Summary
Denne metoden beskriver vurderingen av globale endringer i allestedsnærværende kjedetopologi. Vurderingen utføres ved bruk av en massespektrometribasert målrettet proteomikktilnærming.
Abstract
Vurdering av den globale profilen til allestedsnærværende kjedetopologier i et proteom er av interesse for å svare på et bredt spekter av biologiske spørsmål. Protokollen som er skissert her, drar nytte av di-glycin (-GG) modifikasjonen som er igjen etter den tryptiske fordøyelsen av allestedsnærværende inkorporert i en kjede. Ved å kvantifisere disse topologi-karakteristiske peptidene kan den relative overfloden av hver allestedsnærværende kjedetopologi bestemmes. Trinnene som kreves for å kvantifisere disse peptidene ved et parallelt reaksjonsovervåkingseksperiment, rapporteres med tanke på stabilisering av allestedsnærværende kjeder. Forberedelse av tunge kontroller, cellelys og fordøyelse beskrives sammen med riktig massespektrometeroppsett og arbeidsflyt for dataanalyse. Et eksempel på datasett med perturbasjoner i allestedsnærværende topologi presenteres, ledsaget av eksempler på hvordan optimalisering av protokollen kan påvirke resultatene. Ved å følge trinnene som er skissert, vil en bruker kunne utføre en global vurdering av det allestedsnærværende topologilandskapet i sin biologiske kontekst.
Introduction
Den nære reguleringen av proteinfunksjon og stabilitet er av avgjørende betydning, da de er viktige drivere for fenotypisk kontroll av biologi. Funksjonen til et protein er konstruert av to komponenter: dens iboende polypeptidsekvens og eventuelle posttranslasjonelle modifikasjoner (PTMer). Ulike kjemiske PTMer er identifisert, inkludert glykosylering, fosforylering, acetylering og metylering1. I 1975 identifiserte Goldstein et al.2 et lite protein og kalte det allestedsnærværende på grunn av sin allestedsnærværende natur. Ubiquitin ble funnet å være viktig i proteinforringelse3. Men siden da har det blitt fastslått at funksjonen til allestedsnærværende som et signalmolekyl strekker seg langt utover reguleringen av proteinstabilitet. Ubiquitin signalering er involvert i et bredt spekter av andre biologiske funksjoner, for eksempel proteinstabilisering, autofagi, cellesykluskontroll og proteinhandel4.
Mens andre PTMer generelt er binære (dvs. proteinet er modifisert eller forlatt umodifisert) for et gitt sted, kan allestedsnærværende modifisere et protein både som en monomer eller som en polymerkjede, med den vedlagte allestedsnærværende selv som allestedsnærværende. Videre kan denne polyubiquitination kjeden utvikle seg i flere topologier med allestedsnærværende av den forrige allestedsnærværende feste til en av åtte koblingssteder5,6. Ubiquitin overføres av en multistep enzymatisk prosess (Figur 1) der C-terminus av ubiquitin er knyttet til en av sine syv lysinrester (K06, K11, K27, K29, K33, K48 eller K63) eller N-terminalen til den forrige allestedsnærværende (referert til som M1 eller lineær allestedsnærværende)5,6. Denne kjedetopologien er nøkkelen til proteinets skjebne under modifikasjon. For eksempel fører modifikasjonen med en K48 eller K11 koblet kjede til nedbrytning av det modifiserte proteinet ved proteasomet, mens en lineær kjede er nødvendig for aktivering av NF-kB-signalering. Dermed er den relative fordelingen av disse kjedetopologiene relevant for et bredt spekter av biologiske spørsmål.
Bruken av massespektrometri (MS) er spesielt fordelaktig for allestedsnærværende kjedetopologianalyse, da den ikke er avhengig av antistoffbaserte eller affinitetsbaserte interaksjoner7,8, hvorav mange har begrenset spesifisitet og ikke skiller mellom de ulike kjedetypene. En annen deteksjonsmulighet er å bruke genetisk modifiserte allestedsnærværende mutanter. Her byttes en bestemt lysin mot arginin, som ikke kan støtte modifikasjonen av ubiquitin. Mangelen på allestedsnærværende kjededannelse på substratproteinet tolkes deretter som bevis for en bestemt topologi9.
