Summary
Curvas inovadoras (BTCs) são ferramentas eficientes para estudar o transporte de bactérias em mídia porosa. Aqui introduzimos ferramentas baseadas em dispositivos fluidos em combinação com microscopia e contagem citométrica de fluxo para obter BTCs.
Abstract
Compreender o transporte, dispersão e deposição de microrganismos na mídia porosa é uma tarefa científica complexa que compreende temas tão diversos quanto hidrodinâmica, ecologia e engenharia ambiental. A modelagem do transporte bacteriano em ambientes porosos em diferentes escalas espaciais é fundamental para prever melhor as consequências do transporte bacteriano, mas os modelos atuais muitas vezes não conseguem subir de laboratório para condições de campo. Aqui, introduzimos ferramentas experimentais para estudar o transporte bacteriano em meios porosos em duas escalas espaciais. O objetivo dessas ferramentas é obter observações macroscópicas (como curvas inovadoras ou perfis de deposição) de bactérias injetadas em matrizes porosas transparentes. Na pequena escala (10-1000 μm), os dispositivos microfluidos são combinados com microscopia de vídeo óptico e processamento de imagem para obter curvas inovadoras e, ao mesmo tempo, rastrear células bacterianas individuais na escala de poros. Em maior escala, a citometria de fluxo é combinada com um dispensador robótico auto-fabricado para obter curvas inovadoras. Ilustramos a utilidade dessas ferramentas para entender melhor como as bactérias são transportadas em mídias porosas complexas, como a zona hiporérica dos córregos. Como essas ferramentas fornecem medições simultâneas em escalas, elas abrem caminho para modelos baseados em mecanismos, criticamente importantes para o upscaling. A aplicação dessas ferramentas pode não apenas contribuir para o desenvolvimento de novas aplicações de bioremediação, mas também lançar uma nova luz sobre as estratégias ecológicas dos microrganismos colonizando substratos porosos.
Introduction
Estudos com o objetivo de compreender o transporte de micróbios por meio de mídia porosa têm sido impulsionados principalmente por preocupações de contaminação1, transmissão da doença2 e bioremediação3. Nesse sentido, as bactérias têm sido tratadas principalmente como partículas nos modelos de transporte4 e processos como filtragem, tensão, fixação gravitacional ou remobilização de biofilmes têm sido identificados como condutores de retenção ou transporte de micróbios5. No entanto, estudar o transporte de bactérias através de paisagens porosas também pode nos informar sobre as estratégias ecológicas que sustentam seu sucesso nesses ambientes complexos. No entanto, isso requer novos experimentos e modelos matemáticos operando em nível único de célula, população ou comunidade microbiana.
Ambientes porosos naturais, como os encontrados na zona hiporérica de córregos e rios, são densamente colonizados por diversas comunidades de micróbios formadores de biofilmes6. Os biofilmes formam estruturas que modificam o fluxo e, portanto, o transporte e dispersão de bactérias na fase líquida7,8. O transporte de bactérias em escala de poros depende da disponibilidade de espaço restrita na matriz porosa e a dispersão relacionada à motilidade pode ser uma maneira eficaz de aumentar o condicionamento físico individual através da redução da concorrência por recursos em áreas menos densamente povoadas. Por outro lado, as bactérias motile também podem atingir regiões mais isoladas da matriz porosa e a exploração prolongada dessas áreas pode proporcionar oportunidades ecológicas para as populações10. Em escalas espaciais maiores, o crescimento do biofilme desvia os caminhos de fluxo também levando ao entupimento (parcial) dos poros e, assim, ao estabelecimento de condições de fluxo ainda mais canalizadas e heterogêneas11. Isso tem consequências para o fornecimento de nutrientes e capacidade de dispersão, frequência e distância. O fluxo preferencial, por exemplo, pode gerar as chamadas "faixas rápidas" e as bactérias motile podem atingir velocidades ainda mais altas do que o fluxo local ao longo dessas faixas12. Esta é uma maneira eficaz de aumentar a exploração de novos habitats.
