Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

تحليل سلسلة يوبيكيتين من خلال رصد التفاعل الموازي

Published: June 17, 2020 doi: 10.3791/60702
Automatic Translation
1, 1, 1
1Quantitative Biology Unit, Luxembourg Institute of Health

Summary

تصف هذه الطريقة تقييم التغيرات العالمية في طوبولوجيا سلسلة ubiquitin. ويتم التقييم بتطبيق نهج البروتيوميات المستهدفة القائمة على قياس الطيف الكتلي.

Abstract

تقييم الصورة العالمية للنوبولوجيا سلسلة في كل مكان داخل البروتيوم هو من المهم الإجابة على مجموعة واسعة من الأسئلة البيولوجية. البروتوكول المبين هنا يستفيد من تعديل دي غليسين (-GG) المتبقي بعد الهضم المحاولة من يوبيكيتين أدرجت في سلسلة. من خلال تحديد كميا هذه الببتيدات ذات الخصائص الطوبولوجية يمكن تحديد الوفرة النسبية لكل طوبولوجيا سلسلة في كل مكان. وتفيد التقارير بأن الخطوات اللازمة لقياس هذه الببتيدات من خلال تجربة موازية لرصد التفاعل تأخذ في الاعتبار استقرار سلاسل كل مكان. يتم وصف إعداد الضوابط الثقيلة ، وتحلل الخلية ، والهضم جنبا إلى جنب مع إعداد مطياف الكتلة المناسبة وسير عمل تحليل البيانات. يتم تقديم مثال على مجموعة البيانات مع الاضطرابات في طوبولوجيا كل مكان ، مصحوبة بأمثلة عن كيفية تحسين البروتوكول يمكن أن تؤثر على النتائج. باتباع الخطوات المبينة ، سيتمكن المستخدم من إجراء تقييم عالمي لمناظر طوبولوجيا كل مكان في سياقه البيولوجي.

Introduction

التنظيم الوثيق لوظيفة البروتين والاستقرار له أهمية قصوى ، لأنها محركات رئيسية للسيطرة على علم الأحياء. يتم بناء وظيفة البروتين من عنصرين: تسلسله البوليبتيد الجوهري وأي تعديلات ما بعد النقل (PTMs). وقد تم تحديد مختلف PTMs الكيميائية بما في ذلك الجليكوزيليشن، الفوسفور، أسيتيل، والمثيلة1. في عام 1975، حدد غولدشتاين وآخرون2 بروتين صغير وأطلق عليه اسم يوبيكيتين بسبب طبيعته في كل مكان. تم العثور على يوبيكيتين أن تكون مهمة في تدهور البروتين3. ومع ذلك ، منذ ذلك الحين ثبت أن وظيفة كل مكان كجزيء إشارات تمتد إلى ما هو أبعد من تنظيم استقرار البروتين. وتشارك إشارة يوبيكيتين في مجموعة واسعة من الوظائف البيولوجية الأخرى, مثل استقرار البروتين, autophagy, خلية التحكم في دورة, والاتجار البروتين4.

في حين أن PTMs الأخرى ثنائية بشكل عام (أي يتم تعديل البروتين أو تركه غير معدل) لموقع معين ، يمكن أن يعدل ubiquitin بروتينا سواء كمونومر أو كسلسلة بوليمرية ، مع وجود كل مكان مرفق في حد ذاته في كل مكان. علاوة على ذلك ، يمكن أن تتطور سلسلة تعدد الأضلاع هذه في العديد من طبولوجيا مع انتشار كل مكان في كل مكان سابق يرتبط بأحد مواقع الربط الثمانية5،6. يتم نقل يوبيكيتين بواسطة عملية انزيمية متعددة الخطوات (الشكل 1) حيث يرتبط C-terminus من كل مكان إلى واحدة من بقايا اليسين السبعة (K06، K11، K27، K29، K33، K48، أو K63) أو N-محطة من ubiquitin السابقة (يشار إليها باسم M1 أو كل مكان خطي)5،6. هذه الطوبولوجيا السلسلة هو المفتاح لمصير البروتين قيد التعديل. على سبيل المثال ، فإن التعديل مع سلسلة K48 أو K11 المرتبطة يؤدي إلى تدهور البروتين المعدل في proteasome ، في حين أن سلسلة خطية ضرورية لتنشيط إشارات NF-kB. وبالتالي، فإن التوزيع النسبي لهذه السلاسل من طبولوجيا ذات صلة بمجموعة واسعة من المسائل البيولوجية.

استخدام قياس الطيف الكتلي (MS) هو ذات فائدة خاصة لتحليل طوبولوجيا سلسلة ubiquitin كما أنها لا تعتمد على التفاعلات القائمة على الأجسام المضادة أو تقارب القائم7،8، وكثير منها محدودة خصوصية ولا تفرق بين أنواع السلسلة المختلفة. وهناك احتمال مختلف للكشف هو استخدام المسوخ المعدلة وراثيا في كل مكان. هنا, يتم استبدال ليسين محددة للأرجينيين, التي لا يمكن أن تدعم التعديل عن طريق كل مكان. ثم يتم تفسير عدم وجود تشكيل سلسلة في كل مكان على بروتين الركيزة كدليل على طوبولوجيا محددة9.

