Summary
この方法はユビキチン鎖トポロジーにおけるグローバルな変化の評価を記述する。この評価は、質量分析法に基づく標的プロテオミクスアプローチの適用によって行われます。
Abstract
プロテオーム内のユビキチン鎖トポロジーのグローバルプロファイルの評価は、幅広い生物学的問題に答える上で興味深いものです。ここで概説するプロトコルは、鎖に組み込まれたユビキチンのトリプティック消化後に残されたジグリシン(-GG)修飾を利用する。これらのトポロジ特性ペプチドを定量化することにより、ユビキチン鎖トポロジーの相対的な存在量を求めることができる。これらのペプチドを並列反応モニタリング実験で定量するために必要なステップは、ユビキチン鎖の安定化を考慮して報告されている。重いコントロール、細胞の分解、および消化の準備は、適切な質量分析計のセットアップとデータ分析のワークフローと共に記述されています。ユビキチントポロジーにおける摂動を伴うデータセットの例は、プロトコルの最適化が結果に与える影響の例を伴って提示される。概説された手順に従うことによって、ユーザーは生物学的文脈の中でユビキチントポロジ景観のグローバル評価を行うことができる。
Introduction
タンパク質の機能と安定性の密接な調節は、生物学の表現法制御の主要な原動力であるため、最も重要です。タンパク質の機能は、その本質的なポリペプチド配列と翻訳後修飾(PTM)の2つの成分から構成されます。グリコシル化、リン酸化、アセチル化、メチル化1など、様々な化学PTMが同定されている。1975年、Goldsteinらの2 は小さなタンパク質を同定し、そのユビキタスな性質のためにユビキチンと名付けた。ユビキチンはタンパク質分解3において重要であることが判明した。しかし、それ以来、シグナル分子としてのユビキチンの機能は、タンパク質安定性の調節をはるかに超えて広がったことが確立されています。ユビキチンシグナル伝達は、タンパク質安定化、オートファジー、細胞周期制御、およびタンパク質の人身売買4のような他の生物学的機能の広い範囲に関与している。
他のPTMは一般的に、特定の部位に対してバイナリ(すなわち、タンパク質が改変または未修飾のまま)であるが、ユビキチンは単量体またはポリマー鎖の両方としてタンパク質を修飾することができ、その後ユビキチン自体はユビキチン化される。また、このポリユビキチン化鎖は、前のユビキチンのユビキチン化を伴ういくつかのトポロジーで開発することができ、8つのリンケージサイト5、6のいずれかに付着している。ユビキチンは、ユビキチンのC末端が7つのリジン残基(K06、K11、K27、K29、K33、K48、またはK63)または以前のユビキチンのN末端(M1または線形5と呼ばれる)にリンクされている多段階酵素プロセス(図1)によって伝達される。この連鎖トポロジーは、修飾下のタンパク質の運命の鍵です。例えば、K48またはK11連結鎖を用いた修飾はプロテアソームでの改変タンパク質の分解をもたらし、一方、NF-kBシグナル伝達の活性化には線形鎖が必要である。したがって、これらの連鎖トポロジの相対的分布は、多種多様な生物学的問題に関連する。
質量分析(MS)の使用は、ユビキチン鎖トポロジ解析には、抗体ベースまたは親和性に基づく相互作用7,8に依存しておらず、その多くは特異性が限られており、様々な鎖型を区別しないため、特に有益である。別の検出可能性は、遺伝子組み換えユビキチン変異体を使用しています。ここで、特定のリジンはアルギニンと交換され、ユビキチンによる修飾を支持することができない。基質タンパク質上のユビキチン鎖形成の欠如は、特定のトポロジ9の証拠として解釈される。
ユビキチン化タンパク質のMSベース同定は、ユビキチンのC末端に、MS分析のためのサンプルのタンパク質分解調製中にトリプシンによって認識される74位にアルギニン残基が含まれているという事実に基づいており、C末端のダブルグリシンを分離する。このGlyGly(-GG)は、基質タンパク質のリジン残基のε-アミノ基に結合したままである。ユビキチントポロジ解析では、ユビキチンの7つのリジン残基のうちの1つに修飾が起こります。これにより、GGによって修飾されたリジン残基を持つ7つの主要なペプチドのセットが作成され、各トポロジーに固有である(図2)。例えば、K06トポロジーでは、アミノ酸配列の位置6のリジンは、このリジンに114 Daの-GG修飾を加えてトリプシン消化から保護される。
