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Biochemistry

Analyse en chaîne de l’ubiquitine par surveillance parallèle des réactions

Published: June 17, 2020 doi: 10.3791/60702
Automatic Translation
1, 1, 1
1Quantitative Biology Unit, Luxembourg Institute of Health

Summary

Cette méthode décrit l’évaluation des changements mondiaux dans la topologie de chaîne d’ubiquitine. L’évaluation est effectuée par l’application d’une approche protéomique ciblée basée sur la spectrométrie de masse.

Abstract

L’évaluation du profil global des topologies de chaîne d’ubiquitine dans un protéome est d’intérêt pour répondre à un large éventail de questions biologiques. Le protocole décrit ici tire parti de la modification de la di-glycine (-GG) laissée après la digestion tryptique de l’ubiquitine incorporée dans une chaîne. En quantifiant ces peptides caractéristiques de la topologie, l’abondance relative de chaque topologie de la chaîne d’ubiquitine peut être déterminée. Les étapes nécessaires pour quantifier ces peptides par une expérience parallèle de surveillance des réactions sont signalées en tenant compte de la stabilisation des chaînes d’ubiquitine. La préparation des contrôles lourds, la lyse cellulaire, et la digestion sont décrites avec la configuration appropriée de spectromètre de masse et le flux de travail d’analyse de données. Un exemple de données avec des perturbations dans la topologie de l’ubiquitine est présenté, accompagné d’exemples de la façon dont l’optimisation du protocole peut affecter les résultats. En suivant les étapes décrites, un utilisateur sera en mesure d’effectuer une évaluation globale du paysage de topologie ubiquitine dans leur contexte biologique.

Introduction

La régulation étroite de la fonction et de la stabilité des protéines est d’une importance primordiale, car ils sont les principaux moteurs du contrôle phénotypique de la biologie. La fonction d’une protéine est construite à partir de deux composants : sa séquence intrinsèque de polypeptide et toutes les modifications posttranslationnelles (MPT). Divers M PTM chimiques ont été identifiés, y compris la glycosylation, la phosphorylation, l’acétylation et la méthylation1. En 1975, Goldstein et coll.2 ont identifié une petite protéine et l’ont nommée ubiquitine en raison de sa nature omniprésente. L’ubiquitine s’est trouvée importante dans la dégradation deprotéine 3. Cependant, depuis lors, il a été établi que la fonction de l’ubiquitine en tant que molécule de signalisation s’étend bien au-delà de la régulation de la stabilité des protéines. La signalisation d’ubiquitine est impliquée dans un large éventail d’autres fonctions biologiques, telles que la stabilisation de protéine, l’autophagie, le contrôle de cycle cellulaire, et le trafic deprotéine 4.

Alors que d’autres MNP sont généralement binaires (c.-à-d. que la protéine est modifiée ou non modifiée) pour un site donné, l’ubiquitine peut modifier une protéine à la fois comme monomère ou comme chaîne polymérique, l’ubiquitine ci-jointe étant elle-même ubiquitinée. En outre, cette chaîne de polyubiquitination peut se développer dans plusieurs topologies avec l’ubiquitination de l’ubiquitine précédente s’attachant à l’un des huit sites deliaison 5,6. L’ubiquitine est transférée par un processus enzymatique en plusieurs étapes (figure 1) où le C-terminus d’ubiquitine est relié à l’un de ses sept résidus de lysine (K06, K11, K27, K29, K33, K48 ou K63) ou au terminal N de l’ubiquitine précédente (appelée ubiquitination M1 ou linéaire)5,6. Cette topologie de chaîne est la clé du sort de la protéine en cours de modification. Par exemple, la modification avec une chaîne liée au K48 ou au K11 entraîne la dégradation de la protéine modifiée au protéasome, tandis qu’une chaîne linéaire est nécessaire pour l’activation de la signalisation NF-kB. Ainsi, la répartition relative de ces topologies de chaîne est pertinente à une grande variété de questions biologiques.

L’utilisation de la spectrométrie de masse (SP) est particulièrement bénéfique pour l’analyse de la topologie de la chaîne d’ubiquitine car elle ne dépend pas d’interactions basées sur les anticorps ou les affinités7,8, dont beaucoup ont une spécificité limitée et ne font pas de distinction entre les différents types de chaînes. Une autre possibilité de détection est d’utiliser des mutants ubiquitine génétiquement modifiés. Ici, une lysine spécifique est échangée contre de l’arginine, qui ne peut pas soutenir la modification par l’ubiquitine. L’absence de formation de chaîne d’ubiquitine sur la protéine de substrat est alors interprétée comme évidence pour une topologie spécifique9.

