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Biochemistry

Ubiquitin-Kettenanalyse durch Parallelreaktionsüberwachung

Published: June 17, 2020 doi: 10.3791/60702
Automatic Translation
1, 1, 1
1Quantitative Biology Unit, Luxembourg Institute of Health

Summary

Diese Methode beschreibt die Bewertung globaler Veränderungen in der Ubiquitin-Kettentopologie. Die Bewertung erfolgt durch die Anwendung eines auf Massenspektrometrie basierenden zielgerichteten Proteomik-Ansatzes.

Abstract

Die Bewertung des globalen Profils von Ubiquitin-Kettentopologien innerhalb eines Proteoms ist von Interesse, um eine Vielzahl biologischer Fragen zu beantworten. Das hier skizzierte Protokoll nutzt die Di-Glylyin-Modifikation (-GG), die nach der tryptischen Verdauung von Ubiquitin in einer Kette zurückgelassen wurde. Durch quantifizieren diese topologie-charakteristischen Peptide kann die relative Häufigkeit jeder Ubiquitin-Kettentopologie bestimmt werden. Die Schritte, die erforderlich sind, um diese Peptide durch ein paralleles Reaktionsüberwachungsexperiment zu quantifizieren, werden unter Berücksichtigung der Stabilisierung von Ubiquitinketten berichtet. Die Vorbereitung von schweren Kontrollen, Zelllyse und Verdauung werden zusammen mit dem entsprechenden Massenspektrometer-Setup und Datenanalyse-Workflow beschrieben. Ein Beispieldatensatz mit Störungen in der Ubiquitin-Topologie wird vorgestellt, begleitet von Beispielen, wie sich die Optimierung des Protokolls auf die Ergebnisse auswirken kann. Durch Befolgen der beschriebenen Schritte kann ein Benutzer eine globale Bewertung der Ubiquitin-Topologie-Landschaft in seinem biologischen Kontext durchführen.

Introduction

Die enge Regulierung der Proteinfunktion und -stabilität ist von größter Bedeutung, da sie wichtige Treiber der phätotypischen Kontrolle der Biologie sind. Die Funktion eines Proteins besteht aus zwei Komponenten: seiner intrinsischen Polypeptidsequenz und allen posttranslationalen Modifikationen (PTMs). Verschiedene chemische PTMs wurden identifiziert, einschließlich Glykosylierung, Phosphorylierung, Acetylierung und Methylierung1. 1975 identifizierten Goldstein et al.2 ein kleines Protein und nannten es aufgrund seiner allgegenwärtigen Natur Ubiquitin. Ubiquitin erwies sich als wichtig für den Proteinabbau3. Seitdem steht jedoch fest, dass die Funktion von Ubiquitin als Signalmolekül weit über die Regulierung der Proteinstabilität hinausgeht. Ubiquitin Signalisierung ist in einer Vielzahl von anderen biologischen Funktionen beteiligt, wie Proteinstabilisierung, Autophagie, Zellzykluskontrolle, und Proteinhandel4.

Während andere PTMs im Allgemeinen binär sind (d. h., das Protein wird modifiziert oder unverändert gelassen) für eine bestimmte Stelle, kann Ubiquitin ein Protein sowohl als Monomer oder als polymere Kette modifizieren, wobei das angefügte Ubiquitin selbst ubiquitiniert ist. Darüber hinaus kann sich diese Polyubiquitinationskette in mehreren Topologien mit der Ubiquitination des vorherigen Ubiquitins entwickeln, das an einer von acht Verknüpfungsstellen5,6anhängt. Ubiquitin wird durch einen mehrstufigen enzymatischen Prozess übertragen (Abbildung 1), bei dem der C-Terminus von Ubiquitin mit einem seiner sieben Lysinrückstände (K06, K11, K27, K29, K33, K48 oder K63) oder dem N-Terminal des vorherigen Ubiquitins (als M1 oder lineare Ubiquitination bezeichnet)5,6verbunden ist. Diese Kettentopologie ist der Schlüssel zum Schicksal des Proteins, das verändert wird. Beispielsweise führt die Modifikation mit einer K48 oder K11-Verbindungskette zum Abbau des modifizierten Proteins am Proteasom, während eine lineare Kette für die Aktivierung der NF-kB-Signalisierung notwendig ist. Daher ist die relative Verteilung dieser Kettentopologien für eine Vielzahl biologischer Fragen relevant.

Die Verwendung der Massenspektrometrie (MS) ist von besonderem Nutzen für die Analyse der Ubiquitin-Kettentopologie, da sie nicht auf antikörperbasierte oder affinitätsbasierte Wechselwirkungen7,8angewiesen ist, von denen viele eine begrenzte Spezifität aufweisen und nicht zwischen den verschiedenen Kettentypen unterscheiden. Eine andere Nachweismöglichkeit besteht darin, genetisch veränderte Ubiquitin-Mutationen zu verwenden. Hier wird ein bestimmtes Lysin gegen Arginin ausgetauscht, das die Modifikation durch Ubiquitin nicht unterstützen kann. Der Mangel an Ubiquitin-Kettenbildung auf dem Substratprotein wird dann als Beweis für eine spezifische Topologieinterpretiert 9.

