Summary
Denna metod beskriver bedömningen av globala förändringar i ubiquitin kedjan topologi. Bedömningen utförs genom tillämpning av en masspektrometri-baserad riktad proteomics strategi.
Abstract
Bedömning av den globala profilen av ubiquitin kedjan topologies inom en proteome är av intresse att svara på ett brett spektrum av biologiska frågor. Protokollet som beskrivs här drar nytta av di-glycin (-GG) modifieringen kvar efter tryptisk matsmältning av ubiquitin införlivas i en kedja. Genom att kvantifiera dessa topologi-karakteristiska peptider kan det relativa överflöd av varje ubiquitin kedja topologi bestämmas. De åtgärder som krävs för att kvantifiera dessa peptider genom ett parallellt reaktionsövervakningsexperiment rapporteras med hänsyn till stabiliseringen av ubiquitinkedjor. Förberedelse av tunga kontroller, celllys och matsmältning beskrivs tillsammans med lämplig masspektrometerinställning och dataanalysarbetsflöde. Ett exempel på datauppsättning med oro i allestädes närvarande topologi presenteras, tillsammans med exempel på hur optimering av protokollet kan påverka resultaten. Genom att följa de steg som beskrivs kommer en användare att kunna utföra en global bedömning av det allestädes närvarande topologilandskapet i sitt biologiska sammanhang.
Introduction
Den nära regleringen av proteinfunktion och stabilitet är av största vikt, eftersom de är viktiga drivkrafter för fenotypisk kontroll av biologi. Ett proteins funktion är konstruerad av två komponenter: dess inneboende polypeptidsekvens och eventuella posttranslational modifieringar (PTMs). Olika kemiska PTMs har identifierats inklusive glykosylering, fosforylering, acetylering och metylering1. År 1975 identifierade Goldstein et al.2 ett litet protein och döpte det till allestädes närvarande på grund av dess allestädes närvarande natur. Ubiquitin konstaterades vara viktigt vid proteinnedbrytning3. Men sedan dess har det fastställts att ubiquitins funktion som signalmolekyl sträcker sig långt bortom regleringen av proteinstabilitet. Ubiquitin signalering är involverad i ett brett spektrum av andra biologiska funktioner, såsom proteinstabilisering, autofagi, cellcykelkontroll och proteinhandel4.
Medan andra PTMs i allmänhet är binära (dvs. proteinet modifieras eller lämnas omodifierat) för en viss plats, kan ubiquitin modifiera ett protein både som monomer eller som en polymerisk kedja, med den bifogade ubiquitin själv allestädes närvarande. Vidare kan denna polyubiquitination kedja utvecklas i flera topologies med ubiquitination av den tidigare allestädes närvarande fästa vid en av åtta länkplatser5,6. Ubiquitin överförs genom en multistep enzymatisk process(figur 1) där ubiquitins C-ändstation är kopplad till en av dess sju lysinrester (K06, K11, K27, K29, K33, K48 eller K63) eller N-terminalen för den tidigare allestädes närvarande (kallad M1 eller linjär ubiquitination)5,6. Denna kedjetopologi är nyckeln till proteinet under modifiering. Till exempel leder modifieringen med en K48- eller K11-länkad kedja till nedbrytning av det modifierade proteinet vid proteasomen, medan en linjär kedja är nödvändig för aktivering av NF-kB-signalering. Således är den relativa fördelningen av dessa kedje-topologies relevant för en mängd olika biologiska frågor.
Användningen av masspektrometri (MS) är särskilt till nytta för ubiquitin kedjetopologi analys eftersom det inte är beroende av antikroppsbaserade eller affinitet-baserade interaktioner7,8, varav många har begränsad specificitet och skiljer inte mellan de olika kedjetyperna. En annan detektionsmöjlighet är att använda genetiskt modifierade ubiquitinmutanter. Här utbyts ett specifikt lysin mot arginin, som inte kan stödja modifieringen av ubiquitin. Bristen på ubiquitin kedjebildning på substratproteinet tolkas sedan som bevis för en specifik topologi9.
