다. 우리는 형광 태그 세포의 BtC를 기록하기 위해 현미경 이미징과 함께 미세 유체 장치의 새로운 사용을보고합니다. 모공 스케일에서 로컬 속도와 궤적은 이미지 처리를 통해 얻을 수 있습니다. 또한, 우리는 원시 스트림 생물막에 의해 식민지화 다공성 환경에서 연약및 비 연약 세포의 세균수송을 관찰하기 위해 유량 세포계 계수와 결합하여 PMMA 기반 유체 장치의 사용을 입증한다.
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Protocol
1. 세균 배양 조건
- 라미나르 유동 후드 하에서 작업하면, GFP 태그가 지정된 슈도모나스 푸티다 KT2440(1× 107mL -1,-80°C에 저장됨)의 글리세롤 스톡 100μL을 사용하여 루리아-베르타니(LB) 배지의 5mL를 접종한다. 하룻밤 사이에 250 rpm에서 흔들면서 30 °C에서 배양하십시오.
- 다음 날, 5mL LB 배지에서 야간 배양100 μL을 재중단하고 5h(지수상)에 대해 동일한 조건하에서 배양한다. 2mL 튜브에 1mL 알리쿼트를 샘플링하여 실온(~15분)과 원심분리기(5분 동안 2300 x g)로 식힙니다.
- 상체를 제거하고 펠릿에 1mL 운동완충을 추가합니다. 소용돌이는 샘플을 균질화하기 위해 간략하게. 원하는 세포 농도에 도달하기 위해 희석, 예를 들어, 5 x 105 mL-1.
- 스트림에서 파생된 것과 같은 자연 공동체와 관련된 실험의 경우 비선택적 재배 매체를 준비합니다. 예를 들어, 멸균 여과 및 오토클레이브 스트림 워터 또는 복잡한 탄소 공급원(LB 매체)으로 수정된 인공 스트림 수매체를 사용하십시오.
2. 폴리디메틸실록산(PDMS)에서 미세유체 장치 제조
- 반경 크기 및 센터 좌표에 의해 설명된 원매트릭스(즉, 흐르는 불투과성 장애물)로 구성된 컴퓨터 지원 제도(CAD)소프트웨어(18)를통해 원하는 다공성 형상을 설계한다.
참고: 무작위 곡물 및 모공 크기를 가진 다공성 형상의 예가 도 1A에제공됩니다. 콘센트 에 가까운 장애물이없는 관찰 채널은 BtC의 인수를 용이하게합니다. - 선택한 형상을 기반으로 표준 SU-8-포토리소그래피(18)를 사용하여 금형을 준비한다.18
참고: 또는 전용 미세 제조 시설에서 금형을 주문할 수도 있습니다. 수평 평면에서 이질적인 유체 흐름을 얻기 위해서는, 평균 공공 목 크기와 동일한 순서의 미세 유체 챔버의 두께를 설계하는 것이 중요하다. 그러나, 미세 유체 장치의 치수가 현미경 (예를 들어, 현미경 슬라이드에 작동)에서 관찰에 적합한지 확인하십시오. - 면바늘 없이 주사기를 사용하여 중량별로 탄성동체의 90%에 크로스 링커(디메틸, 메틸수소 실록산 합합체)의 10%를 추가하여 PDMS 50g을 준비합니다. 깨끗한 조건에서 작업하고 가능한 한 먼지를 피하십시오. 두 시약을 깨끗한 일회용 용기에 넣고 진공(100mbar)을 30분 간 적용하여 점성 PDMS에서 용존 공기와 기포를 제거합니다.
- 금형을 페트리 접시에 넣습니다(직경 100mm, 높이 15mm). PDMS를 금형에 붓고 원하는 높이(예: 2-5mm)로 붓습니다. 페트리 접시를 덮고 60 °C에서 4 시간 (두꺼운 층의 경우 하룻밤)으로 유지하여 치료하십시오.