Uma variedade de ferramentas se aproveitam para o estudo do transporte de bactérias motile e não-motile (e partículas) em meios porosos. Modelos numéricos têm grandes capacidades preditivas importantes para aplicações, porém muitas vezes são limitados por pressupostos inerentes4. Experimentos em escala de laboratório13,14 combinados com modelagem de curva inovadora (BTC) forneceram insights importantes sobre a importância das propriedades da superfície celular bacteriana para a eficiência da aderência15. Normalmente, os BTCs (ou seja, vezes a série de concentração de partículas em um local fixo) são obtidos através de versões de taxa constante e medição de números de células no fluxo de saída do dispositivo experimental. Nesse contexto, os BTCs refletem a dinâmica de dispersão de advecção das bactérias na matriz porosa e podem ser estendidos por um termo de pia que contabiliza o apego. No entanto, a modelagem de BTCs por si só não resolve o papel da organização espacial do substrato poroso ou biofilme para processos de transporte. Outros observáveis macroscópicos, como perfis de dispersividade ou deposição, provaram fornecer informações importantes sobre a distribuição espacial ou as partículas retidas ou comunidades em crescimento. Microfluidos é uma tecnologia que permite estudar o transporte em mídia porosa por investigação de microscopia9,,12,,16, e exceto um trabalho recente10, sistemas experimentais são tipicamente limitados a uma única escala de comprimento de resolução, ou seja, a escala de poros ou toda a escala de dispositivo fluido.
Aqui, introduzimos um conjunto de métodos combinados para estudar o transporte de bactérias motile e não-motile em paisagens porosas em diferentes escalas. Combinamos observações de transporte bacteriano na escala de poros com informações em maior escala, por meio da análise do BTC. Dispositivos microfluidos construídos a partir da litografia macia usando polidimtilsiloxano (PDMS) são biocompatíveis, resistentes a uma gama de produtos químicos, permitem a replicabilidade a baixo custo e fornecem excelente transparência óptica, bem como baixa autofluorescência crítica para observação microscópica. Microfluidos baseados em PDMS tem sido usado anteriormente para estudar o transporte de micróbios nos canais simples17 ou em geometrias mais complexas12. No entanto, experimentos tipicamente microfluidos se concentram em horizontes de curto prazo e a observação microscópica epi-fluorescência de células vivas é comumente restrita a cepas geneticamente modificadas (por exemplo, cepas marcadas por GFP). Aqui apresentamos ferramentas para estudar o transporte bacteriano usando dispositivos microfluidos baseados em PDMS em combinação com microscopia e dispositivos maiores fabricados a partir de poli (metil methacrilate) (PMMA, também conhecido como plexiglass) em combinação com citometria de fluxo. PDMS e PMMA diferem na permeabilidade do gás e nas propriedades superficiais, proporcionando oportunidades complementares para estudar o transporte bacteriano. Embora o dispositivo microfluido forneça um ambiente mais controlado, o dispositivo maior permite experimentos por longos períodos de tempo ou usando comunidades bacterianas naturais. A contagem de microscopia em alta resolução temporal em uma área dedicada é usada para obter BTC no dispositivo microfluido baseado em PDMS. Para obter contagem de células para modelagem de BTC a partir do dispositivo baseado em PMMA, introduzimos um distribuidor líquido automatizado auto-construído em combinação com citometria de fluxo. Nesta configuração, as células passam o dispositivo fluido e são consecutivamente dispensadas em 96 placas de poço. A resolução temporal é restrita pelo volume mínimo que pode ser dispensado com precisão e, portanto, pela taxa média de fluxo através do dispositivo fluido. Fixação nos poços previne o crescimento e facilita a coloração do DNA para enumeração fluxo-citométrica a jusante. Para evitar o crescimento bacteriano durante os experimentos de transporte, usamos um meio mínimo (tampão de motilidade a termo).
Uma vez que os protocolos para a preparação de dispositivos fluidos em diferentes escalas estão prontamente disponíveis, apenas introduzimos brevemente as técnicas para produzir tais dispositivos e, em vez disso, focamos nos procedimentos experimentais para gravar BTCs. Da mesma forma, existem várias rotinas para a enumeração citométrica de fluxo de micróbios e os usuários exigem conhecimento especializado para interpretar resultados obtidos pela citometria de fluxo. Relatamos o novo uso de dispositivos microfluidos em combinação com imagens microscópicas para registrar BTCs de células fluorescentes marcadas. Na escala de poros, as velocidades e trajetórias locais são obtidas por meio do processamento de imagens. Além disso, demonstramos o uso de um dispositivo fluido baseado em PMMA em combinação com a contagem flutormétrica para observar o transporte bacteriano de células motile e não-motile em ambientes porosos colonizados por um biofilme de fluxo nativo.