ويستند تحديد MS القائم على البروتينات في كل مكان على حقيقة أن C-terminus من كل مكان يحتوي على بقايا أرجينين في الموقف 74 التي يتم التعرف عليها من قبل تريبسين أثناء إعداد بروتيوليك من العينات لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد, فصل الجليسين المزدوج C-المحطة الطرفية. هذا غليغلي (-GG) لا تزال تعلق على مجموعة الأمينية ε من بقايا اليسين من بروتين الركيزة. لتحليل طوبولوجيا في كل مكان، يحدث التعديل على واحدة من بقايا اليوزين السبعة في كل مكان. وهذا يخلق مجموعة من سبعة الببتيدات الرئيسية التي تحمل بقايا ليسين التي يتم تعديلها من قبل GG، محددة لكل من طبولوجيا(الشكل 2). على سبيل المثال، مع طوبولوجيا K06، سيتم حماية ال ليسين في الموقف 6 على تسلسل الأحماض الأمينية من الهضم المحاولة مع تعديل -GG من 114 دا إضافة إلى هذا اليوزين.

ويشار إلى تحديد الببتيدات محددة سلفا من قبل MS كما proteomics المستهدفة، أو على وجه التحديد، اقتناء الببتيدالمستهدفة 10. وقد تم تطوير طريقتين اعتمادا على أداء مطياف الكتلة المستخدمة. هذه هي رصد رد الفعل المختار (SRM) ، وتسمى أيضا رصد ردود الفعل المتعددة (MRM) ، ورصد التفاعل الموازي (PRM). SRM ينطوي على اختيار التحولات التي تتكون من السلائف م / ض والمنتج أيون م / ض. وعلى العكس من ذلك، لا يتطلب إجراء إعادة المتر سوى السلائف m/z. بعد التحديد، يتم إجراء مسح كامل لعملية مسح أيونات المنتج. هذا له ميزة أنه لا يوجد اختيار أيونات المنتج المناسب للكمية على مطياف الكتلة محددة ضروري قبل القياس11. ويمكن جدولة كل من إدارة الموارد البشرية واستراتيجية الحد من الفقر، اعتمادا على الصك. الجدولة هي ممارسة تعيين نافذة زمنية يتم خلالها تضمين أيون معين للتحليل ، حيث أن الببتيدات يتم تهييثها في أوقات احتجاز محددة من النظام الكروماتوغرافي. ويؤدي تخفيض عدد الأيونات التي يجري استجوابها في أي وقت من الأوقات إلى زيادة وتيرة استجواب تلك الأيونات المقرر إجراؤها في ذلك الوقت، مما يحسن دقة البيانات.

بشكل عام ، فإن تطبيق البروتيوميات المستهدفة لطبولوجيا كل مكان هو نفس أي تجربة بروتيوميات مستهدفة أخرى. ومع ذلك، هناك اختلافان رئيسيان مهمان: أولا، يجب النظر في استقرار سلاسل البيكيتين. هناك العديد من الإنزيمات القوية التي تتحلل بسرعة عند تحلل الخلايا. وproteases في كل مكان محددة تندرج في فئتين، وthioesterases و metalloproteases. معظم الهيدرولاسيس في كل مكان هي ثيويستراس وتحمل بقايا السيستين في مركزها النشط. عن طريق الألكيلات هذه بقايا السيستين، يمكن تعطيلها. على هذا النحو ، فإن استخدام مخازن تثبيت في كل مكان تحتوي على عوامل الألكيلات ، مثل N-ethylmaleimide (NEM) ، والمواد الكيميائية عالية الإزالة ، والحفاظ على العينات المبردة أمر حيوي لتحليل ناجح. ثانيا، على عكس التجارب المستهدفة الأخرى، يتم إصلاح خيار الببتيد. في تجربة نموذجية مستهدفة ، يمكن اختيار الببتيد البروتيوتيبيك لأداء كروماتوغرافي وتأين جيد. بالنسبة لبعض الببتيدات المميزة للطبولوجيا مثل K48 ، فإن هذه الخصائص جيدة ، بينما بالنسبة للآخرين ، فهي أقل جاذبية. على سبيل المثال ، K33 الكروماتوغرافيا في الإعداد نموذجية عكس المرحلة سيئة بسبب تشكيل ملف elution امتدت ، وضعف خصائص التأين من الببتيد K27 تقليل وضوحه من قبل MS12.

في هذا البروتوكول، ونحن نصف كيفية إجراء تقييم طوبولوجيا في كل مكان من عينة بيولوجية من قبل PRM. يتم تقديم بيانات مثال على الإجراء باستخدام اضطراب البروتيازوم باستخدام علاج مثبط MG-132 في عدة أنواع مختلفة من الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد معيار الببتيد الثقيلة

  1. اعتمادا على المورد وجودة الببتيدات الثقيلة التي تم شراؤها ، فإن الببتيدات الثقيلة تحتاج إلى تخفيفها. استخدم هذا البروتوكول تسلسل الببتيد المبلغ عنها في الجدول 1، مع الأحماض الأمينية C-terminal المعدلة إلى ليسين(13C615N2-lysine) أو أرجينين (13C615N4- أرجينين).
    1. خلط الببتيدات الثقيلة، وتمييع المزيج مع 50٪ أسيتونيتريل (ACN) لإنشاء مزيج الببتيد مع كل الببتيد في 10 ميكرومتر.
    2. إنشاء aliquots من مزيج الببتيد وتخزينها في -80 درجة مئوية.