Die MS-basierte Identifizierung ubiquitinierter Proteine basiert auf der Tatsache, dass der C-Terminus von Ubiquitin einen Argininrückstand in Position 74 enthält, der von Trypsin während der proteolytischen Vorbereitung der Proben für die MS-Analyse erkannt wird und das C-terminale Doppelglycin trennt. Dieses GlyGly (-GG) bleibt an der ε-Amino-Gruppe des Lysinrückstands des Substratproteins befestigt. Für die Ubiquitin-Topologie-Analyse erfolgt die Modifikation an einem der sieben Lysinrückstände von Ubiquitin. Dadurch wird ein Satz von sieben Schlüsselpeptiden erstellt, die einen Lysinrückstand tragen, der durch GG modifiziert wird, spezifisch für jede der Topologien (Abbildung 2). Bei der K06-Topologie wird beispielsweise das Lysin an Position 6 der Aminosäuresequenz mit einer -GG-Modifikation von 114 Da, die diesem Lysin zugesetzt wird, vor tryptischer Verdauung geschützt.

Die Identifizierung spezifischer vorbestimmter Peptide durch MS wird als gezielte Proteomik oder genauer gesagt als gezielte Peptidakquise10bezeichnet. Je nach Leistung des verwendeten Massenspektrometers wurden zwei Methoden entwickelt. Dabei handelt es sich um ausgewählte Reaktionsüberwachung (SRM), auch als Multiple Reaction Monitoring (MRM) und als parallele Reaktionsüberwachung (PRM) bezeichnet. SRM umfasst die Auswahl von Übergängen, die aus dem Vorläufer m/z und dem Produkt ion m/z bestehen. Umgekehrt benötigt PRM nur den Vorläufer m/z. Nach der Auswahl wird ein vollständiger Vermessungscan der Produktionen durchgeführt. Dies hat den Vorteil, dass vor der Messung11keine Auswahl geeigneter Produktionen zur Quantifizierung auf dem spezifischen Massenspektrometer erforderlich ist. Sowohl SRM als auch PRM können je nach Instrument geplant werden. Die Terminplanung ist die Praxis der Zuweisung eines Zeitfensters, in dem ein bestimmtes Ion zur Analyse einbezogen wird, da Peptide zu definierten Retentionszeiten aus dem chromatographischen System eluieren. Die Verringerung der Anzahl der zu einem bestimmten Zeitpunkt verhörten Ionen erhöht die Häufigkeit der Abfrage der zu diesem Zeitpunkt geplanten Ionen und verbessert so die Datengenauigkeit.

Im Allgemeinen ist die Anwendung der gezielten Proteomik für die Ubiquitin-Topologie die gleiche wie bei jedem anderen gezielten Proteomik-Experiment. Zwei wesentliche Unterschiede sind jedoch wichtig: Erstens muss die Stabilität von Ubiquitinketten berücksichtigt werden. Es gibt mehrere potente deubiquitinierende Enzyme (DUBs), die Ketten bei der Zelllyse schnell abbauen. Die ubiquitinspezifischen Proteasen lassen sich in zwei Kategorien einteilen: die Thioesterasen und die Metalloproteasen. Die meisten Der Ubiquitin-Hydrolasen sind Thioesterasen und tragen einen Cystein-Rückstand in ihrem aktiven Zentrum. Durch Alkylierung dieses Cysteinrückstandes können sie inaktiviert werden. Daher ist die Verwendung von Ubiquitin-Stabilisierungspuffern, die Alkylierungsmittel wie N-Ethylmaleimid (NEM) und hochdenaturierende Chemikalien enthalten, und die Kühlung von Proben von entscheidender Bedeutung für eine erfolgreiche Analyse. Zweitens ist die Peptidauswahl im Gegensatz zu anderen gezielten Experimenten fixiert. In einem typischen gezielten Experiment kann ein proteotypisches Peptid für eine gute chromatographische und ionisationsleistung ausgewählt werden. Für einige Topologie-charakteristische Peptide wie K48 sind diese Eigenschaften gut, während sie für andere weniger wünschenswert sind. Beispielsweise ist die K33-Chromatographie in einem typischen Reverse-Phase-Setup aufgrund der Bildung eines gestreckten Elutionsprofils schlecht, und die schlechten Ionisationseigenschaften des K27-Peptids reduzieren seine Sichtbarkeit um MS12.

In diesem Protokoll beschreiben wir, wie die Ubiquitin-Topologie-Bewertung einer biologischen Probe durch PRM durchgeführt wird. Beispieldaten für das Verfahren werden mit einer Störung des Proteasommittels mittels MG-132-Inhibitorbehandlung in verschiedenen Zelltypen dargestellt.

