Summary
Прорыв кривых (BTCs) являются эффективными инструментами для изучения транспортировки бактерий в пористых средств массовой информации. Здесь мы представляем инструменты, основанные на жидкостных устройствах в сочетании с микроскопией и цитометрическим подсчетом потока для получения БТК.
Abstract
Понимание транспорта, рассеивания и осаждения микроорганизмов в пористых средствах массовой информации является сложной научной задачей, включающей такие разнообразные темы, как гидродинамика, экология и экологическая инженерия. Моделирование бактериального транспорта в пористых средах в различных пространственных масштабах имеет решающее значение для лучшего прогнозирования последствий бактериального транспорта, однако нынешние модели часто не могут масштабироваться от лабораторных к полевым условиям. Здесь мы представляем экспериментальные инструменты для изучения бактериального транспорта в пористых средствах массовой информации в двух пространственных масштабах. Цель этих инструментов состоит в том, чтобы получить макроскопические наблюдаемые (такие как прорыв кривых или осаждения профилей) бактерий, введенных в прозрачные пористые матрицы. В малых масштабах (10-1000 мкм) микрофлюидные устройства сочетаются с оптической видео-микроскопией и обработкой изображений для получения прорывных кривых и, в то же время, для отслеживания отдельных бактериальных клеток в порной шкале. В более широком масштабе цитометрия потока сочетается с самодельным роботизированным дозатором для получения прорывных кривых. Мы иллюстрируют полезность этих инструментов, чтобы лучше понять, как бактерии транспортируются в сложных пористых средствах массовой информации, таких как гипорхейная зона потоков. Поскольку эти инструменты обеспечивают одновременные измерения в масштабах, они прокладывают путь для моделей на основе механизмов, критически важных для перенаписьвания. Применение этих инструментов может не только способствовать разработке новых методов биовосстановления, но и пролить новый свет на экологические стратегии микроорганизмов колонизации пористых субстратов.
Introduction
Исследования, направленные на понимание транспортировки микробов через пористые средства массовой информации в основном былиобусловлены опасениями загрязнения 1,передачи болезни 2 и биовосстановления3. В этой связи бактерии в основном рассматриваются как частицы втранспортных моделях 4 и такие процессы, как фильтрация, напряжение, гравитационное оседают или ремобилизации из биопленки были определены в качестве драйверов удержания или транспортировкимикробов 5. Тем не менее, изучение транспортировки бактерий через пористые ландшафты может также информировать нас об экологических стратегиях, лежащих в основе их успеха в этих сложных средах. Тем не менее, это требует новых экспериментов и математических моделей, работающих на уровне одной клетки, популяции или микробного сообщества.
Природные пористые среды, такие как те, которые находятся в гипорхейской зоне ручьев и рек, плотно колонизированы различными сообществами биопленообразующихмикробов 6. Биопленки образуют структуры, которые изменяют поток и, таким образом, транспортировку и рассеивание бактерий в жидкойфазе 7,,8. Транспортировка бактерий в поровом масштабе зависит от ограниченной доступности пространства в пористой матрице, и рассеивание, связанное с подвижностью, может быть эффективным способом повышения физической подготовки отдельных людей за счет снижения конкуренции за ресурсы в менее густонаселенных районах. С другой стороны, подвижные бактерии могут также достигать более изолированных областей пористой матрицы и расширенное исследование таких районов может обеспечить экологические возможности для подвижнойпопуляции 10. В больших пространственных масштабах рост биопленки отвлекает пути потока, также ведущие к (частичному) засорему пор и, таким образом, к созданию еще более ченнелингов и неоднородныхусловий потока 11. Это имеет последствия для способности к поставкам и рассеиванию питательных веществ, частоте и расстоянию. Преференциальный поток, например, может генерировать так называемые "быстрые треки" и пестрые бактерии могут достигать еще более высоких скоростей, чем локальный поток вдоль этихтреков 12. Это эффективный способ увеличить разведку новых мест обитания.
