Summary
Denne metode beskriver vurderingen af globale ændringer i ubiquitin kæde topologi. Vurderingen foretages ved anvendelse af en massespektrometribaseret målrettet proteomikmetode.
Abstract
Vurdering af den globale profil af ubiquitin kæde topologier inden for et proteom er af interesse at besvare en bred vifte af biologiske spørgsmål. Protokollen er skitseret her drager fordel af di-glycin (-GG) ændring tilbage efter tryptisk fordøjelse af ubiquitin indarbejdet i en kæde. Ved at kvantificere disse topologi-karakteristiske peptider den relative overflod af hver ubiquitin kæde topologi kan bestemmes. De foranstaltninger, der er nødvendige for at kvantificere disse peptider ved et parallelt reaktionsovervågningseksperiment, rapporteres under hensyntagen til stabiliseringen af ubiquitinkæder. Forberedelse af tunge kontroller, celle lysis, og fordøjelsen er beskrevet sammen med den relevante masse spektrometer setup og dataanalyse workflow. Et eksempel på datasæt med forstyrrelser i ubiquitin-topologi præsenteres ledsaget af eksempler på, hvordan optimering af protokollen kan påvirke resultaterne. Ved at følge de skitserede trin vil en bruger være i stand til at udføre en global vurdering af det allestedsnærværende topologilandskab i deres biologiske kontekst.
Introduction
Den tætte regulering af proteinfunktion og stabilitet er af afgørende betydning, da de er vigtige drivkræfter bag fænotypisk kontrol af biologi. Et proteins funktion er konstrueret af to komponenter: dets iboende polypeptidsekvens og eventuelle posttranslationale modifikationer (PTMs). Der er identificeret forskellige kemiske PTM'er, herunder glykosylering, fosforylering, acetylering og methylering1. I 1975 identificerede Goldstein et al.2 et lille protein og kaldte det ubiquitin på grund af dets allestedsnærværende natur. Ubiquitin viste sig at være vigtig i proteinforringelse3. Siden da er det imidlertid blevet fastslået, at ubiquitins funktion som signalmolekyle strækker sig langt ud over reguleringen af proteinstabilitet. Ubiquitin signalering er involveret i en bred vifte af andre biologiske funktioner, såsom protein stabilisering, autofagi, cellecyklus kontrol, og protein handel4.
Mens andre PTMs generelt er binære (dvs. proteinet er modificeret eller efterladt uændret) for et givet sted, kan ubiquitin ændre et protein både som en monomer eller som en polymer kæde, hvor den vedhæftede ubiquitin selv allestedsnærværende. Desuden kan denne polyubiquitinationskæde udvikle sig i flere topologier med allestedsnærværende af den tidligere ubiquitin, der er knyttet til et af otte sammenkoblingssteder5,6. Ubiquitin overføres ved en multistep enzymatisk proces (figur 1), hvor C-endestationen for ubiquitin er knyttet til en af dens syv lysinrester (K06, K11, K27, K29, K33, K48 eller K63) eller N-terminalen i den tidligere ubiquitin (benævnt M1 eller lineær allestedsnærværende)5,6. Denne kædetopologi er nøglen til skæbnen for det protein, der er under modifikation. For eksempel fører modifikationen med en K48- eller K11-forbundet kæde til nedbrydning af det modificerede protein ved proteasomet, mens en lineær kæde er nødvendig for aktivering af NF-kB-signalering. Således er den relative fordeling af disse kædetopologier relevant for en lang række biologiske spørgsmål.
Brugen af massespektrometri (MS) er en særlig fordel for ubiquitin kædetopologianalyse, da den ikke er afhængig af antistofbaserede eller affinitetsbaserede interaktioner7,8, hvoraf mange har begrænset specificitet og ikke skelner mellem de forskellige kædetyper. En anden påvisningsmulighed er at bruge genetisk modificerede ubiquitin mutanter. Her udveksles en bestemt lysin til arginin, som ikke kan understøtte ubiquitins modifikation. Manglen på ubiquitin kædedannelse på substratproteinet fortolkes derefter som bevis for en bestemt topologi9.