MS-basert identifikasjon av allestedsnærværende proteiner er basert på det faktum at C-terminus av allestedsnærværende inneholder en argininrester i posisjon 74 som gjenkjennes av trypsin under proteolytisk fremstilling av prøvene for MS-analyse, som skiller C-terminal dobbel glycin. Denne GlyGly (-GG) forblir festet til ε-aminogruppen av lysinrester av substratproteinet. For allestedsnærværende topologi analyse skjer modifikasjonen på en av de syv lysinrester av ubiquitin. Dette oppretter et sett med syv viktige peptider som bærer en lysinrester som er modifisert av GG, spesifikk for hver av topologiene (Figur 2). For eksempel, med K06 topologi, vil lysinen i posisjon 6 på aminosyresekvensen bli beskyttet mot tryptisk fordøyelse med en -GG-modifikasjon på 114 Da lagt til denne lysinen.
Identifisering av spesifikke forhåndsbestemte peptider av MS kalles målrettet proteomikk, eller mer spesifikt, målrettet peptidanskaffelse10. To metoder er utviklet avhengig av ytelsen til massespektrometeret som brukes. Dette er valgt reaksjonsovervåking (SRM), også kalt multippel reaksjonsovervåking (MRM), og parallell reaksjonsovervåking (PRM). SRM innebærer valg av overganger som består av forløperen m/z og produktet ion m/z. På den annen side krever PRM bare forløperen m/z. Etter valg utføres en fullstendig undersøkelsesskanning av produktionene. Dette har fordelen at det ikke er nødvendig med valg av passende produktioner for kvantgering på det spesifikke massespektrometeret før målingen11. Både SRM og PRM kan, avhengig av instrumentet, planlegges. Planlegging er praksisen med å tilordne et tidsvindu der en bestemt ion vil bli inkludert for analyse, da peptider eluterer på definerte oppbevaringstider fra det kromatografiske systemet. Å redusere antall ioner som blir avhørt til enhver tid øker hyppigheten av avhør av de ionene som er planlagt på den tiden, og forbedrer dermed datanøyaktigheten.
Generelt er anvendelsen av målrettet proteomikk for allestedsnærværende topologi det samme som alle andre målrettede proteomikkeksperimenter. Imidlertid er to viktige forskjeller viktige: For det første må stabiliteten til allestedsnærværende kjeder vurderes. Det er flere potente deubiquitinating enzymer (DUB) som raskt nedbryter kjeder på cellelys. De allestedsnærværende spesifikke proteasene faller inn i to kategorier, tioesteraser og metalloproteaser. De fleste av allestedsnærværende hydrolaser er tioesteraser og bærer en cysteinrester i sitt aktive senter. Ved å alkylere denne cysteinrester, kan de inaktiveres. Som sådan er bruk av allestedsnærværende stabiliseringsbuffere som inneholder alkyleringsmidler, som N-etylmalimid (NEM), og svært denaturerende kjemikalier, og det er viktig å holde prøvene avkjølt for en vellykket analyse. For det andre, i motsetning til andre målrettede eksperimenter, er peptidvalget løst. I et typisk målrettet eksperiment kan et proteotypisk peptid velges for god kromatografisk og iioniseringsytelse. For noen topologi-karakteristiske peptider som K48 er disse egenskapene gode, mens for andre er de mindre ønskelige. For eksempel er K33-kromatografien i et typisk omvendt faseoppsett dårlig på grunn av dannelsen av en strukket elutionprofil, og de dårlige iioniseringsegenskapene til K27-peptidet reduserer synligheten med MS12.
I denne protokollen beskriver vi hvordan man utfører allestedsnærværende topologivurdering av en biologisk prøve av PRM. Eksempeldata for prosedyren presenteres ved hjelp av en perturbasjon av proteasomet ved hjelp av MG-132 hemmerbehandling i flere forskjellige celletyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av en tung peptidstandard
- Avhengig av leverandør og kvalitet på de tunge peptidene som er kjøpt, må de tunge peptidene fortynnes. Denne protokollen brukte peptidsekvensene rapportert i tabell 1, med C-terminal aminosyre modifisert til Lysine (13C615N2-lysin) eller Arginin (13C615N4-arginin).
- Bland de tunge peptidene, fortynn blandingen med 50% acetonitril (ACN) for å lage en peptidblanding med hvert peptid ved 10 μM.
- Lag aliquots av peptidblandingen og oppbevar ved -80 °C.