Различные инструменты используются для изучения транспортировки пестрых и недвижимых бактерий (и частиц) в пористых средствах массовой информации. Численные модели имеют большие прогностический потенциал, важный для приложений, однако часто ограничены присущимипредположениям 4. Лабораторные эксперименты13,14 всочетании с прорывом кривой (BTC) моделирования предоставили важные идеи в важности бактериальных свойств поверхности клеток для прилипанияэффективности 15. Как правило, БТК (т.е. серия времени концентрации частиц в фиксированном месте) получаются с помощью постоянных выбросов скорости и измерения числа клеток при оттоке экспериментального устройства. В этом контексте БТК отражают динамику дисперсии бактерий в пористой матрице и могут быть расширены термином раковины, учитывая привязанность. Однако моделирование БТР само по себе не решает роли пространственной организации пористого субстрата или биопленки для транспортных процессов. Было доказано, что другие макроскопические наблюдаемые факторы, такие как дисперсия или профили осаждения, предоставляют важную информацию о пространственном распределении или сохраненных частицах или растущих сообществах. Микрофлюиды это технология, которая позволяет изучать транспорт в пористых средствахмассовой информации с помощью микроскопии исследования 9,12,16, и заисключением недавней работы 10, экспериментальные системы, как правило, ограничены одной шкале длины разрешения, то есть, поры масштаба или всей жидкости масштаба устройства.
Здесь мы представляем набор комбинированных методов для изучения транспортировки подвижных и немостоялых бактерий в пористых ландшафтах в различных масштабах. Мы сочетаем наблюдения за бактериальным транспортом в поровом масштабе с информацией в более широком масштабе с помощью анализа BTC. Микрофлюидные устройства, построенные из мягкой литографии с использованием полидиметилсилоксана (PDMS), биосовместимы, устойчивы к ряду химических веществ, позволяют воспроизводиться при низких затратах и обеспечивают отличную оптическую прозрачность, а также низкую аутофторесценцию, критически важную для микроскопических наблюдений. Микрофлюиды на основе PDMS ранее использовались для изучения транспортировки микробов в простыхканалах 17 или в более сложных геометриях12. Тем не менее, как правило, эксперименты микрофлюиды сосредоточиться на краткосрочных горизонтов и эпи-флуоресценции микроскопического наблюдения живых клеток, как правило, ограничивается генетически модифицированных штаммов (например, GFP-тегами штаммов). Здесь мы представляем инструменты для изучения бактериального транспорта с использованием микрофлюидных устройств на основе PDMS в сочетании с микроскопией и более крупными устройствами, изготовленными из поли (метил-метакрилата) (PMMA, также известного как плексиглас) в сочетании с цитометрией потока. PDMS и PMMA отличаются проницаемостью газа и поверхностными свойствами, тем самым предоставляя дополнительные возможности для изучения бактериального транспорта. В то время как микрофлюидное устройство обеспечивает более контролируемую среду, более крупное устройство позволяет проводить эксперименты в течение длительных периодов времени или с использованием естественных бактериальных сообществ. Микроскопия, подсчитываемая при высоком временном разрешении в выделенной области, используется для получения BTC в микрофлюидных устройствах на основе PDMS. Чтобы получить количество ячеев для моделирования BTC с устройства на основе PMMA, мы вводим самосконструируемый автоматизированный жидкий дозатор в сочетании с цитометрией потока. В этой установке, клетки проходят жидкостное устройство и последовательно распределяется в 96 пластин хорошо. Временное разрешение ограничено минимальным объемом, который можно точно распределить, и, таким образом, средней скоростью потока через жидкое устройство. Фиксация в скважинах предотвращает рост и облегчает окрашивание ДНК для нисходящего потока-цитометрического перечисления. Для предотвращения роста бактерий в ходе транспортных экспериментов мы используем минимальную среду (такую же подвижность буфера).
Поскольку протоколы по подготовке жидкостных устройств в различных масштабах легко доступны, мы лишь кратко вводим методы производства таких устройств и, скорее, сосредоточиваемся на экспериментальных процедурах записи БТК. Аналогичным образом существуют различные процедуры для цитометрического перечисления потока микробов, и пользователи требуют экспертных знаний для интерпретации результатов, полученных с помощью цитометрии потока. Мы сообщаем о новой использовании микрофлюидных устройств в сочетании с микроскопической визуализацией для записи БТК клеток с флуоресцентными тегами. В поровом масштабе локальные скорости и траектории получаются с помощью обработки изображений. Кроме того, мы демонстрируем использование жидкого устройства на основе PMMA в сочетании с потоко-цитометрическим подсчетом для наблюдения за бактериальной транспортировкой подвижных и недвижимых клеток в пористых средах, колонизированных биопленкой родного потока.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Условия бактериальной культуры
- Работая под капотом ламинарного потока, используйте 100 л глицеролового запаса GFP-тегами Pseudomonas putida KT2440 (1 × 107 мл-1, хранится при -80 градусах по Цельсию) для прививки 5 мл среды Лурия-Бертани (LB). Инкубировать при 30 градусов по Цельсию при тряске при 250 об/мин за ночь.