L’identification basée sur la SP des protéines ubiquitinées est basée sur le fait que le C-terminus d’ubiquitine contient un résidu d’arginine dans la position 74 qui est reconnu par la trypsine pendant la préparation protéolytique des échantillons pour l’analyse de la SP, séparant la double glycine du terminal C. Ce GlyGly (-GG) reste attaché au groupe ε-aminé du résidu de lysine de la protéine de substrat. Pour l’analyse de topologie d’ubiquitine, la modification se produit sur l’un des sept résidus de lysine de l’ubiquitine. Cela crée un ensemble de sept peptides clés qui transportent un résidu de lysine qui est modifié par GG, spécifique pour chacune des topologies (Figure 2). Par exemple, avec la topologie K06, la lysine à la position 6 sur la séquence des acides aminés sera protégée de la digestion tryptique avec une modification de -GG de 114 Da ajoutée à cette lysine.

L’identification de peptides prédéterminés spécifiques par la SP est appelée protéomique ciblée, ou plus précisément acquisition ciblée de peptides10. Deux méthodes ont été développées en fonction des performances du spectromètre de masse utilisé. Il s’agit d’une surveillance des réactions sélectionnée (GRS), également appelée surveillance des réactions multiples (MRM) et de la surveillance parallèle des réactions (PRM). SRM implique la sélection des transitions composées du précurseur m/z et de l’ion produit m/z. Inversement, PRM ne nécessite que le précurseur m/z. Après sélection, une analyse complète des ions du produit est effectuée. Cela a l’avantage qu’aucune sélection d’ions de produit appropriés pour la quantitation sur le spectromètre de masse spécifique n’est nécessaire avant lamesure 11. SRM et PRM peuvent, selon l’instrument, être programmés. La planification est la pratique consistant à attribuer une fenêtre de temps au cours de laquelle un ion particulier sera inclus pour analyse, car les peptides s’échappent à des moments de rétention définis à partir du système chromatographique. La réduction du nombre d’ions interrogés à un moment donné augmente la fréquence des interrogatoires des ions prévus à ce moment-là, améliorant ainsi l’exactitude des données.

En général, l’application de la protéomique ciblée pour la topologie de l’ubiquitine est la même que toute autre expérience protéomique ciblée. Cependant, deux différences clés sont importantes : premièrement, la stabilité des chaînes d’ubiquitine doit être prise en considération. Il existe de multiples enzymes déubiquitines puissantes (DUB) qui dégradent rapidement les chaînes lors de la lyse cellulaire. Les protéases spécifiques à l’ubiquitine se équipent en deux catégories, les thioesterases et les métalloproteases. La plupart des ubiquitine-hydrolases sont des thioesterases et portent un résidu de cystéine dans leur centre actif. En alkylating ce résidu de cystéine, ils peuvent être inactivés. En tant que tel, l’utilisation de tampons de stabilisation de l’ubiquitine contenant des agents alcalinateurs, comme l’éthylmaleimide N (NEM), et des produits chimiques très dénaturants, et de garder les échantillons réfrigérés est essentielle à une analyse réussie. Deuxièmement, contrairement à d’autres expériences ciblées, le choix du peptide est fixé. Dans une expérience ciblée typique, un peptide protéotypique peut être sélectionné pour une bonne performance chromatographique et ionisation. Pour certains peptides caractéristiques de la topologie tels que K48, ces propriétés sont bonnes, tandis que pour d’autres, elles sont moins souhaitables. Par exemple, la chromatographie K33 dans une configuration typique en phase inverse est pauvre en raison de la formation d’un profil d’élitution étiré, et les faibles propriétés d’ionisation du peptide K27 réduisent sa visibilité par MS12.

Dans ce protocole, nous décrivons comment effectuer l’évaluation de topologie d’ubiquitine d’un échantillon biologique par PRM. Des données d’exemple pour la procédure sont présentées utilisant une perturbation du protéasome utilisant le traitement inhibiteur de MG-132 dans plusieurs types différents de cellules.