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Protocol
1. Condições de cultura bacteriana
- Trabalhando sob uma capa de fluxo laminar, use 100 μL de um estoque de glicerol de Pseudomonas putida KT2440 (1 × 107 mL-1, armazenado a -80 °C) para inocular 5 mL de meio Luria-Bertani (LB). Incubar a 30 °C enquanto treme a 250 rpm durante a noite.
- No dia seguinte, resuspense 100 μL da cultura noturna em 5 mL LB médio e incubar sob as mesmas condições por 5h (fase exponencial). Prove uma alíquota de 1 mL em um tubo de 2 mL, deixe esfriar à temperatura ambiente (~15 min) e centrífuga (2300 x g por 5 min).
- Remova o supernatante e adicione 1 mL de mL de ml de mtilidade à pelota. Vórtice brevemente para homogeneizar a amostra. Diluir para alcançar a concentração celular desejada, por exemplo, 5 x 105 mL-1.
- Para experimentos envolvendo comunidades naturais, como os derivados de córregos, prepare um meio de cultivo não seletivo. Por exemplo, use água de córrego filtrada e autoclavada e autoclavada ou um meio de água artificial de córrego alterado com uma fonte de carbono complexa (meio LB).
2. Preparação de um dispositivo microfluido em polidimtilsiloxano (PDMS)
- Projete a geometria porosa desejada por meio do software CAD (Computer-Aided Drafting, elaboração de computador)18,que consiste em uma matriz de círculos (que é o obstáculo impermeável ao fluxo), descrita pelo tamanho do raio e coordenadas centrais.
NOTA: Um exemplo de geometria porosa com tamanhos de grãos e poros randomizados é fornecido na Figura 1A. Um canal de observação sem obstáculos próximos à tomada facilita a aquisição de BTCs. - Com base na geometria escolhida, prepare um molde usando a fotolitografia padrão SU-818.
NOTA: Alternativamente, os moldes também podem ser encomendados a partir de uma instalação dedicada de microfabagem. Para obter fluxo de fluido heterogêneo no plano horizontal, é importante projetar a espessura da câmara de microfluidos da mesma ordem de magnitude que o tamanho médio da garganta dos poros. No entanto, certifique-se de que as dimensões do dispositivo microfluido são adequadas para observação sob o microscópio (por exemplo, trabalhe em slides de microscópio). - Prepare 50 g de PDMS adicionando 10% de linker cruzado (copolímero de dimetila, metilhidrogênio) a 90% de elastômero em peso, usando uma seringa sem agulha. Trabalhe em condições limpas e evite poeira o máximo possível. Misture os dois reagentes em um recipiente descartável limpo e aplique vácuo (100 mbar) por 30 minutos para remover ar dissolvido e bolhas do PDMS viscoso.
- Coloque o molde em uma placa de Petri (100 mm de diâmetro, 15 mm de altura). Despeje o PDMS sobre o molde até a altura desejada (por exemplo, 2-5 mm). Cubra a placa de petri e mantenha-a a 60 °C por 4h (durante a noite para camadas mais grossas) para curar.
NOTA: Para fins de visualização, a luz deve ser capaz de passar pelo PDMS, assim, uma camada fina entre 2 mm e 5 mm é desejável. Camadas mais grossas (>5 mm) reduzem a transparência do dispositivo e as mais finas são submetidas a deformações durante a aplicação. - Retire o molde do forno e deixe o dispositivo microfluido esfriar à temperatura ambiente. Uma vez esfriado, remova cuidadosamente a porção desejada de PDMS com um bisturi.
NOTA: Fortes pressões no molde resultam em fraturas de molde. Não toque no PDMS com as mãos nuas, pois as impressões digitais afetarão a transparência óptica. - Veda temporariamente a parte inferior do canal PDMS (onde a geometria desejada foi gravada) com fita. Com um perfurador de biópsia de 0,5 mm de diâmetro, fure o canal microfluídico para criar uma entrada e uma saída que encaixe a tubulação de 0,5 mm (diâmetro interno).