2. إعداد العينة

  1. تحلل العينة
    ملاحظة: يجب مراعاة استقرار سلاسل ubiquitin أثناء إعداد العينة. الحفاظ على العينات البيولوجية والمخازن المؤقتة المبردة في 4 درجة مئوية وإضافة عينات إلى التخزين المؤقت استقرار ubiquitin في أسرع وقت ممكن.
    1. إعداد حل من 1 M NH4HCO3 (بيكربونات الأمونيوم) في الماء وضبط درجة الحموضة إلى 8 باستخدام 1 M NaOH.
    2. إعداد حل من 200 mM N-ethylmaleimide (NEM) في الماء.
    3. إعداد ubiquitin استقرار العازلة باستخدام 8 M اليوريا في 50 mM NH4HCO3/10 mM NEM. يجب أن تكون مستعدة يوبيكيتين استقرار العازلة طازجة في كل مرة.
      ملاحظة: سوف يتطلب محلول 5 مل من 8 M يوريا أقل بكثير من 5 مل من الماء نظرا لتوسيع المياه عندما تكون في محلول مشبع مع اليوريا.
      تنبيه: لا تعد العازل فوق 50 درجة مئوية بسبب ميل اليوريا إلى تشكيل البولي يوريا في درجات حرارة عالية.
    4. Resuspend العينة البيولوجية التي سيتم التحقيق فيها في العازلة استقرار في كل مكان تهدف إلى 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر من البروتين وlyse الخلايا مع طريقة مناسبة للعينة. طريقة سونيكيشن تتكون من ثلاث نبضات 10 ق مع سونيفير برانسون SFX 150 تعيين في كثافة 70٪ مع فواصل 10 ق على الجليد بين كل نبضة، واستخدمت لخطوط الخلية في هذا البروتوكول.
    5. عينة الطرد المركزي في 18,000 x g لمدة 10 دقائق عند 4 °C في جهاز طرد مركزي على سطح الطاولة.
    6. نقل supernatant إلى أنبوب الطارد الدقيق ملزمة منخفضة البروتين الطازجة. يمكن تخزين العينات عند -20 درجة مئوية عند هذه النقطة إذا لزم الأمر.
  2. إعداد العينة والضوابط
    1. إذا تم تجميد العينات، اخلط (على سبيل المثال، مع ثيرموميكسر) أثناء إذابتها لإذابة اليوريا بسرعة.
      تنبيه: لا تستخدم درجات حرارة أعلى من 50 درجة مئوية بسبب ميل اليوريا لتشكيل البولي يوريا في درجات حرارة عالية.
    2. عينة الطرد المركزي في 18,000 x g لمدة 10 دقائق عند 4 °C في جهاز طرد مركزي على سطح الطاولة.
    3. نقل 20 ميكروغرام من العينة إلى أنبوب طرد دقيق منخفض الربط جديد وضبط مستوى الصوت إلى 50 ميكرولتر مع حاجز تثبيت كل مكان.
    4. إنشاء عنصر تحكم سالب باستخدام وحدة تخزين طبيعية من المخزن المؤقت لتثبيت ubiquitin (50 ميكرولتر). في هذه العينة ، لا ينبغي أن تكون هناك نسخة خفيفة من كل ببتيد ، مما يسمح بمراقبة أي تلوث خفيف ينشأ عن الببتيدات الثقيلة. واستخدمت هذه السيطرة السلبية أيضا لجدولة وقت الاحتفاظ ب PRM الموضحة في القسم 3-1.
    5. كما تم إنشاء سيطرة إيجابية مع التخزين المؤقت لتثبيت ubiquitin وإضافة أنواع السلسلة المتاحة تجاريا إلى الحجم الطبيعي لحاجز تثبيت ubiquitin (50 ميكرولتر). عادة، K63، K48، و M1 متوفرة. في النتائج التمثيلية 20 نانوغرام من K48، K63، و M1 استخدمت.
  3. الحد، الألكيل، والهضم
    1. إعداد حل من بيكربونات الأمونيوم 50 mm (NH4HCO3) في الماء وضبط العينة إلى درجة الحموضة = 8 مع 1 M NaOH.
    2. تم طرد ثقافة الإشريكية القولونية التي تزرع في مرق LB 5000 × ز لمدة 5 دقائق لتشكيل بيليه ، والتي تم غسلها بعد ذلك 2x مع PBS قبل إعادة الإنفاق في حاجز تثبيت في كل مكان عند 5 ميكروغرام / ميكرولتر.
    3. أضف 1 ميكروغرام من lysate الإشريكية القولونية إلى كل عينة والتحكم. يستخدم هذا البروتوكول الإشريكية القولونية (DH10B)، ولكن يمكن استخدام أي lysate معقدة دون كل مكان. لاحظ أن كل مكان مشترك بين جميع eukaryotes.
      ملاحظة: استخدام مصفوفة lysate القولونية يقلل من فقدان الببتيدات بسبب التصاق غير محدد إلى الأواني البلاستيكية. هذا ملحوظ بشكل خاص في السيطرة السلبية أو عينات مع محتوى البروتين محدودة ولها تأثير قوي على مراقبة K6312.
    4. إعداد حل من 500 مللي متر تريس (2-carboxyethyl)فوسفين (TCEP) في MS الصف المياه (DTT يمكن استخدامها كبديل).
    5. تقليل العينات والضوابط بإضافة TCEP إلى تركيز نهائي قدره 50 mM. دوامة لفترة وجيزة قبل احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT). إذا تم استخدام DTT، يجب رفع درجة الحرارة إلى 50 درجة مئوية.
      تنبيه: لا تستخدم درجات حرارة أعلى من 50 درجة مئوية بسبب ميل اليوريا لتشكيل البولي يوريا في درجات حرارة عالية.
    6. إعداد حل من 550 mM الكلورواسيتاميد (CAA) في NH4HCO3. تخزين في الظلام.
    7. Alkylate العينات والضوابط بإضافة CAA إلى تركيز النهائي من 55 mM. دوامة لفترة وجيزة قبل احتضان لمدة 20 دقيقة في RT في الظلام.
      ملاحظة: يستخدم CAA بدلا من iodoacetamide كعامل تخفيض لتقليل فرصة تعديل كارباميدوميثيل مزدوج (114.0429) على بقايا ليسين يجري مخطئا لتعديل -GG (114.0429)13.
    8. إضافة endopeptidase LysC إلى العينات في 1:25 (ث / ث) نسبة إلى محتوى البروتين. حضانة لمدة 3 ساعة في 37 درجة مئوية.
    9. تمييع العينات والضوابط مع 200 ميكرولتر من 50 م م NH4HCO3 درجة الحموضة = 8 (1:5 v/v).
    10. إضافة تريبسين إلى العينات في 1:25 ث / ث نسبة إلى محتوى البروتين. حضانة لمدة 12 ساعة في 37 درجة مئوية.
    11. إضافة 10٪ محلول حمض الفورميك (FA) في مياه درجة MS بنسبة 1:10 v/v إلى كل عينة وعينة تحكم. تحقق من أن درجة الحموضة هي < 3) قبل تنظيف C18 وإضافة المزيد من حمض الفورميك إذا لزم الأمر.
    12. لكل عينة والتحكم إضافة 0.5 ميكرولتر من معيار الببتيد الثقيلة التي تم إنشاؤها في القسم 1.
  4. تنظيف الببتيد
    1. تقدم العديد من الشركات المصنعة نصائح تنظيف C18 أو لوحات. اتبع تعليمات الشركة المصنعة للمنتج المستخدم، والببتيدات المجففة في جهاز طرد مركزي فراغ، وعلى استعداد لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد.