- На следующий день, resuspend 100 йл ночной культуры в 5 мл LB среды и инкубировать в тех же условиях для 5h (экспоненциальная фаза). Попробуйте алицит 1 мл в трубку 2 мл, дайте остыть до комнатной температуры (15 мин) и центрифуге (2300 х г в течение 5 мин).
- Удалите супернатант и добавьте в гранулы буфер подвижности 1 мл. Vortex кратко гомогенизировать образец. Разбавить, чтобы достичь желаемой концентрации клеток, например, 5 х10 5 мл-1.
- Для экспериментов с участием естественных сообществ, таких, как те, которые получены из потоков, подготовить не избирательного культивирования среды. Например, использовать стерилизованную фильтрованную и автоклавированную потоковую воду или искусственный поток водной среды с измененным сложным источником углерода (LB medium).
2. Подготовка микрофлюидного устройства в полидиметилсилоксане (PDMS)
- Дизайн желаемой пористой геометрии с помощью компьютерного программного обеспечения (CAD)18, который состоит из матрицы кругов (то есть непроницаемым препятствием для потока), описанные размер радиуса и координаты центра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пример пористой геометрии со рандомизированными размерами зерна и пор приведен на рисунке 1A. Канал наблюдения без препятствий вблизи торговой точки облегчает приобретение БТК. - Основываясь на выбранной геометрии, подготовь форму с использованием стандартной фотолитографииСУ-8 18.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, формы также могут быть заказаны из специализированных микрофабрикации объекта. Для того, чтобы получить неоднородный поток жидкости в горизонтальной плоскости, важно, чтобы проектировать толщину микрофлюиды камеры того же порядка величины, как средний размер горла поры. Однако убедитесь, что размеры микрофлюидного устройства пригодны для наблюдения под микроскопом (например, работа над микроскопом слайдов). - Подготовка 50 г PDMS, добавив 10% от перекрестного связующим звеном (диметил, метилгидроген силоксан кополимер) до 90% еластомера по весу, используя шприц без иглы. Работайте в чистых условиях и избегайте пыли как можно больше. Смешайте два реагента в чистом одноразовом контейнере и нанесите вакуум (100 мбар) на 30 минут, чтобы удалить растворенный воздух и пузырьки из вязкой PDMS.
- Поместите форму в чашку Петри (100 мм в диаметре, 15 мм в высоту). Налейте PDMS на форму на нужную высоту (например, 2-5 мм). Обложка чашку Петри и держать его на 60 градусов по Цельсию в течение 4 ч (ночь для более толстых слоев) для лечения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации, свет должен быть в состоянии пройти через PDMS, таким образом, тонкий слой от 2 мм до 5 мм желательно. Более толстые слои (nogt;5 мм) снижают прозрачность устройства, а более тонкие — деформации во время применения. - Удалить плесень из духовки и позволить микрофлюидного устройства для охлаждения до комнатной температуры. После охлаждения осторожно удалите желаемую порцию PDMS скальпелем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сильное давление на плесень приводит к переломам плесени. Не прикасайтесь к PDMS голыми руками, так как отпечатки пальцев повлияют на оптическую прозрачность. - Временно запечатать дно канала PDMS (где была выгравирована желаемая геометрия) лентой. С помощью пуншатора биопсии диаметром 0,5 мм прокалывает микрофлюидный канал для создания входного и розетки, установки труб диаметром 0,5 мм (внутренний диаметр).
ПРИМЕЧАНИЕ: Мягкий характер PDMS обеспечит герметичность, как только трубки будут вставлены. Входные и торговые каналы не могут быть сделаны после того, как PDMS был запечатан на стекло. - Печать микрофлюидного канала через кислородную плазменную связь с использованием высокочастотного генератора (плазменный бондер, Таблица материалов). Для этого очистите силикатную стеклянную горку (25 мм х 75 мм) этанолом и дайте ему высохнуть. Удалите ленту с канала PDMS и поместите канал с пористой стороной вверх. Лечить силикат стекла слайд и PDMS поверхностей с плазмой около 45 с при комнатной температуре.
- Поместите канал PDMS на силикатную стеклянную горку и нагревайте при температуре 100 градусов по Цельсию в течение 30 минут на горячей тарелке.
- Снимите микрофлюидное устройство с горячей пластины и охладите его до комнатной температуры. Подключите вход канала PDMS с трубкой. Нанесите вакуум на 30 минут, чтобы удалить воздух из PDMS, который почти непроницаем для жидкостей, но проницаем для газа.