NOTA: A natureza macia do PDMS garantirá o aperto assim que a tubulação estiver inserida. Os canais de entrada e saída não podem ser feitos depois que o PDMS foi selado ao vidro. - Selar o canal microfluido através da ligação de plasma de oxigênio usando o gerador de alta frequência (fiador de plasma, Tabela de Materiais). Para isso, limpe uma lâmina de vidro silicato (25 mm x 75 mm) com etanol e deixe secar. Remova a fita do canal PDMS e coloque o canal com o lado poroso voltado para cima. Trate o escorregador de vidro silicato e as superfícies PDMS com plasma para cerca de 45 s em temperatura ambiente.
- Coloque o canal PDMS no escorregador de vidro silicato e aqueça a 100 °C por 30 minutos em uma placa quente.
- Remova o dispositivo microfluido da placa quente e esfrie-o à temperatura ambiente. Conecte a entrada do canal PDMS com a tubulação. Aplique vácuo por 30 minutos para remover o ar do PDMS, que é quase impermeável aos fluidos, mas permeável ao gás.
- Prepare 100 mL de tampão de motilidade (fosfato de potássio de 10 mM, 0,1 mM EDTA, suplementado com 1% de glicose w/v, pH 7.0) e injete 1 mL dele no dispositivo microfluido usando uma bomba de seringa operada a 10 μL min-1.
NOTA: Como o PDMS está subsaturado em gás (devido à etapa anterior do vácuo), as bolhas desaparecerão dentro de ~30 min.
3. Preparação de um dispositivo fluido em poli (metacrilato de metila)
- Projete a geometria desejada com o software CAD. Se aplicável, certifique-se de que as dimensões são adequadas para observação sob o microscópio (por exemplo, dimensões de uma placa de poço padrão 96 em combinação com um suporte apropriado). O dispositivo fluido é composto por uma base (127 × 127 × 12 mm) e uma tampa (127 × 127 × 12 mm) de PMMA.
NOTA: Recomenda-se a experiência com o software CAD. Um exemplo de desenho técnico é fornecido na Figura 1A. - Para produzir o compartimento de poros, por meio de microvasagem de alta precisão (WF31SA, Mikron), remova 0,5 mm da camada pmma inferior e mote uma ranhura (1,1 × 1,1 mm) para um anel O de borracha. Furar 12 orifícios roscados (M5). Isso servirá como base do dispositivo fluido.
NOTA: As dimensões do dispositivo fluido precisam ser ajustadas para se adequar ao estágio do microscópio e à distância focal. Um desenho técnico é fornecido na Figura S1. - Faça dois furos roscados (tipo 1/4-28UNF) para entrada e saída na parte superior do dispositivo fluido e 12 furos (5,5 mm) para os parafusos. Isso servirá como a tampa do dispositivo fluido.
NOTA: A expertise em micro moagem é aconselhável; os autores utilizam o apoio de uma oficina especializada. - A fim de limpar e esterilizar o dispositivo fluido antes e depois de cada uso, mergulhe a base e a tampa do dispositivo fluido em HCl 7% e enxágue três vezes com água desionizada.
- Base do parafuso e tampa juntos usando os 12 orifícios roscados.
4. Configuração de dispensador automatizado
NOTA: Os distribuidores líquidos disponíveis comercialmente são caros e muitas vezes não oferecem flexibilidade para dispensar diretamente do fluxo de saída do dispositivo fluido. Portanto, recomenda-se a montagem de um sistema de distribuidor robótico barato e flexível a partir de um Robô Plotter XY (Tabela de Materiais).
- Para dispensar a saída do dispositivo fluido em 96 placas de poço, monte o dispensador robótico em uma placa PMMA e cavidades moinho de 85,8 x 128 mm com uma profundidade de 1 mm para segurar várias placas de 96 poços.
- Conecte o tubo de saída do dispositivo fluido ao braço robótico do dispensador.
- Para operar o dispensador robótico baixe bCNC do github: https://github.com/vlachoudis/bCNC e siga as instruções para instalar o programa.
- Baixe dispenser.py do material de suporte deste artigo.
NOTA: Este código python fornece um plugin ao bCNC para um simples layout de dispensador robótico. - Conecte o dispensador robótico ao computador em execução bCNC e identifique a porta COM correta.