3. تحليل LC-MS/MS

  1. تنفيذ تحليل PRM الأولي على معيار الببتيد الثقيل بطريقة غير مقررة.
    1. Resuspend العينات المجففة في 10 ميكرولتر من MS تحميل العازلة 2٪ ACN/0.05٪ حمض ثلاثي فلوريستيك (TFA).
    2. تجهيز HPLC مع عكس المرحلة C18 عمود تحليلي (75 ميكرومتر × 15 سم، 2 ميكرومتر 100 Å C18 حبات) مصممة لnanoflow MS. شكل التدرجات الخطية تبادل المياه درجة MS تكملها مع 0.1٪ FA مع ACN تحتوي على 0.1٪ FA. تم استخدام عمود فخ التضحية (75 ميكرومتر × 2 سم ، 3 ميكرومتر ، 100 حبة18 Å C) للحفاظ على حياة العمود التحليلي هنا ولكن ليس مطلوبا.
    3. يزوج إخراج العمود التحليلي بمصدر نانو-ESI على مطياف كتلة عالي الدقة.
    4. استخدام طريقة بروتيوميات مستهدفة مناسبة لمطياف الكتلة. على سبيل المثال، على Q-Exactive بالإضافة إلى أسلوب التجربة اثنين، دورة بين MS الكامل وتجربة PRM. بالنسبة لتجربة التصلب المتعدد الكامل، تم استخدام حل قدره 120,000 مع هدف AGC من 1e6 و 240 مللي ثانية كحد أقصى. وبالنسبة لتجربة إدارة الحد من الفقر، استخدم نفس الهدف من نظام تحديد القيمة المضافة والحد الأقصى من تكنولوجيا المعلومات بدقة أقل قدرها 000 60 ونافذة عزل تبلغ 1.2 م/ض.
    5. حقن 200 نانوغرام من عنصر التحكم السلبي على العمود التحليلي باستخدام الطوابع التلقائية HPLC. تطبيق تدرج خطي على العينة على العمود التحليلي زيادة تركيز ACN من 2-25٪ على مدى فترة ~ 45 دقيقة.
      ملاحظة: تركيز ACN 25٪ أقل من المعتاد لبروتيوميات بسبب الطبيعة الهيدروفيلية المنخفضة للببتيدات النموذجية ذات الخصائص الطوبولوجية في كل مكان. وإذا كان للببتيدات الأخرى أن تحدد كميا، فقد يكون من المرغوب فيه تركيز أعلى لل ACN لتحقيق فصل جيد للهدف.
    6. تحليل نتائج تشغيل الجدولة كما هو موضح في المقطع 4.2 لإنشاء قائمة تضمين مجدولة.
  2. تحليل العينات
    1. تشغيل العينات المتبقية كما هو موضح للجدولة في 3.1 بصرف النظر عن استخدام قائمة التضمين المجدولة التي تم إنشاؤها في القسم 4.2.
      ملاحظة: يجب تشغيل فارغة بعد عنصر التحكم الإيجابي للتأكد من أنه يتم الكشف عن أي ترحيل من التشغيل السابق في عينات لاحقة.