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Protocol

1. Herstellung eines schweren Peptidstandards

  1. Je nach Lieferant und Qualität der gekauften schweren Peptide müssen die schweren Peptide verdünnt werden. Dieses Protokoll verwendete die in Tabelle 1berichteten Peptidsequenzen, wobei die C-terminale Aminosäure zu Lysin (13C615N2-lysin) oder Arginin (13C615N4-arginin) modifiziert wurde.
    1. Mischen Sie die schweren Peptide, verdünnen Sie die Mischung mit 50% Acetonitril (ACN), um eine Peptidmischung mit jedem Peptid bei 10 M zu erstellen.
    2. Aliquots des Peptid-Mixes erstellen und bei -80 °C lagern.

2. Probenvorbereitung

  1. Beispiellyse
    HINWEIS: Die Stabilität von Ubiquitinketten muss bei der Probenvorbereitung berücksichtigt werden. Biologische Proben und Puffer bei 4 °C gekühlt aufbewahren und Proben so schnell wie möglich in den Ubiquitin-Stabilisierungspuffer aufnehmen.
    1. Bereiten Sie eine Lösung von 1 M NH4HCO3 (Ammoniumbicarbonat) in Wasser vor und stellen Sie den pH-Wert mit 1 M NaOH auf 8 ein.
    2. Bereiten Sie eine Lösung von 200 mM N-Ethylmaleimid (NEM) in Wasser vor.
    3. Bereiten Sie den Ubiquitin-Stabilisierungspuffer mit 8 M Harnstoff in 50 mM NH4HCO3/10 mM NEM vor. Ubiquitin-Stabilisierungspuffer muss jedes Mal frisch zubereitet werden.
      HINWEIS: Eine 5 ml Lösung von 8 M Harnstoff benötigt bei der Ausdehnung des Wassers in einer gesättigten Lösung mit Harnstoff deutlich weniger als 5 ml Wasser.
      VORSICHT: Bereiten Sie den Puffer nicht über 50 °C vor, da Harnstoff bei hohen Temperaturen zu Polyurea neigt.
    4. Setzen Sie die biologische Probe, die im Ubiquitin-Stabilisierungspuffer untersucht werden soll, mit dem Ziel von 0,5 g/l Protein, und limieren Sie die Zellen mit einer geeigneten Methode für die Probe. Für die Zelllinien in diesem Protokoll wurde eine Beschallungsmethode mit drei 10 s Impulsen mit einem SFX 150 Branson Sonifier mit 70% Intensität und 10 s Brüchen auf Eis zwischen jedem Puls verwendet.
    5. Zentrifugenprobe bei 18.000 x g für 10 min bei 4 °C in einer Tischzentrifuge.
    6. Überstand auf ein frisches, proteinarmes Mikrozentrifugenrohr übertragen. Proben können bei Bedarf bei -20 °C gelagert werden.
  2. Vorbereitung von Proben und Kontrollen
    1. Wenn die Proben eingefroren sind, mischen Sie (z.B. mit einem Thermomixer), während sie aufgetaut werden, um den Harnstoff schnell aufzulösen.
      VORSICHT: Verwenden Sie keine Temperaturen über 50 °C aufgrund der Tendenz von Harnstoff, Bei hohen Temperaturen Polyurea zu bilden.
    2. Zentrifugenprobe bei 18.000 x g für 10 min bei 4 °C in einer Tischzentrifuge.
    3. Übertragen Sie 20 g Probe in ein frisches, bindendes Mikrozentrifugenrohr und stellen Sie das Volumen mit dem Ubiquitin-Stabilisierungspuffer auf 50 l ein.
    4. Erstellen Sie einen negativen Kontrollwert mit einem normalisierten Volumen des Ubiquitin-Stabilisierungspuffers (50 l). In dieser Probe sollte keine leichte Version jedes Peptids vorhanden sein, so dass eine leichte Kontamination durch die spike-in schweren Peptide beobachtet werden kann. Diese negative Kontrolle wurde auch für die Aufbewahrungszeitplanung des in Abschnitt 3.1 beschriebenen PRM verwendet.