MS-baserad identifiering av allestädes närvarande proteiner baseras på det faktum att C-ändstationen av ubiquitin innehåller en arginin rester i position 74 som känns igen av trypsin under proteolytisk beredning av proverna för MS analys, separera C-terminal dubbel glycin. Denna GlyGly (-GG) förblir fäst vid ε-aminogruppen av lysinresterna i substratproteinet. För ubiquitin topologi analys sker modifieringen på en av de sju lysin resterna av ubiquitin. Detta skapar en uppsättning av sju viktiga peptider som bär en lysinrester som modifieras av GG, specifik för var och en av topologies (Figur 2). Till exempel, med K06 topologi, lysinet på position 6 på aminosyrasekvensen kommer att skyddas från tryptisk matsmältning med en -GG-modifiering av 114 Da läggs till detta lysin.
Identifiering av specifika förutbestämda peptider av MS kallas riktad proteomik, eller mer specifikt riktat peptidförvärv10. Två metoder har utvecklats beroende på masspektrometerns prestanda. Dessa är utvalda reaktionsövervakning (SRM), även kallad multipla reaktionsövervakning (MRM) och parallell reaktionsövervakning (PRM). SRM innebär val av övergångar bestående av föregångaren m/z och produkten jon m/z. Omvänt kräver PRM endast föregångaren m/z. Efter valet utförs en fullständig undersökning av produktjonerna. Detta har fördelen att inget urval av lämpliga produktjoner för kvantifiering på den specifika masspektrometern är nödvändigt före mätningen11. Både SRM och PRM kan, beroende på instrumentet, schemaläggas. Schemaläggning är praxis att tilldela ett tidsfönster under vilket en viss jon kommer att inkluderas för analys, eftersom peptider eluerar vid definierade retentionstider från det kromatografiska systemet. Att minska antalet joner som förhörs vid en viss tidpunkt ökar frekvensen av förhör av de joner som planeras vid den tidpunkten, vilket förbättrar datanoggrannheten.
I allmänhet är tillämpningen av riktade proteomik för ubiquitin topologi samma som alla andra riktade proteomics experiment. Två viktiga skillnader är dock viktiga: För det första måste stabiliteten hos ubiquitinkedjor beaktas. Det finns flera potenta deubiquitinating enzymer (DUB) som snabbt försämrar kedjor på cell lys. De allestädes närvarande proteaserna tillhör två kategorier, thioesterases och metalloproteases. De flesta av ubiquitin-hydrolaserna är thioesteraser och bär en cysteinrester i sitt aktiva centrum. Genom att alkylera denna cysteinrester kan de inaktiveras. Som sådan är användningen av ubiquitin stabiliseringsbuffertar som innehåller alkylerande medel, som N-etylmaleimid (NEM), och mycket denaturerande kemikalier, och att hålla prover kylda avgörande för en framgångsrik analys. För det andra, till skillnad från andra riktade experiment, är peptidvalet fixat. I ett typiskt riktat experiment kan en proteotypisk peptid väljas för god kromatografisk och joniseringsprestanda. För vissa topologi-karakteristiska peptider som K48 är dessa egenskaper bra, medan de för andra är mindre önskvärda. Till exempel är K33-kromatografin i en typisk omvänd fasinställning dålig på grund av bildandet av en sträckt elueringsprofil, och de dåliga joniseringsegenskaperna hos K27-peptiden minskar sikten med MS12.
I detta protokoll beskriver vi hur man utför ubiquitin topologi bedömning av ett biologiskt prov av PRM. Exempeldata för förfarandet presenteras med hjälp av en stör av proteasomen med MG-132-hämmarbehandling i flera olika celltyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av en tung peptidstandard
- Beroende på leverantör och kvalitet på de tunga peptider som köps måste de tunga peptiderna spädas ut. Detta protokoll använde de peptidsekvenser som rapporterats i tabell 1, med C-terminal aminosyran modifierad till Lysin (13C615N2-lysin) eller arginin (13C615N4-arginin).
- Blanda de tunga peptiderna och späd blandningen med 50% acetonitril (ACN) för att skapa en peptidblandning med varje peptid vid 10 μM.
- Skapa alikvoter av peptidblandningen och förvara vid -80 °C.
2. Provberedning
- Prov lysis
OBS: Stabiliteten hos ubiquitinkedjor måste beaktas under provberedningen. Förvara biologiska prover och buffertar kylda vid 4 °C och tillsätt prover till stabiliseringsbufferten för allestädes närvarande så snabbt som möjligt.- Förbered en lösning på 1 M NH4HCO3 (ammoniumbikarbonat) i vatten och justera pH-8 med 1 M NaOH.