4. تحليل البرمجيات

  1. إنشاء قائمة تضمين التنسيق المناسب ل MS المستخدمة. استخدم هذا البروتوكول برنامج المصدر المفتوح Skyline (الإصدار 19.1.0.193) (https://skyline.ms)، والذي يقدم دعما ومساعدة موثقين جيدا. ويمكن إنشاء قائمة إدراج لعدة مطيافات كتلة باستخدام مرفق قائمة عزل الصادرات.
    1. افتح مستند Skyline جديد.
    2. حدد تعديلات النظائر الثقيلة حسب الاقتضاء للببتيدات الثقيلة المميزة للطبولوجيا. في الإعدادات| إعدادات الببتيد تحت علامة التبويب تعديل، انقر على حقل الاسم لرؤية التعديل المحتمل. ويستند الاختيار على الحالة النظيرية للببتيدات الثقيلة التي تم شراؤها. في هذا المثال، استخدمت الببتيدات الاصطناعية التي تحمل إما ليسين الثقيلة(13C615N2-lysine) أو أرجينين الثقيلة(13C615N4-arginine) في C-terminus. التسميات المناسبة ستكون: "Label:13C(6)15N(2) (C-term K)" و "Label:13C(6)15N(4) (C-term R)".
    3. حدد الإعدادات| الانتقال. ضمن علامة التبويب تصفية تشمل رسوم السلائف 2، 3، 4.
    4. إدراج الببتيدات عن طريق تحديد تحرير| إدراج| الببتيدات.
    5. قم بتعبئة الحقول ذات الصلة بما في ذلك تسلسل الببتيد المميز للطبولوجيا واسم البروتين (على سبيل المثال، "Chain-K63").
    6. توسيع كل الببتيد هو مبين الآن في لوحة الأهداف. حذف حالات الرسوم غير المرغوب فيها. حالة الشحنة المفضلة وطاقة التصادم ، والتي قد تختلف استنادا إلى مطياف الكتلة المستخدم ، لكل ببتيد مميز طوبولوجيا موضح في الجدول 1.
    7. لكل ببتيد طوبولوجيا مميزة (باستثناء M1 حيث يتم تضمين GG في التسلسل) انقر بزر الماوس الأيمن على التسلسل وحدد تعديل. إضافة GG كتعديلات هيكلية بالنقر فوق حقل الاسم وتحديد <إظهار كافة... > قبل اختيار "غليغلي (K)".
    8. تصدير ملف قائمة العزل| تصدير| قائمة العزل، حدد نوع الأداة وتعيين نوع الأسلوب إلى قياسي. سيؤدي تحديد موافق إلى فتح مطالبة لحفظ ملف .csv * يمكن استخدامه لإنشاء أسلوب PRM.
  2. إنشاء قائمة إدراج مجدولة استنادا إلى تشغيل جدولة الببتيد الثقيلة وأوضح هنا باستخدام برنامج أفق المصدر المفتوح.
    1. إنشاء قائمة أهداف كما هو موضح في المقطع 4.1.
    2. استيراد الجدولة تشغيل في 3.1 عن طريق تحديد ملف| استيراد| النتائج.
    3. راجع الهويات. يمكن ملاحظة الإشارة الثقيلة لكل ببتيد من خلال النقر على الكتلة لكل إدخال الببتيد الثقيل. غالبا ما يتم تحديد التعرف الصحيح على الذروة تلقائيا ، ولكن قد يتطلب البرنامج المعالجة اليدوية عن طريق تحديد الذروة باستخدام النقر والسحب تحت المحور س.
    4. يتم أيضا تطبيق أوقات الاستبقاء المحددة للمتغيرات الثقيلة على الإصدارات الخفيفة ، وبالتالي إنشاء جدول زمني ل PRM. يمكن تعديل إطار الجدولة ضمن الإعدادات| إعدادات الببتيد باستخدام علامة التبويب التنبؤ، عن طريق تغيير الإطار الزمني.
    5. يمكن الآن تصدير قائمة إدراج مجدولة باستخدام File| تصدير| قائمة العزل وتحديد نوع الأداة المناسبة ونوع أسلوب الإعداد إلى جدولة.
  3. تحليل البيانات.
    1. استيراد العينات بنفس الطريقة لتحليل تشغيل الجدولة في القسم 4.2.
    2. بعد الاستيراد الكامل لجميع العينات ، يوصى بعلاج التحولات. هذه هي العملية التي تتم من خلالها إزالة التحولات مع التداخل أو نسب الإشارة إلى الضوضاء الضعيفة. يظهر مثال على اللوني قبل وبعد المعالجة في الشكل 4.
    3. يمكن الآن تصدير البيانات إما عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على الرسوم البيانية ذات الصلة وتحديد نسخ البيانات أو عن طريق تحديد File| تصدير| النتائج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لإثبات استخدام تحليل سلسلة في كل مكان من قبل PRM ، تم اختيار ثلاثة خطوط الخلية: خط الخلية الميلانوما الماوس B16 ، وخطي الخلايا البشرية المشتركة A549 (الخلايا الظهارية السنية الغدية) وهيلا (خلايا سرطان عنق الرحم). نمت هذه الثقافات إلى مرحلة متوسطة في الوسائط المناسبة قبل أن يتم علاجها مع 0 أو 10 أو 100 mM MG-132 لمدة 4 ساعات قبل الحصاد. MG-132 هو مثبط بروتيسوم يمنع تدهور البروتينات المترافقة في كل مكان من قبل proteasome14. وبالنظر إلى ذلك ، فهو شرط اختبار مناسب لإثبات تحليل سلسلة ubiquitin. ويمكن رؤية الزيادة الناتجة في سلسلة K48 في الشكل 3. تسبب العلاج مثبط بروتيسوم زيادة في سلاسل K4815.