2. Prøvepreparering
- Eksempel på lysis
MERK: Stabiliteten til allestedsnærværende kjeder må vurderes under prøvepreparering. Hold biologiske prøver og buffere avkjølt ved 4 °C og legg til prøver i allestedsnærværende stabiliseringsbuffer så raskt som mulig.- Forbered en løsning på 1 M NH4HCO3 (ammoniumbikarbonat) i vann og juster pH til 8 ved hjelp av 1 M NaOH.
- Forbered en løsning på 200 mM N-etylmalimid (NEM) i vann.
- Klargjør allestedsnærværende stabiliseringsbuffer ved hjelp av 8 M urea i 50 mM NH4HCO3/10 mM NEM. Ubiquitin stabiliseringsbuffer må tilberedes fersk hver gang.
MERK: En 5 ml løsning på 8 M urea vil kreve betydelig mindre enn 5 ml vann gitt utvidelse av vann når det er i en mettet løsning med urea.
FORSIKTIG: Ikke klargjør bufferen over 50 °C på grunn av tendensen til urea til å danne polyurea ved høye temperaturer. - Resuspend den biologiske prøven som skal undersøkes i allestedsnærværende stabiliseringsbuffer med sikte på 0,5 μg / μL protein og lyse cellene med en passende metode for prøven. En sonikeringsmetode bestående av tre 10 s pulser med en SFX 150 Branson-sonifikator satt til 70% intensitet med 10 s brudd på is mellom hver puls, ble brukt til cellelinjene i denne protokollen.
- Sentrifugeprøve ved 18 000 x g i 10 min ved 4 °C i en sentrifuge på bordplaten.
- Overfør supernatant til et friskt mikrosenterrør med lavt proteinbinding. Prøver kan lagres ved -20 °C på dette tidspunktet om nødvendig.
- Utarbeidelse av utvalg og kontroller
- Hvis prøvene er frosset, bland (f.eks. med en thermomixer) mens de tines for raskt å oppløse ureaen.
FORSIKTIG: Ikke bruk temperaturer over 50 °C på grunn av tendensen til urea til å danne polyurea ved høye temperaturer. - Sentrifugeprøve ved 18 000 x g i 10 min ved 4 °C i en sentrifuge på bordplaten.
- Overfør 20 μg prøve til et friskt mikrosenterrør med lav binding og juster volumet til 50 μL med allestedsnærværende stabiliseringsbuffer.
- Lag en negativ kontroll ved hjelp av et normalisert volum av allestedsnærværende stabiliseringsbuffer (50 μL). I denne prøven bør ingen lett versjon av hvert peptid være til stede, slik at observasjon av lysforurensning som oppstår fra de spike-in tunge peptidene. Denne negative kontrollen ble også brukt til oppbevaringstidsplanlegging av PRM beskrevet i avsnitt 3.1.
- En positiv kontroll ble også opprettet med allestedsnærværende stabiliseringsbuffer og tilsetning av kommersielt tilgjengelige kjedetyper til det normaliserte volumet av allestedsnærværende stabiliseringsbuffer (50 μL). Vanligvis er K63, K48 og M1 tilgjengelige. I de representative resultatene ble det benyttet 20 ng K48, K63 og M1.
- Hvis prøvene er frosset, bland (f.eks. med en thermomixer) mens de tines for raskt å oppløse ureaen.
- Reduksjon, alkylering og fordøyelse
- Forbered en løsning på 50 mM ammoniumbikarbonat (NH4HCO3) i vann og juster prøven til pH = 8 med 1 M NaOH.
- En kultur av E. coli dyrket i LB kjøttkraft ble sentrifugert 5000 x g i 5 min for å danne en pellets, som deretter ble vasket 2x med PBS før resuspension i allestedsnærværende stabilisering buffer ved 5 μg /μL.
- Tilsett 1 μg E. coli lysat i hver prøve og kontroll. Denne protokollen bruker E. coli (DH10B), men ethvert komplekst lysat uten allestedsnærværende kan brukes. Legg merke til at ubiquitin er vanlig for alle eukaryoter.