- Förbered en lösning på 200 mM N-etylmaleimid (NEM) i vatten.
- Förbered ubiquitinstabiliseringsbuffert med 8 M urea i 50 mM NH4HCO3/10 mM NEM. Ubiquitin stabiliseringsbuffert måste beredas ny varje gång.
OBS: En 5 ml lösning på 8 M urea kommer att kräva betydligt mindre än 5 ml vatten med tanke på vattenutvidgningen när den är i en mättad lösning med urea.
VARNING: Förbered inte bufferten över 50 °C på grund av ureaens tendens att bilda polyurea vid höga temperaturer. - Återanvänd det biologiska prov som ska undersökas i stabiliseringsbufferten för allestädes närvarande med siktet 0,5 μg/μL protein och lysa cellerna med en lämplig metod för provet. En ultraljudsbehandling metod bestående av tre 10 s pulser med en SFX 150 Branson sonifier inställd på 70% intensitet med 10 s pauser på is mellan varje puls, användes för cellinjerna i detta protokoll.
- Centrifugprov vid 18 000 x g i 10 min vid 4 °C i en bordscentrifug.
- Överför supernatant till ett färskt mikrocentrifugrör med låg proteinhalt. Proverna kan förvaras vid -20 °C vid behov.
- Förberedelse av prov och kontroller
- Om proverna är frysta, blanda (t.ex. med en termomixer) medan de tinas upp för att snabbt lösa upp urea.
VARNING: Använd inte temperaturer över 50 °C på grund av ureaens tendens att bilda polyurea vid höga temperaturer. - Centrifugprov vid 18 000 x g i 10 min vid 4 °C i en bordscentrifug.
- Överför 20 μg prov till ett färskt mikrocentrifugrör med låg bindning och justera volymen till 50 μL med stabiliseringsbufferten ubiquitin.
- Skapa en negativ kontroll med hjälp av en normaliserad volym stabiliseringsbuffert för allestädes närvarande (50 μL). I detta prov bör ingen ljusversion av varje peptid finnas, vilket möjliggör observation av ljusförorening som härrör från spik-in tunga peptider. Denna negativa kontroll användes också för schemaläggning av kvarhållningstid för den PRM som beskrivs i avsnitt 3.1.
- En positiv kontroll skapades också med ubiquitin stabilisering buffert och tillägg av kommersiellt tillgängliga kedjetyper till den normaliserade volymen av ubiquitin stabilisering buffert (50 μL). Vanligtvis finns K63, K48 och M1 tillgängliga. I de representativa resultaten utnyttjades 20 ng av K48, K63 och M1.
- Om proverna är frysta, blanda (t.ex. med en termomixer) medan de tinas upp för att snabbt lösa upp urea.
- Minskning, alkylering och matsmältning
- Bered en lösning på 50 mM ammoniumbikarbonat (NH4HCO3)i vatten och justera provet till pH = 8 med 1 M NaOH.
- En kultur av E. coli odlas i LB buljong var centrifuged 5,000 x g för 5 min för att bilda en pellet, som sedan tvättades 2x med PBS innan återsuspension i ubiquitin stabilisering buffert vid 5 μg/μL.
- Tillsätt 1 μg E. coli lysat till varje prov och kontroll. Detta protokoll använder E. coli (DH10B), men alla komplexa lysat utan ubiquitin kan användas. Observera att allestädes närvarande är vanligt för alla eukaryoter.
OBS: Användning av en E. coli lysatmatris minskar förlusten av peptider på grund av ospecificerad vidhäftning till plastartiklar. Detta är särskilt märkbart i den negativa kontrollen eller proverna med ett begränsat proteininnehåll och har en stark inverkan på observationen av K6312. - Förbered en lösning på 500 mM tris (2-karboxyetyl)fosfin (TCEP) i MS-vatten (DTT kan användas som ett alternativ).
- Minska proverna och kontrollerna genom att tillsläpa TCEP till en slutlig koncentration på 50 mM. Vortex kort innan du inkuberar i 30 min vid rumstemperatur (RT). Om DTT används måste temperaturen höjas till 50 °C.
VARNING: Använd inte temperaturer över 50 °C på grund av ureaens tendens att bilda polyurea vid höga temperaturer. - Förbered en lösning på 550 mM kloroacetamid (CAA) i NH4HCO3. Förvara i mörkret.