    5. Eine positive Steuerung wurde auch mit dem Ubiquitin-Stabilisierungspuffer und der Zugabe kommerziell erhältlicher Kettentypen zum normalisierten Volumen des Ubiquitin-Stabilisierungspuffers (50 l) geschaffen. Häufig sind K63, K48 und M1 verfügbar. In den repräsentativen Ergebnissen wurden 20 ng von K48, K63 und M1 verwendet.
  3. Reduktion, Alkylierung und Verdauung
    1. Bereiten Sie eine Lösung von 50 mM Ammoniumbicarbonat (NH4HCO3) in Wasser vor und stellen Sie die Probe mit 1 M NaOH auf pH = 8 ein.
    2. Eine Kultur von E. coli, die in LB-Brühe angebaut wurde, wurde 5.000 x g für 5 min zentrifugiert, um ein Pellet zu bilden, das dann 2x mit PBS gewaschen wurde, bevor es im Ubiquitin-Stabilisierungspuffer bei 5 g/l wieder aufsuspension wurde.
    3. Fügen Sie jeder Probe und Kontrolle 1 g E. coli Lysat hinzu. Dieses Protokoll verwendet E. coli (DH10B), aber jedes komplexe Lysat ohne Ubiquitin kann verwendet werden. Beachten Sie, dass Ubiquitin allen Eukaryoten gemeinsam ist.
      HINWEIS: Die Verwendung einer E. coli Lysat-Matrix reduziert den Verlust von Peptiden aufgrund der unspezifischen Haftung an Kunststoffen. Dies ist besonders auffällig bei der Negativkontrolle oder bei Proben mit begrenztem Proteingehalt und hat einen starken Einfluss auf die Beobachtung von K6312.
    4. Bereiten Sie eine Lösung aus 500 mM Tris(2-Carboxyethyl)phosphin (TCEP) in MS-Wasser (DTT kann als Alternative verwendet werden).
    5. Reduzieren Sie die Proben und Kontrollen durch Zugabe von TCEP auf eine Endkonzentration von 50 mM. Wirbel kurz vor der Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur (RT). Bei Verwendung von DTT muss die Temperatur auf 50 °C erhöht werden.
      VORSICHT: Verwenden Sie keine Temperaturen über 50 °C aufgrund der Tendenz von Harnstoff, Bei hohen Temperaturen Polyurea zu bilden.
    6. Bereiten Sie eine Lösung von 550 mM Chloroacetamide (CAA) in NH4HCO3vor. Im Dunkeln lagern.
    7. Alkyliern Sie die Proben und Kontrollen, indem Sie CAA zu einer Endkonzentration von 55 mM hinzufügen. Wirbel kurz vor der Inkubation für 20 min bei RT im Dunkeln.
      HINWEIS: CAA wird anstelle von Iodoacetamid als Reduktionsmittel verwendet, um die Wahrscheinlichkeit einer doppelten Carbamidmethylmodifikation (114.0429) an einem Lysinrückstand zu verringern, der mit einer -GG-Modifikation verwechselt wird (114.0429)13.
    8. Fügen Sie endopeptidase LysC zu den Proben bei 1:25 (w/w) Verhältnis zum Proteingehalt hinzu. 3 h bei 37 °C inkubieren.
    9. Verdünnen Sie die Proben und Kontrollen mit 200 l von 50 mM NH4HCO3 pH = 8 (1:5 v/v).
    10. Fügen Sie Trypsin den Proben im Verhältnis 1:25 w/w zum Proteingehalt hinzu. 12 h bei 37 °C inkubieren.
    11. Fügen Sie 10% Ameisensäure (FA) Lösung in MS-Grade-Wasser in einem Verhältnis von 1:10 v/v zu jeder Probe und Kontrollprobe hinzu. Überprüfen Sie, ob der pH-Wert <3) vor der C18-Bereinigung ist, und fügen Sie bei Bedarf weitere Ameisensäure hinzu.
    12. Zu jeder Probe und Kontrolle fügen Sie 0,5 l des schweren Peptidstandards hinzu, der in Abschnitt 1 erstellt wurde.
  4. Peptid-Reinigung
    1. Mehrere Hersteller bieten C18 Reinigungsspitzen oder Platten an. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für das verwendete Produkt und trockene eluierte Peptide in einer Vakuumzentrifuge, die für die MS-Analyse bereit ist.