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Protocol

1. Préparation d’une norme de peptide lourd

  1. Selon le fournisseur et la qualité des peptides lourds achetés, les peptides lourds devront être dilués. Ce protocole utilisait les séquences peptidiques rapportées dans le tableau 1,l’acide aminé c-terminal ayant été modifié en Lysine(13C615N2-lysine) ou arginine(13C615N4-arginine).
    1. Mélanger les peptides lourds, diluer le mélange avec 50% d’acétylonitrile (ACN) pour créer un mélange de peptide avec chaque peptide à 10 μM.
    2. Créer des aliquots du mélange peptidique et les conserver à -80 °C.

2. Préparation de l’échantillon

  1. Exemple de lyse
    REMARQUE : La stabilité des chaînes d’ubiquitine doit être prise en compte lors de la préparation de l’échantillon. Gardez les échantillons biologiques et les tampons refroidis à 4 °C et ajoutez des échantillons au tampon de stabilisation de l’ubiquitine aussi rapidement que possible.
    1. Préparer une solution de 1 M NH4HCO3 (bicarbonate d’ammonium) dans l’eau et ajuster le pH à 8 à l’aide de 1 M NaOH.
    2. Préparer une solution de 200 mM N-éthylmaleimide (NEM) dans l’eau.
    3. Préparer le tampon de stabilisation de l’ubiquitine à l’aide de 8 M d’urée dans 50 mM NH4HCO3/10mM NEM. Le tampon de stabilisation ubiquitine doit être préparé fraîchement à chaque fois.
      REMARQUE : Une solution de 5 mL de 8 M d’urée nécessitera beaucoup moins de 5 mL d’eau étant donné l’expansion de l’eau lorsqu’elle est dans une solution saturée d’urée.
      ATTENTION: Ne préparez pas le tampon au-dessus de 50 °C en raison de la tendance de l’urée à former du polyurée à des températures élevées.
    4. Resuspendez l’échantillon biologique à étudier dans le tampon de stabilisation de l’ubiquitine visant 0,5 μg/μL de protéines et lyse les cellules avec une méthode appropriée pour l’échantillon. Une méthode de sonication composée de trois impulsions de 10 s avec un sonificateur SFX 150 Branson réglé à 70% d’intensité avec 10 ruptures de glace entre chaque impulsion, a été utilisée pour les lignées cellulaires dans ce protocole.
    5. Échantillon de centrifugeuse à 18 000 x g pendant 10 min à 4 °C dans une centrifugeuse de table.
    6. Transférer le supernatant dans un tube de microcentrifugeuse à faible teneur en protéines. Les échantillons peuvent être stockés à -20 °C à ce stade si nécessaire.
  2. Préparation de l’échantillon et des contrôles
    1. Si les échantillons sont congelés, mélanger (p. ex., à l’aide d’un thermomixeur) pendant qu’ils sont décongelés pour dissoudre rapidement l’urée.
      ATTENTION: N’utilisez pas de températures supérieures à 50 °C en raison de la tendance de l’urée à former du polyurée à des températures élevées.
    2. Échantillon de centrifugeuse à 18 000 x g pendant 10 min à 4 °C dans une centrifugeuse de table.
    3. Transférer 20 μg d’échantillon dans un tube de microcentrifugeuse fraîchement à faible liaison et ajuster le volume à 50 μL avec tampon de stabilisation de l’ubiquitine.
    4. Créez un contrôle négatif à l’aide d’un volume normalisé de tampon de stabilisation de l’ubiquitine (50 μL). Dans cet échantillon, aucune version légère de chaque peptide ne devrait être présente, permettant l’observation de toute contamination légère résultant des peptides lourds spike-in. Ce contrôle négatif a également été utilisé pour la planification du temps de rétention du PRM décrite à l’article 3.1.