- No bCNC, clique no botão home para retornar o dispensador robótico à posição de casa.
NOTA: Homing retorna o dispensador robótico a uma posição conhecida (x=0, y=0) e, portanto, melhora a precisão do dispensador. - Antes do experimento, prepare um número suficiente de 96 placas de poço, com poços contendo uma quantidade adequada de fixação (por exemplo, concentração final de 3,7% formaldeído).
NOTA: Por exemplo, a uma vazão de 0,2 mL min-1, 100 μL são dispensados em cada poço a cada 30 s. Portanto, adicione 10 μL de 37% de formaldeído a cada poço para atingir uma concentração final de Formaldeído entre 2 e 4%. O uso de oito placas de poços 96 permitirá operar o experimento por mais de 6 h com um total de 768 pontos de dados. Além disso, observe que as células marcadas por GFP podem perder seu sinal fluorescente após a fixação usando formaldeído.
5. Analise o transporte bacteriano usando dispositivos microfluidos PDMS
- Coloque o dispositivo microfluido PDMS previamente saturado com o tampão de motilidade no estágio do microscópio. Use fita para fixar a tubulação para minimizar a perturbação do fluxo durante o movimento do estágio.
- Mova o estágio do microscópio para o canal de observação perto da tomada. Utilizando microscopia de campo brilhante ou contraste de fase, concentre-se no centro do canal de observação e ajuste a ampliação para visualizar células bacterianas individuais.
- Mude as configurações do caminho da luz para microscopia de fluorescência e ajuste o tempo de exposição da câmera para resolver células bacterianas individuais (por exemplo, 100 ms), ou tal que os sinais de fluorescência das células são pelo menos 3x mais fortes que o ruído de fundo.
- Em seguida, insira a tubulação de entrada em um tubo de 2 mL contendo a suspensão bacteriana. Inverte a direção da bomba e começa a retirar a suspensão a uma vazão de 1 μL min-1.
- Escaneie a seção transversal de todo o canal de observação gravando uma imagem composta a cada 2 minutos, durante toda a duração do experimento.
6. Processamento básico de imagens
NOTA: O objetivo dessas rotinas básicas de processamento de imagem é contar o número de bactérias nas imagens gravadas. Os procedimentos de processamento ideais dependem das especificações técnicas do microscópio e da câmera, bem como das propriedades de fluorescência da cepa bacteriana utilizada no experimento e, portanto, precisam ser ajustadas.
- Primeiras imagens de exportação em formato .tiff.
- Importe imagens para uma plataforma de software desejada (por exemplo, MATLAB, ImageJ, R ou Python).
- Remova o ruído da câmera, que é uma variação aleatória da intensidade do pixel nas imagens e corrija para aberração óptica. Isso pode ser feito aplicando um filtro gaussiano em cada imagem: o tamanho do filtro depende da qualidade do sensor de câmera (por exemplo, CCD ou CMOS). A aberração óptica pode ser removida normalizando cada imagem por uma imagem de referência coletada na ausência da amostra com a mesma configuração óptica.
- Corte as imagens para uma região de interesse.
- Identifique um valor limiar (intensidade de pixel), de tal forma que valores acima do limiar incluem células bacterianas.
NOTA: Caso as imagens sejam iluminadas de forma irregular (por causa de aberração óptica ou ruído), pode ser útil aplicar um limiar adaptativo, que escolhe um valor limiar com base nas intensidades médias locais. - Subtraia a cada imagem o limiar definido acima.
- Binarize a imagem resultante, de tal forma que as células bacterianas tenham um valor de 1, enquanto o fundo tem um valor de 0.
- Remova aglomerados com uma área menor do que o menor tamanho de células bacterianas.
- Soma a imagem binarizada para obter o número total de pixels dos clusters restantes. Divida o número de pixels pelo tamanho médio (em pixels) de uma célula bacteriana: isso fornece uma estimativa do número total de células.
- Conhecendo a profundidade de visão e a área de investigação, transformar conta em concentração (partículas mL-1).
- É fundamental identificar a concentração da suspensão da bactéria injetada. Para isso, injete uma seringa de 1 mL de suspensão da cultura bacteriana no canal de observação de um dispositivo microfluido limpo. Regissuir a imagem e calcular a concentração bacteriana influente (C0)conforme descrito acima (6,1 a 6,10).