MERK: Bruk av en E. coli lysate matrise reduserer tap av peptider på grunn av ikke-spesifikk vedheft til plastikk. Dette er spesielt merkbart i negativ kontroll eller prøver med begrenset proteininnhold og har en sterk innvirkning på observasjonen av K6312. - Forbered en løsning på 500 mM tris (2-karboksyetyl)fosfin (TCEP) i MS-klasse vann (DTT kan brukes som et alternativ).
- Reduser prøvene og kontrollene ved å legge TCEP til en endelig konsentrasjon på 50 mM. Vortex kort før inkubering i 30 min ved romtemperatur (RT). Hvis DTT brukes, må temperaturen heves til 50 °C.
FORSIKTIG: Ikke bruk temperaturer over 50 °C på grunn av tendensen til urea til å danne polyurea ved høye temperaturer. - Forbered en løsning på 550 mM kloroacetamid (CAA) i NH4HCO3. Oppbevar i mørket.
- Alkylat prøvene og kontrollene ved å legge CAA til en endelig konsentrasjon på 55 mM. Vortex kort før inkubering i 20 min på RT i mørket.
MERK: Caa brukes i stedet for iodoacetamid som reduksjonsmiddel for å redusere sjansen for en dobbel karboamidometylmodifikasjon (114.0429) på en lysinrester som forveksles med en -GG-modifikasjon (114.0429)13. - Tilsett endopeptidase LysC i prøvene ved 1:25 (w/w) forhold til proteininnholdet. Inkuber i 3 timer ved 37 °C.
- Fortynn prøvene og kontrollene med 200 μL 50 mM NH4HCO3 pH = 8 (1:5 v/v).
- Legg trypsin til prøvene med forholdet 1:25 m/w til proteininnholdet. Inkuber i 12 timer ved 37 °C.
- Tilsett 10 % maursyre (FA)-oppløsning i ms-klasse vann med et 1:10-forhold v/v i hver prøve- og kontrollprøve. Kontroller at pH er <3) før oppryddingen av C18 og tilsett mer maursyre om nødvendig.
- Til hver prøve og kontroll legger du til 0,5 μL av den tunge peptidstandarden som er opprettet i avsnitt 1.
- Peptid opprydding
- Flere produsenter tilbyr C18 opprydding tips eller plater. Følg produsentens anvisninger for produktet som brukes, og tørre, rømte peptider i en vakuumsentrifuge, klar for MS-analyse.
3. Analyse av LC-MS/MS
- Utfør innledende PRM-analyse på den tunge peptidstandarden på en uplanlagt måte.
- Resuspend de tørkede prøvene i 10 μL MS-lastebuffer 2% ACN / 0,05% trifluoroacetisk syre (TFA).
- Utstyr en HPLC med en omvendt fase C18 analytisk kolonne (75 μm x 15 cm, 2 μm 100 Å C18 perler) designet for nanoflow MS. Form lineære gradienter som utveksler MS-klasse vann supplert med 0,1% FA med ACN som inneholder 0,1% FA. En offerfellekolonne (75 μm x 2 cm, 3 μm, 100 Å C18 perler) for å bevare levetiden til den analytiske kolonnen ble brukt her, men er ikke nødvendig.
- Koble utgangen av den analytiske kolonnen til en nano-ESI-kilde på et høyoppløselig massespektrometer.
- Bruk en passende målrettet proteomikkmetode for massespektrometeret. På en Q-Exactive pluss en metode med to eksperimenter, kan du for eksempel veksle mellom en Full MS og et PRM-eksperiment. For Full MS-eksperimentet ble det brukt en oppløsning på 120 000 med et AGC-mål på 1e6 og 240 ms siden Maksimal IT ble brukt. For PRM-eksperimentet ble det samme AGC-målet og maksimal IT brukt med en lavere oppløsning på 60 000 og et isolasjonsvindu på 1,2 m/z.
- Injiser 200 ng av den negative kontrollen på den analytiske kolonnen ved hjelp av HPLC autosampler. Påfør en lineær gradient på prøven på den analytiske kolonnen som øker ACN-konsentrasjonen fra 2-25% over en periode på ~ 45 min.
MERK: 25% ACN-konsentrasjonen er lavere enn vanlig for proteomikk på grunn av den lave hydrofile naturen til typiske allestedsnærværende topologi-karakteristiske peptider. Hvis andre peptider skal kvantifiseres, kan en høyere ACN-konsentrasjon ønskes for å oppnå god målseparasjon. - Analyser resultatene av planleggingskjøringen som beskrevet i del 4.2 for å opprette en planlagt inkluderingsliste.