MS-baseret identifikation af allestedsnærværende proteiner er baseret på det faktum, at C-endestationen for ubiquitin indeholder en argininrester i position 74, der genkendes af trypsin under proteolytisk forberedelse af prøverne til MS-analyse, der adskiller C-terminalen dobbelt glycin. Denne GlyGly (-GG) forbliver knyttet til ε-aminogruppen af lysinrester af substrateproteinet. Til ubiquitin topologianalyse sker modifikationen på en af de syv lysinrester af ubiquitin. Dette skaber et sæt af syv centrale peptider, der bærer en lysinrester, der er modificeret af GG, der er specifik for hver af topologierne (Figur 2). For eksempel, med K06 topologi, lysin på position 6 på aminosyre sekvens vil blive beskyttet mod tryptisk fordøjelse med en -GG modifikation af 114 Da føjet til denne lysin.
Medlemsstaternes identifikation af specifikke forudbestemte peptider kaldes målrettede proteomics , eller mere specifikt målrettet peptiderhvervelse10. Der er udviklet to metoder afhængigt af ydeevnen af det anvendte massespektrometer. Disse er udvalgte reaktionsovervågning (SRM), også kaldet multiple reaction monitoring (MRM), og parallel reaktionsovervågning (PRM). SRM indebærer udvælgelse af overgange bestående af prækursor m/z og produktet ion m/z. Omvendt kræver PRM kun forløberen m/z. Efter udvælgelsen udføres en fuld undersøgelsesscanning af produktionerne. Dette har den fordel , at det ikke er nødvendigt at vælge passende produktioner til kvantation på det specifikke massespektrometer inden målingen11. Både SRM og PRM kan, afhængigt af instrumentet, planlægges. Planlægning er den praksis, der bestod i at tildele et tidsvindue, hvor en bestemt ion vil blive medtaget til analyse, da peptider udråber på definerede opbevaringstidspunkter fra det kromatografiske system. En reduktion af antallet af ioner, der afhøres på et givet tidspunkt, øger hyppigheden af forhør af de ioner, der er planlagt på det pågældende tidspunkt, hvilket forbedrer datanøjagtigheden.
Generelt er anvendelsen af målrettede proteomics for ubiquitin topologi det samme som ethvert andet målrettet proteomics eksperiment. To vigtige forskelle er imidlertid vigtige: For det første skal stabiliteten af ubiquitinkæder overvejes. Der er flere potente deallestedsnærværende enzymer (DUB'er), der hurtigt nedbryder kæder på celle lysis. De allestedsnærværende specifikke proteaser kan inddeles i to kategorier, thioesteraser og metalloproteases. De fleste af de ubiquitin-hydrolaser er thioesteraser og bære en cystein rester i deres aktive center. Ved at alkylere denne cysteinrester kan de inaktiveres. Som sådan er brugen af ubiquitin stabiliseringsbuffere, der indeholder alkyleringsmidler, som N-ethylmaleimide (NEM) og stærkt denaturerende kemikalier og opbevaring af prøver kølet afgørende for en vellykket analyse. For det andet, i modsætning til andre målrettede eksperimenter, peptid valg er fast. I et typisk målrettet eksperiment kan der vælges en proteotypic peptid for god kromatografisk og ioniseringsydelse. For nogle topologi-karakteristiske peptider som K48 er disse egenskaber gode, mens de for andre er mindre ønskelige. For eksempel er K33-kromatografi i en typisk omvendt fase-opsætning dårlig på grund af dannelsen af en strakt elutionsprofil, og K27 peptids dårlige ioniseringsegenskaber reducerer synligheden med MS12.
I denne protokol beskriver vi, hvordan man udfører ubiquitin topologivurdering af en biologisk prøve af PRM. Eksempeldata for proceduren præsenteres ved hjælp af en forstyrrer ved hjælp af MG-132-hæmmerbehandling i flere forskellige celletyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Udarbejdelse af en tung peptidstandard
- Afhængigt af leverandøren og kvaliteten af de tunge peptider, der købes, skal de tunge peptider fortyndes. Denne protokol anvendte de peptidsekvenser, der er rapporteret i tabel 1, med C-terminal aminosyren modificeret til Lysin (13C615N2-lysin) eller Arginin (13C615N4-arginin).
- De tunge peptider blandes og fortyndes blandingen med 50% acetonistril (ACN) for at skabe en peptidblanding med hver peptid ved 10 μM.
- Der skal laves aliquots af peptidblandingen, og de opbevares ved -80 °C.