- Analise os BTCs normalizando a concentração bacteriana de efluentes (C) com concentração bacteriana influente (C0) e plot C/C0 versus tempo.
7. Analisar o transporte bacteriano na escala de poros
- Com o objetivo de analisar as velocidades locais e trajetórias das bactérias transportadas através da matriz porosa, mova o estágio do microscópio para a região de interesse e ajuste o foco para o centro do dispositivo microfluido.
- Defina microscópio para campo brilhante ou contraste de fase.
NOTA: Isso só no caso do sinal de fluorescência da célula bacteriana não permite gravar imagens em tempo de exposição menor do que o tempo médio bacteriano, caso contrário, use microscopia de fluorescência. - Registo de tempo, no momento de exposição que captura o deslocamento de bactérias (menor que o deslocamento médio sobre um número de pixels menor que o tamanho do objeto), e que otimiza a detecção de células bacterianas (por exemplo, exposição de 20 ms e imagens gravadas a cada 50 ms). Grave imagens ao longo de um tempo suficiente para registrar o suficiente (para ser estatisticamente representativo) das trajetórias mais lentas (por exemplo, 3 min).
NOTA: Certifique-se de que o computador tenha espaço suficiente para o disco. - Para remover o ruído de fundo, subtraia de cada imagem a média de todas as imagens gravadas. Para isso, crie uma matriz cujo resultado é a soma da intensidade de todas as imagens, para cada pixel, e divida-a pelo número de imagens.
- A partir da imagem processada (Im), determine o módulo do gradiente numérico
e normalize-o pelo seu valor máximo(máximo),conforme definido abaixo.
- Binarize a matriz B através do limiar de intensidade, veja os passos 6.7-6.8.
- Para cada ponto de tempo, registo as coordenadas de bactérias (x, y em pixel ou mm) e o tempo de aquisição de imagem em um arquivo de três colunas.
- Finalmente, aplique um script de rastreamento de partículas para processar os dados gravados e calcular as trajetórias das bactérias. Por exemplo, use o protocolo estabelecido19e o Código de Rastreamento de Partículas Matlab disponível gratuitamente: (http://site.physics.georgetown.edu/matlab/).
e normalize-o pelo seu valor máximo(máximo),conforme definido abaixo.
8. Estude filtragem bacteriana por meio de perfis de deposição
- Para obter perfis de depoimento de células P. putida KT2440 marcadas por GFP por microscopia de fluorescência, registou uma imagem composta de todo o canal poroso antes, ou seja, o fundo, e após a injeção de suspensão bacteriana através do dispositivo microfluido. Use um tempo de exposição que permita a aquisição de sinal fluorescente bacteriano (por exemplo, 100 ms), sem branquear o sinal.
- Exportar imagens e importar na plataforma de software desejada (ver 6.1-6.2).
- Remova o fundo das imagens gravadas após a injeção bacteriana.
- Integre o sinal total de fluorescência de bactérias retidas ao longo de seções transversais do canal poroso.
- Para calcular o perfil do depoimento, plote o sinal de floresnce integrado versus o comprimento do canal poroso.
9. Analisar o transporte bacteriano usando dispositivos fluidos PMMA e citometria de fluxo
- Conecte a bomba peristáltica com a entrada usando tubos de 50 cm (diâmetro interno) de 50 cm e o fluxo de saída com o dispensador automatizado usando o mesmo tubo (50 cm, ver seção 4).
NOTA: Use a bomba para dispensar meios de cultivo e para injetar células bacterianas. Use conectores Luer-lock e válvulas de três vias para deslocar entre suspensão média e bacteriana durante a liberação de taxa constante. - Bombear meio de cultivo no dispositivo fluido. Note a chegada do meio na tubulação de saída fixada ao dispensador robótico.
- Comece a injetar a suspensão bacteriana através do dispositivo fluido PMMA a uma taxa de fluxo de 0,2 mL min-1,
- Quando as bactérias atingem a entrada do dispositivo fluido, ligue o dispensador automatizado.
- Para fazer uma injeção de pulso, injete suspensão bacteriana para alguns volumes de poros (por exemplo 30) e, em seguida, mude a injeção para a mídia de cultivo até o fim do experimento.