MSによる特定の所定のペプチドの同定は、標的プロテオミクス、またはより具体的には、標的ペプチド獲得10と呼ばれる。使用されている質量分析計の性能に応じて、2つの方法が開発されています。これらは、反応モニタリング(SRM)、多重反応モニタリング(MRM)、および並列反応モニタリング(PRM)とも呼ばれる選択される。SRM では、前駆体 m/z と製品イオン m/z からなる遷移の選択が行われます。反対に、PRM は前駆体 m/z のみを必要とします。選択後、生成イオンの完全な調査スキャンが行われる。これは、測定11の前に、特定の質量分析計で定量するための適切な生成イオンの選択が不要であるという利点を有する。SRM と PRM の両方を、計測器に応じてスケジュールできます。スケジューリングとは、特定のイオンが分析に含まれる時間枠を割り当てる練習であり、ペプチドはクロマトグラフィーシステムから定義された保持時間で溶出します。特定の時点で尋問されるイオンの数を減らすことは、その時点で予定されているイオンの尋問の頻度を増加させ、したがって、データの精度を向上させます。
一般に、ユビキチントポロジーに対する標的プロテオミクスの適用は、他の標的プロテオミクス実験と同じである。しかし、2つの重要な違いが重要である:まず、ユビキチン鎖の安定性を考慮する必要があります。細胞のリシス時に鎖を急速に分解する複数の強力なデュービキチン化酵素(DUB)があります。ユビキチン特異的プロテアーゼは、チオエステラーゼとメタロプロテアーゼの2つのカテゴリーに分類されます。ユビキチン-ヒドロラーゼのほとんどはチオエステラーゼであり、活性中心にシステイン残基を運ぶ。このシステイン残基をアルキル化することにより、不活性化することができる。したがって、N-エチルマレイミド(NEM)のようなアルキル化剤を含むユビキチン安定化バッファーと高変性化学物質の使用、およびサンプルを冷やして保持することは、分析を成功させるために不可欠です。第2に、他の標的実験とは異なり、ペプチドの選択は固定される。典型的な標的実験では、タンパク質ペプチドを選んで、クロマトグラフィーとイオン化の性能を良好にします。K48のようないくつかのトポロジ特性ペプチドは、これらの特性は良好であるが、他の人にとっては、それらはあまり望ましくない。例えば、典型的な逆相セットアップにおけるK33クロマトグラフィーは、伸伸溶性プロファイルの形成により不良であり、かつK27ペプチドのイオン化特性が悪いため、MS12によってその視認性が低下する。
本プロトコルでは、PRMによる生体試料のユビキチントポロジアセスメントを行う方法について説明する。この手順のサンプルデータは、いくつかの異なる細胞タイプにおけるMG-132阻害剤処理を用いたプロテアソームの摂動を用いて提示される。
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Protocol
1. 重いペプチド標準の調製
- 購入した重いペプチドのサプライヤーと品質に応じて、重いペプチドを希釈する必要があります。このプロトコルは、表1で報告されたペプチド配列を使用し、リジン(13C615N2-リジン)またはアルギニン(13C615N4-アルギニン)に修飾したC末端アミノ酸を有する。
- 重いペプチドを混合し、50%アセトニトリル(ACN)と混合して、10μMの各ペプチドとのペプチドミックスを作成する。
- ペプチドミックスのアリコートを作成し、-80°Cで保存します。
2. サンプル準備
- サンプルのリシス
注: ユビキチン鎖の安定性は、サンプル調製中に考慮する必要があります。生物学的サンプルとバッファーを 4 °C で冷やし、できるだけ迅速にユビキチン安定化バッファーにサンプルを追加します。- 水に1 M NH4HCO3( 炭酸アンモニウム)の溶液を調製し、1 M NaOHを使用してpHを8に調整します。
- 水に200 mM N-エチルマライムミド(NEM)の溶液を準備します。
- ユビキチン安定化バッファーは、50 mM NH4HCO3/10 mM NEM で 8 M 尿素を使用して準備します。
注:8 M尿素の5 mL溶液は尿素と飽和溶液で水の膨張を与えられて水のかなり少ない5 mLを必要とします。