3. Analyse durch LC-MS/MS

  1. Führen Sie eine erste PRM-Analyse auf den schweren Peptidstandard in einer ungeplanten Weise durch.
    1. Setzen Sie die getrockneten Proben in 10 l MS-Ladepuffer 2% ACN/0,05% Trifluoressigsäure (TFA) wieder auf.
    2. Rüsten Sie einen HPLC mit einer Analysesäule der Kehrphase C18 (75 x 15 cm, 2 m 100 c18 Perlen) für Nanofluss MS aus. Bilden Sie lineare Gradienten, die MS-Wasser austauschen, ergänzt mit 0,1% FA mit ACN mit 0,1% FA. Hier wurde eine Opferfalle-Säule (75 x 2 cm, 3 m, 100 c18 Perlen) verwendet, um die Lebensdauer der analytischen Säule zu erhalten, ist aber nicht erforderlich.
    3. Koppeln Sie die Ausgabe der analytischen Säule mit einer Nano-ESI-Quelle auf einem hochauflösenden Massenspektrometer.
    4. Verwenden Sie eine geeignete gezielte Proteomik-Methode für das Massenspektrometer. Beispiel: Bei einer Q-Exactive plus einer Zwei-Experiment-Methode zwischen einem Full MS und einem PRM-Experiment. Für das Full MS-Experiment wurde eine Auflösung von 120.000 mit einem AGC-Ziel von 1e6 und 240 ms als Maximale IT verwendet. Für das PRM-Experiment wurde das gleiche AGC-Ziel und die maximale IT mit einer niedrigeren Auflösung von 60.000 und einem Isolationsfenster von 1,2 m/z verwendet.
    5. Mit dem HPLC-Autosampler 200 ng der Negativkontrolle in die analytische Säule injizieren. Wenden Sie einen linearen Gradienten auf die Probe auf die analytische Spalte an, wodurch die ACN-Konzentration über einen Zeitraum von 45 min von 2–25 % erhöht wird.
      HINWEIS: Die 25% ACN-Konzentration ist niedriger als üblich für Proteomik aufgrund der geringen hydrophilen Natur der typischen Ubiquitin-Topologie-charakteristischen Peptide. Wenn andere Peptide quantifiziert werden sollen, kann eine höhere ACN-Konzentration gewünscht werden, um eine gute Zieltrennung zu erreichen.
    6. Analysieren Sie die Ergebnisse des Planungslaufs wie in Abschnitt 4.2 beschrieben, um eine Liste mit geplanter Einschlussaufnahme zu erstellen.
  2. Analyse der Proben
    1. Führen Sie die verbleibenden Beispiele, wie für die Planung in 3.1 beschrieben, aus, abgesehen von der Verwendung der in Abschnitt 4.2 erstellten Liste für geplante Einschlusse.
      HINWEIS: Nach dem Positivsteuerelement muss ein Leerzeichen ausgeführt werden, um sicherzustellen, dass in nachfolgenden Stichproben keine Übertragung vom vorherigen Lauf erkannt wird.

4. Softwareanalyse

  1. Erstellen Sie eine Einschlussliste mit geeigneten Formatierungen für die verwendete MS. Dieses Protokoll verwendet die Open-Source-Software Skyline (Version 19.1.0.193) (https://skyline.ms), die gut dokumentierte Unterstützung und Hilfe bietet. Mithilfe der Exportisolationslistenfunktion kann eine Einschlussliste für mehrere Massenspektrometer erstellt werden.
    1. Öffnen Sie ein neues Skyline-Dokument.
    2. Wählen Sie schwere Isotopenmodifikationen entsprechend schweren Topologie-charakteristischen Peptiden aus. In den Einstellungen| Peptideinstellungen unter der Registerkarte Änderung, klicken Sie auf das Namensfeld, um die mögliche Änderung zu sehen. Die Auswahl basiert auf dem Isotopenzustand der gekauften schweren Peptide. In diesem Beispiel wurden synthetische Peptide verwendet, die entweder ein schweres Lysin (13C615N2-lysin) oder ein schweres Arginin (13C615N4-arginin) am C-Terminus trugen. Geeignete Bezeichnungen wären: "Label:13C(6)15N(2) (C-term K)" und "Label:13C(6)15N(4) (C-term R)".
    3. Wählen Sie Einstellungen aus| Übergang. Unter der Registerkarte Filter enthalten Precursor Charges 2, 3, 4.
    4. Peptide einfügen, indem Sie Bearbeiten auswählen| Einfügen| Peptide.
    5. Füllen Sie die relevanten Felder einschließlich der topologie-charakteristischen Peptidsequenz und eines Proteinnamens (z. B. "Chain–K63") aus.
    6. Erweitern Sie jedes Peptid, das jetzt im Bedienfeld "Ziele" angezeigt wird. Löschen Sie unerwünschte Ladezustände. Der bevorzugte Ladezustand und die Kollisionsenergie, die je nach verwendetem Massenspektrometer unterschiedlich sein können, ist für jedes topologiecharakteristische Peptid in Tabelle 1dargestellt.
    7. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Sequenz und wählen Sie Ändern. Fügen Sie ein GG als strukturelle Änderung hinzu, indem Sie auf das Namensfeld klicken und <Alle anzeigenauswählen ... > bevor Sie "GlyGly (K)" auswählen.
    8. Exportieren Sie die Isolationsliste Datei| Export| Isolationsliste, wählen Sie den Instrumententyp aus, und legen Sie den Methodentyp auf Standardfest. Wenn Sie OK auswählen, wird eine Eingabeaufforderung zum Speichern einer *.csv Datei geöffnet, die zum Erstellen einer PRM-Methode verwendet werden kann.
  2. Erstellen Sie eine geplante Inklusionsliste basierend auf einem schweren Peptid-Scheduling-Lauf, der hier mit der Open-Source-Skyline-Software erläutert wird.
    1. Erstellen Sie eine Zielliste, wie in Abschnitt 4.1 beschrieben.
    2. Importieren Sie den Planungslauf in 3.1, indem Sie Datei auswählen| Import| Ergebnisse.
    3. Überprüfen Sie die Kennungen. Das schwere Signal für jedes Peptid ist beobachtbar, indem man auf die Masse für jeden schweren Peptideintrag klickt. Die korrekte Erkennung der Spitze wird oft automatisch bestimmt, aber die Software kann eine manuelle Kuration erfordern, indem Sie die Spitze per Klick und Ziehen unter der x-Achse auswählen.
    4. Retentionszeiten, die für die schweren Varianten ausgewählt wurden, werden auch auf die Lichtversionen angewendet, wodurch ein Zeitplan für das PRM erstellt wird. Das Planungsfenster kann unter Einstellungen geändert werden| Peptideinstellungen mithilfe der Registerkarte Vorhersage, indem Sie das Zeitfensterändern.
    5. Eine geplante Einschlussliste kann nun mit File exportiert werden| Export| Isolationsliste und Auswahl des entsprechenden Instrumententyps und Einstellungsmethodentyps auf Geplant.
  3. Analysieren Sie die Daten.
    1. Importieren Sie die Stichproben auf die gleiche Weise wie für die Planungslaufanalyse in Abschnitt 4.2.
    2. Nach dem vollständigen Import aller Proben wird die Kuration der Übergänge empfohlen. Dies ist der Prozess, durch den Übergänge mit Interferenzen oder schlechten Signal-Rausch-Verhältnissen entfernt werden. Ein Beispiel für ein Chromatogramm vor und nach der Kuration ist in Abbildung 4dargestellt.
    3. Die Daten können nun entweder exportiert werden, indem Sie mit der rechten Maustaste auf relevante Diagramme klicken und Daten kopieren auswählen oder indem Sie Datei auswählen| Export| Ergebnisse.