كما هو موضح في المقدمة ، على عكس SRM أو MRM ، تقوم PRM بمسح أيون المنتج بالكامل بعد اختيار أيون السلائف. في حين أن هذا يعني أن أيونات المنتج لا تحتاج إلى تحديد قبل التشغيل ، إلا أنه يجب أن تكون لا تزال منسقة بعد التشغيل. المعالجة هي العملية التي يتم من خلالها اختيار التحولات التي تمثل حقا الببتيد المقصود. الشكل 4 يظهر اللوني أيون المنتج لK48 قبل وبعد العلاج. تمت إزالة أيونات المنتجات التي تحتوي على إشارة مع ملف تعريف elution غير متناسقة المحتمل بسبب التداخل. ثم أزيلت أيونات المنتجات منخفضة الكثافة بالنظر إلى أن نسبة الإشارة إلى الضوضاء أقل ملاءمة لمثل هذه التحولات. عادة ما تكون التحولات المثلى التي يتم اختيارها أثناء المعالجة متسقة بين التجارب ، وقد تختلف اعتمادا على مطياف الكتلة المستخدم ، والظروف اللونية ، وإعدادات التحليل ، والخلفية البيولوجية للعينة. وهكذا، لكل التحقيق المعالجة السليمة للتحولات مطلوب. كما يلزم تحقيق توازن بين إدراج المزيد من التحولات وبالتالي التكرار التقني والبيانات الأنظف للقياس الكمي.

تظهر كروماتوجرامات أيونات المنتج النموذجية لكل من طبولوجيا سلسلة ubiquitin المحددة في هذه التجربة في الشكل 5. يتم حذف K27 و K29 هنا لأنه في ظل هذه الظروف البيولوجية كانت الإشارة أقل من الكشف. وكان ملف elution K33 كما هو مبين هنا أوسع بكثير مما يمكن قبوله عادة لتحليل PRM. ومع ذلك ، فإن الاختيار البديل للببتيدات مع ملامح أفضل elution غير ممكن في تحليل سلسلة ubiquitin ويجب إجراء تفسير على أساس هذا الملف الشخصي. إذا كان K33 ذات أهمية خاصة، قد تحسن الظروف اللونية المتغيرة القياس الكمي لهذا النوع من السلسلة، ولكن من المرجح أن يضر بأنواع السلسلة الأخرى.

في تصميم تجربة PRM ، من الأفضل زيادة إشارة أيونات المنتج المستخدمة للقياس الكمي عن طريق زيادة الإشارة إلى الضوضاء. الأمثل للطاقة الاصطدام (أي الطاقة المستخدمة من قبل مطياف الكتلة لتجزئة أيونات الببتيد السلائف إلى أيونات المنتج) هي إحدى الوسائل التي يمكن من خلالها تحسينالإشارة 16. تم تطبيق نطاق طاقة الاصطدام من 14-28 إلى الحقن المتكررة لعينة واحدة مع مناطق الذروة الملحوظة الناتجة من K63 و M1 الموضحة في الشكل 6. كما يمكن أن نرى، لK63 طاقة اصطدام أعلى من 26 كان الأمثل، في حين أن ل M1 طاقة أقل من 18 كان مثاليا. تظهر طاقة التصادم لكل ببتيد مميز طوبولوجيا ومجموعة مختارة من شظايا كل مكان غير المعدلة في الجدول 1. وقد تحتاج طاقات التصادم هذه إلى تحسينها استنادا إلى مطياف الكتلة وطريقة التجزئة المستخدمة.