2. Prøveforberedelse
- Eksempel på lysis
BEMÆRK: Ubiquitinkædernes stabilitet skal tages i betragtning under prøveforberedelsen. De biologiske prøver og buffere skal opspares ved 4 °C, og der tilsættes prøver til ubiquitinstabiliseringsbufferen så hurtigt som muligt.- Forbered en opløsning på 1 M NH4HCO3 (ammoniumbicarbonat) i vand og juster pH til 8 ved hjælp af 1 M NaOH.
- Forbered en opløsning på 200 mM N-ethylmaleimid (NEM) i vand.
- Forbered ubiquitin stabiliseringsbuffer ved hjælp af 8 M urinstof i 50 mM NH4HCO3/10 mM NEM. Ubiquitin stabiliseringsbuffer skal tilberedes frisk hver gang.
BEMÆRK: En 5 ml opløsning på 8 M urinstof vil kræve betydeligt mindre end 5 ml vand i betragtning af vandudvidelsen, når den er i en mættet opløsning med urinstof.
ADVARSEL: Bufferen må ikke forberedes over 50 °C på grund af urinstofets tendens til at danne polyurea ved høje temperaturer. - Den biologiske prøve, der skal undersøges i ubiquitinstabiliseringsbufferen, og som sigter mod 0,5 μg/μL protein, opsættes igen, og cellerne lyser med en passende metode til prøven. En sonikering metode bestående af tre 10 s pulser med en SFX 150 Branson sonifier sat til 70% intensitet med 10 s pauser på is mellem hver puls, blev brugt til cellelinjer i denne protokol.
- Centrifugeprøve ved 18.000 x g i 10 min ved 4 °C i en bordpladecentrifuge.
- Overfør supernatant til et friskt lavt protein bindende mikrocentrifugerør. Prøverne kan opbevares ved -20 °C på dette tidspunkt, hvis det er nødvendigt.
- Forberedelse af stikprøver og kontrol
- Hvis prøverne fryses, blandes (f.eks. med en termomixer), mens de optøes for hurtigt at opløse urinstof.
ADVARSEL: Brug ikke temperaturer over 50 °C på grund af urinstofs tendens til at danne polyurea ved høje temperaturer. - Centrifugeprøve ved 18.000 x g i 10 min ved 4 °C i en bordpladecentrifuge.
- Der overføres 20 μg prøve til et friskt mikrocentrifugerør med lavt bindingsindhold, og volumenet justeres til 50 μL med ubiquitinstabiliseringsbuffer.
- Opret en negativ kontrol ved hjælp af en normaliseret mængde ubiquitinstabiliseringsbuffer (50 μL). I denne prøve må der ikke være nogen lysversion af hver peptid til stede, hvilket gør det muligt at observere enhver lysforurening som følge af de kraftige peptider. Dette negative kontrolelement blev også brugt til tidsplanlægning for tilbageholdelse af prm beskrevet i afsnit 3.1.
- Der blev også oprettet en positiv kontrol med ubiquitinstabiliseringsbuffer og tilføjelse af kommercielt tilgængelige kædetyper til den normaliserede mængde ubiquitinstabiliseringsbuffer (50 μL). Normalt er K63, K48 og M1 tilgængelige. I de repræsentative resultater blev 20 ng K48, K63 og M1 udnyttet.
- Hvis prøverne fryses, blandes (f.eks. med en termomixer), mens de optøes for hurtigt at opløse urinstof.
- Reduktion, alkylering og fordøjelse
- Der fremstilles en opløsning på 50 mM ammoniumbicarbonat (NH4HCO3)i vand, og prøven justeres til pH = 8 med 1 M NaOH.
- En kultur af E. coli dyrket i LB bouillon blev centrifuged 5.000 x g i 5 min til at danne en pellet, som derefter blev vasket 2x med PBS før resuspension i ubiquitin stabilisering buffer ved 5 μg/μL.
- Der tilsættes 1 μg E. coli lysat til hver prøve og kontrol. Denne protokol bruger E. coli (DH10B), men ethvert komplekst lysat uden ubiquitin kan bruges. Bemærk, at ubiquitin er fælles for alle eukaryoter.
BEMÆRK: Brug af en E. coli lysatmatrix reducerer tabet af peptider på grund af uspecifik vedhæftning til plastartikler. Dette er især mærkbart i den eller de negative kontrolprøver med et begrænset proteinindhold og har en stærk indvirkning på observationen af K6312. - Forbered en opløsning på 500 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) i MS grade vand (DTT kan bruges som et alternativ).
- Prøverne og kontrollerne reduceres ved at tilføre TCEP til en endelig koncentration på 50 mM. Vortex kort før inkubation i 30 minutter ved stuetemperatur (RT). Hvis der anvendes DTT, skal temperaturen hæves til 50 °C.
ADVARSEL: Brug ikke temperaturer over 50 °C på grund af urinstofs tendens til at danne polyurea ved høje temperaturer. - Der fremstilles en opløsning på 550 mM chloracetamid (CAA) i NH4HCO3. Opbevar i mørket.
- Alkylater prøverne og kontrollerne ved at tilsætte CAA til en endelig koncentration på 55 mM. Vortex kort før inkubation i 20 min på RT i mørke.
BEMÆRK: CAA anvendes i stedet for iodoacetamid som reduktionsmiddel for at mindske risikoen for, at en dobbelt carbamidomethylmodifikation (114.0429) på en lysinrester forveksles med en -GG-modifikation (114.0429)13. - Der tilsættes endopeptidase LysC til prøverne ved forholdet 1:25 (w/w) til proteinindholdet. Inkuberes i 3 timer ved 37 °C.
- Prøverne og kontrollerne fortyndes med 200 μL på 50 mM NH4HCO3 pH = 8 (1:5 v/v).
- Trypsin til prøverne ved 1:25 w/w forhold til proteinindholdet. Inkuberes i 12 timer ved 37 °C.
- Der tilsættes 10 % myresyreopløsning (FA) i vand af MS-kvalitet ved et 1:10-forhold v/v til hver prøve og kontrolprøve. Kontroller, at pH-koden er <3) før C18-oprydningen, og tilsæt om nødvendigt mere myresyre.
- Til hver prøve og kontrol tilsættes 0,5 μL af den tunge peptidstandard, der er oprettet i afsnit 1.
- Oprydning i Peptid
- Flere producenter tilbyder C18 oprydning tips eller plader. Følg producentens anvisninger for det anvendte produkt, og tør eluttificerede peptider i en vakuumcentrifuge, klar til MS-analyse.
3. Analyse foretaget af LC-MS/MS
- Udfør indledende PRM-analyse på den tunge peptidstandard på en uplanlagt måde.
- De tørrede prøver blev genbrugt i 10 μL MS-læssebuffer 2% ACN/0,05% trifluorodikesyre (TFA).
- Udstyr en HPLC med en omvendt fase C18 analytisk kolonne (75 μm x 15 cm, 2 μm 100 Å C18 perler) designet til nanoflow MS. Form lineære stigninger, der udveksler MS-kvalitet vand suppleret med 0,1% FA med ACN indeholdende 0,1% FA. Her blev der anvendt en offerfældekolonne (75 μm x 2 cm, 3 μm, 100 Å C18 perler) til at bevare analysekolonnens levetid, men det er ikke påkrævet.
- Par outputtet af analysekolonnen til en nano-ESI-kilde på et massespektrometer med høj opløsning.
- Udnyt en passende målrettet proteomics metode til massespektrometeret. På en Q-Exactive plus en to-eksperimentmetode kan du f.eks. For full MS-eksperimentet blev der brugt en opløsning på 120.000 med et AGC-mål på 1e6 og 240 ms, da maksimal IT blev brugt. Til PRM-eksperimentet blev det samme AGC-mål og maksimale IT brugt med en lavere opløsning på 60.000 og et isolationsvindue på 1,2 m/z.
- 200 ng af den negative kontrol indsprøjtes på analysekolonnen ved hjælp af HPLC-autosampleren. Påfør en lineær hældning på prøven på analysekolonnen, der øger ACN-koncentrationen fra 2-25% over en periode på ~45 min.
BEMÆRK: Acn-koncentrationen på 25 % er lavere end normalt for proteomik på grund af den lave hydrofile karakter af typiske ubiquitin-topologikarakteristika peptider. Hvis andre peptider skal kvantificeres, kan det ønskes at opnå en højere ACN-koncentration for at opnå en god måladskillelse. - Analyser resultaterne af planlægningskørslen som beskrevet i afsnit 4.2 for at oprette en planlagt medtagelsesliste.
- Analyse af prøverne
- Kør de resterende eksempler som beskrevet for planlægningen i 3.1, bortset fra brugen af den planlagte medtagelsesliste, der er oprettet i afsnit 4.2.
BEMÆRK: Der skal køres en blindprøve efter den positive kontrol for at sikre, at der ikke opdages fremførsel fra den foregående kørsel i efterfølgende prøver.
- Kør de resterende eksempler som beskrevet for planlægningen i 3.1, bortset fra brugen af den planlagte medtagelsesliste, der er oprettet i afsnit 4.2.
4. Softwareanalyse
- Opret en medtagelsesliste over passende formatering for den anvendte MS. Denne protokol brugte open source-softwaren Skyline (version 19.1.0.193) (https://skyline.ms), som tilbyder veldokumenteret support og hjælp. Der kan oprettes en medtagelsesliste for flere massespektrometre ved hjælp af eksportisolationslistefaciliteten.
- Åbn et nyt Skyline-dokument.
- Vælg tunge isotopændringer, alt efter hvad der passer til tunge topologikarakteristika peptider. I Indstillinger| Peptidindstillinger under fanen Ændring skal du klikke på navnefeltet for at se den potentielle ændring. Udvælgelsen er baseret på isotoptilstanden af de tunge peptider, der er købt. I dette eksempel blev der anvendt syntetiske peptider, der enten bar en tung lysin (13C615N2-lysin) eller en tung arginin (13C615N4-arginin) ved C-endestationen. De relevante etiketter ville være: "Label:13C(6)15N(2) (C-term K)" og "Label:13C(6)15N(4) (C-term R)".
- Vælg Indstillinger| Overgang. Under fanen Filter skal du medtage precursorgebyrer 2, 3, 4.
- Indsæt peptider ved at vælge Rediger| Indsæt| Peptider.
- Udfyld de relevante felter, herunder den topologi-karakteristiske peptidsekvens og et proteinnavn (f.eks. "Chain-K63").
- Udvid hver peptid, der nu vises i panelet Mål. Slet uønskede gebyrstater. Den foretrukne opladningstilstand og kollisionsenergi, som kan variere baseret på det anvendte massespektrometer, for hver topologikarakteristika peptid er vist i tabel 1.
- For hver topologikarakteristika peptid (undtagen M1, hvor GG'en er inkluderet i sekvensen) skal du højreklikke på sekvensen og vælge Rediger. Tilføj en GG som en strukturel ændring ved at klikke på navnefeltet og vælge <Vis alle... > før du vælger "GlyGly (K)".
- Eksporter isolationslisten Fil| Eksporter| Isolationsliste, vælg instrumenttypen, og angiv metodetypen til Standard. Hvis du vælger OK, åbnes en prompt om at gemme en *.csv-fil, der kan bruges til at oprette en PRM-metode.
- Opret en planlagt inklusionsliste baseret på en tung peptidplanlægningskørsel, der er forklaret her ved hjælp af open source Skyline-softwaren.
- Opret en målliste som beskrevet i afsnit 4.1.
- Importer planlægningskørslen i 3.1 ved at vælge Filer| Importér| Resultater.
- Gennemse identifikationerne. Det tunge signal for hver peptid kan observeres ved at klikke på massen for hver tung peptidindgang. Korrekt genkendelse af toppen bestemmes ofte automatisk, men softwaren kan kræve manuel kuration ved at vælge toppen ved hjælp af klik og træk under x-aksen.
- Opbevaringstider, der er valgt til de tunge varianter, anvendes også på de lette versioner, hvilket skaber en tidsplan for PRM. Planlægningsvinduet kan ændres under Indstillinger| Peptidindstillinger under fanen Forudsigelse ved at ændre tidsvinduet.
- En planlagt medtagelsesliste kan nu eksporteres ved hjælp af Filer| Eksporter| Isolationsliste og valg af den relevante instrumenttype og indstillingsmetodetype til Planlagt.
- Analyser dataene.
- Importér eksemplerne på samme måde som for analysen af planlægningskørsel i afsnit 4.2.
- Efter den fuldstændige import af alle prøver anbefales kuration af overgange. Dette er den proces, hvorved overgange med interferens eller dårlige signal-til-støj-forhold fjernes. Et eksempel på et kromatogram før og efter kurationen er vist i figur 4.
- Data kan nu eksporteres enten ved at højreklikke på relevante grafer og vælge Kopier data eller ved at vælge Filer| Eksporter| Resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at demonstrere brugen af en ubiquitin kædeanalyse af PRM blev der valgt tre cellelinjer: en musemelanomcellelinje B16 og de to almindelige menneskelige cellelinjer A549 (adenocarcinomiske alveolar basal epitelceller) og HeLa (livmoderhalskræftceller). Disse kulturer voksede til midexponential fase i passende medier, før de behandles med 0, 10, eller 100 mM MG-132 i 4 timer før høst. MG-132 er en proteasomhæmmer, der forhindrer nedbrydningen af ubiquitinkonjugerede proteiner ved proteasomet14. I betragtning af dette er det en passende testtilstand at påvise ubiquitinkædeanalyse. Den deraf følgende stigning i K48-kæden fremgår af figur 3. Proteasome hæmmer behandling induceret en stigning i K48 kæder15.
Som beskrevet i indledningen udfører PRM i modsætning til SRM eller MRM en fuld produktionscanning efter valg af prækursorionen. Selvom dette betyder, at produktioner ikke behøver at være specificeret før kørslen, skal de stadig kurateres efter kørsel. Kuration er den proces, hvorved overgange, der virkelig er repræsentative for den tilsigtede peptid, vælges. Figur 4 viser produktets ionkromatogram for K48 før og efter kuration. Produktioner, der har et signal med en inkonsekvent elueringsprofil, der sandsynligvis skyldes interferens, blev fjernet. Lavintensive produktioner blev derefter fjernet, da signal-til-støj-forholdet er mindre gunstigt for sådanne overgange. De optimale overgange, der vælges under kurationen, vil normalt være konsistente mellem forsøgene og kan variere afhængigt af det anvendte massespektrometer, kromatografiske forhold, analyseindstillinger og prøvens biologiske baggrund. For hver undersøgelse er der således behov for korrekt kuration af overgange. Der er også behov for en balance mellem inddragelse af flere overgange og dermed tekniske replikater og renere data til kvantificering.
Typiske produktionkromatogrammer for hver af de identificerede ubiquitinkædetopologier i dette forsøg er vist i figur 5. K27 og K29 er udeladt her, fordi under disse biologiske forhold signalet var under påvisning. K33's elutionsprofil, som vist her, var betydeligt bredere, end det ville være almindeligt accepteret til PRM-analyse. Alternativt valg af peptider med bedre elueringsprofiler er dog ikke muligt i ubiquitin kædeanalyse, og der skal foretages en fortolkning baseret på denne profil. Hvis K33 er af særlig interesse, kan ændrede kromatografiske forhold forbedre kvantificeringen af denne kædetype, men sandsynligvis til skade for andre kædetyper.
Ved udformningen af et PRM-eksperiment er det at foretrække at maksimere signalet fra de produktioner, der bruges til kvantificering, ved at øge signal-til-støj. Optimering af kollisionsenergi (dvs. den energi, som massespektrometeret anvender til at fragmentere prækursorpeptidioner til produktioner) er et middel, hvormed signalet kan forbedres16. Der blev anvendt et kollisionsenergiområde fra 14-28 til gentagne injektioner af en enkelt prøve med de deraf følgende observerede topområder på K63 og M1 vist i figur 6. Som det kan ses, for K63 en højere kollision energi på 26 var optimal, mens for M1 en lavere energi på 18 var ideel. Kollisionsenergien for hver topologikarakteristika peptid og et udvalg af uændrede ubiquitinfragmenter er vist i tabel 1. Det kan være nødvendigt at optimere kollisionsenergierne baseret på det anvendte massespektrometer og fragmenteringsmetoden.
Figur 1: Skematisk repræsentation af den allestedsnærværende kaskade. Ubiquitin er først bundet af et E1-enzym på en ATP-afhængig måde. Den aktiverede ubiquitin overføres derefter til et E2-enzym, der derefter følgeskab af en E3-ligase for at overføre ubiquitin til substrateproteinet. Denne proces gentages flere gange, indtil der dannes en ubiquitinkæde på substrateproteinet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Diagram, der viser afledningen af den allestedsnærværende topologi-karakteristiske peptid. Post tryptic fordøjelsen opstrøms bindende site er afledt med -GG C-terminal af downstream ubiquitin vedhæftet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Sammenligning af K48-kæden under MG-132-behandling for en musecellelinje B16 og de to menneskelige cellelinjer A459 og HeLa. I A459 førte stigende koncentrationer af MG-132 til stabilisering af K48-kæder. Med B16- og HeLa-celler blev der set en stigning under behandling med enten 10 mM eller 100 mM MG-132. Faldet observeret fra 10 mM til 100 mM kan forklares ved den øgede følsomhed af B16 og HeLa celler til MG-132, hvilket fører til celledød. Fejllinjer viser standardafvigelsen for overgangene. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Produkt ionkromatogrammer af M1-topologikarakteristikken peptid før og efter kuration af overgange for interferens eller lav intensitet. Retentionstiden på x-aksen vises i minutter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Typisk produktionkromatogram af forskellige topologikarakteristika peptider samt to ikke-modificerede ubiquitin peptider. Elueringstiden i minutter og observeret massefejl for hver peptid rapporteres over toppen af den relevante top. Syede linjer viser også vinduet til bestemmelse af toparealet. Retentionstiden på x-aksen vises i minutter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Observeret topareal for K63 og M1 over en række normaliserede kollisionsenergier. De forskellige farver repræsenterer den ionintensitet, som hver overgang bidrager med. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Kædetype | Topologi Karakteristisk Peptid | Opladningstilstand | Normaliseret kollisionsenergi |
| K06 | MQIFVK[GG]TLTGK | 3 | 18 |
| K11 | TLTGK[GG]TITLEVEPSDTIENVK | 3 | 18 |
| K27 | TITELVEPSDTIENVK[GG]AK | 3 | 18 |
| K29 | AK[GG]IQDK | 2 | 22 |
| K33 | IQDK[GG]EGIPPDQQR | 3 | 18 |
| K48 | LIFAGK[GG]QLEDGR | 3 | 24 |
| K63 | TLSDYNIQK[GG]ESTLHLVLR | 4 | 26 |
| M1 (lineær) | GGMQIFVK | 2 | 18 |
| Ikke-ændret Ubqiuitin | ESTLHLVLR | 2 | 26 |
| Ikke-ændret Ubqiuitin | TITELVEPSDTIENVK | 2 | 18 |
| Ikke-ændret Ubqiuitin | TLSDYNIQK | 2 | 18 |
Tabel 1: Sekvenser for de humane ubiquitin topologi-karakteristiske peptider, den mest observerbare opladningstilstand og gunstig normaliseret kollisionsenergi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analyse af ubiquitin tilstand inden for et proteom er af stigende betydning for en bred vifte af biologiske spørgsmål. Beskrivelsen af en prøves allestedsnærværende tilstand skal ikke kun fokusere på profilen af proteiner, der allestedsnærværes, men også på topologien af en sådan allestedsnærværende. Vurderingen af denne topologi foretaget af målrettede medlemsstater, som beskrevet her, spiller en rolle i en lang række biologiske undersøgelser.
Det skal forstås, at den protokol, der er skitseret her, giver en global topologiprofil. Brug af en bottom-up proteomics tilgang giver mulighed for bestemmelse af peptider, der blev allestedsnærværende, herunder ubiquitin peptider. Observationen af allestedsnærværende ubiquitin peptider gør det muligt at bestemme kædetopologien, men forbindelsen til målet for ubiquitin går tabt. Således kan den særlige kædetopologi på et givet protein ikke bestemmes, men en global topologiprofil er afledt. Metoden kan også kombineres med en berigelsesstrategi for at give mere målrettede resultater. En sådan berigelse skal tage hensyn til kædestabiliteten og overfloden af kæder efter tilsætning. Påvisningen af kædetopologien er begrænset af renheden, som berigelsesstrategien giver, da det ikke er muligt at skelne mellem en ubiquitin-topologi, der er knyttet til et forurenende protein, og dem, der er knyttet til det protein, der er af interesse. Det kritiske skridt i denne protokol, der letter en vellykket analyse, er balancen mellem at bevare ubiquitinkæden, mens den fordøjer ubiquitinproteinet. Dette er udfordrende på grund af tilbøjeligheden af kædenedbrud koblet til modstanden af ubiquitin selv til enzymatisk fordøjelse. Desuden er tilføjelsen af en støttematrix og omhyggelig overvejelse af MS-betingelser påkrævet i betragtning af den mindre gunstige karakter af nogle af de topologikarakteristikade peptider til flydende kromatografisk koblet massespektrometrisk analyse.
Mens vi i denne protokol har skitseret et middel, hvormed alle ubiquitin kædetyper kan vurderes samtidigt, er det også muligt at justere flere aspekter af protokollen baseret på den særlige kædetopologi af interesse. Manipulering af kromatografiske forhold eller varierende kraftige peptidkoncentrationer kan øge nøjagtigheden af en undersøgelse, forbedre resultaterne for en bestemt kædetopologi og skræddersy undersøgelsen til det foreslåede biologiske spørgsmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Céline Jeanty for hendes hjælp til at skabe cellulære pellets med behandling af MG-132 som beskrevet i de repræsentative resultater og Elise Mommaerts for hendes levering af E. coli pellets, der anvendes i protokollen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (ACN) | Merck | 100029 | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | Fluka | 9830 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 16 | |
| Chloroacetamide (CAA) | Sigma | 22790 | |
| Eppendorf LoBind | Eppendorf | 22431081 | |
| Formic acid (FA) | Thermo Fisher Scientific | 85178 | |
| Heavy Peptides | JPT Peptide Technologies | ||
| HPLC | Dionex | Ulitimate 3000 | |
| LC Column | Thermo Fisher Scientific | 160321 | |
| Lys C | Wako | 125-05061 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | Q-Exactive Plus | |
| N-ethylmaleimide (NEM) | ACROS Organics | 156100050 | |
| Positive Control Chain K48 | Boston Biochem | UC-240 | |
| Positive Control Chain K63 | Boston Biochem | UC-340-100 | |
| Positive Control Chain M1 | Boston Biochem | UC-710B-025 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S5881 | |
| Sonifier | Branson sonifier | SFX 150 | |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigam | T6508 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Thermo Fisher Scientific | 77720 | |
| Trypsin | Promega | V1511A | |
| Urea | Sigma | 51456 | |
| Waters μElution C18 plates | Waters | 186002318 |
References
- Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Scientific Reports. 1, 90 (2011).
- Goldstein, G., et al. Isolation of a polypeptide that has lymphocyte-differentiating properties and is probably represented universally in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (1), 11-15 (1975).
- Glickman, M. H., Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: Destruction for the sake of construction. Physiol. Rev. 82, 373-428 (2002).
- Pickart, C. M., Eddins, M. J. Ubiquitin: structures, functions, mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1695 (1-3), 55-72 (2004).
- Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. Ubiquitin chain diversity at a glance. Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).
- Komander, D., Rape, M. The Ubiquitin Code. Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).
- Mattern, M., Sutherland, J., Kadimisetty, K., Barrio, R., Rodriguez, M. S. Using Ubiquitin Binders to Decipher the Ubiquitin Code. Trends in Biochemical Sciences. 44 (7), 599-615 (2019).
- Newton, K., et al. Ubiquitin chain editing revealed by polyubiquitin linkage-specific antibodies. Cell. 134 (4), 668-678 (2008).
- Spence, J., et al. Cell cycle-regulated modification of the ribosome by a variant multiubiquitin chain. Cell. 102 (1), 67-76 (2000).
- Borràs, E., Sabidó, E. What is targeted proteomics? A concise revision of targeted acquisition and targeted data analysis in mass spectrometry. PROTEOMICS. 17 (17-18), (2017).
- Lesur, A., Domon, B. Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics. PROTEOMICS. 15 (5-6), 880-890 (2015).
- Longworth, J., Dittmar, G. Assessment of Ubiquitin Chain Topology by Targeted Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1977, Clifton, N.J. 25-34 (2019).
- Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
- Tawa, N. E., Odessey, R., Goldberg, A. L. Inhibitors of the proteasome reduce the accelerated proteolysis in atrophying rat skeletal muscles. The Journal of Clinical Investigation. 100 (1), 197-203 (1997).
- Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
- MacLean, B., et al. Effect of Collision Energy Optimization on the Measurement of Peptides by Selected Reaction Monitoring (SRM) Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (24), 10116-10124 (2010).