    5. Un contrôle positif a également été créé avec le tampon de stabilisation de l’ubiquitine et l’ajout de types de chaîne disponibles dans le commerce au volume normalisé du tampon de stabilisation de l’ubiquitine (50 μL). Généralement, K63, K48, et M1 sont disponibles. Dans les résultats représentatifs 20 ng de K48, K63, et M1 ont été utilisés.
  3. Réduction, alkylation et digestion
    1. Préparer une solution de bicarbonate d’ammonium de 50 mM (NH4HCO3)dans l’eau et ajuster l’échantillon au pH = 8 avec 1 M NaOH.
    2. Une culture d’E. coli cultivée dans le bouillon LB a été centrifugée 5 000 x g pendant 5 min pour former une pastille, qui a ensuite été lavée 2x avec PBS avant la résuspension dans le tampon de stabilisation de l’ubiquitine à 5 μg/μL.
    3. Ajouter 1 μg de lysate E. coli à chaque échantillon et contrôler. Ce protocole utilise E. coli (DH10B), mais tout lysate complexe sans ubiquitine peut être utilisé. Notez que l’ubiquitine est commune à tous les eucaryotes.
      REMARQUE : L’utilisation d’une matrice de lysate E. coli réduit la perte de peptides due à l’adhérence non spécifique aux plastiques. Ceci est particulièrement visible dans le contrôle négatif ou des échantillons avec une teneur limitée en protéines et a un fort impact sur l’observation de K6312.
    4. Préparer une solution de tris (2 carboxyethyl) phosphine (TCEP) de 500 mM dans l’eau de qualité SP (la TNT peut être utilisée comme alternative).
    5. Réduire les échantillons et les contrôles par l’ajout du PTCE à une concentration finale de 50 mM. Vortex brièvement avant d’incuber pendant 30 min à température ambiante (RT). Si la TNT est utilisée, la température doit être élevée à 50 °C.
      ATTENTION: N’utilisez pas de températures supérieures à 50 °C en raison de la tendance de l’urée à former du polyurée à des températures élevées.
    6. Préparer une solution de chlorocétamide de 550 mM (CAA) en NH4HCO3. Stockez dans le noir.
    7. Alkylate les échantillons et les contrôles en ajoutant CAA à une concentration finale de 55 mM. Vortex brièvement avant d’incuber pendant 20 min à RT dans l’obscurité.
      REMARQUE : Caa est employé au lieu de l’iodoacetamide comme agent de réduction pour diminuer le risque d’une modification double de carbamidomethyl (114.0429) sur un résidu de lysine étant confondu avec une modification de -GG (114.0429)13.
    8. Ajouter l’endopeptidase LysC aux échantillons à un rapport de 1:25 (w/w) à la teneur en protéines. Incuber pendant 3 h à 37 °C.
    9. Diluer les échantillons et les contrôles avec 200 μL de 50 mM NH4HCO3 pH = 8 (1:5 v/v).
    10. Ajouter la trypsine aux échantillons à un rapport de 1:25 w/w à la teneur en protéines. Incuber pendant 12 h à 37 °C.
    11. Ajouter une solution d’acide formique (FA) de 10 % dans l’eau de qualité SP à un rapport v/v de 1:10 à chaque échantillon et contrôler l’échantillon. Vérifiez que le pH est <3) avant le nettoyage C18 et ajouter plus d’acide formique si nécessaire.
    12. À chaque échantillon et contrôle ajouter 0,5 μL de la norme peptidique lourde créée dans la section 1.
  4. Nettoyage peptidique
    1. Plusieurs fabricants offrent des conseils ou des assiettes de nettoyage C18. Suivez les instructions du fabricant pour le produit utilisé, et séchez les peptides élités dans une centrifugeuse sous vide, prête pour l’analyse de la SP.

