Summary
Banebrytende kurver (BTCer) er effektive verktøy for å studere transport av bakterier i porøse medier. Her introduserer vi verktøy basert på fluidiske enheter i kombinasjon med mikroskopi og flytcytokometrisk telling for å oppnå BTCer.
Abstract
Å forstå transport, spredning og avsetning av mikroorganismer i porøse medier er en kompleks vitenskapelig oppgave bestående av emner så forskjellige som hydrodynamikk, økologi og miljøteknikk. Modellering av bakteriell transport i porøse miljøer i ulike romlige skalaer er avgjørende for å bedre forutsi konsekvensene av bakteriell transport, men dagens modeller klarer ofte ikke å oppskalere fra laboratorie-til-feltforhold. Her introduserer vi eksperimentelle verktøy for å studere bakteriell transport i porøse medier på to romlige skalaer. Målet med disse verktøyene er å oppnå makroskopiske observerbare (for eksempel gjennombruddskurver eller avsetningsprofiler) av bakterier injisert i gjennomsiktige porøse matriser. I liten skala (10-1000 μm) kombineres mikrofluidiske enheter med optisk videomikroskopi og bildebehandling for å oppnå gjennombruddskurver og samtidig spore individuelle bakterielle celler i poreskalaen. I større skala kombineres strømningscytometri med en selvskapt robotdispenser for å oppnå gjennombruddskurver. Vi illustrerer nytten av disse verktøyene for å bedre forstå hvordan bakterier transporteres i komplekse porøse medier som den hypoheiske sonen av bekker. Etter hvert som disse verktøyene gir samtidige målinger på tvers av skalaer, baner de vei for mekanismebaserte modeller, kritisk viktige for oppskalering. Anvendelse av disse verktøyene kan ikke bare bidra til utviklingen av nye bioremediation applikasjoner, men også kaste nytt lys over de økologiske strategiene for mikroorganismer kolonisere porøse substrater.
Introduction
Studier som tar sikte på å forstå transport av mikrober gjennom porøse medier har hovedsakelig vært drevet av bekymringer for forurensning1,overføring avsykdom 2 og bioremediation3. I denne forbindelse har bakterier for det meste blitt behandlet som partikler i transportmodeller4, og prosesser som filtrering, belastning, gravitasjonsoppgjør eller remobilisering fra biofilmer har blitt identifisert som drivere for oppbevaring eller transport av mikrober5. Men å studere transport av bakterier gjennom porøs landskap kan også informere oss om de økologiske strategiene som underbygger deres suksess i disse komplekse miljøene. Likevel krever dette nye eksperimenter og matematiske modeller som opererer på enkeltcelle, befolkning eller mikrobiell samfunnsnivå.
Naturlige porøse miljøer, som de som finnes i den hyporheiske sonen av bekker og elver, koloniseres tett av ulike samfunn av biofilmdannende mikrober6. Biofilmer danner strukturer som endrer strømmen og dermed transport og spredning av bakterier i væskefase7,8. Transport av bakterier i poreskalaen avhenger av begrenset plasstilgjengelighet i porøs matrise og motilitetsrelatert spredning kan være en effektiv måte å øke den individuelle formen gjennom redusert konkurranse om ressurser i mindre tett befolkede områder. På den annen side kan motile bakterier også nå mer isolerte områder av porøs matrise, og den utvidede utforskningen av slike områder kan gi økologiske muligheter til motilepopulasjoner 10. Ved større romlige skalaer avleder biofilmveksten strømningsbanene som også fører til (delvis) tilstopping av porer og dermed til etablering av enda mer kanaliserte og heterogene strømningsforhold11. Dette har konsekvenser for næringsforsyning og spredningskapasitet, frekvens og avstand. Fortrinnsrett flyt, for eksempel, kan generere såkalte "fast-spor" og motile bakterier kan oppnå enda høyere hastigheter enn den lokale flyten langs dissesporene 12. Dette er en effektiv måte å øke utforskningen av nye habitater på.
En rekke verktøy benytte seg for studiet av transport av motile og ikke-motile bakterier (og partikler) i porøse medier. Numeriske modeller har stor prediktiv kapasitet som er viktige for applikasjoner, men er ofte begrenset av iboende antagelser4. Laboratorieskala eksperimenter13,14 kombinert med banebrytende kurve (BTC) modellering har gitt viktig innsikt i viktigheten av bakterielle celle overflateegenskaper for å stikke effektivitet15. Vanligvis oppnås BTCer (det vil vil vil vil at tider serie med partikkelkonsentrasjon på et fast sted) oppnås via konstanthastighetsutgivelser og måling av celletall ved utløpet av den eksperimentelle enheten. I denne sammenheng reflekterer BTCene adveksjonsspredningsdynamikken til bakterier i porøs matrise og kan utvides med et synkebelegg som står for vedlegg. Modellering av BTCer alene løser imidlertid ikke rollen som romlig organisering av porøs substrat eller biofilm for transportprosesser. Andre makroskopiske observerbare enheter som dispersivitet eller deponeringsprofiler har vist seg å gi viktig informasjon om romlig fordeling eller de beholdt partiklene eller voksende samfunnene. Microfluidics er en teknologi som gjør det mulig å studere transport i porøse medier ved mikroskopiundersøkelse9,,12,,16,og bortsett fra et nylig arbeid10,er eksperimentelle systemer vanligvis begrenset til en enkelt lengde skala av oppløsning, det vil si poreskalaen eller hele fluidisk enhetsskala.