참고: 시각화를 위해 빛은 PDMS를 통과할 수 있어야 하므로 2mm에서 5mm 사이의 얇은 층이 바람직합니다. 두꺼운 층(>5mm)은 장치 투명성을 감소시키고 더 얇은 레이어는 적용 중에 변형을 받게 됩니다. - 오븐에서 금형을 제거하고 미세 유체 장치가 실온으로 냉각 할 수 있습니다. 냉각되면 메스로 PDMS의 원하는 부분을 조심스럽게 제거하십시오.
참고: 금형에 대한 강한 압력으로 인해 곰팡이가 골절됩니다. 지문이 광학 투명성에 영향을 미치기 때문에 맨손으로 PDMS를 만지지 마십시오. - PDMS 채널의 맨 아래를 테이프로 일시적으로 밀봉합니다(원하는 형상이 새겨진 곳). 직경 0.5mm의 생검 펀처를 사용하여 미세 유체 채널을 관통하여 0.5mm(내부 직경) 튜브에 맞는 입구와 콘센트를 만듭니다.
참고: PDMS의 부드러운 특성은 튜브가 삽입되면 압박감을 보장합니다. PDMS가 유리에 밀봉된 후에는 입구및 콘센트 채널을 만들 수 없습니다. - 고주파 발생기(플라즈마 본더, 재료의 표)를사용하여 산소 플라즈마 접합을 통해 미세 유체 채널을 밀봉하십시오. 이를 위해 에탄올로 규산 유리 슬라이드 (25mm x 75mm)를 청소하고 건조시키십시오. PDMS 채널에서 테이프를 제거하고 다공성 면이 위로 향하는 채널을 배치합니다. 실온에서 약 45s의 플라즈마로 규산염 유리 슬라이드및 PDMS 표면을 처리합니다.
- PDMS 채널을 규산 유리 슬라이드에 놓고 뜨거운 접시에 30 분 동안 100 °C에서 가열하십시오.
- 뜨거운 플레이트에서 미세 유체 장치를 제거하고 실온으로 냉각합니다. PDMS 채널 입구를 튜브와 연결합니다. 30분 동안 진공을 적용하여 액체에 거의 침투할 수 없지만 가스에 투과할 수 있는 PDMS에서 공기를 제거합니다.
- 100mL의 운동성 버퍼(10mM 칼륨 인산염, 0.1 mM EDTA, 1%w/v 포도당, pH 7.0)를 보충하고 10μLmin-1에서작동하는 주사기 펌프를 사용하여 미세 유체 장치에 1mL을 주입한다.
참고: PDMS가 가스에서 포화 상태가 부족하기 때문에(이전 진공 단계로 인해) 기포가 ~30분 이내에 사라집니다.
3. 폴리 (메틸 메타크릴레이트)의 유체 장치 준비
- CAD 소프트웨어로 원하는 형상을 설계합니다. 해당하는 경우, 치수가 현미경(예: 표준 96 웰 플레이트의 치수과 적절한 홀더와 함께)에 따른 관찰에 적합한지 확인하십시오. 유체 장치는 PMMA의 베이스(127× 127 × 127 × 127mm)와 뚜껑(127× × 12mm)에 의해 구성됩니다.
참고: CAD 소프트웨어에 대한 전문 지식을 권장합니다. 그림 1A에기술 도면이 제공된 예제입니다. - 공공 구획을 생산하려면 고정밀 마이크로밀링(WF31SA, Mikron)을 통해, 하단 PMMA 층에서 0.5mm를 제거하고 고무 O 링에 대한 홈(1.1 × 1.1mm)을 밀링한다. 드릴 12 스레드 구멍 (M5). 이것은 유체 장치의 기초역할을 할 것입니다.
참고: 유체 장치의 치수는 현미경 단계 및 초점 거리에 맞게 조정되어야 합니다. 그림 S1에기술 도면이 제공됩니다. - 유체 장치의 상단 부분으로 인-및 출구에 대해 두 개의 나사 구멍(유형 1/4-28UNF)을 드릴링하고 나사에 대해 12홀(5.5mm)을 드릴한다. 이것은 유체 장치의 뚜껑 역할을합니다.