3. Analyse par LC-MS/MS

  1. Exécutez l’analyse prm initiale sur la norme peptidique lourde d’une manière imprévue.
    1. Resuspendez les échantillons séchés dans 10 μL de tampon de chargement de SP 2 % d’acide trifluoroacétique ACN/0,05 % d’acide trifluoroacétique (AFE).
    2. Équipez un HPLC d’une colonne analytique de phase inverse C18 (75 μm x 15 cm, 2 μm 100 perles Å C18) conçue pour les gradients linéaires de nanoflow MS. Formez des gradients linéaires échangeant de l’eau de qualité MS complétée par 0,1 % de FA avec acn contenant 0,1 % de FA. Une colonne de piège sacrificielle (75 μm x 2 cm, 3 μm, 100 perles Å C18) pour préserver la durée de vie de la colonne analytique a été utilisée ici, mais n’est pas nécessaire.
    3. Couplez la sortie de la colonne analytique à une source nano-ESI sur un spectromètre de masse haute résolution.
    4. Utilisez une méthode protéomique ciblée appropriée pour le spectromètre de masse. Par exemple, sur un Q-Exactive plus une méthode de deux expériences, cycle entre une SEp complète et une expérience PRM. Pour l’expérience full MS, une résolution de 120 000 avec un objectif AGC de 1e6 et 240 ms comme IT maximum a été utilisée. Pour l’expérience PRM, la même cible AGC et le maximum de TI ont été utilisés avec une résolution inférieure de 60 000 et une fenêtre d’isolement de 1,2 m/z.
    5. Injectez 200 ng de contrôle négatif sur la colonne analytique à l’aide de l’autosampler HPLC. Appliquer un gradient linéaire à l’échantillon sur la colonne analytique, augmentant la concentration d’ACN de 2 à 25 % sur une période d’environ 45 min.
      REMARQUE : La concentration d’ACN de 25 % est plus faible que d’habitude pour la protéomique en raison de la faible nature hydrophilique des peptides typiques caractéristiques de la topologie de l’ubiquitine. Si d’autres peptides doivent être quantifiés, une concentration plus élevée d’ACN peut être souhaitée pour atteindre une bonne séparation de cible.
    6. Analyser les résultats de l’exécutement de planification tel que décrit à la section 4.2 pour créer une liste d’inclusion planifiée.
  2. Analyse des échantillons
    1. Exécutez les échantillons restants tels que décrits pour la planification en 3.1 en dehors de l’utilisation de la liste d’inclusion planifiée créée à la section 4.2.
      REMARQUE : Un blanc doit être exécuté après le contrôle positif pour s’assurer qu’aucun report de l’exécuter précédent n’est détecté dans les échantillons ultérieurs.

4. Analyse logicielle

  1. Créez une liste d’inclusion de mise en forme appropriée pour la SP utilisée. Ce protocole a utilisé le logiciel open source Skyline (version 19.1.0.193) (https://skyline.ms), qui offre un soutien et une aide bien documentés. Une liste d’inclusion peut être créée pour plusieurs spectromètres de masse à l’aide de l’installation de liste d’isolement des exportations.
    1. Ouvrez un nouveau document Skyline.
    2. Choisissez des modifications isotopiques lourdes, le cas échéant, aux peptides lourds caractéristiques de la topologie. Dans paramètres| Paramètres peptidique sous l’onglet Modification, cliquez sur le champ nom pour voir la modification potentielle. La sélection est basée sur l’état isotopique des peptides lourds achetés. Dans cet exemple, des peptides synthétiques transportant soit une lysine lourde(13C615N2-lysine) soit une arginine lourde(13C615N4-arginine) au C-terminus ont été utilisés. Les étiquettes appropriées seraient : « Étiquette : 13C(6)15N(2) (C-term K) » et « Label:13C(6)15N(4) (C-term R) ».
    3. Sélectionnez Paramètres| Transition. Sous l’onglet Filtre comprennent Les charges précurseurs 2, 3, 4.
    4. Insérez des peptides en sélectionnant Edit| Insérez| Peptides.
    5. Remplissez les champs pertinents, y compris la séquence peptidique caractéristique de la topologie et un nom protéique (p. ex., « Chaîne-K63 »).
    6. Élargissez chaque peptide maintenant indiqué dans le panneau Cibles. Supprimez les états de charge non désirés. L’état de charge préféré et l’énergie de collision, qui peuvent différer en fonction du spectromètre de masse utilisé, pour chaque peptide caractéristique de la topologie sont indiqués dans le tableau 1.
    7. Pour chaque peptide caractéristique de la topologie (à l’exception de M1 où le GG est inclus dans la séquence) cliquez à droite sur la séquence et sélectionnez Modifier. Ajouter un GG comme une modification structurelle en cliquant sur le champ de nom et la sélection <Afficher tousles ... > avant de sélectionner "GlyGly (K)« .
    8. Exporter la liste d’isolement Fichier| L’exportation| Liste d’isolement, sélectionnez le type d’instrument, et définissez le type de méthode à la norme. Sélection OK ouvrira une invite pour enregistrer un fichier *.csv qui peut être utilisé pour créer une méthode PRM.
  2. Créez une liste d’inclusion planifiée basée sur un lourd processus de planification peptidique expliqué ici à l’aide du logiciel Open source Skyline.
    1. Créez une liste de cibles telle que décrite à la section 4.1.
    2. Importez l’exécutement de planification en 3.1 en sélectionnant le fichier| L’importation| Résultats.
    3. Examinez les pièces d’identité. Le signal lourd pour chaque peptide est observable en cliquant sur la masse pour chaque entrée de peptide lourd. La reconnaissance correcte du pic est souvent déterminée automatiquement, mais le logiciel peut nécessiter une curation manuelle en sélectionnant le pic en utilisant le clic et la traînée sous l’axe x.
    4. Les temps de rétention sélectionnés pour les variantes lourdes sont également appliqués aux versions légères, créant ainsi un calendrier pour le PRM. La fenêtre de planification peut être modifiée sous Paramètres| Paramètres Peptide à l’aide de l’onglet Prédiction, en changeant la fenêtre de temps.
    5. Une liste d’inclusion planifiée peut maintenant être exportée à l’aide de File| L’exportation| Liste d’isolement et sélection du type d’instrument approprié et le type de méthode de réglage à scheduled.
  3. Analyser les données.
    1. Importez les échantillons de la même manière que pour l’analyse de l’exécutement de planification à la section 4.2.
    2. Après l’importation complète de tous les échantillons, la curation des transitions est recommandée. Il s’agit du processus par lequel les transitions avec des interférences ou de faibles rapports signal-bruit sont supprimées. Un exemple de chromatogramme avant et après la curation est indiqué dans la figure 4.
    3. Les données peuvent maintenant être exportées soit en cliquant à droite sur les graphiques pertinents et en sélectionnant les données copy, soit en sélectionnant le fichier| L’exportation| Résultats.