Her introduserer vi en rekke kombinerte metoder for å studere transport av motile og ikke-motile bakterier i porøs landskap i forskjellige skalaer. Vi kombinerer observasjoner av bakteriell transport i poreskalaen med informasjon i større skala, ved hjelp av BTC-analyse. Mikrofluidiske enheter bygget av myk litografi ved hjelp av polydimetylsiloxane (PDMS) er biokompatibele, motstandsdyktige mot en rekke kjemikalier, tillater replikerbarhet til lave kostnader og gir utmerket optisk gjennomsiktighet samt lav autofluorescens kritisk for mikroskopisk observasjon. Mikrofluidics basert på PDMS har tidligere blitt brukt til å studere transport av mikrober i enklekanaler 17 eller i mer komplekse geometrier12. Imidlertid fokuserer typisk mikrofluidics eksperimenter på kortsiktige horisonter og epi-fluorescens mikroskopisk observasjon av levende celler er ofte begrenset til genmodifiserte stammer (f.eks GFP-merkede stammer). Her presenterer vi verktøy for å studere bakteriell transport ved hjelp av PDMS-baserte mikrofluidiske enheter i kombinasjon med mikroskopi og større enheter fabrikkert fra poly(metylmetakkrylat) (PMMA, også kjent som plexiglass) i kombinasjon med strømningscytometri. PDMS og PMMA varierer i gasspermeabilitet og overflateegenskaper, og gir dermed komplementære muligheter til å studere bakteriell transport. Mens den mikrofluidiske enheten gir et mer kontrollert miljø, gjør den større enheten mulighet for eksperimenter over lengre perioder eller bruk av naturlige bakterielle samfunn. Mikroskopitelling ved høy temporal oppløsning i et dedikert område brukes til å skaffe BTC i den PDMS-baserte mikrofluidiske enheten. For å få celletellinger for BTC-modellering fra den PMMA-baserte enheten, introduserer vi en selvkonstruert automatisert væskedispenser i kombinasjon med strømningscytometri. I dette oppsettet passerer cellene den fluidiske enheten og blir etterfølgende dispensert i 96 brønnplater. Den timelige oppløsningen er begrenset av minimumsvolumet som kan dispenseres nøyaktig og dermed middels strømningshastighet gjennom den fluidiske enheten. Fikseringsmiddel i brønnene forhindrer vekst og letter DNA-farging for nedstrøms strømningscytokometriske opplisting. For å forhindre bakteriell vekst under transporteksperimenter bruker vi en minimal medium (be sikt motilitetsbuffer).
Siden protokoller for fremstilling av fluidiske enheter i forskjellige skalaer er lett tilgjengelige, introduserer vi bare kort teknikkene for å produsere slike enheter og heller fokusere på eksperimentelle prosedyrer for å registrere BTCer. På samme måte finnes det ulike rutiner for flytcytokometrisk opplisting av mikrober og brukere krever ekspertkunnskap for å tolke resultater oppnådd ved strømningscytometri. Vi rapporterer den nye bruken av mikrofluidiske enheter i kombinasjon med mikroskopisk bildebehandling for å registrere BTCer av fluorescerende merkede celler. På poreskalaen oppnås lokale hastigheter og baner ved hjelp av bildebehandling. Videre demonstrerer vi bruken av en PMMA-basert fluidisk enhet i kombinasjon med flow-cytometrisk telling for å observere bakteriell transport av motile og ikke-motile celler i porøse miljøer kolonisert av en innfødt stream biofilm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bakterielle kulturforhold
- Arbeider under en laminær strømningshette, bruk 100 μL av en glyserol lager av GFP-merket Pseudomonas putida KT2440 (1 × 107 ml-1, lagret ved -80 °C) for å inokulere 5 ml Luria-Bertani (LB) medium. Inkuber ved 30 °C mens du rister ved 250 o/min over natten.
- Neste dag, resuspend 100 μL av natten kultur i 5 ml LB medium og inkubere under de samme forholdene for 5t (eksponentiell fase). Prøv en 1 ml aliquot inn i en 2 ml rør, la avkjøles til romtemperatur (~ 15 min) og sentrifuge (2300 x g for 5 min).