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Representative Results

Um die Verwendung einer Ubiquitin-Kettenanalyse durch PRM zu demonstrieren, wurden drei Zelllinien ausgewählt: eine Mausmelanom-Zelllinie B16 und die beiden gemeinsamen menschlichen Zelllinien A549 (adenokarcinomische alveolische Alveolar-Basthelialzellen) und HeLa (Gebärmutterhalskrebszellen). Diese Kulturen wuchsen bis zur midexponentiellen Phase in geeigneten Medien, bevor sie mit 0, 10 oder 100 mM MG-132 für 4 h vor der Ernte behandelt wurden. MG-132 ist ein Proteasomen-Inhibitor, der den Abbau von ubiquitinkonjugierten Proteinen durch das Proteasom14verhindert. Angesichts dieser Tatsache ist es eine geeignete Testbedingung, um eine Ubiquitin-Kettenanalyse nachzuweisen. Die daraus resultierende Zunahme der K48-Kette ist in Abbildung 3zu sehen. Die Behandlung mit Proteasomen-Inhibitoren führte zu einer Erhöhung der K48-Ketten15.

Wie in der Einleitung beschrieben, führt PRM im Gegensatz zu SRM oder MRM einen vollständigen Produktionenscan nach Auswahl des Vorläuferions durch. Dies bedeutet zwar, dass Produktionen nicht vor dem Lauf angegeben werden müssen, aber sie sollten dennoch nach dem Lauf kuratiert werden. Kuration ist der Prozess, durch den Übergänge wirklich repräsentativ für das beabsichtigte Peptid ausgewählt werden. Abbildung 4 zeigt das Produkt Ionenchromatogramm für K48 vor und nach der Kuration. Produktionen, die ein Signal mit einem inkonsistenten Elutionsprofil haben, das wahrscheinlich auf Interferenzen zurückzuführen ist, wurden entfernt. Die Produktionen mit niedriger Intensität wurden dann entfernt, da das Signal-Rausch-Verhältnis für solche Übergänge weniger günstig ist. Die optimalen Übergänge, die während der Kuration ausgewählt werden, sind häufig konsistent zwischen den Experimenten und können je nach verwendetem Massenspektrometer, chromatographischen Bedingungen, Analyseeinstellungen und dem biologischen Hintergrund der Probe unterschiedlich sein. Daher ist für jede Untersuchung eine ordnungsgemäße Kuration der Übergänge erforderlich. Ein Gleichgewicht zwischen der Einbeziehung von mehr Übergängen und damit technischen Replikationen und saubereren Daten für die Quantifizierung ist ebenfalls erforderlich.

Typische Produkt-Ionenchromatogramme für jede der identifizierten Ubiquitin-Kettentopologien in diesem Experiment sind in Abbildung 5dargestellt. K27 und K29 entfallen hier, da unter diesen biologischen Bedingungen das Signal unterhalb der Detektion war. Das hier gezeigte Elutionsprofil von K33 war wesentlich breiter, als es für die PRM-Analyse allgemein akzeptiert würde. Eine alternative Auswahl von Peptiden mit besseren Elutionsprofilen ist jedoch in der Ubiquitin-Kettenanalyse nicht möglich, und eine Interpretation muss auf der Grundlage dieses Profils erfolgen. Wenn K33 von besonderem Interesse ist, können veränderte chromatographische Bedingungen die Quantifizierung dieses Kettentyps verbessern, wahrscheinlich jedoch zu Lasten anderer Kettentypen.