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Representative Results

Pour démontrer l’utilisation d’une analyse de chaîne d’ubiquitine par PRM, trois lignes cellulaires ont été choisies : une ligne de cellule de mélanome de souris B16, et les deux lignes communes de cellules humaines A549 (cellules épithéliales alvéolaires alvéolaires adénocaronomiques) et HeLa (cellules cancéreuses cervicales). Ces cultures sont passée à la phase médiane dans les médias appropriés avant d’être traitées avec 0, 10 ou 100 mM MG-132 pendant 4 h avant la récolte. MG-132 est un inhibiteur protéasome empêchant la dégradation des protéines conjuguées à l’ubiquitine par le protéasome14. Compte tenu de cela, il s’agit d’une condition d’essai appropriée pour démontrer l’analyse de la chaîne d’ubiquitine. L’augmentation qui en résulte dans la chaîne K48 se trouve à la figure 3. Le traitement inhibiteur du protéasome a entraîné une augmentation des chaînes K4815.

Tel que décrit dans l’introduction, contrairement à SRM ou MRM, PRM effectue un balayage complet de l’ion du produit après sélection de l’ion précurseur. Bien que cela signifie que les ions de produit n’ont pas besoin d’être spécifiés avant la course, ils doivent toujours être gérés après l’exécuter. La curation est le processus par lequel les transitions véritablement représentatives du peptide prévu sont sélectionnées. La figure 4 montre le chromatogramme iion du produit pour K48 avant et après la curation. Les ions produits qui ont un signal avec un profil d’élitution incohérent probablement dû à des interférences ont été supprimés. Des ions de produit de faible intensité ont alors été enlevés étant donné que le rapport signal-bruit est moins favorable à de telles transitions. Les transitions optimales sélectionnées lors de la curation seront généralement cohérentes entre les expériences, et peuvent différer selon le spectromètre de masse utilisé, les conditions chromatographiques, les paramètres d’analyse et le contexte biologique de l’échantillon. Ainsi, pour chaque enquête, une bonne curation des transitions est nécessaire. Un équilibre est également nécessaire entre l’inclusion d’un plus grand nombre de transitions et donc de répliques techniques et de données plus propres pour la quantification.

Les chromatogrammes d’ion typiques de produit pour chacune des topologies identifiées de chaîne d’ubiquitine dans cette expérience sont montrés dans la figure 5. K27 et K29 sont omis ici parce que dans ces conditions biologiques le signal était en dessous de la détection. Le profil d’élitution du K33 tel qu’il est indiqué ici était considérablement plus large que ce qui serait communément accepté pour l’analyse prm. Cependant, la sélection alternative des peptides avec de meilleurs profils d’élitution n’est pas possible dans l’analyse de chaîne d’ubiquitine et une interprétation doit être faite basée sur ce profil. Si K33 est d’un intérêt particulier, des conditions chromatographiques altérées peuvent améliorer la quantification de ce type de chaîne, mais probablement au détriment d’autres types de chaînes.