참고: 마이크로 밀링에 대한 전문 지식은 권장됩니다. 저자는 전문 워크샵의 지원을 사용합니다. - 사용 전과 후에 유체 장치를 세척하고 살균하기 위해 HCl7%에 유체 장치의 베이스와 뚜껑을 적어 탈이온수로 세 번 헹구십시오.
- 나사 베이스와 뚜껑은 12개의 나사 구멍을 사용하여 함께 합니다.
4. 자동 디스펜서 설치
참고: 시판되는 액체 디스펜서는 비용이 많이 들며 유체 장치의 유출로부터 직접 분배할 수 있는 유연성을 제공하지 않는 경우가 많습니다. 따라서 XY 플로터 로봇(재료 테이블)에서 저렴하고 유연한 로봇 디스펜서 시스템을 조립하는 것이 좋습니다.
- 유체 장치에서 유출을 96 개의 우물 플레이트로 분배하기 위해 로봇 디스펜서를 PMMA 플레이트및 85.8 x 128mm의 밀 캐비티에 장착하여 깊이 가 1mm로 여러 96 개의 우물 플레이트를 보유하십시오.
- 유체 장치의 유출 튜브를 디스펜서의 로봇 암에 부착합니다.
- github에서 로봇 디스펜서 다운로드 bCNC를 작동하려면 : https://github.com/vlachoudis/bCNC 프로그램을 설치하는 지침을 따르십시오.
- 이 문서의 지원 자료에서 dispenser.py 다운로드합니다.
참고 : 이 파이썬 코드는 간단한 로봇 디스펜서 레이아웃을 위해 bCNC에 플러그인을 제공합니다. - 로봇 디스펜서를 bCNC를 실행하는 컴퓨터에 연결하고 올바른 COM 포트를 식별합니다.
- bCNC에서 홈 버튼을 클릭하여 로봇 디스펜서를 홈 위치로 반환합니다.
참고: 호밍은 로봇 디스펜서를 알려진 위치(x=0, y=0)로 반환하므로 디스펜서의 정확도를 향상시킵니다. - 실험 에 앞서, 적절한 양의 고정을 포함하는 우물 (예를 들어, 최종 농도 3.7% 포름알데히드)를 포함하는 우물과 함께 96 개의 웰 플레이트의 충분한 수를 준비합니다.
참고: 예를 들어, 0.2mL 분-1의유속으로, 100 μL은 30초마다 각 우물에 분배됩니다. 따라서, 2와 4% 사이 포름알데히드의 최종 농도에 도달하기 위하여 각 우물에 37%의 포름알데히드의 10 μL를 추가합니다. 8개의 96개의 웰 플레이트를 사용하면 총 768개의 데이터 포인트로 6시간 이상 실험을 작동할 수 있습니다. 더욱이, GFP 태그 세포는 포름알데히드를 사용하여 고정 후 형광 신호를 잃을 수 있음을 유의하십시오.
5. PDMS 미세 유체 장치를 사용하여 세균 수송 분석
- 이전에 미약학적 완충장치로 포화된 PDMS 미세유체 장치를 현미경 단계에 놓습니다. 테이프를 사용하여 튜브를 고정하여 스테이지 이동 중에 흐름의 방해를 최소화합니다.
- 현미경 단계를 콘센트 에 가까운 관찰 채널로 이동합니다. 밝은 필드 현미경 검사법 또는 위상 대비를 사용하여 관찰 채널의 중심에 초점을 맞추고 배율을 조정하여 개별 세균 세포를 시각화합니다.
- 광 경로 설정을 형광 현미경으로 전환하고 개별 세균 세포(예: 100ms)를 해결하기 위해 카메라 노출 시간을 조정하거나 세포의 형광 신호가 배경 소음보다 적어도 3배 더 강하다는 것을 확인합니다.
- 다음으로, 세균 현탁액을 포함하는 2mL 튜브에 입구 튜브를 삽입합니다. 펌프 방향을 역으로 하고 1 μLmin-1의유량으로 서스펜션을 철회하기 시작합니다.