NOTA: o volume de poros do dispositivo fluido é de aproximadamente 0,2 mL, assim, na taxa de fluxo prosed a cada minuto um volume inteiro de poros é trocado. - Uma vez que uma placa de 96 poços esteja concluída, cubra a placa para reduzir a evaporação e armazene-a a 4 °C.
- Analisar a abundância bacteriana através da citometria de fluxo, seguindo os protocolos estabelecidos20.
NOTA: Por exemplo, adicione 25 μL da mancha de ácido nucleico verde-fluorescente (Tabela de Materiais) a 0,025 mM (em água ultrauso) a cada poço. Mancha o DNA bacteriano, permitindo assim quantificar por citometria de fluxo a abundância bacteriana. Incubar amostras por 15 minutos no escuro e, em seguida, analisar usando um citómetro de fluxo equipado com um laser de 488 nm e detectores a 515 nm. - Antes da análise do BTC, considere a diluição da amostra devido à adição de fixação e mancha. Corrigir abundância bacteriana por um fator de 1,35 para explicar fixação e mancha.
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Representative Results
Para ilustrar a funcionalidade do fluxo de trabalho apresentado, realizamos experimentos utilizando pseudomonas putida KT2440 geneticamente modificada, uma bactéria motile negativa grama importante para bioremediação e biotecnologia. Versões geneticamente modificadas desta cepa que expressam a produção de GFP estão disponíveis comercialmente. Uma cepa não motil de P. putida KT2440 que não possui os genes estruturais e regulatórios relevantes para a motilidade também está disponível. Usando ambos, motile e não-motile GFP marcado p. putida KT2440, realizamos experimentos sequenciais em dispositivos microfluidos PDMS com uma matriz aleatória de pilares(Figura 1B) e BTCs gravados(Figura 2A). Os BTCs foram normalizados à concentração de células injetadas (C0). Simultaneamente, as trajetórias bacterianas na escala dos poros foram visualizadas através do processamento de imagens e rastreamento de partículas conforme descrito acima (Figura 2B).
Em seguida, realizamos experimentos com dispositivos fluidos de larga escala moídos a partir de PMMA (Figura 1A). Motile e não-motile P. putida KT2440 (não fluorescente) foram injetados em uma matriz porosa regularmente espaçada e os BTCs foram obtidos usando o dispensador líquido e a contagem de citometria de fluxo conforme descrito acima(Figura 3A). Surpreendentemente, em um ambiente poroso desprovido de biofilme, motile e não-motile P. putida KT2440 mostrou um comportamento de transporte notavelmente diferente. Em uma matriz porosa colonizada por 48h com uma complexa comunidade de biofilmes de fluxo, essas diferenças no BTC entre motile e não-motile P. putida KT2440 desapareceram(Figura 3B).)
Figura 1: Dispositivos fluidos para estudar o transporte microbiano em mídia porosa (A) Ilustração de um dispositivo fluido fresado de PMMA. A matriz porosa é moída na camada base do dispositivo, a tampa é fechada usando parafusos. Uma seção transversal mostra o arranjo dos pilares dentro do dispositivo fluido. A inserção mostra uma matriz porosa com uma grade espaçada regular de pilares e o respectivo campo de fluxo de velocidade. (B) O dispositivo PDMS é montado em uma lâmina de vidro de microscopia. São mostrados o fluxo de entrada e saída, conectado ao reservatório médio e à bomba de seringa, respectivamente. A câmara de observação para contagem microscópica é colocada como uma câmara separada sem uma matriz porosa no mesmo slide de microscópio. A inserção mostra uma matriz porosa com uma matriz aleatória de pilares (em diâmetro e espaçamento). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Transporte bacteriano na escala de canais e poros no dispositivo fluido PDMS (A) BTCs de motile e não-motile P. putida KT2440 (GFP marcado) obtidos com um dispositivo microfluido PDMS e contagem microscópica. (B) Trajetórias de células não motil na escala de poros. As cores são escolhidas para melhorar a diferenciação das trajetórias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Transporte bacteriano na escala de canais e poros no dispositivo fluido PMMA (A) BTCs de motile e não-motile P. putida KT2440 (não marcado) obtidos utilizando um dispositivo fluido PMMA e contagem de fluxo-citometria. (B) O dispositivo fluido foi colonizado por uma comunidade natural de córregos por 2 dias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Desenhos técnicos do dispositivo fluido PMMA. O dispositivo é composto por uma unidade base contendo a matriz porosa e uma unidade de tampa com os orifícios para a entrada e saída. O dispositivo é selado usando 12 parafusos e um anel O. Clique aqui para baixar este número.