Lors de la conception d’une expérience PRM, il est préférable de maximiser le signal des ions du produit utilisés pour la quantification en augmentant le signal au bruit. L’optimisation de l’énergie de collision (c.-à-d. l’énergie utilisée par le spectromètre de masse pour fragmenter les ions peptides précurseurs aux ions du produit) est un moyen d’améliorer le signal16. Une plage d’énergie de collision de 14 à 28 a été appliquée aux injections répétées d’un seul échantillon avec les zones de pointe observées résultantes de K63 et M1 indiquées à la figure 6. Comme on peut le voir, pour K63 une énergie de collision plus élevée de 26 était optimale, tandis que pour M1 une énergie inférieure de 18 était idéale. L’énergie de collision pour chaque peptide caractéristique de la topologie et une sélection de fragments d’ubiquitine non modifiés sont indiquées dans le tableau 1. Ces énergies de collision peuvent devoir être optimisées en fonction du spectromètre de masse et de la méthode de fragmentation utilisée.

Figure 1
Figure 1 : Représentation schématique de la cascade conjuguée à l’ubiquitine. L’ubiquitine est d’abord liée par une enzyme E1 d’une manière dépendante de l’ATP. L’ubiquitine activée est ensuite transférée à une enzyme E2 qui est ensuite rejointe par un E3-ligase pour transférer l’ubiquitine à la protéine du substrat. Ce processus est répété plusieurs fois jusqu’à ce qu’une chaîne d’ubiquitine soit formée sur la protéine du substrat. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Diagramme montrant la dérivation du peptide caractéristique de la topologie de l’ubiquitine. Digestion post-tryptique le site de liaison en amont est dérivé avec le -GG C-terminal de l’ubiquitine en aval attaché. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Comparaison de la chaîne K48 sous traitement MG-132 pour une lignée cellulaire de souris B16 et les deux lignées cellulaires humaines A459 et HeLa. Dans l’A459, l’augmentation des concentrations de MG-132 a conduit à la stabilisation des chaînes K48. Avec les cellules B16 et HeLa, une augmentation a été observée sous traitement avec 10 mM ou 100 mM MG-132. La diminution observée de 10 mM à 100 mM peut s’expliquer par la sensibilité accrue des cellules B16 et HeLa à MG-132, conduisant à la mort cellulaire. Les barres d’erreur affichent l’écart type des transitions. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Chromatogrammes iion du peptide caractéristique de la topologie M1 avant et après la curation des transitions pour interférence ou faible intensité. Le temps de rétention sur l’axe x est indiqué en quelques minutes. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Chromatogramme d’ion typique de divers peptides caractéristiques de la topologie ainsi que deux peptides d’ubiquitine non modifiés. Le temps d’élitution en quelques minutes et l’erreur de masse observée pour chaque peptide sont signalés au-dessus de l’apogée du pic pertinent. Les lignes pointillées montrent également la fenêtre pour la détermination de la zone de pointe. Le temps de rétention sur l’axe x est indiqué en quelques minutes. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Zone de pointe observée pour K63 et M1 au cours d’une série d’énergies de collision normalisées. Les différentes couleurs représentent l’intensité iration de chaque transition. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Type de chaîne Peptide caractéristique de topologie État de charge Énergie de collision normalisée
K06 (en) MQIFVK[GG]TLTGK 3 18
K11 (K11) TLTGK[GG]TITLEVEPSDTIENVK 3 18
K27 (K27) TITLEVEPSDTIENVK 3 18
K29 (K29) AK[GG]IQDK 2 22
K33 (K33) IQDK[GG]EGIPPDQQR 3 18
K48 (en) LIFAGK[GG]QLEDGR 3 24
K63 (en) TLSDYNIQK[GG]ESTLHLVLR 4 26
M1 (linéaire) GGMQIFVK GGMQIFVK 2 18
Ubqiuitin non modifié ESTLHLVLR ESTLHLVLR 2 26
Ubqiuitin non modifié TITREVEPSDTIENVK 2 18
Ubqiuitin non modifié TLSDYNIQK TLSDYNIQK 2 18

Tableau 1 : Séquences pour les peptides caractéristiques de la topologie de l’ubiquitine humaine, état de charge le plus observable et énergie de collision normalisée favorable.