- Analyse av prøvene
- Kjør de gjenværende eksemplene som beskrevet for planleggingen i 3.1, bortsett fra bruken av den planlagte inkluderingslisten som er opprettet i del 4.2.
MERK: Et tomt felt må kjøres etter den positive kontrollen for å sikre at ingen overføring fra forrige kjøring oppdages i etterfølgende prøver.
- Kjør de gjenværende eksemplene som beskrevet for planleggingen i 3.1, bortsett fra bruken av den planlagte inkluderingslisten som er opprettet i del 4.2.
4. Programvareanalyse
- Opprett en inkluderingsliste med riktig formatering for den brukte MS. Denne protokollen brukte open source-programvaren Skyline (versjon 19.1.0.193) (https://skyline.ms), som tilbyr veldokumentert støtte og hjelp. En inkluderingsliste kan opprettes for flere massespektrometre ved hjelp av eksportisolasjonslisteanlegget.
- Åpne et nytt Skyline-dokument.
- Velg tunge isotopmodifikasjoner etter behov for tunge topologi-karakteristiske peptider. I Innstillinger| Peptidinnstillinger under kategorien Endring klikker du på navnefeltet for å se den potensielle endringen. Utvalget er basert på den isotopiske tilstanden til de tunge peptidene som er kjøpt. I dette eksemplet ble syntetiske peptider som bærer enten en tung Lysine (13C615N2-lysin) eller en tung Arginine (13C615N4-arginin) ved C-terminus brukt. Passende etiketter vil være: "Label:13C(6)15N(2) (C-term K)" og "Label:13C(6)15N(4) (C-term R)".
- Velg Innstillinger| Overgang. I kategorien Filter finner du Forløperkostnader 2, 3, 4.
- Sett inn peptider ved å velge Rediger| Sett inn| Peptider.
- Fyll ut de aktuelle feltene, inkludert den topologi-karakteristiske peptidsekvensen og et proteinnavn (f.eks.
- Utvid hvert peptid som nå vises i Mål-panelet. Slett uønskede gebyrtilstander. Den foretrukne ladetilstanden og kollisjonsenergien, som kan variere basert på massespektrometer som brukes, for hvert topologi-karakteristisk peptid er vist i tabell 1.
- For hvert topologi-karakteristisk peptid (unntatt M1 der GG er inkludert i sekvensen) høyreklikker du på sekvensen og velger Endre. Legg til en GG som en strukturell endring ved å klikke navnefeltet og velge <Vis alle... > før du velger "GlyGly (K)".
- Eksporter isolasjonslistefilen| Eksporter| Isolasjonsliste, velg instrumenttype og sett metodetypen til Standard. Hvis du velger OK , åpnes en melding om å lagre en *.csv fil som kan brukes til å opprette en PRM-metode.
- Lag en planlagt inkluderingsliste basert på et tungt peptidplanleggingsløp forklart her ved hjelp av open source Skyline-programvaren.
- Opprett en målliste som beskrevet i del 4.1.
- Importer planleggingskjøringen i 3.1 ved å velge Fil| Importer| Resultater.
- Se gjennom identifikasjonene. Det tunge signalet for hvert peptid er observerbart ved å klikke på massen for hver tunge peptidinngang. Riktig gjenkjennelse av toppen bestemmes ofte automatisk, men programvaren kan kreve manuell kurasjon ved å velge toppen ved å klikke og dra under x-aksen.
- Oppbevaringstider valgt for de tunge variantene brukes også på lysversjonene, og skaper dermed en tidsplan for PRM. Planleggingsvinduet kan endres under Innstillinger| Peptidinnstillinger ved hjelp av kategorien Forutsigelse ved å endre tidsvinduet.
- En planlagt inkluderingsliste kan nå eksporteres ved hjelp av Fil| Eksporter| Isolasjonsliste og valg av riktig instrumenttype og innstillingsmetodetype til Planlagt.
- Analyser dataene.
- Importer eksemplene på samme måte som for planleggingskjøringsanalysen i del 4.2.
- Etter fullstendig import av alle prøver anbefales kurasjon av overganger. Dette er prosessen der overganger med forstyrrelser eller dårlige signal-til-støy-forhold fjernes. Et eksempel på et kromatogram før og etter kurasjon vises i figur 4.