注意:尿素が高温でポリ尿素を形成する傾向があるため、50°C以上のバッファーを準備しないでください。 - 0.5 μG/μLのタンパク質を目指すユビキチン安定化バッファーで調べる生物学的サンプルを再中断し、サンプルに適した方法で細胞をライゼします。SFX 150ブランソンソニフィエを有する3つの10sパルスからなる超音波処理方法は、各パルス間の氷上で10のブレークを有する70%の強度に設定され、このプロトコルの細胞株に使用された。
- 卓上遠心分離機で4°Cで10分間18,000xgの遠心分離機サンプル。
- 上清を新鮮な低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに移す。サンプルは必要に応じて、この時点で-20 °Cで保存することができます。
- サンプルとコントロールの準備
- サンプルが凍結している場合は、尿素を急速に溶解させるために解凍されている間に混合します(例えば、サーモミキサーで)。
注意:尿素が高温でポリ尿素を形成する傾向があるため、50°Cを超える温度を使用しないでください。 - 卓上遠心分離機で4°Cで10分間18,000xgの遠心分離機サンプル。
- 20 μgのサンプルを新しい低結合マイクロ遠心分離チューブに移し、ユビキチン安定化バッファーでボリュームを 50 μL に調整します。
- ユビキチン安定化バッファー(50 μL)の正規化されたボリュームを使用して、負のコントロールを作成します。このサンプルでは、各ペプチドの光バージョンが存在してはならないため、スパイクイン重いペプチドから生じる光の汚染を観察することができます。この陰性制御は、セクション3.1で説明したPRMの保持時間スケジューリングにも使用された。
- また、ユビキチン安定化バッファーと、ユビキチン安定化バッファー (50 μL) の正規化されたボリュームに市販のチェーンタイプを追加して、正のコントロールを作成しました。一般的に、K63、K48、および M1 が利用可能です。代表結果ではK48、K63、M1の20ngを利用した。
- サンプルが凍結している場合は、尿素を急速に溶解させるために解凍されている間に混合します(例えば、サーモミキサーで)。
- 還元、アルキル化、消化
- 50 mM重炭酸アンモニウム(NH4HCO3)の溶液を水中に調製し、サンプルをpH = 8に1 M NaOHで調整します。
- LBスープで栽培された大腸菌の培養液を5分間遠心してペレットを形成し、その後5μg/μLのユビキチン安定化バッファーで再懸濁する前にPBSで2倍洗浄した。
- 各サンプルとコントロールに大腸菌の1μgを加えます。このプロトコルは大腸菌(DH10B)を使用しますが、ユビキチンのない任意の複雑なライセートを使用することができます。ユビキチンは、すべての真核生物に共通であることに注意してください。
注:大腸菌の母質マトリックスを使用すると、プラスチック製品への非特異的接着によるペプチドの損失を減少させます。これは、タンパク質含有量が限られている陰性コントロールまたはサンプルにおいて特に顕著であり、K6312の観察に強い影響を与える。 - MSグレード水で500 mMトリス(2-カルボックスエチル)ホスフィン(TCEP)の溶液を準備します(DTTは代替として使用することができます)。
- TCEPを最終的な濃度50 mMに加えることによって、サンプルとコントロールを減らします。室温(RT)で30分間インキュベートする前に短時間渦を起こさせる。DTTを使用する場合、温度を50°Cに上昇させる必要があります。
注意:尿素が高温でポリ尿素を形成する傾向があるため、50°Cを超える温度を使用しないでください。 - 550 mM クロロアセトアミド (CAA) の溶液を NH4HCO3で準備します。暗闇の中で保管してください。
- CAAを最終濃度55mMに添加して、サンプルとコントロールをアルキル化します。暗闇の中でRTで20分間インキュベートする前に短時間渦を起た。
注:CAAは、−GG修飾(114.0429)13と間違えられるリジン残基に対する二重カルバミドメチル改変(114.0429)の可能性を減少させる還元剤としてヨードアセトアミドの代わりに使用される。 - タンパク質含有量に対する比率 1:25 (w/w) でサンプルに Endopeptidase LysC を加えます。37°Cで3時間インキュベートする。
- サンプルとコントロールを200 μLの50 mM NH4HCO3 pH = 8 (1:5 v/v)で希釈します。