- Приготовьте 100 мл буфера подвижности (10 мМ фосфат калия, 0,1 мМ ЭДТА, дополненный 1% в/в глюкозой, рН 7,0) и ввините 1 мл его в микрофлюидное устройство с помощью шприц-насоса, работая при 10йл мин -1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку PDMS недостаточно насыщен газом (из-за предыдущего вакуумного шага), пузырьки исчезнут в течение 30 минут.
3. Подготовка жидкого устройства в поли (метилмахкрилат)
- Разработка желаемой геометрии с помощью программного обеспечения CAD. Если это применимо, убедитесь, что размеры пригодны для наблюдения под микроскопом (например, размеры стандартной пластины 96 хорошо в сочетании с соответствующим держателем). Жидкое устройство состоит из основания (127 × 127 × 12 мм) и крышки (127 × 127 × 12 мм) PMMA.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется экспертиза программного обеспечения CAD. Пример технического чертежа приведен на рисунке 1A. - Для производства порового отсека с помощью высокоточного микромиллиона (WF31SA, Mikron) снимите 0,5 мм со дна слоя PMMA и измельчите паз (1,1 × 1,1 мм) для резинового O-кольца. Просверлите 12 резьбовые отверстия (M5). Это послужит основой жидкостного устройства.
ПРИМЕЧАНИЕ: Размеры жидкого устройства должны быть скорректированы в нужное время, чтобы соответствовать стадии микроскопа и фокусного расстояния. Технический чертеж поставляется на рисунке S1. - Просверлите два резьбовых отверстия (тип 1/4-28UNF) для внутри- и розетки в верхней части жидкостного устройства, и 12 отверстий (5,5 мм) для винтов. Это будет служить в качестве крышки жидкостного устройства.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется экспертиза в области микро-фрезерования; авторы пользуются поддержкой специализированного семинара. - Для того, чтобы очистить и стерилизовать жидкое устройство до и после каждого использования, замочить основание и крышку жидкостного устройства в HCl 7% и промыть три раза с деионизированной водой.
- Винт базы и крышки вместе, используя 12 резьбовые отверстия.
4. Настройка автоматизированного дозатора
ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерчески доступные жидкие дозаторы являются дорогостоящими и часто не предлагают гибкость, чтобы обойтись непосредственно от оттока жидкого устройства. Поэтому рекомендуется сборка дешевой и гибкой роботизированной дозаторной системы от XY Plotter Robot (Таблица материалов).
- Для того, чтобы распределить отток из жидкого устройства в 96 пластин, смонтировать роботизированный дозатор на пластину PMMA и мельницы полостей 85,8 х 128 мм с глубиной 1 мм, чтобы провести несколько пластин 96 хорошо.
- Прикрепите трубку оттока жидкостного устройства к роботизированной руке дозатора.
- Для работы роботизированного дозатора загрузите bCNC из github: https://github.com/vlachoudis/bCNC и следуйте инструкциям по установке программы.
- Скачать dispenser.py из вспомогательного материала этой статьи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот код питона обеспечивает плагин для bCNC для простой макет робота дозатора. - Подключите роботизированный дозатор к компьютеру под управлением bCNC и определите правильный порт COM.
- В bCNC нажмите кнопку «Домой», чтобы вернуть роботизированный дозатор в домашнее положение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Homing возвращает роботизированный дозатор в известное положение (x'0, y'0) и, следовательно, повышает точность дозатора. - До начала эксперимента подготовьте достаточное количество пластин из 96 скважин, при этом скважины содержат соответствующее количество фиксатора (например, окончательная концентрация 3,7% формальдегида).
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, при скорости потока 0,2 млмин -1, 100 йл распределяются в каждый колодец каждые 30 с. Таким образом, добавьте 10 МКЛ 37% формальдегида к каждой колодец, чтобы достичь окончательной концентрации формальдегида между 2 и 4%. Использование восьми пластин 96 хорошо позволит работать эксперимент более 6 ч в общей сложности 768 точек данных. Кроме того, обратите внимание, что GFP-тегами клетки могут потерять свой флуоресцентный сигнал после фиксации с помощью формальдегида.
5. Анализ бактериального транспорта с помощью микрофлюидных устройств PDMS
- Поместите микрофлюидное устройство PDMS, ранее насыщенное буфером подвижности, на сцене микроскопа. Используйте ленту, чтобы исправить трубки, чтобы свести к минимуму нарушение потока во время движения стадии.
- Переместив стадию микроскопа на канал наблюдения рядом с розеткой. Используя яркую полевую микроскопию или фазовую контрастность, сосредоточьтесь на центре канала наблюдения и отрегулируйте увеличение, чтобы визуализировать отдельные бактериальные клетки.