- Alkylera proverna och kontrollerna genom att tillsätta CAA till en slutlig koncentration på 55 mM. Vortex kort innan han inkuberar i 20 minuter på RT i mörkret.
OBS: CAA används istället för jodacetamid som reduktionsmedel för att minska risken för dubbel karbamidetylmodifiering (114.0429) på en lysinrester som misstas för en -GG-modifiering (114.0429)13. - Tillsätt endopeptidas LysC till proverna vid 1:25 (w/w) förhållande till proteinhalten. Inkubera i 3 timmar vid 37 °C.
- Späd ut proverna och kontrollerna med 200 μL 50 mM NH4HCO3 pH = 8 (1:5 v/v).
- Lägg till trypsin i proverna vid förhållandet 1:25 w/w till proteinhalten. Inkubera i 12 timmar vid 37 °C.
- Tillsätt 10% myrsyralösning (FA) i MS-vatten med ett 1:10-förhållande v/v till varje prov och kontrollprov. Kontrollera att pH är <3) före C18-rensningen och tillsätt mer myrsyra om det behövs.
- Tillsätt 0,5 μL av den tunga peptidstandard som skapas i avsnitt 1 till varje prov och kontroll.
- Peptidrensning
- Flera tillverkare erbjuder C18 rengöringstips eller tallrikar. Följ tillverkarens instruktioner för den använda produkten och torka eluterade peptider i en vakuumcentrifug, redo för MS-analys.
3. Analys av LC-MS/MS
- Utför initial PRM-analys på den tunga peptidstandarden på ett oplanerat sätt.
- Återanvänd de torkade proverna i 10 μL MS-belastningsbuffert 2% ACN/0,05% trifluoracetisk syra (TFA).
- Utrusta ett HPLC med en analyskolonn i omvänd fas C18 (75 μm x 15 cm, 2 μm 100 Å C18 pärlor) avsedd för nanoflow MS. Bilda linjära lutningar som utbyter MS-vatten kompletterat med 0,1% FA med ACN som innehåller 0,1% FA. Här användes en offerfälla (75 μm x 2 cm, 3 μm, 100 Å C18 pärlor) för att bevara analyskolonnens livslängd, men krävs inte.
- Koppla analyskolonnens utgång till en nano-ESI-källa på en högupplöst masspektrometer.
- Använd en lämplig riktad proteomikmetod för masspektrometern. Om du till exempel använder en Q-Exactive plus en tvåexperimentsmetod cyklar du mellan en fullständig MS och ett PRM-experiment. För hela MS-experimentet användes en upplösning på 120 000 med ett AGC-mål på 1e6 och 240 ms som maximal IT. För PRM-experimentet användes samma AGC-mål och maximal IT med en lägre upplösning på 60 000 och ett isoleringsfönster på 1,2 m/z.
- Injicera 200 ng negativ kontroll på analyskolonnen med hplc-autosamplern. Applicera en linjär gradient på provet på analyskolonnen som ökar ACN-koncentrationen från 2–25% under en period av ~ 45 min.
OBS: Acn-koncentrationen på 25% är lägre än vanligt för proteomik på grund av den låga hydrofila karaktären hos typiska ubiquitin topologi-karakteristiska peptider. Om andra peptider ska kvantifieras kan en högre ACN-koncentration önskas för att uppnå god målseparation. - Analysera resultaten av schemaläggningskörningen enligt beskrivningen i avsnitt 4.2 för att skapa en lista över schemalagda inkluderingar.
- Analys av proverna
- Kör de återstående exemplen enligt beskrivningen för schemaläggningen i 3.1, förutom användningen av listan över schemalagda inkludering som skapats i avsnitt 4.2.
OBS: Ett tomrum måste köras efter den positiva kontrollen för att säkerställa att ingen överföring från föregående körning upptäcks i efterföljande prover.
- Kör de återstående exemplen enligt beskrivningen för schemaläggningen i 3.1, förutom användningen av listan över schemalagda inkludering som skapats i avsnitt 4.2.
4. Programvaruanalys
- Skapa en inkluderingslista med lämplig formatering för den använda MS. Detta protokoll använde open source-programvaran Skyline (version 19.1.0.193) (https://skyline.ms), som erbjuder väldokumenterat stöd och hjälp. En inkluderingslista kan skapas för flera masspektrometrar med hjälp av exportisoleringslistefunktionen.