- 실험의 전체 기간 동안 2분마다 합성 그림을 기록하는 전체 관측 채널의 단면을 스캔합니다.
6. 기본 이미지 처리
참고: 이러한 기본 이미지 처리 루틴의 목표는 기록된 이미지의 박테리아 수를 계산하는 것입니다. 최적의 처리 절차는 현미경 및 카메라의 기술 사양뿐만 아니라 실험에 사용되는 세균 균주의 형광 특성에 따라 달라지므로 조정해야합니다.
- 먼저 이미지를 .tiff 형식으로 내보냅니다.
- 이미지를 원하는 소프트웨어 플랫폼(예: MATLAB, ImageJ, R 또는 파이썬)으로 가져옵니다.
- 이미지의 픽셀 강도의 임의변형인 카메라 노이즈를 제거하고 광학 수차에 적합합니다. 각 그림에 가우시안 필터를 적용할 수 있습니다: 필터의 크기는 카메라 센서(예: CCD 또는 CMOS)의 품질에 따라 달라집니다. 광학 수차는 동일한 광학 구성을 가진 시편이 없는 경우 수집된 참조 영상에 의해 각 그림을 정상화하여 제거할 수 있다.
- 이미지를 관심 영역으로 자르는 것입니다.
- 임계값(픽셀 강도)을 식별하여 임계값 이상의 값에는 세균 세포가 포함됩니다.
참고: 이미지가 고르지 않게 비추는 경우(광학 수차 또는 노이즈로 인해) 로컬 평균 강도에 따라 임계값값을 선택하는 적응형 임계값을 적용하는 것이 유용할 수 있습니다. - 각 그림에서 위에 정의된 임계값을 뺍니다.
- 결과 이미지를 비나이즈하여 세균 세포가 1의 값을 취하는 반면 배경은 0의 값을 차지합니다.
- 가장 작은 세균 세포 크기보다 작은 영역으로 클러스터를 제거합니다.
- 바이나화된 이미지를 합하여 나머지 클러스터의 총 픽셀 수를 가져옵니다. 픽셀 수를 세균 세포의 평균 크기(픽셀)로 나눕니다.
- 시야와 조사 영역을 알면 카운트를 농도(입자mL-1)로변환합니다.
- 주입된 박테리아 현탁액의 농도를 식별하는 것이 기본입니다. 이를 위해, 깨끗한 미세 유체 장치의 관찰 채널에 박테리아 배양 현탁액의 주사기 1 mL를 주입한다. 상기(6.1 ~ 6.10)와 같이 이미지를 기록하고 부수성 세균 농도(C0)를계산한다.
- 폐수 세균 농도(C)를 유정상화하여 C(C)를 분석하고 C/C0을 시간 대 플롯한다.0
7. 모공 스케일에서 세균 수송 분석
- 다공성 매트릭스를 통해 수송되는 박테리아의 국소 속도와 궤적을 분석하기 위해 현미경 단계를 관심 영역으로 이동하고 미세 유체 장치의 중심으로 초점을 조정합니다.
- 현미경을 밝은 필드 또는 위상 대비로 설정합니다.
참고: 이것은 세균 세포의 형광 신호가 평균 세균성 시간보다 짧은 노출 시간에 영상을 기록하는 것을 허용하지 않는 경우에만 형광 현미경 검사를 사용합니다. - 시간 경과 이미지를 기록하여 박테리아 변위를 캡처하고(물체 크기보다 작은 픽셀 수에 비해 평균 변위보다 짧음) 세균 세포 검출(예: 20ms의 노출 및 50ms마다 기록된 이미지)을 최적화합니다. 가장 느린 궤적(예: 3분)을 충분히 기록하기 위해 충분한 시간 동안 사진을 기록합니다(예: 3분).
참고: 컴퓨터에 디스크 공간이 충분한지 확인합니다. - 배경 노이즈를 제거하려면 각 이미지에서 기록된 모든 이미지의 평균을 뺍니다. 이렇게 하려면 결과가 각 픽셀에 대한 모든 이미지의 강도의 합계인 행렬을 만들고 이미지 수로 나눕니다.