- Переключите настройки пути света на микроскопию флуоресценции и отрегулируйте время экспозиции камеры, чтобы решить отдельные бактериальные клетки (например, 100 мс), или таким образом, чтобы флуоресцентные сигналы клеток были по крайней мере в 3 раза сильнее фонового шума.
- Затем вставьте входную трубку в трубку 2 мл, содержащую бактериальную суспензию. Обратное направление насоса и начать снятие подвески со скоростью потока 1 йл мин-1.
- Сканирование поперечного сечения всего канала наблюдения, записывающего композитное изображение каждые 2 минуты, в течение всего периода эксперимента.
6. Базовая обработка изображений
ПРИМЕЧАНИЕ: Цель этих основных процедур обработки изображений состоит в том, чтобы подсчитать количество бактерий в записанных изображениях. Оптимальные процедуры обработки зависят от технических характеристик микроскопа и камеры, а также от свойств флуоресценции бактериального штамма, используемого в эксперименте, и поэтому нуждаются в корректировке.
- Первые экспортные изображения .tiff формате.
- Импорт изображений на нужную программную платформу (например, MATLAB, ImageJ, R или Python).
- Удалите шум камеры, который является случайным изменением интенсивности пикселей в изображениях и правильным для оптической аберрации. Это можно сделать с применением гауссийского фильтра к каждой картинке: размер фильтра зависит от качества датчика камеры (например, CCD или CMOS). Оптическая аберрация может быть удалена путем нормализации каждой картины эталонным изображением, собранным в отсутствие образца с одинаковой оптической конфигурацией.
- Обрезать изображения в регионе, представляющих интерес.
- Определите пороговое значение (интенсивность пикселей), таким образом, что значения выше порога включают бактериальные клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: В случае неравномерного освещения изображений (из-за оптической аберрации или шума) может быть полезно применить адаптивный порог, который выбирает пороговое значение на основе локальной интенсивности среднего значения. - Вычесть из каждой картины порог, определенный выше.
- Binarize в результате изображения, такие, что бактериальные клетки принимают значение 1, в то время как фон занимает значение 0.
- Удалите кластеры с площадью меньше, чем самый маленький размер бактериальных клеток.
- Сумма binarized изображение, чтобы получить общее количество пикселей остальных кластеров. Разделите количество пикселей на средний размер (в пикселях) бактериальной клетки: это дает оценку общего количества клеток.
- Зная глубину зрения и область исследования, трансформирует количество в концентрацию (частицы МЛ-1).
- Это имеет основополагающее значение для определения концентрации инъекционных бактерий подвески. Для этого ввимите шприцем 1 мл культуры бактерий подвеску в канал наблюдения чистого микрофлюидного устройства. Завехайте изображение и вычислите бактериальную концентрацию (C0),описанную выше (6,1-6,10).
- Анализ БТК путем нормализации сточных вод бактериальной концентрации (C) с вопли бактериальной концентрации (C0) и участок C / C0 по сравнению со временем.
7. Анализ бактериального транспорта по шкале пор
- Для анализа локальных скоростей и траекторий бактерий, транспортируемых через пористую матрицу, переместите стадию микроскопа в область интереса и отрегулируйте фокус к центру микрофлюидного устройства.
- Установите микроскоп на яркое поле или фазовую контрастность.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это только в том случае, если флуоресцентный сигнал бактериальной клетки не позволяет записывать изображения во время экспозиции короче, чем среднее время бактерии, в противном случае использовать флуоресцентную микроскопию. - Запись покадровые изображения, во время экспозиции, которая захватывает перемещение бактерий (короче, чем среднее перемещение на несколько пикселей меньше, чем размер объекта), и что оптимизирует обнаружение бактериальных клеток (например, воздействие 20 мс и изображения, записанные каждые 50 мс). Запись фотографий за достаточное количество времени для того, чтобы зафиксировать достаточно (чтобы быть статистически репрезентативным) самых медленных траекторий (например, 3 мин).
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что компьютер имеет достаточно места на диске. - Чтобы удалить фоновый шум, вычесть из каждого изображения среднее значение всех записанных изображений. Для этого создайте матрицу, результатом которой является сумма интенсивности всех изображений, для каждого пикселя, и разделите ее на количество изображений.
- Из обработанного изображения (Im) определите модуль численного градиента и
нормализуете его по максимальномузначению (максимум),как определено ниже.
- Binarize матрицы B через интенсивность пороговых значений, см шаги 6,7-6,8.
- Для каждой точки времени, запись координат бактерий (x, y в пикселе или мм) и время получения изображения в файл с тремя столбцами.