- タンパク質含有量に対する1:25 w/w比でサンプルにトリプシンを加えます。37°Cで12時間インキュベートする。
- 各サンプルおよび対照サンプルに対して1:10比v/vでMSグレード水に10%のギ酸(FA)溶液を加えます。pH が <3) C18 クリーンアップの前であることを確認し、必要に応じてさらにギ酸を追加します。
- 各サンプルおよび対照に、セクション1で作成された重いペプチド標準の0.5 μLを加えます。
- ペプチドのクリーンアップ
- いくつかのメーカーは、C18 クリーンアップのヒントやプレートを提供しています。使用する製品に関するメーカーの指示に従い、真空遠心分離機で溶出したペプチドをMS分析の準備を整えます。
3. LC-MS/MSによる分析
- 重いペプチド標準に関する初期PRM分析を予定外の方法で実行します。
- 乾燥したサンプルをMS負荷バッファー2%ACN/0.05%トリフルオロ酢酸(TFA)の10 μLで再懸濁します。
- ナノフロー用に設計された逆相C18 分析カラム(75 μm x 15 cm、2 μm 100 Å C18 ビーズ)をHPLCに装備し、MSグレード水を交換する線形勾配を0.1%FAに0.1%含むACNで交換します。分析カラムの寿命を保つ犠牲トラップカラム(75 μm x 2 cm、3 μm、100 Å C18 ビーズ)は、ここで使用しましたが、必須ではありません。
- 分析カラムの出力を高解像度の質量分析計上のナノESIソースに結合します。
- 質量分析計に適当な標的プロテオミクス法を利用する。たとえば、Q-Exactive と 2 つの実験方法では、完全 MS と PRM 実験の間でサイクルを行います。完全な MS 実験では、最大 IT として 1e6 と 240 ミリ秒の AGC 目標を持つ 120,000 の解像度が使用されました。PRM実験では、同じAGC目標と最大ITを使用し、解像度は60,000、分離ウィンドウは1.2 m/zでした。
- HPLCオートサンプラーを使用して、200 ngの陰性制御を分析カラムに注入します。分析カラムのサンプルに線形勾配を適用し、ACN濃度を〜45分の期間で2~25%上昇させます。
注:25%のACN濃度は、典型的なユビキチントポロジ特性ペプチドの親水性が低いため、プロテオミクスでは通常より低くなっています。他のペプチドが定量化される場合、より高いACN濃度が良好な標的分離を達成することが望まれる。 - セクション 4.2 で説明したように、スケジュール実行の結果を分析して、スケジュール済み対象リストを作成します。
- サンプルの分析
- セクション 4.2 で作成されたスケジュール済み包含リストを使用する場合とは別に、3.1 でのスケジュールの説明に従って残りのサンプルを実行します。
注: 前の実行からの繰り越しが後続のサンプルで検出されないように、正のコントロールの後にブランクを実行する必要があります。
- セクション 4.2 で作成されたスケジュール済み包含リストを使用する場合とは別に、3.1 でのスケジュールの説明に従って残りのサンプルを実行します。
4. ソフトウェア分析
- 使用する MS に適した書式の一覧を作成します。このプロトコルは、オープンソースソフトウェアSkyline(バージョン19.1.0.193)(https://skyline.ms)を使用し、十分に文書化されたサポートとヘルプを提供しています。包含リストは、エクスポート隔離リスト機能を使用して、複数の質量分析計に対して作成できます。
- 新しいスカイライン ドキュメントを開きます。
- 重いトポロジ特性ペプチドに適した重い同位体修飾を選択します。[設定] で|[変更]タブの下にある[ペプチド設定]をクリックし、名前フィールドをクリックして、潜在的な変更を確認します。選択は、購入した重いペプチドの同位体状態に基づく。この例では、C末語で重リジン(13C615N2-リジン)または重アルギニン(13C615N4-アルギニン)のいずれかを担持した合成ペプチドが使用された。適切なラベルは、「ラベル:13C(6)15N(2)(C-用語K)」と「ラベル:13C(6)15N(4)(C項R)」となります。
- [設定]を選択します|遷移:[フィルタ] タブには、前駆体料金2、3、4 が含まれます。
- [編集]を選択してペプチドを挿入します|挿入|ペプチド .