Bei der Entwicklung eines PRM-Experiments ist es vorzuziehen, das Signal der für die Quantifizierung verwendeten Produktionen durch Erhöhung von Signal-zu-Rauschen zu maximieren. Die Optimierung der Kollisionsenergie (d.h. die Energie, die das Massenspektrometer zur Fragmentierung von Vorläuferpeptidionen zu Produktionen verwendet) ist ein Mittel, mit dem das Signal verbessert werden kann16. Ein Kollisionsenergiebereich von 14–28 wurde auf wiederholte Injektionen einer einzelnen Probe mit den in Abbildung 6dargestellten beobachteten Spitzenbereichen von K63 und M1 angewendet. Wie man sieht, war für K63 eine höhere Kollisionsenergie von 26 optimal, während für M1 eine geringere Energie von 18 ideal war. Die Kollisionsenergie für jedes topologiecharakteristische Peptid und eine Auswahl unveränderter Ubiquitinfragmente ist in Tabelle 1dargestellt. Diese Kollisionsenergien müssen möglicherweise auf der Grundlage des verwendeten Massenspektrometers und der verwendeten Fragmentierungsmethode optimiert werden.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der ubiquitin-konjugatingKaskade. Ubiquitin wird zunächst durch ein E1-Enzym auf ATP-abhängige Weise gebunden. Das aktivierte Ubiquitin wird dann auf ein E2-Enzym übertragen, das dann durch eine E3-Ligase verbunden wird, um das Ubiquitin auf das Substratprotein zu übertragen. Dieser Prozess wird mehrmals wiederholt, bis eine Ubiquitinkette auf dem Substratprotein gebildet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Diagramm, das die Ableitung des Ubiquitin-Topologie-charakteristischen Peptids zeigt. Die posttryptische Verdauung der vorgelagerten Bindungsstelle wird mit dem -GG C-Terminal des nachgeschalteten Ubiquitins abgeleitet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Vergleich der K48-Kette unter MG-132-Behandlung für eine Mauszelllinie B16 und die beiden menschlichen Zelllinien A459 und HeLa. In A459 führten zunehmende Konzentrationen von MG-132 zur Stabilisierung der K48-Ketten. Bei B16- und HeLa-Zellen wurde eine Erhöhung unter Behandlung mit entweder 10 mM oder 100 mM MG-132 beobachtet. Die beobachtete Abnahme von 10 mM bis 100 mM kann durch die erhöhte Empfindlichkeit von B16- und HeLa-Zellen gegenüber MG-132 erklärt werden, was zum Zelltod führt. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung der Übergänge an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Produktionenchromatogramme des M1-Topologie-charakteristischen Peptids vor und nach der Kuratierung von Übergängen für Interferenzen oder geringe Intensität. Die Haltezeit auf der x-Achse wird in Minuten angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Typisches Produkt-Ionenchromatogramm verschiedener topologie-charakteristischer Peptide sowie zwei nicht modifizierter Ubiquitinpeptide. Die Elutionszeit in Minuten und beobachtete Massenfehler für jedes Peptid wird über dem Scheitelpunkt des jeweiligen Peaks gemeldet. Gepunktete Linien zeigen auch das Fenster zur Bestimmung des Spitzenbereichs an. Die Haltezeit auf der x-Achse wird in Minuten angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Beobachtete Spitzenfläche für K63 und M1 über eine Reihe normalisierter Kollisionsenergien. Die verschiedenen Farben stellen die Ionenintensität dar, die bei jedem Übergang beigesteuert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Kettentyp Topologie Merkmal Peptid Ladezustand Normalisierte Kollisionsenergie
K06 MQIFVK[GG]TLTGK 3 18
K11 TLTGK[GG]TITLEVEPSDTIENVK 3 18
K27 TITLEVEPSDTIENVK[GG]AK 3 18
K29 AK[GG]IQDK 2 22
K33 IQDK[GG]EGIPPDQQR 3 18
K48 LIFAGK[GG]QLEDGR 3 24
K63 TLSDYNIQK[GG]ESTLHLVLR 4 26
M1 (linear) GGMQIFVK 2 18
Nicht modifiziertes Ubqiuitin ESTLHLVLR 2 26
Nicht modifiziertes Ubqiuitin TITLEVEPSDTIENVK 2 18
Nicht modifiziertes Ubqiuitin TLSDYNIQK 2 18

Tabelle 1: Sequenzen für die humanen Ubiquitin-Topologie-charakteristischen Peptide, den beobachtbarsten Ladezustand und günstige normalisierte Kollisionsenergie.