- 처리된 이미지(Im)에서 아래 정의된 대로 수치 그라데이션의 계수를 결정하고
최대값(최대값)으로정규화합니다.
- 강도 임계값을 통해 매트릭스 B를 비나이즈하고 단계 6.7-6.8을 참조하십시오.
- 각 시간 지점에 대해 박테리아 좌표(x, 픽셀 또는 mm)와 이미지 수집 시간을 3열 파일로 기록합니다.
- 마지막으로 파티클 추적 스크립트를 적용하여 기록된 데이터를 처리하고 박테리아의 궤적을 계산합니다. 예를 들어 설정된프로토콜(19)과자유롭게 사용할 수 있는 Matlab 입자 추적 코드(http://site.physics.georgetown.edu/matlab/)를 사용합니다.
최대값(최대값)으로정규화합니다.
8. 증착 프로파일을 통해 세균 여과 를 연구
- 형광 현미경에 의한 GFP 태그P. putida KT2440 세포의 증착 프로파일을 얻으려면, 전 전체 다공성 채널의 합성 이미지를 기록, 즉, 배경이며, 미세 유체 장치를 통해 세균 현탁액의 주입 후. 신호를 표백하지 않고 세균형 형광 신호(예: 100ms)를 획득할 수 있는 노출 시간을 사용합니다.
- 이미지를 내보내고 원하는 소프트웨어 플랫폼에서 가져오기(6.1-6.2 참조).
- 세균 주사 후 기록 된 이미지에서 배경을 제거합니다.
- 다공성 채널의 횡단 섹션을 따라 유지 된 박테리아의 총 형광 신호를 통합합니다.
- 증착 프로파일을 계산하려면 통합 된 플로레시언 신호대 다공성 채널 길이를 플롯합니다.
9. PMMA 유체 장치 및 유동 세포종을 사용하여 세균 수송 분석
- 50cm(내모름 1mm) 튜브를 사용하여 입구와 연동 펌프를 연결하고, 동일한 튜브를 사용하여 자동 디스펜서와 유출(50cm, 섹션 4 참조)을 사용합니다.
참고: 펌프를 사용하여 재배 미디어를 분배하고 박테리아 세포를 주입합니다. Luer-lock 커넥터와 3방향 밸브를 사용하여 일정 속도 릴리스 중에 중간 및 세균 서스펜션 사이를 전환합니다. - 유체 장치에서 펌프 재배 배지. 로봇 디스펜서에 고정된 콘센트 튜브에 매체가 도착했습니다.
- 0.2mL 분-1의유속으로 PMMA 유체 장치를 통해 세균 현탁액을 주입하기 시작하십시오.
- 박테리아가 유체 장치에 도달하면 자동 디스펜서를 켭니다.
- 펄스 주입을 하기 위해 일부 모공 부피(예: 30)에 세균 현탁액을 주입한 다음 실험이 끝날 때까지 재배 매체로 주입을 전환합니다.
참고: 유체 장치의 모공 부피는 약 0.2mL이므로 1분마다 프로세드 유량으로 전체 모공 부피가 교환됩니다. - 96웰 플레이트가 완료되면 플레이트를 덮어 증발을 줄이고 4°C로 보관하십시오.
- 기존프로토콜(20)에따라 유동 세포측정을 통해 세균성 풍부를 분석한다.
참고: 예를 들어, 녹색 형광 핵산 얼룩의 25 μL을 각각 우물에 0.025 mM(초순수 수분)에 추가하십시오. 세균 DNA를 얼룩지게 하여 세균성 풍부하게 흐르는 세포측정에 의해 정량화할 수 있습니다. 어둠 속에서 15 분 동안 샘플을 배양 한 다음 515 nm에서 488 nm 레이저 및 검출기가 장착 된 유동 사이토미터를 사용하여 분석합니다. - BTC 분석 에 앞서 고정 및 얼룩의 첨가로 인한 샘플희석을 고려하십시오. 고정 및 얼룩을 설명하기 위해 1.35의 요인에 의해 세균 성 풍부를 수정합니다.