- トポロジ特性ペプチド配列とタンパク質名(例えば、「Chain–K63」)を含む関連フィールドを記入してください。
- ターゲットパネルに表示されている各ペプチドを展開します。不要な充電状態を削除します。好ましい電荷状態および衝突エネルギーは、使用される質量分析計に基づいて異なる場合があり、トポロジ特性ペプチドごとに表1に示されている。
- トポロジ特性ペプチドごとに(GGがシーケンスに含まれているM1を除く)、シーケンスを右クリックして [修正]を選択します。名前フィールドをクリックして <すべてを表示.> を選択する前に "GlyGly (K)"。
- 分離リストファイルをエクスポート します|輸出|[隔離リスト]で、計測器の種類を選択し、メソッドの種類を [標準] に設定します。 [OK] を 選択すると、PRM メソッドの作成に使用できる *.csv ファイルを保存するプロンプトが開きます。
- オープンソースのSkylineソフトウェアを使用して、ここで説明する重いペプチドスケジューリングの実行に基づいて、スケジュールされた包含リストを作成します。
- セクション 4.1 で説明されているようにターゲット リストを作成します。
- [ファイル]を選択して、スケジューリング実行を 3.1 でインポート します|インポート|結果:
- ID を確認します。各ペプチドの重いシグナルは、重いペプチドのエントリごとに質量をクリックすることによって観察可能です。ピークの正しい認識は自動的に決定されることが多いが、ソフトウェアはクリックしてX軸下にドラッグしてピークを選択することによって手動キュレーションを必要とする場合がある。
- 重いバリアントに対して選択された保持時間もライト バージョンに適用され、PRM のスケジュールが作成されます。スケジュール設定ウィンドウは、[設定]で変更できます|[予測] タブを使用して、タイム ウィンドウを変更してペプチド設定を行います。
- スケジュールされた対象リストを File を使用してエクスポートできるようになりました |輸出|分離 リストを選択し、適切な機器の種類と設定方法の種類を [スケジュール済み] にします。
- データを分析します。
- セクション 4.2 のスケジューリング実行分析と同じ方法でサンプルをインポートします。
- すべてのサンプルを完全にインポートした後、遷移のキュレーションを推奨します。これは、干渉や低い信号対雑音比を持つ遷移を除去するプロセスです。キュレーション前後のクロマトグラムの例を 図4に示します。
- データをエクスポートするには、関連するグラフを右クリックして[データを コピー ]を選択するか、[ファイル]を選択 します|輸出|結果:
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Representative Results
PRMによるユビキチン鎖分析の使用を実証するために、マウスメラノーマ細胞株B16と2つの一般的なヒト細胞株A549(腺癌性肺胞基底細胞)およびHeLa(子宮頸癌細胞)の3つの細胞株が選択された。これらの培養物は、収穫前に4時間0、10、または100 mM MG-132で処理される前に、適切な培地で中電関数的な相に成長した。MG-132は、プロテアソーム14によるユビキチン共役タンパク質の分解を防止するプロテアソーム阻害剤である。このような場合、ユビキチン連鎖解析を実証することは適切な試験条件である。K48鎖の増加の結果は 図3に見ることができる。プロテアソーム阻害剤治療は、K48鎖15の増加を誘発した。
導入に記載されているように、SRMまたはMRMとは異なり、PRMは前駆体イオンの選択後にフル製品イオンスキャンを行う。これは、製品イオンが実行前に指定される必要がないことを意味しますが、実行後にキュレーションする必要があります。キュレーションとは、意図したペプチドを真に代表する遷移が選択されるプロセスである。 図4 は、K48のキュレーション前後の製品イオンクロマトグラムを示しています。干渉による溶出プロファイルが一致しないシグナルを有する製品イオンは除去した。その後、このような遷移に対するシグナル対雑音比の好ましくないと考えると、低強度の製品イオンを除去した。キュレーション中に選択される最適な遷移は、一般的に実験間で一貫しており、使用される質量分析計、クロマトグラフ条件、分析設定、およびサンプルの生物学的背景によって異なる場合があります。したがって、各調査に対して、遷移の適切なキュレーションが必要です。さらに多くのトランジションを含めることと、技術的な複製と定量化のためのよりクリーンなデータを含めることのバランスも必要です。
この実験で同定されたユビキチン鎖トポロジの各々の典型的な製品イオンクロマトグラムを 図5に示す。K27及びK29は、これらの生物学的条件下でのシグナルが検出以下であったため、ここでは省略されている。ここに示すようにK33の溶出プロファイルは、PRM分析のために一般的に受け入れられるよりもかなり広かった。しかし、ユビキチン鎖分析では、より優れた溶出プロファイルを有するペプチドの代替選択は不可能であり、このプロファイルに基づいて解釈を行う必要があります。K33が特に関心を持つ場合、クロマトグラフィー条件の変化は、この鎖型の定量化を改善するかもしれないが、他の鎖型の損害を与える可能性がある。