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Discussion

Die Analyse des Ubiquitinzustandes innerhalb eines Proteoms gewinnt für eine Vielzahl biologischer Fragen zunehmend an Bedeutung. Die Beschreibung des Ubiquitinationszustands einer Probe muss sich nicht nur auf das Profil der ubiquitinierten Proteine konzentrieren, sondern auch auf die Topologie einer solchen Ubiquitination. Die Bewertung dieser Topologie durch gezielte MS, wie hier beschrieben, spielt eine Rolle in einer Vielzahl biologischer Untersuchungen.

Es sollte verstanden werden, dass das hier beschriebene Protokoll ein globales Topologieprofil bereitstellt. Die Verwendung eines Bottom-up-Proteomik-Ansatzes ermöglicht die Bestimmung von Peptiden, die ubiquitiniert waren, einschließlich Ubiquitin-Peptide. Die Beobachtung der Ubiquitination von Ubiquitin-Peptiden ermöglicht die Bestimmung der Kettentopologie, aber das Glied zum Ziel von Ubiquitin geht verloren. Daher kann die jeweilige Kettentopologie eines bestimmten Proteins nicht bestimmt werden, aber es wird ein globales Topologieprofil abgeleitet. Die Methode kann auch mit einer Anreicherungsstrategie kombiniert werden, um gezieltere Ergebnisse zu erzielen. Eine solche Bereicherung muss die Kettenstabilität und die Fülle der Ketten nach der Anreicherung berücksichtigen. Der Nachweis der Kettentopologie wird durch die Reinheit begrenzt, die die Anreicherungsstrategie bietet, da es nicht möglich ist, eine Ubiquitin-Topologie, die mit einem kontaminierenden Protein verbunden ist, von den mit dem Protein von Interesse verbundenen zu unterscheiden. Der entscheidende Schritt in diesem Protokoll, der eine erfolgreiche Analyse ermöglicht, ist die Abwägung der Erhaltung der Ubiquitin-Kette bei gleichzeitiger Verdauung des Ubiquitin-Proteins. Dies ist aufgrund der Neigung zum Kettenbruch in Verbindung mit der Resistenz von Ubiquitin selbst gegen die enzymatische Verdauung eine Herausforderung. Darüber hinaus sind die Zugabe einer Stützmatrix und eine sorgfältige Berücksichtigung der MS-Bedingungen angesichts der ungünstigeren Natur einiger topologie-charakteristischer Peptide zur flüssigen chromatographischen gekoppelten Massenspektrometrieanalyse erforderlich.

Während wir in diesem Protokoll ein Mittel skizziert haben, mit dem alle Ubiquitin-Kettentypen gleichzeitig bewertet werden können, ist es auch möglich, mehrere Aspekte des Protokolls auf der Grundlage der jeweiligen Kettentopologie von Interesse anzupassen. Die Manipulation der chromatographischen Bedingungen oder die Variation der schweren Peptidkonzentrationen kann die Genauigkeit einer Untersuchung erhöhen, die Ergebnisse für eine bestimmte Kettentopologie verbessern und die Untersuchung an die vorgeschlagene biologische Frage anpassen.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Acknowledgments

Die Autoren danken Céline Jeanty für ihre Unterstützung bei der Herstellung von Zellpellets mit DerBehandlung von MG-132, wie in den repräsentativen Ergebnissen beschrieben, und Elise Mommaerts für ihre Bereitstellung von E. coli Pellets, die im Protokoll verwendet werden.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile (ACN) Merck 100029
Ammonium bicarbonate (ABC) Fluka 9830
Centrifuge Beckman Coulter Microfuge 16
Chloroacetamide (CAA) Sigma 22790
Eppendorf LoBind Eppendorf 22431081
Formic acid (FA) Thermo Fisher Scientific 85178
Heavy Peptides JPT Peptide Technologies
HPLC Dionex Ulitimate 3000
LC Column Thermo Fisher Scientific 160321
Lys C Wako 125-05061
Mass Spectrometer Thermo Fisher Scientific Q-Exactive Plus
N-ethylmaleimide (NEM) ACROS Organics 156100050
Positive Control Chain K48 Boston Biochem UC-240
Positive Control Chain K63 Boston Biochem UC-340-100
Positive Control Chain M1 Boston Biochem UC-710B-025
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma S5881
Sonifier Branson sonifier SFX 150
Thermomixer Eppendorf Thermomixer Comfort
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigam T6508
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) Thermo Fisher Scientific 77720
Trypsin Promega V1511A
Urea Sigma 51456
Waters μElution C18 plates Waters 186002318

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References

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Biochemie Ausgabe 160 Ubiquitin Kette Massenspektrometrie Parallelreaktionsüberwachung (PRM) Proteomik gezielt posttranslational Modifikation Topologie
Ubiquitin-Kettenanalyse durch Parallelreaktionsüberwachung
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Longworth, J., Mendes, M. L.,… More

Longworth, J., Mendes, M. L., Dittmar, G. Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring. J. Vis. Exp. (160), e60702, doi:10.3791/60702 (2020).

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