- Data kan nå eksporteres enten ved å høyreklikke på relevante grafer og velge Kopier data eller ved å velge Fil| Eksporter| Resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å demonstrere bruken av en allestedsnærværende kjedeanalyse av PRM, ble tre cellelinjer valgt: en mus melanomcellelinje B16, og de to vanlige menneskelige cellelinjene A549 (adenokarcinomiske alveolar basale epitelceller) og HeLa (livmorhalskreftceller). Disse kulturene vokste til midteksponentielt fase i passende medier før de ble behandlet med 0, 10 eller 100 mM MG-132 i 4 timer før høsting. MG-132 er en proteasomhemmer som forhindrer nedbrytning av allestedsnærværende konjugede proteiner av proteasomet14. Gitt slike er det en passende testtilstand for å demonstrere allestedsnærværende kjedeanalyse. Den resulterende økningen i K48-kjeden kan ses i figur 3. Proteasomhemmerbehandling førte til en økning i K48-kjedene15.
Som beskrevet i introduksjonen, i motsetning til SRM eller MRM, utfører PRM en full produktionskanning etter valg av forløperion. Selv om dette betyr at produktioner ikke trenger å angis før kjøringen, bør de fortsatt kurateres etter kjøring. Kurasjon er prosessen der overganger som virkelig er representative for det tiltenkte peptidet, velges. Figur 4 viser produktets ionkromatogram for K48 før og etter kurasjon. Produktioner som har et signal med en inkonsekvent elutionprofil som sannsynligvis skyldes interferens, ble fjernet. Produktioner med lav intensitet ble deretter fjernet gitt at signal-til-støy-forholdet er mindre gunstig for slike overganger. De optimale overgangene som velges under kurasjon vil vanligvis være konsistente mellom eksperimenter, og kan variere avhengig av massespektrometeret som brukes, kromatografiske forhold, analyseinnstillinger og den biologiske bakgrunnen til prøven. For hver undersøkelse er det derfor nødvendig med riktig kurasjon av overganger. Det kreves også en balanse mellom inkludering av flere overganger og dermed tekniske replikeringer og renere data for kvantifisering.
Typiske produkt-ionkromatogrammer for hver av de identifiserte allestedsnærværende kjedetopologiene i dette eksperimentet er vist i figur 5. K27 og K29 er utelatt her fordi signalet under disse biologiske forholdene var under deteksjon. Elution-profilen til K33 som vist her var betydelig bredere enn det som ofte ville bli akseptert for PRM-analyse. Alternativt utvalg av peptider med bedre elutionprofiler er imidlertid ikke mulig i allestedsnærværende kjedeanalyse, og det må gjøres en tolkning basert på denne profilen. Hvis K33 er av spesiell interesse, kan endrede kromatografiske forhold forbedre kvantifiseringen av denne kjedetypen, men sannsynligvis skade andre kjedetyper.
Ved utforming av et PRM-eksperiment er det å foretrekke å maksimere signalet til produktionene som brukes til kvantifisering ved å øke signal-til-støy. Optimalisering av kollisjonsenergi (dvs. energien som brukes av massespektrometeret til å fragmentere forløperpeptidioner til produktioner) er en måte signalet kan forbedrespå 16. Et kollisjonsenergiområde fra 14–28 ble brukt på gjentatte injeksjoner av en enkelt prøve med de observerte toppområdene K63 og M1 vist i figur 6. Som man kan se, for K63 var en høyere kollisjonsenergi på 26 optimal, mens for M1 var en lavere energi på 18 ideell. Kollisjonsenergien for hvert topologi-karakteristisk peptid og et utvalg av umodifiserte allestedsnærværende fragmenter er vist i tabell 1. Disse kollisjonsenergiene må kanskje optimaliseres basert på massespektrometeret og fragmenteringsmetoden som brukes.