PRM実験の設計では、信号対雑音を増加させることにより、定量に使用される生成イオンのシグナルを最大にすることが好ましい。衝突エネルギーの最適化(すなわち、質量分析計が、生成物イオンに前駆ペプチドイオンを断片化するために使用するエネルギー)は、信号を改善することができる16の手段である。14~28の衝突エネルギー範囲を、単一サンプルの繰り返し注入に適用し、結果として観測されたK63とM1のピーク領域を 図6に示した。ご覧のとおり、K63の場合は26の高い衝突エネルギーが最適でしたが、M1の場合は18の低いエネルギーが理想的でした。トポロジ特性ペプチドの衝突エネルギーと未修飾ユビキチンフラグメントの選択を 表1に示す。これらの衝突エネルギーは、使用される質量分析計および断片化法に基づいて最適化する必要がある場合があります。
図1:ユビキチン結合カスケードの概略図。ユビキチンは、まずATP依存的な方法でE1酵素によって結合される。活性化されたユビキチンはE2酵素に移され、E3-リガーゼによって結合され、ユビキチンを基質タンパク質に移す。このプロセスは、ユビキチン鎖が基質タンパク質上に形成されるまで数回繰り返される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ユビキチントポロジ特性ペプチドの誘導を示す図。上流結合部位のトリプティック消化後は、下流ユビキチンの-GG-C末端を取り付けて誘導される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:マウス細胞株B16とヒト細胞株A459とHeLaのMG-132治療におけるK48鎖の比較。A459ではMG-132の濃度を増加させ、K48鎖の安定化につながった。B16およびHeLa細胞では、10 mMまたは100 mM MG-132のいずれかで治療を受けて増加が見られた。10 mMから100 mMに観察された減少は、Mg-132に対するB16およびHeLa細胞の感受性の増加によって説明され、細胞死につながる。誤差範囲は、遷移の標準偏差を示します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:M1トポロジ特性ペプチドの生成イオンクロマトグラムは、干渉または低強度の遷移のキュレーションの前後に行った。X軸の保持時間は分単位で表示されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:様々なトポロジ特性ペプチドの代表的なイオンクロマトグラム、ならびに2つの非修飾ユビキチンペプチド。各ペプチドの溶出時間と観察された質量誤差は、関連するピークの頂点を上回って報告される。点線はピーク領域の判定用ウィンドウも示す。X軸の保持時間は分単位で表示されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:正規化された一連の衝突エネルギーに対してK63とM1のピーク面積を観測した。異なる色は、各遷移によって寄与されるイオンの強度を表します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| チェーンタイプ | トポロジー特性ペプチド | 充電状態 | 正規化された衝突エネルギー |
| K06 | ムチフク[GG]TLTGK | 3 | 18 |
| K11 | TLTGK[GG]タイトルベップスディティエンク | 3 | 18 |
| K27 | タイトルベプスドティエンク[GG]AK | 3 | 18 |
| K29 | AK[GG]IQDK | 2 | 22 |
| K33 | IQDK[GG]エギップドクQR | 3 | 18 |
| K48 | リファクク[GG]QLEDGR | 3 | 24 |
| K63 | TLSDYNIQK[GG]ESTLHLVLR | 4 | 26 |
| M1 (線形) | グムチフク | 2 | 18 |
| 非修飾ウブキイチン | エストルルヴル | 2 | 26 |
| 非修飾ウブキイチン | タイトルベプスドティエンク | 2 | 18 |
| 非修飾ウブキイチン | TLSDYNIQK | 2 | 18 |
表1:ヒトユビキチントポロジ特性ペプチドに対する配列は、最も観察可能な電荷状態、および良好な正規化された衝突エネルギーである。
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Discussion
プロテオーム内のユビキチン状態の解析は、多種多様な生物学的問題に対して重要性を増している。サンプルのユビキチン化状態の記述は、ユビキチン化されるタンパク質のプロファイルだけでなく、ユビキチン化のトポロジーにも焦点を当てる必要があります。ここで説明するように、標的MSによるこのトポロジーの評価は、広範囲の生物学的調査において役割を有する。