- Fjern supernatanten og tilsett 1 ml motilitetsbuffer til pelleten. Vortex kort for å homogenisere prøven. Fortynn for å nå ønsket cellekonsentrasjon, f.eks.5 -1
- For eksperimenter som involverer naturlige samfunn, for eksempel de som er avledet fra bekker, utarbeide et ikke-selektivt dyrkingsmedium. Bruk for eksempel sterilt filtrert og autoklavet bekkevann eller et kunstig strømvannmedium endret med en kompleks karbonkilde (LB medium).
2. Tilberedning av en mikrofluidisk enhet i polydimetylsiloxane (PDMS)
- Design ønsket porøs geometri ved hjelp av dataassistert tegning (CAD)programvare 18, som består av en matrise av sirkler (det vil si ugjennomtrengelig hindring for flyt), beskrevet av radius størrelse og senter koordinater.
MERK: Et eksempel på en porøs geometri med randomiserte korn- og porestørrelser er gitt i figur 1A. En observasjonskanal uten hindringer nær utløpet forenkler oppkjøpet av BTCer. - Basert på den valgte geometrien, forberede en mold ved hjelp av standard SU-8-fotolitografi18.
MERK: Alternativt kan mugg også bestilles fra dedikert mikrofabrikasjonsanlegg. For å oppnå heterogen væskestrøm i horisontalplanet, er det viktig å designe tykkelsen på mikrofluidiskammeret av samme størrelsesorden som gjennomsnittlig pore halsstørrelse. Kontroller imidlertid at dimensjonene på mikrofluidisk enhet er egnet for observasjon under mikroskopet (f.eks. arbeid på mikroskopsklier). - Forbered 50 g PDMS ved å tilsette 10 % av krysskoblingen (dimetyl, metylhydrogent siloksankopolymer) til 90 % av elastomeren etter vekt ved hjelp av en sprøyte uten kanyle. Arbeid under rene forhold og unngå støv så mye som mulig. Bland de to reagensene i en ren engangsbeholder og påfør vakuum (100 mbar) i 30 min for å fjerne oppløst luft og bobler fra viskøs PDMS.
- Legg formen i en petriskål (100 mm i diameter, 15 mm høy). Hell PDMS på formen til ønsket høyde (f.eks. 2-5 mm). Dekk petriskålen og hold den ved 60 °C i 4 timer (over natten for tykkere lag) for å kurere.
MERK: For visualiseringsformål skal lyset kunne passere gjennom PDMS, og dermed er et tynt lag mellom 2 mm til 5 mm ønskelig. Tykkere lag (> 5 mm) reduserer enhetens gjennomsiktighet og tynnere blir utsatt for deformasjoner under påføring. - Fjern formen fra ovnen og la mikrofluidisk enhet avkjøles til romtemperatur. Når den er avkjølt, fjern forsiktig den ønskede delen av PDMS med en skalpell.
MERK: Sterkt trykk på formen resulterer i muggfrakturer. Ikke berør PDMS med bare hender, da fingeravtrykk vil påvirke optisk gjennomsiktighet. - Tet midlertidig bunnen av PDMS-kanalen (der ønsket geometri er gravert) med tape. Med en biopsipuncher med 0,5 mm diameter, må du pierce mikrofluidisk kanal for å skape et innløp og et uttak som passer til 0,5 mm (indre diameter) rør.
MERK: Den myke naturen til PDMS vil sikre tetthet når slangen vil bli satt inn. Innløps- og utløpskanaler kan ikke gjøres etter at PDMS er forseglet til glasset. - Forsegle mikrofluidkanalen via oksygenplasmabinding ved hjelp av høyfrekvent generator (plasmabinder, Materialtabell). For dette, rengjør en silikat glass lysbilde (25 mm x 75 mm) med etanol og la den tørke. Fjern tape fra PDMS-kanalen og plasser kanalen med den porøse siden vendt opp. Behandle silikatglasssklie og PDMS-overflater med plasma i ca. 45 s ved romtemperatur.
- Plasser PDMS-kanalen på silikatglasssklie og varm ved 100 °C i 30 min på en kokeplate.
- Fjern mikrofluidisk enhet fra kokeplaten og avkjøl den til romtemperatur. Koble PDMS-kanalinntaket til slangen. Påfør vakuum i 30 min for å fjerne luft fra PDMS, som er nesten ugjennomtrengelig for væsker, men gjennomtrengelig for gass.
- Forbered 100 ml motilitetsbuffer (10 mM kaliumfosfat, 0,1 mM EDTA, supplert med 1 % w/v glukose, pH 7,0) og injiser 1 ml av den i mikrofluidisk enhet ved hjelp av en sprøytepumpe som drives ved 10 μL min-1.