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Representative Results
제시된 워크플로우의 기능을 설명하기 위해, 우리는 유전자 변형 슈도모나스 푸티다 KT2440, 생체 치료 및 생명 공학에 중요한 그램 음성 운동균을 사용하여 실험을 수행했습니다. GFP 생산을 발현하는 이 균주의 유전자 변형 버전은 시판됩니다. 운동성에 대한 관련 구조 및 규제 유전자가 부족한 P. putida KT2440의 비운동균도 사용할 수 있습니다. 모틸및비운동성 GFP 태그를 모두 사용하여 P. putida KT2440을 사용하여, 임의의 기둥 배열(도1B)과기록된 BtC(그림2A)를가진 PDMS 미세유체 장치에서 순차적인 실험을 수행했습니다. NBTC는 주입된 세포의 농도(C0)로정규화되었다. 동시에, 공공 스케일에서의 세균 궤적들은 상술한 바와 같이 이미지 처리 및 입자 추적을 통해 시각화하였다(도2B).
다음으로, PMMA(그림1A)로부터분쇄된 대규모 유체 장치로 실험을 수행했습니다. 모틸및 비운동성 P. putida KT2440(비형광)은 상술한 바와 같이 액체 디스펜서 및 유동 세포측정 계산을 사용하여 정기적으로 이격된 다공성 매트릭스및 BtC를 사용하여 수득하였다(그림3A). 놀랍게도, 생물막이 없는 다공성 환경에서, 모틸및 비운동성 P. putida KT2440은 현저하게 다른 수송 동작을 보였다. 복합 스트림 바이오필름 커뮤니티와 함께 48h를 위해 식민지화된 다공성 매트릭스에서, 오토바이와 비모틸 P. putida KT2440 사이의 BTC의 이러한 차이는 사라졌다(그림 3B.)
그림 1: 다공성 미디어에서 미생물 수송을 연구하는 유체 장치 (A)PMMA에서 분쇄 된 유체 장치의 그림. 다공성 매트릭스는 장치의 기본 층으로 분쇄되고, 뚜껑은 나사를 사용하여 닫힙다. 단면은 유체 장치 내의 기둥의 배열을 나타낸다. 인서트가 기둥의 일반 간격 그리드와 각각의 속도 유동 필드가 있는 다공성 매트릭스를 나타낸다. (B)PDMS 장치는 현미경 유리 슬라이드에 장착된다. 미디엄 저수지및 주사기 펌프에 각각 연결된 인-및 유출이 도시된다. 현미경 계수에 대한 관찰챔버는 다공성 매트릭스없이 동일한 현미경 슬라이드에 별도의 챔버로 배치된다. 인서트가 임의의 기둥 배열(직경 및 간격)이 있는 다공성 행렬을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: PDMS 유체 장치(A)PDMS 미세 유체 장치 및 현미경 계수로 얻은 motile 및 비 motile P. putida KT2440 (GFP 태그)의 채널 및모공 스케일에서 세균 수송. (B)모공 스케일에서 비 운동성 세포의 궤적. 색상은 궤적의 차별화를 향상시키기 위해 선택됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3:PMMA 유체 장치 (A) PMMA 유체 장치 및 비 motile P. putida KT2440 (비 태그)의 PMMA 유체 장치 및 유량 세포 측정 계산을 사용하여 얻은 MMA 유체 장치(A)에서채널 및모공 스케일에서 세균 수송. (B) 유체 장치는 2 일 동안 자연 스트림 커뮤니티에 의해 식민지화되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보조 도 1: PMMA 유체 장치의 기술 도면. 이 장치는 다공성 매트릭스를 포함하는 베이스 유닛과 입구 및 콘센트의 구멍을 특징으로 하는 뚜껑 장치로 구성됩니다. 이 장치는 12개의 나사와 O-링을 사용하여 밀봉됩니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기서 우리는 단일 세포와 인구 수준에서 다공성 시스템을 통해 미생물의 수송을 연구하는 두 가지 수단을 제안한다. BTC 모델링을 이용한 운송 현상에 대한 연구는 생태계 척도에서 병원균이나 오염물질의 확산에 대한 귀중한 통찰력을 제공했지만 실험실 실험에서 현장 조건으로 확장하는 데 어려움이 여전히 존재합니다. 