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Discussion
Aqui sugerimos dois meios para estudar o transporte de micróbios através de sistemas porosos no nível unicelular e populacional. Embora o estudo dos fenômenos de transporte usando modelagem de BTC tenha fornecido insights valiosos sobre a disseminação de patógenos ou contaminantes nas escalas do ecossistema, as dificuldades de dimensionar de experimentos de laboratório para condições de campo ainda existem. As ferramentas aqui descritas permitem aos pesquisadores resolver experimentalmente as escalas espaciais e temporais, a fim de entender melhor as estratégias ecológicas dos micróbios relevantes para o transporte em ambientes porosos. Os experimentadores podem usar ou modificar esses sistemas para estudar outros traços microbianos que a motilidade, como quimiotaxis ou detecção de quórum ou modificar a geometria ou outras características de habitat da matriz porosa. Além disso, usando esses sistemas, o comportamento do transporte bacteriano pode ser prontamente acoplado a perfis de deposição, que fornecem insights importantes sobre padrões de colonização e são fundamentais para entender como os biofilmes modificam os campos de fluxo locais. Prevemos que uma melhor compreensão das estratégias microbianas para dispersar e colonizar mídias porosas melhorará as previsões do modelo e, assim, contribuirá para o manejo da disseminação de patógenos ou contenção de contaminantes. Outras modificações do sistema também podem contribuir para o desenvolvimento de novos dispositivos de filtragem ou ferramentas de biotecnologia nas quais as células precisam ser fisicamente separadas.
Recomendamos dispositivos baseados em PMMA para experimentos de grande e longo prazo e dispositivos baseados em PDMS para experimentos menores e de curto prazo ou quando a alta resolução temporal é crítica. É preciso ter em mente que os dois materiais têm propriedades diferentes. Por exemplo, pDMS é permeável ao gás como oxigênio, enquanto PMMA é apertado a gás. Essa diferença pode ser usada para estudar o consumo de gás no cenário pmma, enquanto o PDMS pode ser mais adequado para experimentos onde limitações de oxigênio relacionadas à respiração bacteriana são indesejadas.
Em geral, os protocolos aqui descritos são facilmente reprodutíveis e os dados obtidos usando essas ferramentas revelam consistentemente diferenças no transporte de bactérias motile e não motile. O distribuidor líquido auto-fabricado pode ser substituído por uma alternativa comercialmente disponível. No entanto, por razões de versatilidade e custo-benefício, recomendamos o descrito aqui. As etapas críticas do protocolo dizem respeito principalmente ao manuseio dos dispositivos fluidos e à experiência com o processamento de imagens. A qualidade dos dados obtidos através da análise de imagem depende criticamente da qualidade da imagem (principalmente determinada pelo foco e tempo de exposição) e de uma estratégia de limiar adequada. A qualidade dos dados obtidos pela contagem flutorimétrica depende criticamente da fixação e coloração efetiva das células e da expertise na interpretação dos resultados de fluxo-citometria.
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Disclosures
Os autores declaram que não há conflito de interesses.
Acknowledgments
Reconhecemos a ajuda de Antoine Wiedmer com a configuração do dispensador robótico e o dispenser.py roteiro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA | Sigma | ||
| Elastomer Sylgard 184 | Dowsil | 101697 | |
| Flow cytometer NovoCyte | Acea | ||
| Glucose | Sigma | https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit | |
| LB broth | BD | ||
| Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit | makeblock | ||
| Microscope Axio Imager | Zeiss | ||
| Microscope AxioZoom v16 | Zeiss | ||
| Microscope slides, 75 mm × 25 mm | Corning | ||
| Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | ||
| Plasma bonder Corona SB | BlackHole Lab | ||
| Potassium phosphate | Sigma | ||
| Syringe pump New Era NE 4000 | New Era | ||
| Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | Molecular Probes, Invitrogen | ||
| Tygon tubing | Ismatec | ||
| WF31SA universal milling machine | Mikron |
References
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