MERK: Siden PDMS er undermettet i gass (på grunn av forrige vakuumtrinn), forsvinner boblene innen ~ 30 min.
3. Fremstilling av en fluidisk enhet i poly (metylmetakkrylat)
- Design ønsket geometri med CAD-programvaren. Hvis det er aktuelt, må du kontrollere at dimensjonene er egnet for observasjon under mikroskopet (f.eks. dimensjoner på en standard 96 brønnplate i kombinasjon med en passende holder). Den fluidiske enheten består av en base (127 × 127 × 12 mm) og et lokk (127 × 127 × 12 mm) PMMA.
MERK: Ekspertise med CAD-programvare anbefales. Et eksempel på teknisk tegning er angitt i figur 1A. - For å produsere porerommet, ved hjelp av høypresisjons mikromilling (WF31SA, Mikron), fjern 0,5 mm fra det nederste PMMA-laget og fres et spor (1,1 × 1,1 mm) for en gummi O-ring. Bor 12 gjengede hull (M5). Dette vil tjene som bunnen av den fluidiske enheten.
MERK: Dimensjonene på den fluidiske enheten må justeres for å passe til mikroskopstadiet og fokalavstanden. En teknisk tegning er levert i figur S1. - Bor to gjengede hull (type 1/4-28UNF) for inn- og utløp i den øverste delen av den fluidiske enheten, og 12 hull (5,5 mm) for skruene. Dette vil tjene som lokket på den fluidiske enheten.
MERK: Kompetanse innen mikrofresing er tilrådelig; forfatterne bruker støtte fra et spesialisert verksted. - For å rengjøre og sterilisere den fluidiske enheten før og etter hver bruk, suge basen og lokket på den fluidiske enheten i HCl 7% og skyll tre ganger med deionisert vann.
- Skru basen og lokket sammen ved hjelp av de 12 gjengede hullene.
4. Oppsett av automatisert dispenser
MERK: Kommersielt tilgjengelige væskedispensere er kostbare og tilbyr ofte ikke fleksibilitet til å dispensere direkte fra utløpet av den fluidiske enheten. Derfor anbefales montering av et billig og fleksibelt robotdispensersystem fra en XY Plotter Robot (Table of Materials).
- For å dispensere utstrømningen fra den fluidiske enheten i 96 brønnplater, monter robotdispenseren på en PMMA-plate og møllehulrom på 85,8 x 128 mm med en dybde på 1 mm for å holde flere 96 brønnplater.
- Fest utløpsrøret på den fluidiske enheten til dispenserens robotarm.
- For å betjene robotdispenseren last ned bCNC fra github: https://github.com/vlachoudis/bCNC og følg instruksjonene for å installere programmet.
- Last dispenser.py fra støttematerialet i denne artikkelen.
MERK: Denne python-koden gir en plugin til bCNC for en enkel robotdispenseroppsett. - Koble robotdispenseren til datamaskinen som kjører bCNC, og identifiser riktig COM-port.
- I bCNC klikker du på hjem-knappen for å returnere robotdispenseren til hjemmeposisjonen.
MERK: Homing returnerer robotdispenseren til en kjent posisjon (x=0, y=0) og forbedrer derfor nøyaktigheten til dispenseren. - Før forsøket, forberede et tilstrekkelig antall 96 brønnplater, med brønner som inneholder en passende mengde fikseringsmiddel (f.eks. endelig konsentrasjon 3,7% formaldehyd).
MERK: For eksempel, med en strømningshastighet på 0,2 ml min-1,blir 100 μL dispensert i hver brønn hver 30. Tilsett derfor 10 μL med 37 % formaldehyd til hver brønn for å nå en endelig konsentrasjon av Formaldehyd mellom 2 og 4 %. Ved hjelp av åtte 96 brønnplater vil tillate å betjene eksperimentet i mer enn 6 timer med totalt 768 datapunkter. Vær også oppmerksom på at GFP-merkede celler kan miste sitt fluorescerende signal etter fiksering ved hjelp av formaldehyd.
5. Analyser bakteriell transport ved hjelp av PDMS mikrofluidiske enheter
- Plasser PDMS mikrofluidisk enhet som tidligere var mettet med motilitetsbufferen på mikroskopstadiet. Bruk tape for å fikse slangen for å minimere forstyrrelser av strømmen under scenebevegelse.
- Flytt mikroskopstadiet til observasjonskanalen nær uttaket. Bruk lys feltmikroskopi eller fasekontrast, fokuser til midten av observasjonskanalen og juster forstørrelsen for å visualisere individuelle bakterielle celler.
- Bytt lysbaneinnstillingene til fluorescensmikroskopi og juster kameraets eksponeringstid for å løse individuelle bakterieceller (f.eks. 100 ms), eller slik at fluorescenssignaler fra celler er minst 3 ganger sterkere enn bakgrunnsstøy.