Figur 1: Skjematisk representasjon av den allestedsnærværende konjugaterende kaskaden. Ubiquitin er først bundet av et E1-enzym på en ATP-avhengig måte. Det aktiverte allestedsnærværende blir deretter overført til et E2-enzym som deretter sammenføyes av en E3-ligase for å overføre ubiquitin til substratproteinet. Denne prosessen gjentas flere ganger til en allestedsnærværende kjede dannes på substratproteinet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Diagram som viser avledningen av det allestedsnærværende topologi-karakteristiske peptidet. Post tryptisk fordøyelse oppstrøms bindingsstedet er avledet med -GG C-terminalen til nedstrøms ubiquitin festet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Sammenligning av K48-kjede under MG-132-behandling for en musecellelinje B16 og de to humane cellelinjene A459 og HeLa. I A459 førte økende konsentrasjoner av MG-132 til stabilisering av K48-kjeder. Med B16- og HeLa-celler ble det sett en økning under behandling med enten 10 mM eller 100 mM MG-132. Nedgangen observert fra 10 mM til 100 mM kan forklares med økt følsomhet for B16- og HeLa-celler til MG-132, noe som fører til celledød. Feilfelt viser standardavviket for overgangene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Produkt-ionkromatogrammer av det M1 topologi-karakteristiske peptidet før og etter kurasjon av overganger for interferens eller lav intensitet. Oppbevaringstid på x-aksen vises i minutter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Typisk produktionkromatogram av ulike topologi-karakteristiske peptider samt to ikke-modifiserte allestedsnærværende peptider. Elutionstiden i minutter og observert massefeil for hvert peptid rapporteres over toppen av den aktuelle toppen. Prikkede linjer viser også vinduet for fastsettelse av toppområdet. Oppbevaringstid på x-aksen vises i minutter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Observert toppområde for K63 og M1 over en rekke normaliserte kollisjonsenergier. De forskjellige fargene representerer ionintensiteten som hver overgang har bidratt med. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Kjedetype | Topologi Karakteristisk Peptid | Ladetilstand | Normalisert kollisjonsenergi |
| K06 | MQIFVK[GG]TLTGK | 3 | 18 |
| K11 | TLTGK[GG]TITTELVEPSDTIENVK | 3 | 18 |
| K27 | TITTELVEPSDTIENVK[GG]AK | 3 | 18 |
| K29 | AK[GG]IQDK | 2 | 22 |
| K33 | IQDK[GG]EGIPPDQQR | 3 | 18 |
| K48 | LIFAGK[GG]QLEDGR | 3 | 24 |
| K63 | TLSDYNIQK[GG]ESTLHLVLR | 4 | 26 |
| M1 (lineær) | GGMQIFVK | 2 | 18 |
| Ikke endret Ubqiuitin | ESTLHLVLR | 2 | 26 |
| Ikke endret Ubqiuitin | TITTELVEPSDTIENVK | 2 | 18 |
| Ikke endret Ubqiuitin | TLSDYNIQK | 2 | 18 |
Tabell 1: Sekvenser for de humane allestedsnærværende topologi-karakteristiske peptidene, den mest observerbare ladetilstanden og gunstig normalisert kollisjonsenergi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analyse av allestedsnærværende tilstand i et proteom er av økende betydning for et bredt spekter av biologiske spørsmål. Beskrivelsen av allestedsnærværende tilstand av en prøve må fokusere ikke bare på profilen av proteiner som blir allestedsnærværende, men også på topologien til en slik allestedsnærværende. Vurderingen av denne topologien ved målrettet MS, som beskrevet her, har en rolle i et bredt spekter av biologiske undersøkelser.
Det skal forstås at protokollen som er skissert her gir en global topologiprofil. Bruk av en nedenfra-og-opp proteomikk tilnærming gjør det mulig å bestemme peptider som var allestedsnærværende, inkludert allestedsnærværende peptider. Observasjonen av allestedsnærværende allestedsnærværende peptider tillater bestemmelse av kjedetopologien, men koblingen til målet for allestedsnærværende går tapt. Dermed kan den spesielle kjedetopologien på et gitt protein ikke bestemmes, men en global topologiprofil er avledet. Metoden kan også kombineres med en berikelsesstrategi for å gi mer målrettede resultater. En slik berikelse må vurdere kjedestabiliteten og overflod av kjeder etter berikelse. Påvisning av kjedetopologien er begrenset av renheten berikelsesstrategien gir, da det ikke er mulig å skille en allestedsnærværende topologi knyttet til et forurensende protein fra de som er knyttet til proteinet av interesse. Det kritiske trinnet i denne protokollen, som letter en vellykket analyse, er balansen mellom å bevare allestedsnærværende kjeden mens du fordøyer ubiquitinproteinet. Dette er utfordrende på grunn av tilbøyeligheten til kjedebrudd kombinert med motstanden til allestedsnærværende selv til enzymatisk fordøyelse. Videre er det nødvendig med tilsetning av en støttematrise og nøye vurdering av MS-forhold gitt den mindre gunstige naturen til noen av de topologi-karakteristiske peptidene til flytende kromatografisk koblet massespektrometrisk analyse.