- Наконец, примените скрипт отслеживания частиц для обработки записанных данных и расчета траекторий бактерий. Например, используйте установленныйпротокол 19и свободно доступный код отслеживания частиц Matlab: (http://site.physics.georgetown.edu/matlab/).
нормализуете его по максимальномузначению (максимум),как определено ниже.
8. Изучение бактериальной фильтрации с помощью профилей осаждения
- Для получения профилей осаждения GFP-тегами P. putida KT2440 клетки с помощью флуоресценции микроскопии, записывать композитное изображение всего пористого канала раньше, то есть фон, и после инъекции бактериальной суспензии через микрофлюидное устройство. Используйте время экспозиции, позволяющее получать бактериальный флуоресцентный сигнал (например, 100 мс), без отбеливания сигнала.
- Экспорт изображений и импорт в желаемой программной платформе (см. 6.1-6.2).
- Удалите фон из изображений, записанных после бактериальной инъекции.
- Интегрируйте общий флуоресцентный сигнал сохраненных бактерий в поперечные участки пористого канала.
- Для того, чтобы вычислить профиль осаждения, участок интегрированный сигнал флорескции по сравнению с пористой длины канала.
9. Анализ бактериального транспорта с использованием жидкостных устройств PMMA и цитометрии потока
- Подключите перистальтический насос с водой с помощью трубки диаметром 50 см (1 мм внутреннего диаметра) и оттока с помощью автоматизированного дозатора с использованием той же трубки (50 см, см. раздел 4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте насос, чтобы обойтись культивирования средств массовой информации, и вводить бактериальные клетки. Используйте разъемы Luer-lock и трехмерные клапаны для перехода между средней и бактериальной подвеской во время постоянного выпуска. - Насос культивирования среды в жидком устройстве. Обратите внимание на прибытие среды в розетке трубки крепится к роботизированной дозатор.
- Начните вводить бактериальную суспензию через жидкое устройство PMMA со скоростью потока 0,2 мл мин-1,
- Когда бактерии достигают жидкого устройства вход включите автоматизированный дозатор.
- Для того, чтобы сделать инъекцию импульса, введать бактериальную суспензию для некоторых объемов пор (например, 30), а затем переключить инъекцию на культивирование средств массовой информации до окончания эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: объем поры жидкостного устройства составляет примерно 0,2 мл, таким образом, при просеяной скорости потока каждую минуту обменивается целый объем пор. - После того, как пластина 96 хорошо завершена, накройте пластину, чтобы уменьшить испарение и хранить его при 4 градусов по Цельсию.
- Анализ бактериального изобилия с помощью цитометрии потока, следуя установленнымпротоколам 20.
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, добавьте 25 мкл зелено-флуоресцентного пятна нуклеиновой кислоты (Таблица материалов) на 0,025 мМ (в ультрапурной воде) к каждой колодец. Он окрашивает бактериальную ДНК, что позволяет количественно по течению цитометрии бактериального изобилия. Инкубировать образцы в течение 15 минут в темноте, а затем проанализировать с помощью цитометра потока оснащен 488 нм лазера и детекторов на 515 нм. - До анализа BTC, рассмотреть вопрос о разбавлении образца из-за добавления фиксатора и пятна. Правильное бактериальное изобилие в 1,35 раз с учетом фиксации и пятен.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы проиллюстрировать функциональность представленного рабочего процесса, мы провели эксперименты с использованием генетически модифицированных Pseudomonas putida KT2440, грамма отрицательной подвижной бактерии, важной для биовосстановления и биотехнологии. Генетически модифицированные версии этого штамма, которые выражают производство GFP, являются коммерчески доступными. Также имеется недвижимый штамм P. putida KT2440, в котором отсутствуют соответствующие структурные и регуляторные гены подвижности. Используя как более пестрые, так и недвижимые GFP с тегами P. putida KT2440, мы проводили последовательные эксперименты на микрофлюидных устройствах PDMS со случайныммассивом столбов (рисунок 1B) и записывали БТК(рисунок 2A). BTCs были нормализовались до концентрации инъекционных клеток (C0). Одновременно, бактериальные траектории в шкале пор были визуализированы с помощью обработки изображений и отслеживания частиц, как описано выше (Рисунок 2B).