- Deretter setter du inn innløpsslangen i et 2 ml rør som inneholder bakteriesuspensjonen. Omvendt pumperetning og begynn å trekke fjæringen med en strømningshastighet på 1 μL min-1.
- Skann tverrsnittet av hele observasjonskanalen som tar opp et sammensatt bilde hvert 2.
6. Grunnleggende bildebehandling
MERK: Målet med disse grunnleggende bildebehandlingsrutinene er å telle antall bakterier i de registrerte bildene. Optimale behandlingsprosedyrer avhenger av de tekniske spesifikasjonene til mikroskopet og kameraet, samt på fluorescensegenskapene til bakteriestammen som brukes i forsøket, og må derfor justeres.
- Eksporter først bilder .tiff format.
- Importer bilder til en ønsket programvareplattform (f.eks. MATLAB, ImageJ, R eller Python).
- Fjern kamerastøy, som er en tilfeldig variasjon av pikselintensitet i bilder og riktig for optisk avvik. Dette kan gjøres ved å bruke et gaussisk filter på hvert bilde: størrelsen på filteret avhenger av kvaliteten på kamerasensoren (f.eks. CCD eller CMOS). Den optiske avviket kan fjernes ved å normalisere hvert bilde med et referansebilde samlet inn i fravær av prøven med samme optiske konfigurasjon.
- Beskjær bildene til et område av interesse.
- Identifiser en terskelverdi (pikselintensitet), slik at verdier over terskelen inkluderer bakterielle celler.
MERK: Hvis bildene er ujevnt opplyst (på grunn av optisk avvik eller støy), kan det være nyttig å bruke en adaptiv terskel, som velger en terskelverdi basert på lokale gjennomsnittsintensiteter. - Trekk fra hvert bilde terskelen som er definert ovenfor.
- Binarize det resulterende bildet, slik at bakterielle celler tar en verdi på 1, mens bakgrunnen tar en verdi på 0.
- Fjern klynger med et område som er mindre enn den minste bakterielle cellestørrelsen.
- Summer det binariserte bildet for å få det totale antallet piksler for de gjenværende klyngene. Del antall piksler med gjennomsnittsstørrelsen (i piksler) for en bakteriecelle: Dette gir et estimat av det totale antallet celler.
- Å kjenne dybden av synsfeltet og undersøkelsesområdet, forvandle teller til konsentrasjon (partikler ml-1).
- Det er grunnleggende å identifisere konsentrasjonen av injiserte bakterier suspensjon. For å gjøre dette, injiser med en sprøyte 1 ml bakteriekultursuspensjon i observasjonskanalen til en ren mikrofluidisk enhet. Ta opp bildet og beregn den influent bakterielle konsentrasjonen (C0) som beskrevet ovenfor (6,1 til 6,10).
- Analyser BTCer ved å normalisere bakteriekonsentrasjonen av avløpsvann (C) med influent bakteriell konsentrasjon (C0)og plott C/C0 versus tid.
7. Analyser bakteriell transport i poreskalaen
- For å analysere lokale hastigheter og baner av bakterier som transporteres gjennom den porøse matrisen, flytt mikroskopstadiet til interesseområdet og juster fokuset til midten av mikrofluidisk enhet.
- Sett mikroskopet til lyst felt eller fasekontrast.
MERK: Dette bare i tilfelle fluorescenssignalet til bakteriell celle ikke tillater opptak av bilder ved eksponeringstid kortere enn gjennomsnittlig bakteriell tid, ellers bruker fluorescensmikroskopi. - Ta opp tidsforløpsbilder, ved eksponeringstiden som fanger bakterier forskyvning (kortere enn gjennomsnittlig forskyvning over en rekke piksler mindre enn objektstørrelsen), og som optimaliserer bakteriell celledeteksjon (f.eks eksponering av 20 ms og bilder registrert hver 50 ms). Ta opp bilder over tilstrekkelig tid for å registrere nok (for å være statistisk representativ) av de tregeste banene (f.eks. 3 min).
MERK: Kontroller at datamaskinen har nok diskplass. - Hvis du vil fjerne bakgrunnsstøy, trekker du fra hvert bilde gjennomsnittet av alle innspilte bilder. Hvis du vil gjøre dette, oppretter du en matrise hvis resultat er summen av intensiteten til alle bildene, for hver piksel, og deler den med antall bilder.
- Fra det behandlede bildet (Im), bestemme modulen til den numeriske graderingen
og normalisere den med maksimal verdi (maks), som definert nedenfor.
- Binarize matrisen B via intensitetsterserskel, se trinn 6.7-6.8.