Mens vi har skissert i denne protokollen en måte som alle allestedsnærværende kjedetyper kan vurderes samtidig, er det også mulig å justere flere aspekter av protokollen basert på den aktuelle kjedetopologien av interesse. Manipulering av kromatografiske forhold eller variere de tunge peptidkonsentrasjonene kan øke nøyaktigheten av en undersøkelse, forbedre resultatene for en bestemt kjedetopologi og skreddersy undersøkelsen til det biologiske spørsmålet som foreslås.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke Céline Jeanty for hennes hjelp til å lage cellulære pellets med behandling av MG-132 som beskrevet i de representative resultatene og Elise Mommaerts for hennes levering av E. coli pellets som brukes i protokollen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (ACN) | Merck | 100029 | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | Fluka | 9830 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 16 | |
| Chloroacetamide (CAA) | Sigma | 22790 | |
| Eppendorf LoBind | Eppendorf | 22431081 | |
| Formic acid (FA) | Thermo Fisher Scientific | 85178 | |
| Heavy Peptides | JPT Peptide Technologies | ||
| HPLC | Dionex | Ulitimate 3000 | |
| LC Column | Thermo Fisher Scientific | 160321 | |
| Lys C | Wako | 125-05061 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | Q-Exactive Plus | |
| N-ethylmaleimide (NEM) | ACROS Organics | 156100050 | |
| Positive Control Chain K48 | Boston Biochem | UC-240 | |
| Positive Control Chain K63 | Boston Biochem | UC-340-100 | |
| Positive Control Chain M1 | Boston Biochem | UC-710B-025 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S5881 | |
| Sonifier | Branson sonifier | SFX 150 | |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigam | T6508 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Thermo Fisher Scientific | 77720 | |
| Trypsin | Promega | V1511A | |
| Urea | Sigma | 51456 | |
| Waters μElution C18 plates | Waters | 186002318 |
References
- Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Scientific Reports. 1, 90 (2011).
- Goldstein, G., et al. Isolation of a polypeptide that has lymphocyte-differentiating properties and is probably represented universally in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (1), 11-15 (1975).
- Glickman, M. H., Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: Destruction for the sake of construction. Physiol. Rev. 82, 373-428 (2002).
- Pickart, C. M., Eddins, M. J. Ubiquitin: structures, functions, mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1695 (1-3), 55-72 (2004).
- Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. Ubiquitin chain diversity at a glance. Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).
- Komander, D., Rape, M. The Ubiquitin Code. Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).
- Mattern, M., Sutherland, J., Kadimisetty, K., Barrio, R., Rodriguez, M. S. Using Ubiquitin Binders to Decipher the Ubiquitin Code. Trends in Biochemical Sciences. 44 (7), 599-615 (2019).
- Newton, K., et al. Ubiquitin chain editing revealed by polyubiquitin linkage-specific antibodies. Cell. 134 (4), 668-678 (2008).
- Spence, J., et al. Cell cycle-regulated modification of the ribosome by a variant multiubiquitin chain. Cell. 102 (1), 67-76 (2000).
- Borràs, E., Sabidó, E. What is targeted proteomics? A concise revision of targeted acquisition and targeted data analysis in mass spectrometry. PROTEOMICS. 17 (17-18), (2017).
- Lesur, A., Domon, B. Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics. PROTEOMICS. 15 (5-6), 880-890 (2015).
- Longworth, J., Dittmar, G. Assessment of Ubiquitin Chain Topology by Targeted Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1977, Clifton, N.J. 25-34 (2019).
- Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
- Tawa, N. E., Odessey, R., Goldberg, A. L. Inhibitors of the proteasome reduce the accelerated proteolysis in atrophying rat skeletal muscles. The Journal of Clinical Investigation. 100 (1), 197-203 (1997).
- Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
- MacLean, B., et al. Effect of Collision Energy Optimization on the Measurement of Peptides by Selected Reaction Monitoring (SRM) Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (24), 10116-10124 (2010).