여기에 설명된 도구는 다공성 환경에서 수송과 관련된 미생물의 생태 전략을 더 잘 이해하기 위해 연구자가 공간 및 측두적인 비늘을 실험적으로 해결할 수 있게 합니다. 실험자는 이러한 시스템을 사용하여 화학요법이나 쿼럼 감지와 같은 운동성보다 다른 미생물 특성을 연구하거나 다공성 매트릭스의 기하학 또는 기타 서식지 특성을 수정할 수 있다. 또한 이러한 시스템을 사용하면 세균 수송 동작이 쉽게 결합되어 식민지 패턴에 대한 중요한 통찰력을 제공하고 생물막이 로컬 흐름 필드를 수정하는 방법을 이해하는 데 중요합니다. 우리는 다공성 매체를 분산하고 식민지화하기 위한 미생물 전략의 더 나은 이해가 모형 예측을 향상하고 따라서 병원체 퍼짐 또는 오염 물질 봉쇄의 관리에 기여할 것으로 예상합니다. 시스템의 추가 수정은 또한 세포가 물리적으로 분리될 필요가 있는 새로운 여과 장치 또는 생명 공학 공구의 발달에 기여할 수 있습니다.
더 작고 단기적인 실험을 위해 또는 높은 시간적 분해능이 중요한 경우 대규모 및 장기 실험 및 PDMS 기반 장치를 위한 PMMA 기반 장치를 권장합니다. 두 재료의 특성이 다르다는 것을 염두에 두어야 합니다. 예를 들어 PDMS는 산소와 같은 가스에 투과성이 있으며 PMMA는 가스가 단단합니다. 이 차이는 PMMA 시나리오에서 가스 소비를 연구하는 데 사용될 수 있으며, PDMS는 세균 호흡과 관련된 산소 제한이 바람직하지 않은 실험에 더 적합할 수 있습니다.
일반적으로, 여기에 설명된 프로토콜은 쉽게 재현가능하며 이러한 도구를 사용하여 얻은 데이터는 지속적으로 motile 및 비 운동성 박테리아의 수송에 있는 차이를 드러냅니다. 자체 제작 된 액체 디스펜서는 시판되는 대안으로 대체 될 수있다. 그러나 다재다능함과 비용 효율성을 이유로 여기에 설명된 것을 권장합니다. 프로토콜의 중요한 단계는 주로 유체 장치의 처리와 이미지 처리 경험에 관한 것입니다. 이미지 분석을 통해 얻은 데이터의 품질은 이미지 품질(주로 초점 및 노출 시간에 따라 결정)과 적절한 임계값 전략에 따라 달라집니다. 유량 세포측정 계산에 의해 얻어진 데이터 품질은 유동 세포 측정 결과의 해석에 있는 세포 및 전문 지식의 효과적인 고정 및 염색에 달려 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 로봇 디스펜서와 dispenser.py 스크립트의 설정으로 앙토안 위드머의 도움을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA | Sigma | ||
| Elastomer Sylgard 184 | Dowsil | 101697 | |
| Flow cytometer NovoCyte | Acea | ||
| Glucose | Sigma | https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit | |
| LB broth | BD | ||
| Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit | makeblock | ||
| Microscope Axio Imager | Zeiss | ||
| Microscope AxioZoom v16 | Zeiss | ||
| Microscope slides, 75 mm × 25 mm | Corning | ||
| Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | ||
| Plasma bonder Corona SB | BlackHole Lab | ||
| Potassium phosphate | Sigma | ||
| Syringe pump New Era NE 4000 | New Era | ||
| Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | Molecular Probes, Invitrogen | ||
| Tygon tubing | Ismatec | ||
| WF31SA universal milling machine | Mikron |
References
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