Затем мы провели эксперименты с крупномасштабными жидкостными устройствами, измельченными из PMMA(рисунок 1A). Motile и не-motile P. putida KT2440 (не флуоресцентные) были введены в регулярно размежеваемой пористой матрицы и BTCs были получены с помощью жидкого дозатора и потока цитометрии подсчета, как описано выше (Рисунок 3A). Поразительно, но в пористой среде, лишенной биопленки, пестрый и не подвижной P. putida KT2440 показал заметно иное транспортное поведение. В пористой матрице колонизированной для 48h со сложным сообществом биопленки потока, эти различия в BTC между подвижным и не-пестрый P. putida KT2440 исчез(рисунок 3B.)
Рисунок 1: Жидкостные устройства для изучения микробного транспорта в пористых средствах массовой информации (A) Иллюстрация жидкого устройства, измельченного из PMMA. Пористая матрица измельчается в базовый слой устройства, крышка закрывается винтами. Поперечное сечение показывает расположение столбов внутри жидкого устройства. Вставка показывает пористую матрицу с обычной размытой сеткой столбов и соответствующим полем потока скорости. (B)Устройство PDMS устанавливается на микроскопию стеклянной горки. Показаны в- и отток, подключенный к среднему резервуару и шприц насос, соответственно. Камера наблюдения для микроскопического подсчета помещается в отдельную камеру без пористой матрицы на тот же слайд микроскопа. На вставке показана пористая матрица со случайным массивом столбов (в диаметре и интервале). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Бактериальный транспорт по шкале канала и поры в жидком устройстве PDMS (A) BTCs из подвижного и недвижимого P. putida KT2440 (GFP помечены) получены с микрофлюидным устройством PDMS и микроскопическим подсчетом. (B)Траектории недвижимых клеток в порной шкале. Цвета выбраны для повышения дифференциации траекторий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Бактериальный транспорт по шкале канала и поры в жидком устройстве PMMA (A)BTCs из подвижного и не подвижного P. putida KT2440 (не помечены) получены с помощью ПММА жидкого устройства и потока цитометрии подсчета. b) жидкое устройство было колонизирован естественным потоком в течение 2 дней. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная цифра 1: Технические чертежи жидкостного устройства PMMA. Устройство состоит из базового блока, содержащего пористую матрицу и крышку блока с отверстиями для входов и розетки. Устройство опечатывается с помощью 12 винтов и O-кольца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы предлагаем два средства для изучения транспортировки микробов через пористые системы на одноклеточном и популяционные уровни. Хотя изучение транспортных явлений с использованием моделирования БТД дало ценную информацию о распространении патогенных микроорганизмов или загрязняющих веществ в экосистемных масштабах, трудности, связанные с масштабированием от лабораторных экспериментов до полевых условий, все еще существуют. Описанные здесь инструменты позволяют исследователям экспериментально разрешать пространственные и временные масштабы, чтобы лучше понять экологические стратегии микробов, имеющих отношение к транспорту в пористых средах. Экспериментаторы могут использовать или изменять эти системы для изучения других микробных признаков, чем подвижность, таких как хемотаксис или зондирование кворума или изменение геометрии или других характеристик среды обитания пористой матрицы. Кроме того, с помощью этих систем поведение бактериального транспорта может быть легко соединено с профилями осаждения, которые обеспечивают важное понимание моделей колонизации и имеют решающее значение для понимания того, как биопленки изменяют локальные поля потока. Мы ожидаем, что лучшее понимание микробных стратегий для рассеивания и колонизации пористых средств массовой информации улучшит прогнозы моделей и тем самым будет способствовать управлению распространением патогенов или сдерживанием загрязняющих веществ. Дальнейшие изменения системы могут также способствовать разработке новых фильтрационных устройств или биотехнологических инструментов, в которых клетки должны быть физически разделены.
Мы рекомендуем устройства на основе PMMA для больших и долгосрочных экспериментов и устройства на основе PDMS для небольших, краткосрочных экспериментов или когда высокое временное разрешение имеет решающее значение. Следует иметь в виду, что эти два материала имеют разные свойства. Например PDMS проницаем к газу как кислород, пока PMMA газ плотно. Эта разница может быть использована для изучения потребления газа в сценарии PMMA, в то время как PDMS может быть более подходящим для эксперимента, где ограничения кислорода, связанные с бактериальным дыханием, нежелательны.
В целом описанные здесь протоколы легко воспроизводятся, и данные, полученные с помощью этих инструментов, постоянно выявить различия в транспортировке разношерстных и недвижимых бактерий. Самодельный жидкий дозатор может быть заменен коммерчески доступной альтернативой. Тем не менее, по соображениям универсальности и рентабельности мы рекомендуем тот, описанный здесь. Критические шаги в протоколе в основном касаются обработки жидкостных устройств и опыта обработки изображений. Качество данных, полученных в результате анализа изображений, критически зависит от качества изображения (главным образом определяемого временем фокусировки и экспозиции) и соответствующей стратегии порогового значения. Качество данных, полученных путем цитометрического подсчета потока, критически зависит от эффективного фиксации и окрашивания клеток и опыта в интерпретации результатов цитометрии потока.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что конфликта интересов нет.
Acknowledgments
Мы признаем помощь Антуана Видмера с установкой роботизированного дозатора и dispenser.py скрипта.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA | Sigma | ||
| Elastomer Sylgard 184 | Dowsil | 101697 | |
| Flow cytometer NovoCyte | Acea | ||
| Glucose | Sigma | https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit | |
| LB broth | BD | ||
| Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit | makeblock | ||
| Microscope Axio Imager | Zeiss | ||
| Microscope AxioZoom v16 | Zeiss | ||
| Microscope slides, 75 mm × 25 mm | Corning | ||
| Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | ||
| Plasma bonder Corona SB | BlackHole Lab | ||
| Potassium phosphate | Sigma | ||
| Syringe pump New Era NE 4000 | New Era | ||
| Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | Molecular Probes, Invitrogen | ||
| Tygon tubing | Ismatec | ||
| WF31SA universal milling machine | Mikron |
References
- Stevik, K., Aa, K., Ausland, G., Fredrik Hanssen, J. Retention and removal of pathogenic bacteria in wastewater percolating through porous media: a review. Water Research. 38 (6), 1355-1367 (2004).
- Ribet, D., Cossart, P. How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues. Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).
- Ginn, T. R., Wood, B. D., Nelson, K. E., Scheibe, T. D., Murphy, E. M., Clement, T. P. Processes in microbial transport in the natural subsurface. Advances in Water Resources. 25 (8), 1017-1042 (2002).
- Tufenkji, N. Modeling microbial transport in porous media: Traditional approaches and recent developments. Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1455-1469 (2007).
- Foppen, J. W., Van, M. H., Schijven, J. Measuring and modelling straining of Escherichia coli in saturated porous media. Journal of contaminant hydrology. 93 (1-4), 236-254 (2007).
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 251-263 (2016).
- Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., Anna, P., de Battin, T. J. Unraveling the biophysical underpinnings to the success of multispecies biofilms in porous environments. The ISME Journal. 1, (2019).
- Carrel, M., et al. Biofilms in 3D porous media: Delineating the influence of the pore network geometry, flow and mass transfer on biofilm development. Water Research. 134, 280-291 (2018).
- Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Bacterial hopping and trapping in porous media. Nature Communications. 10 (1), 2075 (2019).
- Scheidweiler, D., Miele, F., Peter, H., Battin, T. J., de Anna, P. Trait-specific dispersal of bacteria in heterogeneous porous environments: from pore to porous medium scale. Journal of The Royal Society Interface. 17 (164), 20200046 (2020).
- Morales, V. L., Parlange, J. Y., Steenhuis, T. S. Are preferential flow paths perpetuated by microbial activity in the soil matrix? A review. Journal of Hydrology. 393 (1), 29-36 (2010).
- Creppy, A., Clément, E., Douarche, C., D'Angelo, M. V., Auradou, H. Effect of motility on the transport of bacteria populations through a porous medium. Physical Review Fluids. 4 (1), 013102 (2019).
- Camesano, T. A., Logan, B. E. Influence of Fluid Velocity and Cell Concentration on the Transport of Motile and Nonmotile Bacteria in Porous Media. Environmental Science & Technology. 32 (11), 1699-1708 (1998).
- Lutterodt, G., Basnet, M., Foppen, J. W. A., Uhlenbrook, S. The effect of surface characteristics on the transport of multiple Escherichia coli isolates in large scale columns of quartz sand. Water Research. 43 (3), 595-604 (2009).
- Bozorg, A., Gates, I. D., Sen, A. Impact of biofilm on bacterial transport and deposition in porous media. Journal of Contaminant Hydrology. 183 (Supplement C), 109-120 (2015).
- Long, T., Ford, R. M. Enhanced Transverse Migration of Bacteria by Chemotaxis in a Porous T-Sensor. Environmental Science & Technology. 43 (5), 1546-1552 (2009).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics Expanding the Frontiers of Microbial Ecology. Annual Review of Biophysics. 43 (1), 65-91 (2014).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).
- Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).
- del Giorgio, P. A., Bird, D. F., Prairie, Y. T., Planas, D. Flow cytometric determination of bacterial abundance in lake plankton with the green nucleic acid stain SYTO 13. Limnology and Oceanography. 41 (4), 783-789 (1996).