- For hvert tidspunkt registrerer du bakteriekoordinater (x, y i piksel eller mm) og tidspunktet for bildeinnhenting i en fil med tre kolonner.
- Til slutt, bruk et partikkelsporingsskript for å behandle de registrerte dataene og beregne bakterienes baner. Bruk for eksempel den etablerteprotokollen 19, og den fritt tilgjengelige Matlab Particle Tracking Code: (http://site.physics.georgetown.edu/matlab/).
og normalisere den med maksimal verdi (maks), som definert nedenfor.
8. Studer bakteriell filtrering ved hjelp av avsetningsprofiler
- For å få deponering profiler av GFP-merket P. putida KT2440 celler ved fluorescens mikroskopi, registrere et sammensatt bilde av hele porøs kanal før, det vil si bakgrunnen, og etter injeksjon av bakteriell suspensjon gjennom mikrofluidisk enhet. Bruk en eksponeringstid som gjør det mulig å skaffe bakteriell fluorescerende signal (f.eks. 100 ms), uten å bleke signalet.
- Eksporter bilder og import i ønsket programvareplattform (se 6.1-6.2).
- Fjern bakgrunn fra bildene som er tatt opp etter bakteriell injeksjon.
- Integrer det totale fluorescenssignalet av beholdt bakterier langs tverrgående deler av den porøse kanalen.
- For å beregne avsetningsprofilen, plott det integrerte florescencesignalet kontra porøs kanallengde.
9. Analyser bakteriell transport ved hjelp av PMMA-fluidic enheter og strømningscytometri
- Koble peristaltisk pumpe med innløpet ved hjelp av 50 cm (1 mm indre diameter) rør, og utstrømningen med den automatiserte dispenseren ved hjelp av samme slange (50 cm, se avsnitt 4).
MERK: Bruk pumpen til å dispensere dyrkingsmedier, og til å injisere bakterieceller. Bruk Luer-lock-kontakter og treveis ventiler til å skifte mellom middels og bakteriell suspensjon under konstant hastighetsutløsningen. - Pumpedyrkingsmedium i den fluidiske enheten. Legg merke til at mediet kommer ved utløpsslangen som er festet til robotdispenseren.
- Begynn å injisere bakteriesuspensjonen gjennom PMMA-fluidenheten med en strømningshastighet på 0,2 ml min-1,
- Når bakterier når den fluidiske enheten, slå på den automatiserte dispenseren.
- For å lage en pulsinjeksjon, injiser bakteriell suspensjon for noen porevolumer (f.eks. 30), og bytt deretter injeksjon til dyrkingsmedier til eksperimentslutt.
MERK: porevolumet på den fluidiske enheten er ca. 0,2 ml, og dermed ved prosed strømningshastighet hvert minutt byttes ett helt porevolum. - Når en 96 brønnplate er fullført, dekk platen for å redusere fordampningen og oppbevar den ved 4 °C.
- Analyser bakteriell overflod via strømningscytometri, etter etablerte protokoller20.
MERK: Tilsett for eksempel 25 μL av den grønnfluorelige nukleinsyreflekken (Materialtabell) ved 0,025 mM (i ultrarent vann) til hver brønn. Det flekker bakteriell DNA, og dermed tillater å kvantifisere ved flyt cytometri bakteriell overflod. Inkuber prøver i 15 min i mørket og analyser deretter ved hjelp av et strømningssytometer utstyrt med en 488 nm laser og detektorer ved 515 nm. - Før BTC analyse, vurdere fortynning av prøven på grunn av tilsetning av fikseringsmiddel og flekk. Korriger bakteriell overflod med en faktor på 1,35 for å ta hensyn til fikseringsmiddel og flekk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å illustrere funksjonaliteten til den presenterte arbeidsflyten utførte vi eksperimenter ved hjelp av genmodifiserte Pseudomonas putida KT2440, en gram negativ motil bakterie som er viktig for bioremediering og bioteknologi. Genmodifiserte versjoner av denne stammen som uttrykker GFP-produksjon er kommersielt tilgjengelige. En ikke-motil stamme av P. putida KT2440 som mangler relevante strukturelle og regulatoriske gener for motilitet er også tilgjengelig. Ved hjelp av både, motile og ikke-motile GFP merket P. putida KT2440, utførte vi sekvensielle eksperimenter i PDMS mikrofluidiske enheter med et tilfeldig utvalg av søyler (Figur 1B) og registrerte BTCer (figur 2A). BTC-er er normalisert til konsentrasjonen av injiserte celler (C0). Samtidig ble bakterielle baner i poreskalaen visualisert via bildebehandling og partikkelsporing som beskrevet ovenfor (figur 2B).