ここで説明するプロトコルは、グローバル トポロジ プロファイルを提供することを理解する必要があります。ボトムアッププロテオミクスアプローチを使用すると、ユビキチンペプチドを含むユビキチン化されたペプチドの決定が可能になります。ユビキチンペプチドのユビキチン化の観察は、鎖位相の決定を可能にするが、ユビキチンの標的へのリンクは失われる。したがって、特定のタンパク質上の特定の連鎖トポロジーは特定できませんが、グローバルトポロジープロファイルが導出されます。このメソッドをエンリッチメント戦略と組み合わせて、よりターゲットを絞った結果を提供することもできます。このような濃縮は、チェーンの安定性とチェーンポスト濃縮の豊富さを考慮する必要があります。鎖位相の検出は、濃縮戦略が提供する純度によって制限され、汚染タンパク質にリンクされたユビキチントポロジと目的のタンパク質にリンクされたものを区別することはできない。このプロトコルの重要なステップは、分析を成功させ、ユビキチンタンパク質を消化しながらユビキチン鎖を保存するというバランスです。これは酵素消化にユビキチン自体の抵抗に相まって鎖破壊の傾向に挑戦しています。さらに、液体クロマトグラフィー結合質量分析に対するトポロジ特性ペプチドの一部の好ましくない性質を考慮して、支持マトリックスの添加とMS条件の慎重な検討が必要です。
このプロトコルでは、すべてのユビキチン連鎖タイプを同時に評価できる手段を概説しましたが、目的の特定のチェーントポロジに基づいてプロトコルのいくつかの側面を調整することも可能です。クロマトグラフィー条件を操作したり、重いペプチド濃度を変化させたりすると、調査の精度を高め、特定の連鎖トポロジーの結果を改善し、提案された生物学的な質問に合わせて調査を調整することができます。
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Disclosures
著者らは競合する利益を宣言しない。
Acknowledgments
著者らは、代表的な結果に記載されているようにMG-132の治療を伴う細胞ペレットの作成に関するセリーヌ・ジャンティの支援と、プロトコルで使用される大腸菌ペレットの提供に対するエリーゼ・モマーツに感謝したいと考えている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (ACN) | Merck | 100029 | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | Fluka | 9830 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 16 | |
| Chloroacetamide (CAA) | Sigma | 22790 | |
| Eppendorf LoBind | Eppendorf | 22431081 | |
| Formic acid (FA) | Thermo Fisher Scientific | 85178 | |
| Heavy Peptides | JPT Peptide Technologies | ||
| HPLC | Dionex | Ulitimate 3000 | |
| LC Column | Thermo Fisher Scientific | 160321 | |
| Lys C | Wako | 125-05061 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | Q-Exactive Plus | |
| N-ethylmaleimide (NEM) | ACROS Organics | 156100050 | |
| Positive Control Chain K48 | Boston Biochem | UC-240 | |
| Positive Control Chain K63 | Boston Biochem | UC-340-100 | |
| Positive Control Chain M1 | Boston Biochem | UC-710B-025 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S5881 | |
| Sonifier | Branson sonifier | SFX 150 | |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigam | T6508 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Thermo Fisher Scientific | 77720 | |
| Trypsin | Promega | V1511A | |
| Urea | Sigma | 51456 | |
| Waters μElution C18 plates | Waters | 186002318 |
References
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