Figure 1
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لسلسلة التعاقب المترافقة بين كل مكان. يرتبط يوبيكيتين أولا إنزيم E1 بطريقة تعتمد على ATP. ثم يتم نقل كل مكان المنشط إلى إنزيم E2 الذي ينضم إليه بعد ذلك E3-ligase لنقل كل مكان إلى بروتين الركيزة. وتتكرر هذه العملية عدة مرات حتى تتشكل سلسلة في كل مكان على بروتين الركيزة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: رسم بياني يوضح اشتقاق الببتيد المميز لطبولوجيا كل مكان. بعد الهضم tryptic يتم اشتقاق موقع الربط المنبع مع -GG C-المحطة الطرفية من في كل مكان المصب المرفقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: مقارنة سلسلة K48 تحت العلاج MG-132 لخط الخلية الماوس B16 وخطي الخلية البشرية A459 و HeLa. في A459 أدت التركيزات المتزايدة من MG-132 إلى استقرار سلاسل K48. مع خلايا B16 وهيلا شوهدت زيادة تحت العلاج إما مع 10 mM أو 100 mM MG-132. ويمكن تفسير الانخفاض الملاحظ من 10 مللي متر إلى 100 مللي متر في اليوم بزيادة حساسية خلايا B16 و HeLa ل MG-132، مما يؤدي إلى موت الخلايا. تظهر أشرطة الخطأ الانحراف المعياري للتحولات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: كروماتوجرامات أيون المنتج للببتيد M1 طوبولوجيا مميزة قبل وبعد علاج التحولات للتدخل أو كثافة منخفضة. يظهر وقت الاحتفاظ على المحور س بالدقائق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: اللونيات الأيونية النموذجية للمنتجات لمختلف الببتيدات ذات الخصائص الطوبولوجية بالإضافة إلى ببتيدات كليتيين غير معدلة. يتم الإبلاغ عن وقت elution في دقائق والخطأ الجماعي الملاحظ لكل ببتيد فوق قمة الذروة ذات الصلة. خطوط منقط تظهر أيضا نافذة لتحديد منطقة الذروة. يظهر وقت الاحتفاظ على المحور س بالدقائق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: منطقة الذروة الملاحظة ل K63 و M1 على مدى سلسلة من طاقات الاصطدام العادية. تمثل الألوان المختلفة كثافة الأيونات التي يساهم بها كل انتقال. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

نوع السلسلة طوبولوجيا الببتيد المميز حالة الشحن طاقة الاصطدام الطبيعية
K06 MQIFVK [GG] TLTGK 3 18
K11 TLTGK [GG] العنوانفيبسدتيينفيك 3 18
K27 العنوانفيبسدتيينفيك [GG]AK 3 18
K29 AK [GG]IQDK 2 22
K33 IQDK [GG]EGIPPDQQR 3 18
K48 ليفاغك [GG] QLEDGR 3 24
K63 تلسدينيك [GG]ESTLHLVLR 4 26
M1 (خطي) جي جي إم كيويفك 2 18
غير معدلة أوكويتين ESTLHLVLR 2 26
غير معدلة أوكويتين العنوانفيبسدتيينفيك 2 18
غير معدلة أوكويتين TLSDYNIQK 2 18

الجدول 1: تسلسل للببتيدات البشرية ذات الطابع الطوبولوجي في كل مكان، وحالة الشحن الأكثر وضوحا، وطاقة الاصطدام الطبيعية المواتية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تحليل حالة كل مكان داخل البروتيوم هو ذات أهمية متزايدة لمجموعة واسعة من الأسئلة البيولوجية. يجب أن يركز وصف حالة الانتشار في كل مكان للعينة ليس فقط على ملف البروتينات التي يتم نشرها في كل مكان ولكن أيضا على طوبولوجيا مثل هذا الانتشار. تقييم هذه الطوبولوجيا من قبل MS المستهدفة، كما هو موضح هنا، له دور في مجموعة واسعة من التحقيقات البيولوجية.

وينبغي أن يفهم أن البروتوكول المبين هنا يوفر لمحة طوبولوجية عالمية. استخدام نهج البروتيوميات من أسفل إلى أعلى يسمح بتحديد الببتيدات التي كانت في كل مكان، بما في ذلك الببتيدات في كل مكان. مراقبة انتشار الببتيدات في كل مكان يسمح بتحديد طوبولوجيا السلسلة ، ولكن يتم فقدان الصلة بهدف ubiquitin. وبالتالي، لا يمكن تحديد طوبولوجيا السلسلة الخاصة على أي بروتين معين، ولكن يتم اشتقاق ملف طوبولوجيا عالمي. ويمكن أيضا الجمع بين هذه الطريقة واستراتيجية الإثراء لتوفير نتائج أكثر استهدافا. ويجب أن ينظر هذا الإثراء في استقرار السلسلة ووفرة السلاسل بعد التخصيب. يقتصر الكشف عن طوبولوجيا السلسلة على النقاء الذي توفره استراتيجية الإثراء ، حيث أنه من غير الممكن التمييز بين طوبولوجيا كل مكان مرتبطة ببروتين ملوث عن تلك المرتبطة بالبروتين المثير للاهتمام. الخطوة الحاسمة في هذا البروتوكول ، وتسهيل تحليل ناجح ، هو تحقيق التوازن بين الحفاظ على سلسلة في كل مكان في حين هضم البروتين في كل مكان. هذا أمر صعب بسبب ميل انهيار السلسلة إلى جانب مقاومة في كل مكان في حد ذاته للهضم الأنزيمي. علاوة على ذلك ، هناك حاجة إلى إضافة مصفوفة دعم والنظر الدقيق في ظروف التصلب المتعدد نظرا للطبيعة الأقل ملاءمة لبعض الببتيدات ذات الخصائص الطوبولوجية إلى التحليل الطيفي الكتلي اللوني السائل المقترن.