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Discussion

L’analyse de l’état d’ubiquitine dans un protéome est d’une importance croissante pour une grande variété de questions biologiques. La description de l’état d’ubiquitination d’un échantillon doit se concentrer non seulement sur le profil des protéines étant ubiquitinées, mais aussi sur la topologie d’une telle ubiquitination. L’évaluation de cette topologie par SP ciblée, telle que décrite ici, a un rôle à jouer dans un large éventail d’études biologiques.

Il faut comprendre que le protocole décrit ici fournit un profil topologie global. L’utilisation d’une approche protéomique ascendante permet de déterminer les peptides qui étaient ubiquitinated, y compris les peptides d’ubiquitine. L’observation de l’ubiquitination des peptides d’ubiquitine permet la détermination de la topologie de chaîne, mais le lien à la cible de l’ubiquitine est perdu. Ainsi, la topologie de chaîne particulière sur n’importe quelle protéine donnée ne peut pas être déterminée, mais un profil global de topologie est dérivé. La méthode peut également être combinée à une stratégie d’enrichissement pour fournir des résultats plus ciblés. Un tel enrichissement doit tenir compte de la stabilité de la chaîne et de l’abondance des chaînes après enrichissement. La détection de la topologie de la chaîne est limitée par la pureté de la stratégie d’enrichissement, car il n’est pas possible de distinguer une topologie d’ubiquitine liée à une protéine contaminante de celle liée à la protéine d’intérêt. L’étape critique de ce protocole, facilitant une analyse réussie, est l’équilibre de la préservation de la chaîne d’ubiquitine tout en digérant la protéine d’ubiquitine. Ceci est difficile en raison de la propension de la rupture de chaîne couplée à la résistance de l’ubiquitine elle-même à la digestion enzymatique. De plus, l’ajout d’une matrice de soutien et l’examen attentif des affections de sp sont nécessaires étant donné la nature moins favorable de certains peptides caractéristiques de la topologie à l’analyse spectrométrique de masse couplée chromatographique liquide.

Bien que nous avons décrit dans ce protocole un moyen par lequel tous les types de chaîne d’ubiquitine peuvent être évalués simultanément, il est également possible d’ajuster plusieurs aspects du protocole en fonction de la topologie de chaîne particulière d’intérêt. La manipulation des conditions chromatographiques ou la variation des fortes concentrations de peptides peuvent augmenter la précision d’une enquête, améliorer les résultats d’une topologie de chaîne particulière et adapter l’enquête à la question biologique proposée.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Acknowledgments

Les auteurs remercient Céline Jeanty pour son aide dans la création de granulés cellulaires avec traitement du MG-132 tel que décrit dans les résultats représentatifs et Elise Mommaerts pour sa fourniture de granulés E. coli utilisés dans le protocole.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile (ACN) Merck 100029
Ammonium bicarbonate (ABC) Fluka 9830
Centrifuge Beckman Coulter Microfuge 16
Chloroacetamide (CAA) Sigma 22790
Eppendorf LoBind Eppendorf 22431081
Formic acid (FA) Thermo Fisher Scientific 85178
Heavy Peptides JPT Peptide Technologies
HPLC Dionex Ulitimate 3000
LC Column Thermo Fisher Scientific 160321
Lys C Wako 125-05061
Mass Spectrometer Thermo Fisher Scientific Q-Exactive Plus
N-ethylmaleimide (NEM) ACROS Organics 156100050
Positive Control Chain K48 Boston Biochem UC-240
Positive Control Chain K63 Boston Biochem UC-340-100
Positive Control Chain M1 Boston Biochem UC-710B-025
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma S5881
Sonifier Branson sonifier SFX 150
Thermomixer Eppendorf Thermomixer Comfort
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigam T6508
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) Thermo Fisher Scientific 77720
Trypsin Promega V1511A
Urea Sigma 51456
Waters μElution C18 plates Waters 186002318

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References

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Biochimie Numéro 160 ubiquitine chaîne spectrométrie de masse surveillance des réactions parallèles (PRM) protéomique ciblée posttranslationnelle modification topologie
Analyse en chaîne de l’ubiquitine par surveillance parallèle des réactions
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Longworth, J., Mendes, M. L.,… More

Longworth, J., Mendes, M. L., Dittmar, G. Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring. J. Vis. Exp. (160), e60702, doi:10.3791/60702 (2020).

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