Deretter utførte vi eksperimenter med store fluidiske enheter malt fra PMMA (figur 1A). Motile og ikke-motile P. putida KT2440 (ikke-fluorescerende) ble injisert i en regelmessig fordelt porøs matrise og BTCer ble oppnådd ved hjelp av flytende dispenser og strømningscytometri som teller som beskrevet ovenfor (figur 3A). Påfallende, i et porøs miljø blottet for biofilm, motil og ikke-motile P. putida KT2440 viste en markant annen transport atferd. I en porøs matrise kolonisert for 48h med en kompleks stream biofilm samfunnet, disse forskjellene i BTC mellom motile og ikke-motile P. putida KT2440 forsvant (Figur 3B.)
Figur 1: Fluidic enheter for å studere mikrobiell transport i porøse medier (A) Illustrasjon av en fluidisk enhet malt fra PMMA. Den porøse matrisen er malt inn i det øverste laget av enheten, lokket lukkes ved hjelp av skruer. Et tverrsnitt viser plasseringen av søylene i den fluidiske enheten. Innsatsen viser en porøs matrise med et vanlig mellomrom rutenett av søyler og det respektive hastighetsflytfeltet. (B)PDMS enheten er montert på et mikroskopiglasslysbilde. Vist er inn- og utstrømningen, koblet til middels reservoar og sprøytepumpen, henholdsvis. Observasjonskammeret for mikroskopisk telling er plassert som et eget kammer uten en porøs matrise på samme mikroskopsklie. Innsatsen viser en porøs matrise med et tilfeldig utvalg av søyler (i diameter og avstand). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Bakteriell transport på kanal- og poreskalaen i PDMS-fluidic enheten (A) BTCer av motile og ikke-motile P. putida KT2440 (GFP merket) oppnådd med en PDMS mikrofluidisk enhet og mikroskopisk telling. (B)Baner av ikke-motile celler i poreskalaen. Farger er valgt for å forbedre differensiering av baner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3:Bakteriell transportved kanal- og poreskala i PMMA-fluidic enheten (A) BTCer av motile og ikke-motile P. putida KT2440 (ikke merket) oppnådd ved hjelp av en PMMA fluidic enhet og flow-cytometri telling. (B) Den fluidiske enheten ble kolonisert av et naturlig stream-samfunn i 2 dager. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggstall 1: Tekniske tegninger av PMMA-fluidenheten. Enheten består av en baseenhet som inneholder den porøse matrisen og en lokkenhet med hullene til innløpet og uttaket. Enheten er forseglet med 12 skruer og en O-ring. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her foreslår vi to måter å studere transport av mikrober gjennom porøse systemer på encellet og befolkningsnivå. Mens studien av transportfenomener ved hjelp av BTC-modellering har gitt verdifull innsikt i spredningen av patogener eller forurensninger på økosystemskalaene, eksisterer det fortsatt vanskeligheter med å skalere fra laboratorieeksperimenter til feltforhold. Verktøyene som er beskrevet her, gjør det mulig for forskere å eksperimentelt løse de romlige og timelige skalaene for å bedre forstå mikrobenes økologiske strategier som er relevante for transport i porøse miljøer. Eksperimenterere kan bruke eller endre disse systemene til å studere andre mikrobielle egenskaper enn motilitet, for eksempel chemotaxis eller quorum sensing eller endre geometrien eller andre habitat egenskaper av porøs matrise. Videre kan bakteriell transportatferd lett forbindelsers til deponeringsprofiler, noe som gir viktig innsikt i koloniseringsmønstre og er avgjørende for å forstå hvordan biofilmer endrer lokale strømningsfelt. Vi forventer at en bedre forståelse av mikrobielle strategier for å spre og kolonisere porøse medier vil forbedre modellprognoser og dermed bidra til forvaltning av patogenspredning eller forurensningsdeslutning. Ytterligere modifikasjoner av systemet kan også bidra til utvikling av nye filtreringsenheter eller bioteknologiverktøy der celler må skilles fysisk.
Vi anbefaler PMMA-baserte enheter for store og langsiktige eksperimenter og PDMS-baserte enheter for mindre, kortere termeksperimenter eller når høy temporal oppløsning er kritisk. Det må huskes at de to materialene har forskjellige egenskaper. For eksempel er PDMS gjennomtrengelig for gass som oksygen, mens PMMA er gasstett. Denne forskjellen kan brukes til å studere gassforbruk i PMMA-scenariet, mens PDMS kan være mer egnet for eksperiment der oksygenbegrensninger knyttet til bakteriell respirasjon er uønskede.