في حين أننا حددنا في هذا البروتوكول وسيلة يمكن من خلالها تقييم جميع أنواع سلسلة ubiquitin في وقت واحد ، فمن الممكن أيضا تعديل العديد من جوانب البروتوكول استنادا إلى طوبولوجيا السلسلة الخاصة ذات الاهتمام. يمكن أن يؤدي التلاعب بالظروف الكروماتوغرافية أو تغيير تركيزات الببتيد الثقيلة إلى زيادة دقة التحقيق ، وتحسين النتائج لطوولوجيا سلسلة معينة وتكييف التحقيق مع المسألة البيولوجية المقترحة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgments

ويود المؤلفان أن يشكرا سيلين جانتي على مساعدتها في إنشاء الكريات الخلوية مع علاج MG-132 على النحو المبين في النتائج التمثيلية وإليز مومارتس على توفيرها لكريات الإشريكية القولونية المستخدمة في البروتوكول.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile (ACN) Merck 100029
Ammonium bicarbonate (ABC) Fluka 9830
Centrifuge Beckman Coulter Microfuge 16
Chloroacetamide (CAA) Sigma 22790
Eppendorf LoBind Eppendorf 22431081
Formic acid (FA) Thermo Fisher Scientific 85178
Heavy Peptides JPT Peptide Technologies
HPLC Dionex Ulitimate 3000
LC Column Thermo Fisher Scientific 160321
Lys C Wako 125-05061
Mass Spectrometer Thermo Fisher Scientific Q-Exactive Plus
N-ethylmaleimide (NEM) ACROS Organics 156100050
Positive Control Chain K48 Boston Biochem UC-240
Positive Control Chain K63 Boston Biochem UC-340-100
Positive Control Chain M1 Boston Biochem UC-710B-025
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma S5881
Sonifier Branson sonifier SFX 150
Thermomixer Eppendorf Thermomixer Comfort
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigam T6508
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) Thermo Fisher Scientific 77720
Trypsin Promega V1511A
Urea Sigma 51456
Waters μElution C18 plates Waters 186002318

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Scientific Reports. 1, 90 (2011).
  2. Goldstein, G., et al. Isolation of a polypeptide that has lymphocyte-differentiating properties and is probably represented universally in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (1), 11-15 (1975).
  3. Glickman, M. H., Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: Destruction for the sake of construction. Physiol. Rev. 82, 373-428 (2002).
  4. Pickart, C. M., Eddins, M. J. Ubiquitin: structures, functions, mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1695 (1-3), 55-72 (2004).
  5. Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. Ubiquitin chain diversity at a glance. Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).
  6. Komander, D., Rape, M. The Ubiquitin Code. Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).
  7. Mattern, M., Sutherland, J., Kadimisetty, K., Barrio, R., Rodriguez, M. S. Using Ubiquitin Binders to Decipher the Ubiquitin Code. Trends in Biochemical Sciences. 44 (7), 599-615 (2019).
  8. Newton, K., et al. Ubiquitin chain editing revealed by polyubiquitin linkage-specific antibodies. Cell. 134 (4), 668-678 (2008).
  9. Spence, J., et al. Cell cycle-regulated modification of the ribosome by a variant multiubiquitin chain. Cell. 102 (1), 67-76 (2000).
  10. Borràs, E., Sabidó, E. What is targeted proteomics? A concise revision of targeted acquisition and targeted data analysis in mass spectrometry. PROTEOMICS. 17 (17-18), (2017).
  11. Lesur, A., Domon, B. Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics. PROTEOMICS. 15 (5-6), 880-890 (2015).
  12. Longworth, J., Dittmar, G. Assessment of Ubiquitin Chain Topology by Targeted Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1977, Clifton, N.J. 25-34 (2019).
  13. Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
  14. Tawa, N. E., Odessey, R., Goldberg, A. L. Inhibitors of the proteasome reduce the accelerated proteolysis in atrophying rat skeletal muscles. The Journal of Clinical Investigation. 100 (1), 197-203 (1997).
  15. Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
  16. MacLean, B., et al. Effect of Collision Energy Optimization on the Measurement of Peptides by Selected Reaction Monitoring (SRM) Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (24), 10116-10124 (2010).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 160، في كل مكان، سلسلة، قياس الطيف الكتلي، رصد التفاعل الموازي (PRM)، البروتيوميات، المستهدفة، ما بعد النقل، التعديل، الطوبولوجيا
تحليل سلسلة يوبيكيتين من خلال رصد التفاعل الموازي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Longworth, J., Mendes, M. L.,… More

Longworth, J., Mendes, M. L., Dittmar, G. Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring. J. Vis. Exp. (160), e60702, doi:10.3791/60702 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter