Summary
שיטה זו מתארת הערכה של שינויים גלובליים בטופולוגיית שרשרת ubiquitin. ההערכה מבוצעת על ידי יישום של גישה פרוטאומית ממוקדת ספקטרומטריית מסה.
Abstract
הערכה של הפרופיל העולמי של טופולוגיות שרשרת ubiquitin בתוך פרוטאום הוא עניין לענות על מגוון רחב של שאלות ביולוגיות. הפרוטוקול המתואר כאן מנצל את השינוי di-גליצין (-GG) שנותר לאחר העיכול טריפטי של ubiquitin משולב בשרשרת. על ידי כימות אלה טופולוגיה אופייני פפטידים השפע היחסי של כל טופולוגיית שרשרת ubiquitin ניתן לקבוע. הצעדים הנדרשים לכימות פפטידים אלה על ידי ניסוי ניטור תגובה מקבילה מדווחים תוך התחשבות בייצוב של שרשראות ubiquitin. הכנת פקדים כבדים, תמוגת תאים ועיכול מתוארים יחד עם הגדרת ספקטרומטר המסה המתאימה וזרימת העבודה של ניתוח נתונים. ערכת נתונים לדוגמה עם הפרעות בטופולוגיית ubiquitin מוצגת, מלווה בדוגמאות כיצד מיטוב הפרוטוקול יכול להשפיע על התוצאות. על ידי ביצוע השלבים המתוארים, משתמש יוכל לבצע הערכה גלובלית של הנוף טופולוגית ubiquitin בתוך ההקשר הביולוגי שלהם.
Introduction
הרגולציה ההדוקה של תפקוד החלבון ויציבות היא בעלת חשיבות עליונה, שכן הם מניעים עיקריים של שליטה פנוטיפית בביולוגיה. תפקידו של חלבון בנוי משני מרכיבים: רצף הפוליפפטיד המהותי שלו וכל שינוי פוסט-טרנסלציה (PTMs). זוהו PTMs כימיים שונים כולל גליקוסילציה, זרחון, אצטילציה ומתילציה1. בשנת 1975 זיהה גולדשטיין ואח'2 חלבון קטן וקרא לו אוביקוויטין בשל אופיו בכל מקום. אוביקוויטין נמצאה חשובה בהשפלת חלבונים3. עם זאת, מאז נקבע כי הפונקציה של ubiquitin כמו מולקולת איתות משתרע הרבה מעבר ויסות יציבות החלבון. איתות Ubiquitin מעורב במגוון רחב של פונקציות ביולוגיות אחרות, כגון ייצוב חלבון, autophagy, בקרת מחזור התא, וסחר בחלבון4.
בעוד PTMs אחרים הם בדרך כלל בינארי (כלומר, החלבון משתנה או נשאר ללא שינוי) עבור אתר נתון, ubiquitin יכול לשנות חלבון הן כמונומר או כשרשרת פולימרית, עם ubiquitin המצורף עצמו להיות ubiquitinated. יתר על כן, שרשרת פוליוביקוויטין זו יכולה להתפתח במספר טופולוגיות עם ubiquitination של ubiquitin הקודם הצמדה לאחד משמונה אתרי קישור5,6. אוביקוויטין מועבר על ידי תהליך אנזימטי רב-שלבי (איור 1) שבו מסוף C של אוביקוויטין מקושר לאחד משבעת שאריות הליצין שלו (K06, K11, K27, K29, K33, K48 או K63) או מסוף N של האוביקוויטין הקודם (המכונה M1 או ubiquitination ליניארי)5,6. טופולוגיית שרשרת זו היא המפתח לגורל החלבון תחת שינוי. לדוגמה, השינוי בשרשרת מקושרת K48 או K11 מוביל לפגיעה בחלבון שהשתנה בפרוטאזום, בעוד ששרשרת ליניארית נחוצה להפעלת איתות NF-kB. לפיכך, ההפצה היחסית של טופולוגיות שרשרת אלה רלוונטית למגוון רחב של שאלות ביולוגיות.
השימוש בספקטרומטריית מסה (MS) הוא יתרון מיוחד לניתוח טופולוגיית שרשרת אוביקוויטין מכיוון שהוא אינו מסתמך על אינטראקציות מבוססות נוגדנים או מבוססות זיקה7,8, שרבות מהן ספציפיות מוגבלות ואינן מבדילות בין סוגי השרשרת השונים. אפשרות זיהוי שונה היא שימוש במוטנטים אוביקוויטין מהונדסים גנטית. כאן, ליבין מסוים מוחלף ארגינין, אשר לא יכול לתמוך בשינוי על ידי ubiquitin. חוסר היווצרות שרשרת ubiquitin על חלבון המצע מתפרש לאחר מכן כעדות לטופולוגיה ספציפית9.
זיהוי מבוסס MS של חלבונים ubiquitinated מבוסס על העובדה כי C-מסוף של ubiquitin מכיל שאריות ארגינין בתנוחה 74 כי הוא מוכר על ידי טריפסין במהלך ההכנה הפרוטאוליטית של הדגימות לניתוח טרשת נפוצה, הפרדת גליצין כפול C-מסוף. גליגלי (-GG) זה נשאר מחובר לקבוצה ε אמינו של שאריות ליצין של חלבון המצע. עבור ניתוח טופולוגית ubiquitin, השינוי מתרחשת על אחד משבעת שאריות ליצין של אוביקוויטין. פעולה זו יוצרת קבוצה של שבעה פפטידים מרכזיים הנושאים שאריות ליצין שמשתנות על-ידי GG, ספציפיות לכל אחת מהטופולוגיות (איור 2). לדוגמה, עם טופולוגיית K06, ליצין במיקום 6 על רצף חומצות אמינו יהיה מוגן מפני עיכול טריפטי עם -GG שינוי של 114 Da הוסיף ליצין זה.
זיהוי של פפטידים מוגדרים מראש ספציפיים על ידי טרשת נפוצה נקרא פרוטאומיקה ממוקדת, או ליתר דיוק, רכישת פפטידממוקדת 10. שתי שיטות פותחו בהתאם לביצועים של ספקטרומטר המסה בשימוש. אלה הם ניטור תגובה נבחר (SRM), המכונה גם ניטור תגובה מרובה (MRM), וניטור תגובה מקבילה (PRM). SRM כרוך בבחירת המעברים המורכבים מהמבשר m/z ומהיון המוצר m/z. לעומת זאת, PRM דורש רק את המבשר m/z. לאחר הבחירה, מתבצעת סריקת סקר מלאה של יוני המוצר. זה יש את היתרון כי אין מבחר של יוני מוצר מתאימים עבור כמויות על ספקטרומטר המסה הספציפי יש צורך לפני המדידה11. הן SRM והן PRM יכולים, בהתאם למכשיר, להיות מתוזמנים. תזמון הוא הנוהג של הקצאת חלון זמן שבמהלכו ייכלל יון מסוים לניתוח, שכן פפטידים מתרוממים בזמני שמירה מוגדרים מהמערכת הכרומטוגרפית. צמצום מספר היונים הנחקרים בכל זמן נתון מגדיל את תדירות החקירה של היונים המתוכננים באותה תקופה, ובכך משפר את דיוק הנתונים.
באופן כללי, היישום של פרוטאומיקה ממוקדת עבור טופולוגיית ubiquitin זהה לכל ניסוי פרוטאומיקה ממוקד אחר. עם זאת, שני הבדלים מרכזיים חשובים: ראשית, יש לשקול את היציבות של שרשראות ubiquitin. ישנם אנזימים deubiquitinating חזק מרובים (DUBs) כי במהירות להשפיל שרשראות על תמוגה התא. הפרוטאסות הספציפיות לאוביקוויטין מתחלקות לשתי קטגוריות, התיאסטרות והמתכות. רוב האוביקוויטין-הידרולאסות הן תיאסטראסים ונושאות שאריות ציסטאין במרכז הפעיל שלהן. על ידי alkylating שאריות ציסטאין זה, הם יכולים להיות מושבתים. ככזה, השימוש במאגרי ייצוב ubiquitin המכילים סוכני alkylating, כמו N-אתילמלימיד (NEM), וכימיקלים denaturing מאוד, ושמירה על דגימות מקורר חיוני לניתוח מוצלח. שנית, שלא כמו ניסויים ממוקדים אחרים, בחירת הפפטיד קבועה. בניסוי ממוקד טיפוסי, ניתן לבחור פפטיד פרוטאוטיפי לביצועים כרומטוגרפיים ויוניזציה טובים. עבור כמה פפטידים אופייניים טופולוגיה כגון K48 מאפיינים אלה טובים, ואילו עבור אחרים, הם פחות רצויים. לדוגמה, כרומטוגרפיה K33 בהגדרה הפוכה טיפוסית היא ירודה בשל היווצרות של פרופיל elution מתוח, ואת תכונות יינון לקוי של פפטיד K27 להפחית את הראות שלה על ידי MS12.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לבצע הערכה טופולוגית ubiquitin של מדגם ביולוגי על ידי PRM. נתונים לדוגמה עבור ההליך מוצגים באמצעות הפרעה של פרוטאזום באמצעות טיפול מעכב MG-132 במספר סוגי תאים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת תקן פפטיד כבד
- בהתאם לספק ואיכות הפפטידים הכבדים שנרכשו, יהיה צורך לדלל את הפפטידים הכבדים. פרוטוקול זה השתמש רצפי פפטיד שדווחו בטבלה 1, עם חומצת אמינו C-מסוף שונה ליצין(13C615N2-ליצין) או ארגינין (13C615N4-ארגנין).
- מערבבים את הפפטידים הכבדים, מדללים את התערובת עם 50% אצטוניטריל (ACN) כדי ליצור תערובת פפטיד עם כל פפטיד ב 10 מיקרומטר.
- צור aliquots של תערובת פפטיד ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
2. הכנה לדוגמה
- תמוגה לדוגמה
הערה: יש לקחת בחשבון את היציבות של שרשראות ubiquitin במהלך הכנת מדגם. יש לשמור על דגימות ביולוגיות ומאגרים מצוננים ב-4 מעלות צלזיוס ולהוסיף דגימות למאגר ייצוב האוביקוויטין במהירות האפשרית.- הכן פתרון של 1 M NH4HCO3 (אמוניום ביקרבונט) במים ולהתאים את ה- pH ל 8 באמצעות 1 M NaOH.
- הכינו פתרון של 200 מ"מ N-אתילמלימיד (NEM) במים.
- הכן מאגר ייצוב ubiquitin באמצעות 8 M אוריאה ב 50 mM NH4HCO3/10 mM NEM. מאגר ייצוב Ubiquitin חייב להיות מוכן טרי בכל פעם.
הערה: פתרון 5 מ"ל של 8 M אוריאה ידרוש הרבה פחות מ 5 מ"ל של מים בהתחשב בהרחבת המים כאשר בתמיסה רוויה עם אוריאה.
התראה: אין להכין את המאגר מעל 50 מעלות צלזיוס בשל הנטייה של אוריאה ליצור פוליאוריאה בטמפרטורות גבוהות. - Resuspend המדגם הביולוגי להיחקר במאגר ייצוב ubiquitin מכוון 0.5 מיקרוגרם / μL של חלבון lyse התאים עם שיטה מתאימה עבור המדגם. שיטת sonication המורכבת שלושה פולסים 10 s עם סוניפייר ברנסון SFX 150 להגדיר בעוצמה של 70% עם 10 הפסקות על הקרח בין כל פעימה, שימש עבור קווי התא בפרוטוקול זה.
- דגימת צנטריפוגה ב 18,000 x g במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס בצנטריפוגה שולחן.
- מעבירים את ה-supernatant לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי עם חלבון נמוך. דגימות ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס בשלב זה במידת הצורך.
- הכנת מדגם ופקדים
- אם הדגימות קפואות, מערבבים (למשל, עם תרמומיקסר) בזמן שהם מופשרים כדי להמיס במהירות את אוריאה.
התראה: אין להשתמש בטמפרטורות מעל 50 °C (60 °F) בשל הנטייה של אוריאה ליצור פוליאוריאה בטמפרטורות גבוהות. - דגימת צנטריפוגה ב 18,000 x g במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס בצנטריפוגה שולחן.
- העבר 20 מיקרוגרם של מדגם לצינור מיקרוצנטריפוגה נמוך טרי ולהתאים את עוצמת הקול ל 50 μL עם מאגר ייצוב ubiquitin.
- צור פקד שלילי באמצעות נפח מנורמל של מאגר ייצוב ubiquitin (50 μL). במדגם זה, אין גרסה קלה של כל פפטיד צריך להיות נוכח, המאפשר תצפית של כל זיהום אור הנובע ספייק בפפטידים כבדים. פקד שלילי זה שימש גם לשמירת תזמון זמן של PRM המתואר בסעיף 3.1.
- שליטה חיובית נוצרה גם עם מאגר ייצוב ubiquitin ותוספת של סוגי שרשרת זמינים מסחרית לנפח מנורמל של מאגר ייצוב ubiquitin (50 μL). בדרך כלל, K63, K48 ו- M1 זמינים. בתוצאות הייצוגיות נוצלו 20 ng של K48, K63 ו- M1.
- אם הדגימות קפואות, מערבבים (למשל, עם תרמומיקסר) בזמן שהם מופשרים כדי להמיס במהירות את אוריאה.
- הפחתה, אלקילציה ועיכול
- הכן פתרון של 50 מ"מ אמוניום ביקרבונט (NH4HCO3)במים ולהתאים את המדגם ל- pH = 8 עם 1 M NaOH.
- תרבות של E. coli גדל מרק LB היה צנטריפוגה 5,000 x g במשך 5 דקות כדי ליצור גלולה, אשר נשטף אז 2x עם PBS לפני ההשעיה במאגר ייצוב ubiquitin ב 5 מיקרוגרם / μL.
- הוסף 1 מיקרוגרם של E. coli lysate לכל מדגם ושליטה. פרוטוקול זה משתמש E. coli (DH10B), אבל כל lysate מורכב ללא ubiquitin ניתן להשתמש. שים לב כי אוביקוויטין משותף לכל האיקריוטים.
הערה: שימוש במטריצת E. coli lysate מפחית את אובדן הפפטידים עקב הידבקות לא ספציפית בכלי פלסטיק. זה בולט במיוחד בשליטה השלילית או דגימות עם תכולת חלבון מוגבלת ויש לו השפעה חזקה על התצפית של K6312. - הכן פתרון של 500 mM tris (2-carboxyethyl) פוספין (TCEP) במים כיתה MS (DTT יכול לשמש כחלופה).
- להפחית את הדגימות ואת הפקדים על ידי תוספת של TCEP לריכוז הסופי של 50 מ"מ. וורטקס בקצרה לפני הדגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT). אם נעשה שימוש ב- DTT, יש להעלות את הטמפרטורה ל- 50 °C (60 °F).
התראה: אין להשתמש בטמפרטורות מעל 50 °C (60 °F) בשל הנטייה של אוריאה ליצור פוליאוריאה בטמפרטורות גבוהות. - הכינו פתרון של 550 מ"מ כלורואקטמיד (CAA) ב- NH4HCO3. חנות בחושך.
- Alkylate דגימות ופקדים על ידי הוספת CAA לריכוז הסופי של 55 mM. וורטקס בקצרה לפני הדגירה במשך 20 דקות ב RT בחושך.
הערה: CAA משמש במקום iodoacetamide כסוכן ההפחתה כדי להקטין את הסיכוי של שינוי carbamidomethyl כפול (114.0429) על שאריות ליצין להיות טועה עבור -GG שינוי (114.0429)13. - הוסף אנדופטידאז LysC לדגימות ב 1:25 (w / w) יחס לתכולת החלבון. דגירה במשך 3 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
- לדלל את הדגימות ואת הפקדים עם 200 μL של 50 מ"מ NH4HCO3 pH = 8 (1:5 v / v).
- הוסף טריפסין לדגימות ב 1:25 w / w יחס לתכולת החלבון. דגירה עבור 12 שעות ב 37 °C (69 °F).
- הוסף 10% חומצה פורמית (FA) פתרון במים כיתה MS ביחס 1:10 v / v לכל מדגם מדגם ובקרה. בדוק כי pH הוא <3) לפני ניקוי C18 ולהוסיף חומצה פורמית יותר במידת הצורך.
- לכל דגימה ובקרה להוסיף 0.5 μL של תקן פפטיד כבד שנוצר בסעיף 1.
- ניקוי פפטיד
- מספר יצרנים מציעים C18 טיפים ניקוי או צלחות. בצע את הוראות היצרן עבור המוצר בשימוש, ופפטידים מיובשים בצנטריפוגה ואקום, מוכן לניתוח MS.
3. ניתוח על ידי LC-MS / MS
- בצע ניתוח PRM ראשוני על תקן פפטיד כבד בצורה לא מתוכננת.
- Resuspend את הדגימות המיובשות ב 10 μL של מאגר טעינה MS 2% ACN / 0.05% חומצה trifluoroacetic (TFA).
- צייד HPLC בעמודה אנליטית שלב הפוך C18 (75 מיקרומטר x 15 ס"מ, 2 מיקרומטר 100 Å C18 חרוזים) המיועדת לננו זרימה MS. טופס הדרגתי ליניארי החלפת מים בדרגת MS בתוספת 0.1% FA עם ACN המכיל 0.1% FA. עמודת מלכודת הקרבה (75 מיקרומטר x 2 ס"מ, 3 מיקרומטר, 100 Å C18 חרוזים) כדי לשמר את חיי העמודה האנליטית שימשה כאן אך אינה נדרשת.
- תצמד את התפוקה של העמודה האנליטית למקור ננו-ESI בספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה.
- השתמש בשיטת פרוטאומיקה ממוקדת מתאימה עבור ספקטרומטר המסה. לדוגמה, בשיטת Q-Exactive פלוס שיטת שני ניסויים, יש לעבור בין MS מלא לניסוי PRM. עבור הניסוי MS מלא, רזולוציה של 120,000 עם יעד AGC של 1e6 ו 240 ms כמו ה-IT המרבי שימש. עבור ניסוי PRM, נעשה שימוש באותו יעד AGC וב- IT מרבי ברזולוציה נמוכה יותר של 60,000 וחלון בידוד של 1.2 m/z.
- הזרק 200 ng של הפקד השלילי על העמודה האנליטית באמצעות דגימה אוטומטית HPLC. החל הדרגתי ליניארי על המדגם בעמודה האנליטית הגדלת ריכוז ACN מ 2-25% על פני תקופה של ~ 45 דקות.
הערה: ריכוז ACN 25% נמוך מהרגיל עבור פרוטאומיקה בשל האופי ההידרופילי הנמוך של פפטידים טיפוסיים האופייניים לטופולוגיית אוביקוויטין. אם פפטידים אחרים יש לכמת, ריכוז ACN גבוה יותר עשוי להיות הרצוי כדי להשיג הפרדת יעד טובה. - נתח את תוצאות הפעלת התזמון כמתואר בסעיף 4.2 כדי ליצור רשימת כלילה מתוזמנת.
- ניתוח הדגימות
- הפעל את הדוגמאות הנותרות כמתואר עבור התזמון ב- 3.1 מלבד השימוש ברשימת ההכללה המתוזמנת שנוצרה בסעיף 4.2.
הערה: יש להפעיל ריק לאחר הפקד החיובי כדי להבטיח שלא יתגלה מסירה מההפעלה הקודמת בדגימות הבאות.
- הפעל את הדוגמאות הנותרות כמתואר עבור התזמון ב- 3.1 מלבד השימוש ברשימת ההכללה המתוזמנת שנוצרה בסעיף 4.2.
4. ניתוח תוכנה
- צור רשימת כלילה של עיצוב מתאים עבור MS מנוצל. פרוטוקול זה השתמש בתוכנת הקוד הפתוח Skyline (גירסה 19.1.0.193) (https://skyline.ms), המציעה תמיכה ועזרה מתועדות היטב. ניתן ליצור רשימת כלילה עבור מספר ספקטרומטרים של מסה באמצעות מתקן רשימת בידוד הייצוא.
- פתח מסמך קו רקיע חדש.
- בחר שינויים כבדים איזוטופ בהתאם לצורך פפטידים אופייניים טופולוגיה כבדה. בהגדרות| הגדרות פפטיד תחת הכרטיסיה שינוי, לחץ על שדה השם כדי לראות את השינוי הפוטנציאלי. הבחירה מבוססת על המצב האיזוטופי של הפפטידים הכבדים שנרכשו. בדוגמה זו, פפטידים סינתטיים הנושאים לידין כבד (13C615N2-לידין) או ארגינין כבד (13C615N4-ארגנין) ב C-terminus שימשו. התוויות המתאימות יהיו: "תווית:13C(6)15N(2) (C-מונח K)" ו"תווית:13C(6)15N(4) (C-מונח R)".
- בחר הגדרות| מעבר . תחת הכרטיסיה מסנן כוללים חיובים מבשר 2, 3, 4.
- הוסף פפטידים על-ידי בחירה באפשרות ערוך| הוסף| פפטידים.
- מלאו את התחומים הרלוונטיים, כולל רצף הפפטיד האופייני לטופולוגיה ושם חלבון (למשל, "שרשרת–K63").
- הרחיבו כל פפטיד המוצג כעת בחלונית 'מטרות'. מחק מצבי חיוב לא רצויים. מצב הטעינה המועדף ואנרגיית התנגשות, אשר עשויים להיות שונים בהתבסס על ספקטרומטר מסה בשימוש, עבור כל פפטיד טופולוגי אופייני מוצג בטבלה 1.
- עבור כל פפטיד האופייני לטופולוגיה (למעט M1 שבו GG נכלל ברצף) לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הרצף ובחר שנה. הוסף GG כשינוי מבני על-ידי לחיצה על שדה השם ובחירה באפשרות <הצג את כל... > לפני בחירת "גליגלי (K)".
- יצא את קובץ רשימת הבידוד| יצא| רשימת בידוד, בחר את סוג הכלי והגדר את סוג פעולת השירות כ רגיל. בחירה בלחצן אישור תפתח בקשה לשמירת קובץ *.csv בו ניתן להשתמש כדי ליצור פעולת שירות PRM.
- צור רשימת כלילה מתוזמנת המבוססת על הפעלת תזמון פפטיד כבדה המוסברת כאן באמצעות תוכנת קו הרקיע בקוד פתוח.
- צור רשימת יעד כמתואר בסעיף 4.1.
- יבא את הפעלת התזמון ב- 3.1 על-ידי בחירה באפשרות קובץ| ייבוא| תוצאות .
- סקור את הזיהויים. האות הכבד עבור כל פפטיד ניתן לצפייה על ידי לחיצה על המסה עבור כל כניסת פפטיד כבדה. זיהוי נכון של השיא נקבע לעתים קרובות באופן אוטומטי, אך התוכנה עשויה לדרוש אוצרות ידנית על-ידי בחירת השיא באמצעות לחיצה וגרירה מתחת לציר ה- x.
- זמני השמירה שנבחרו עבור הווריאנטים הכבדים חלים גם על הגירסאות המוארות, ובכך יוצרים לוח זמנים עבור PRM. ניתן לשנות את חלון התזמון תחת הגדרות| הגדרות פפטיד באמצעות הכרטיסיה חיזוי, על-ידי שינוי חלון הזמן.
- כעת ניתן לייצא רשימת כלילה מתוזמנת באמצעות קובץ| יצא| רשימת בידוד ובחירת סוג הכלי המתאים והגדרת סוג פעולת השירות לתזמון.
- נתח את הנתונים.
- יבא את הדגימות באותו אופן כמו עבור ניתוח הפעלת התזמון בסעיף 4.2.
- לאחר הייבוא המלא של כל הדגימות, מומלץ לאצור מעברים. זהו התהליך שבאמצעותו מוסרים מעברים עם הפרעה או יחסי אות לרעש ירודים. דוגמה לכרומטוגרמה לפני ואחרי אוצרות מוצגת באיור 4.
- כעת ניתן לייצא נתונים על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני על גרפים רלוונטיים ובחירת העתקת נתונים או על-ידי בחירת קובץ| יצא| תוצאות .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להדגים את השימוש בניתוח שרשרת ubiquitin על ידי PRM, שלושה קווי תאים נבחרו: קו תא מלנומה עכבר B16, ואת שני קווי התא האנושיים הנפוצים A549 (תאי אפיתל בסיסי מכתשי אדנוקרצ'ינו) ו HeLa (תאים סרטניים צוואר הרחם). תרבויות אלה גדלו לשלב midexponential במדיה המתאימה לפני שטופלו 0, 10, או 100 מ"מ MG-132 עבור 4 שעות לפני הקציר. MG-132 הוא מעכב פרוטאזום המונע השפלה של חלבונים מצומדים אוביקוויטין על ידי פרוטאזום14. בהתחשב בכך, זהו תנאי בדיקה מתאים כדי להדגים ניתוח שרשרת ubiquitin. את העלייה הנובעת מכך ניתן לראות בשרשרת K48 באיור 3. טיפול מעכב פרוטאזום גרם לעלייה בשרשראות K4815.
כמתואר במבוא, שלא כמו SRM או MRM, PRM מבצע סריקת יון מוצר מלאה לאחר בחירת יון המבשר. אמנם משמעות הדבר היא כי יונים המוצר לא צריך להיות מצוין לפני ההפעלה, הם עדיין צריכים להיות אוצרים לאחר הפעלה. אוצרות היא התהליך שבאמצעותו נבחרים מעברים המייצגים באמת את הפפטיד המיועד. איור 4 מציג את כרומטוגרמה יון המוצר עבור K48 לפני ואחרי אוצרות. יונים של מוצרים בעלי אות עם פרופיל elution לא עקבי ככל הנראה עקב הפרעה הוסרו. יוני מוצר בעצימות נמוכה הוסרו לאחר מכן בהתחשב בכך שיחס האות לרעש פחות נוח למעברים כאלה. המעברים האופטימליים שנבחרו במהלך האוצרות יהיו בדרך כלל עקביים בין ניסויים, ועשויים להשתנות בהתאם לספקטרומטר מסה בשימוש, תנאי כרומטוגרפיה, הגדרות ניתוח והרקע הביולוגי של המדגם. לכן, עבור כל חקירה אוצרות נאותה של מעברים נדרש. נדרש גם איזון בין הכללת מעברים נוספים ובכך שכפולים טכניים ונתונים נקיים יותר לכימות.
כרומטוגרמות טיפוסיות של יון מוצר עבור כל אחת מהטופולוגיות המזוהות של שרשרת האוביקוויטין בניסוי זה מוצגות באיור 5. K27 ו K29 מושמטים כאן כי בתנאים ביולוגיים אלה האות היה מתחת לגילוי. פרופיל elution של K33 כפי שמוצג כאן היה רחב משמעותית מאשר היה מקובל עבור ניתוח PRM. עם זאת, בחירה חלופית של פפטידים עם פרופילי elution טובים יותר אינה אפשרית בניתוח שרשרת ubiquitin ויש לפרשנות המבוססת על פרופיל זה. אם K33 הוא עניין מיוחד, תנאים כרומטוגרפיים שהשתנו עשויים לשפר את הכימות של סוג שרשרת זה, אך סביר להניח לרעתם של סוגי שרשרת אחרים.
בתכנון ניסוי PRM, עדיף למקסם את האות של יוני המוצר המשמשים לכימות על ידי הגברת האות לרעש. אופטימיזציה של אנרגיית התנגשות (כלומר, האנרגיה המשמשת את ספקטרומטר המסה כדי לפצל יוני פפטיד מבשר ליונים המוצר) הוא אמצעי אחד שבאמצעותו ניתן לשפר את האות16. טווח אנרגיית התנגשות בין 14 ל-28 הוחל על זריקות חוזרות ונשנות של מדגם יחיד, כאשר אזורי השיא שנצפו כתוצאה מכך של K63 ו-M1 מוצגים באיור 6. כפי שניתן לראות, עבור K63 אנרגיית התנגשות גבוהה יותר של 26 הייתה אופטימלית, ואילו עבור M1 אנרגיה נמוכה יותר של 18 הייתה אידיאלית. אנרגיית ההתנגשות עבור כל פפטיד האופייני לטופולוגיה ומבחר שברי אוביקוויטין שלא שונו מוצגים בטבלה 1. ייתכן שיהיה צורך לייעל אנרגיות התנגשות אלה בהתבסס על ספקטרומטר המסה ושיטת הפיצול בה נעשה שימוש.
איור 1: ייצוג סכמטי של מפל ההטיה האוביקוויטין. אוביקוויטין מאוגד תחילה על ידי אנזים E1 באופן תלוי ATP. האוביקוויטין הפעיל מועבר לאחר מכן לאנזים E2 אליו מצטרף E3-ligase כדי להעביר את האוביקוויטין לחלבון המצע. תהליך זה חוזר על עצמו מספר פעמים עד שנוצרת שרשרת אוביקוויטין על חלבון המצע. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תרשים המציג את הנגזרת של הפפטיד האופייני לטופולוגיית אוביקוויטין. לאחר עיכול טריפטי אתר הכריכה במעלה הזרם נגזר עם -GG C-מסוף של ubiquitin במורד הזרם המצורף. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: השוואה בין שרשרת K48 תחת טיפול MG-132 עבור קו תא עכבר B16 ושני קווי התא האנושי A459 ו- HeLa. בשנת A459 הגדלת הריכוזים של MG-132 הובילה לייצוב רשתות K48. עם B16 ותאי HeLa עלייה נראתה תחת טיפול עם או 10 מ"מ או 100 מ"מ MG-132. הירידה שנצפתה מ 10 mM ל 100 מ"מ יכול להיות מוסבר על ידי הרגישות המוגברת של B16 ותאי HeLa MG-132, המוביל למוות של תאים. קווי שגיאה מציגים את סטיית התקן של המעברים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: כרומטוגרמה של יון המוצר של הפפטיד האופייני לטופולוגיית M1 לפני ואחרי אוצרות המעברים להפרעות או לעוצמה נמוכה. זמן השמירה בציר ה- x מוצג בדקות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: כרומטוגרמה טיפוסית של יון מוצר של פפטידים שונים האופייניים לטופולוגיה, כמו גם שני פפטידים אוביקוויטין שאינם מותאמים. זמן התרוממות רוח בדקות וטעות המונית נצפתה עבור כל פפטיד מדווח מעל לשיא של הפסגה הרלוונטית. קווים מנוקדים מציגים גם את החלון לקביעת אזור השיא. זמן השמירה בציר ה- x מוצג בדקות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: אזור שיא נצפה עבור K63 ו- M1 על סדרה של אנרגיות התנגשות מנורמלות. הצבעים השונים מייצגים את עוצמת היונים שתרמה כל מעבר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| סוג שרשרת | טופולוגיה אופייני פפטיד | מצב טעינה | אנרגיית התנגשות מנורמלת |
| K06 | MQIFVK[GG]TLTGK | 3 | 18 |
| K11 | כותרת TLTGK[GG], אוופסדטיסנבורג | 3 | 18 |
| K27 | כותרתVEPSDTIENVK[GG]AK | 3 | 18 |
| K29 | AK[GG]IQDK | 2 | 22 |
| K33 | IQDK[GG]EGIPPDQQR | 3 | 18 |
| K48 | ליפגק [GG]QLEDGR | 3 | 24 |
| K63 | LSDYNIQK[GG]ESTLHLVLR | 4 | 26 |
| M1 (ליניארי) | GGMQIFVK | 2 | 18 |
| אובקיוטין לא שונה | אסטלהלב ליר | 2 | 26 |
| אובקיוטין לא שונה | כותרתVEPSDTIENVK | 2 | 18 |
| אובקיוטין לא שונה | TLSDYNIQK | 2 | 18 |
טבלה 1: רצפים עבור הפפטידים האופייניים לטופולוגיית האוביקוויטין האנושית, מצב הטעינה הנצפה ביותר ואנרגיית התנגשות מנורמלת חיובית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ניתוח של מצב ubiquitin בתוך פרוטאום הוא בעל חשיבות גוברת למגוון רחב של שאלות ביולוגיות. התיאור של מצב ubiquitination של מדגם חייב להתמקד לא רק על הפרופיל של חלבונים להיות ubiquitinated, אלא גם על הטופולוגיה של ubiquitination כזה. להערכת טופולוגיה זו על ידי טרשת נפוצה ממוקדת, כמתואר כאן, יש תפקיד במגוון רחב של חקירות ביולוגיות.
יש להבין כי הפרוטוקול המתואר כאן מספק פרופיל טופולוגיה כללי. השימוש בגישה פרוטאומית מלמטה למעלה מאפשר קביעת פפטידים שהיו ubiquitinated, כולל פפטידים ubiquitin. התצפית של ubiquitination של פפטידים ubiquitin מאפשר קביעת טופולוגיית השרשרת, אבל הקישור ליעד של אוביקוויטין הולך לאיבוד. לפיכך, לא ניתן לקבוע את טופולוגיית השרשרת המסוימת על כל חלבון נתון, אך נגזר פרופיל טופולוגיה גלובלי. ניתן לשלב את השיטה גם עם אסטרטגיית העשרה כדי לספק תוצאות ממוקדות יותר. העשרה כזו צריכה לקחת בחשבון את יציבות השרשרת ואת שפע הרשתות לאחר העשרה. גילוי טופולוגיית השרשרת מוגבל על ידי הטוהר שאסטרטגיית ההעשרה מספקת, שכן לא ניתן להבחין בין טופולוגיית אוביקוויטין המקושרת לחלבון מזהם מאלה הקשורים לחלבון המעניין. השלב הקריטי בפרוטוקול זה, המאפשר ניתוח מוצלח, הוא איזון של שימור שרשרת האוביקוויטין תוך עיכול חלבון האוביקוויטין. זה מאתגר בשל הנטייה של התמוטטות שרשרת יחד עם ההתנגדות של ubiquitin עצמו לעיכול אנזימטי. כמו כן, תוספת של מטריצת תמיכה ושיקול זהיר של תנאי טרשת נפוצה נדרשים בהתחשב באופי הפחות נוח של חלק מהפטידים האופייניים לטופולוגיה לניתוח ספקטרומטרי מסה כרומטוגרפי נוזלי.
אמנם התווינו בפרוטוקול זה אמצעי שבאמצעותו ניתן להעריך את כל סוגי שרשרת האוביקוויטין בו זמנית, אך ניתן גם להתאים מספר היבטים של הפרוטוקול בהתבסס על טופולוגיית השרשרת המסוימת של עניין. מניפולציה של התנאים הכרומטוגרפיים או שינוי ריכוזי הפפטיד הכבדים יכולים להגביר את הדיוק של חקירה, לשפר את התוצאות עבור טופולוגיית שרשרת מסוימת ולהתאים את החקירה לשאלה הביולוגית המוצעת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות סלין ג'נטי על עזרתה ביצירת כדורי הסלולר עם טיפול MG-132 כמתואר בתוצאות הייצוג ואליז Mommaerts עבור מתן כדורי E. coli בשימוש בפרוטוקול.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (ACN) | Merck | 100029 | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | Fluka | 9830 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 16 | |
| Chloroacetamide (CAA) | Sigma | 22790 | |
| Eppendorf LoBind | Eppendorf | 22431081 | |
| Formic acid (FA) | Thermo Fisher Scientific | 85178 | |
| Heavy Peptides | JPT Peptide Technologies | ||
| HPLC | Dionex | Ulitimate 3000 | |
| LC Column | Thermo Fisher Scientific | 160321 | |
| Lys C | Wako | 125-05061 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | Q-Exactive Plus | |
| N-ethylmaleimide (NEM) | ACROS Organics | 156100050 | |
| Positive Control Chain K48 | Boston Biochem | UC-240 | |
| Positive Control Chain K63 | Boston Biochem | UC-340-100 | |
| Positive Control Chain M1 | Boston Biochem | UC-710B-025 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S5881 | |
| Sonifier | Branson sonifier | SFX 150 | |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigam | T6508 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Thermo Fisher Scientific | 77720 | |
| Trypsin | Promega | V1511A | |
| Urea | Sigma | 51456 | |
| Waters μElution C18 plates | Waters | 186002318 |
References
- Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Scientific Reports. 1, 90 (2011).
- Goldstein, G., et al. Isolation of a polypeptide that has lymphocyte-differentiating properties and is probably represented universally in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (1), 11-15 (1975).
- Glickman, M. H., Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: Destruction for the sake of construction. Physiol. Rev. 82, 373-428 (2002).
- Pickart, C. M., Eddins, M. J. Ubiquitin: structures, functions, mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1695 (1-3), 55-72 (2004).
- Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. Ubiquitin chain diversity at a glance. Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).
- Komander, D., Rape, M. The Ubiquitin Code. Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).
- Mattern, M., Sutherland, J., Kadimisetty, K., Barrio, R., Rodriguez, M. S. Using Ubiquitin Binders to Decipher the Ubiquitin Code. Trends in Biochemical Sciences. 44 (7), 599-615 (2019).
- Newton, K., et al. Ubiquitin chain editing revealed by polyubiquitin linkage-specific antibodies. Cell. 134 (4), 668-678 (2008).
- Spence, J., et al. Cell cycle-regulated modification of the ribosome by a variant multiubiquitin chain. Cell. 102 (1), 67-76 (2000).
- Borràs, E., Sabidó, E. What is targeted proteomics? A concise revision of targeted acquisition and targeted data analysis in mass spectrometry. PROTEOMICS. 17 (17-18), (2017).
- Lesur, A., Domon, B. Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics. PROTEOMICS. 15 (5-6), 880-890 (2015).
- Longworth, J., Dittmar, G. Assessment of Ubiquitin Chain Topology by Targeted Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1977, Clifton, N.J. 25-34 (2019).
- Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
- Tawa, N. E., Odessey, R., Goldberg, A. L. Inhibitors of the proteasome reduce the accelerated proteolysis in atrophying rat skeletal muscles. The Journal of Clinical Investigation. 100 (1), 197-203 (1997).
- Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
- MacLean, B., et al. Effect of Collision Energy Optimization on the Measurement of Peptides by Selected Reaction Monitoring (SRM) Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (24), 10116-10124 (2010).