Generelt er protokollene som er beskrevet her lett reproduserbare, og data innhentet ved hjelp av disse verktøyene avslører konsekvent forskjeller i transport av motile og ikke-motile bakterier. Den selvproderte væskedispenseren kan erstattes av et kommersielt tilgjengelig alternativ. Men på grunn av allsidighet og kostnadseffektivitet anbefaler vi den som er beskrevet her. Kritiske trinn i protokollen gjelder hovedsakelig håndteringen av de fluidiske enhetene og erfaringen med bildebehandling. Kvaliteten på data innhentet gjennom bildeanalyse kritisk avhenger av bildekvalitet (hovedsakelig bestemt av fokus og eksponeringstid) og en passende terskelstrategi. Datakvalitet oppnådd ved flyt-cytometrisk telling kritisk avhenger av effektiv fiksering og farging av cellene og ekspertise i tolkningen av flyt-cytometri resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi anerkjenner hjelp fra Antoine Wiedmer med oppsettet av robotdispenseren og dispenser.py skriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA | Sigma | ||
| Elastomer Sylgard 184 | Dowsil | 101697 | |
| Flow cytometer NovoCyte | Acea | ||
| Glucose | Sigma | https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit | |
| LB broth | BD | ||
| Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit | makeblock | ||
| Microscope Axio Imager | Zeiss | ||
| Microscope AxioZoom v16 | Zeiss | ||
| Microscope slides, 75 mm × 25 mm | Corning | ||
| Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | ||
| Plasma bonder Corona SB | BlackHole Lab | ||
| Potassium phosphate | Sigma | ||
| Syringe pump New Era NE 4000 | New Era | ||
| Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | Molecular Probes, Invitrogen | ||
| Tygon tubing | Ismatec | ||
| WF31SA universal milling machine | Mikron |
References
- Stevik, K., Aa, K., Ausland, G., Fredrik Hanssen, J. Retention and removal of pathogenic bacteria in wastewater percolating through porous media: a review. Water Research. 38 (6), 1355-1367 (2004).
- Ribet, D., Cossart, P. How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues. Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).
- Ginn, T. R., Wood, B. D., Nelson, K. E., Scheibe, T. D., Murphy, E. M., Clement, T. P. Processes in microbial transport in the natural subsurface. Advances in Water Resources. 25 (8), 1017-1042 (2002).
- Tufenkji, N. Modeling microbial transport in porous media: Traditional approaches and recent developments. Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1455-1469 (2007).
- Foppen, J. W., Van, M. H., Schijven, J. Measuring and modelling straining of Escherichia coli in saturated porous media. Journal of contaminant hydrology. 93 (1-4), 236-254 (2007).
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 251-263 (2016).
- Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., Anna, P., de Battin, T. J. Unraveling the biophysical underpinnings to the success of multispecies biofilms in porous environments. The ISME Journal. 1, (2019).
- Carrel, M., et al. Biofilms in 3D porous media: Delineating the influence of the pore network geometry, flow and mass transfer on biofilm development. Water Research. 134, 280-291 (2018).
- Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Bacterial hopping and trapping in porous media. Nature Communications. 10 (1), 2075 (2019).
- Scheidweiler, D., Miele, F., Peter, H., Battin, T. J., de Anna, P. Trait-specific dispersal of bacteria in heterogeneous porous environments: from pore to porous medium scale. Journal of The Royal Society Interface. 17 (164), 20200046 (2020).
- Morales, V. L., Parlange, J. Y., Steenhuis, T. S. Are preferential flow paths perpetuated by microbial activity in the soil matrix? A review. Journal of Hydrology. 393 (1), 29-36 (2010).
- Creppy, A., Clément, E., Douarche, C., D'Angelo, M. V., Auradou, H. Effect of motility on the transport of bacteria populations through a porous medium. Physical Review Fluids. 4 (1), 013102 (2019).
- Camesano, T. A., Logan, B. E. Influence of Fluid Velocity and Cell Concentration on the Transport of Motile and Nonmotile Bacteria in Porous Media. Environmental Science & Technology. 32 (11), 1699-1708 (1998).
- Lutterodt, G., Basnet, M., Foppen, J. W. A., Uhlenbrook, S. The effect of surface characteristics on the transport of multiple Escherichia coli isolates in large scale columns of quartz sand. Water Research. 43 (3), 595-604 (2009).
- Bozorg, A., Gates, I. D., Sen, A. Impact of biofilm on bacterial transport and deposition in porous media. Journal of Contaminant Hydrology. 183 (Supplement C), 109-120 (2015).
- Long, T., Ford, R. M. Enhanced Transverse Migration of Bacteria by Chemotaxis in a Porous T-Sensor. Environmental Science & Technology. 43 (5), 1546-1552 (2009).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics Expanding the Frontiers of Microbial Ecology. Annual Review of Biophysics. 43 (1), 65-91 (2014).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).
- Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).
- del Giorgio, P. A., Bird, D. F., Prairie, Y. T., Planas, D. Flow cytometric determination of bacterial abundance in lake plankton with the green nucleic acid stain SYTO 13. Limnology and Oceanography. 41 (4), 783-789 (1996).