- Öppna ett nytt Skyline-dokument.
- Välj tunga isotopmodifieringar som är lämpliga för tunga topologi-karakteristiska peptider. I Inställningar| Peptidinställningar under fliken Ändring, klicka på namnfältet för att se den potentiella ändringen. Urvalet baseras på det isotopiska tillståndet hos de tunga peptider som köpts. I detta exempel användes syntetiska peptider som bär antingen en tung Lysin (13C615N2-lysin) eller ett tungt arginin (13C615N4-arginin) vid C-ändstationen. Lämpliga etiketter skulle vara: "Etikett:13C(6)15N(2) (C-term K)" och "Label:13C(6)15N(4) (C-term R)".
- Välj Inställningar| Övergång. Under fliken Filter finns prekursoravgifter 2, 3, 4.
- Sätt in peptider genom att välja Redigera| Infoga| Peptider.
- Fyll i relevanta fält inklusive den topologi-karakteristiska peptidsekvensen och ett proteinnamn (t.ex. "Chain–K63").
- Utöka varje peptid som nu visas på panelen Mål. Ta bort oönskade laddnings tillstånd. Den föredragna laddningstillståndet och kollisionsenergin, som kan skilja sig åt baserat på den använda masspektrometern, för varje topologi-karakteristisk peptid visas i tabell 1.
- För varje topologi-karakteristisk peptid (förutom M1 där GG ingår i sekvensen) högerklicka på sekvensen och välj Ändra. Lägg till en GG som en strukturell ändring genom att klicka på namnfältet och välja <Visa alla... > innan du väljer "GlyGly (K)".
- Exportera isoleringslistans fil| Exportera| Isoleringslista, välj instrumenttyp och ställ in metodtypen på Standard. Om du väljer OK öppnas en uppmaning om att spara en *.csv fil som kan användas för att skapa en PRM-metod.
- Skapa en schemalagd inkluderingslista baserad på en tung peptidplaneringskörning som förklaras här med hjälp av Skyline-programvaran med öppen källkod.
- Skapa en mållista enligt beskrivningen i avsnitt 4.1.
- Importera schemaläggningskörningen i 3.1 genom att välja Arkiv| Importera| Resultat.
- Granska identifieringarna. Den tunga signalen för varje peptid är observerbar genom att klicka på massan för varje tung peptidpost. Korrekt igenkänning av toppen bestäms ofta automatiskt, men programvaran kan kräva manuell kuration genom att välja toppen med klick och dra under x-axeln.
- Kvarhållningstider som valts för de tunga varianterna tillämpas också på ljusversionerna, vilket skapar ett schema för PRM. Schemaläggningsfönstret kan ändras under Inställningar| Peptidinställningar med fliken Förutsägelse genom att ändra tidsfönstret.
- En lista över schemalagda inkluderingar kan nu exporteras med fil| Exportera| Isoleringslista och val av lämplig instrumenttyp och inställningsmetodtyp till Schemalagd.
- Analysera data.
- Importera exemplen på samma sätt som för analys av schemaläggningskörning i avsnitt 4.2.
- Efter fullständig import av alla exempel rekommenderas kurering av övergångar. Detta är den process genom vilken övergångar med störningar eller dåliga signal-till-brusförhållanden tas bort. Ett exempel på ett kromatogram före och efter kuration visas i figur 4.
- Data kan nu exporteras antingen genom att högerklicka på relevanta grafer och välja Kopiera data eller genom att välja Arkiv| Exportera| Resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att demonstrera användningen av en ubiquitin kedjeanalys av PRM valdes tre cellinjer: en mus melanom cellinje B16 och de två gemensamma mänskliga cellinjerna A549 (adenocarcinomic alveolar basala epitelial celler) och HeLa (livmoderhalscancer celler). Dessa kulturer växte till midexponential fas i lämpliga medier innan behandlas med 0, 10 eller 100 mM MG-132 för 4 h före skörd. MG-132 är en proteasomhämmare som förhindrar nedbrytning av allestädes närvarande proteiner av proteasomen14. Med tanke på detta är det ett lämpligt testtillstånd att påvisa ubiquitin kedjeanalys. Den resulterande ökningen i K48-kedjan kan ses i figur 3. Proteasomhämmare behandling inducerad en ökning av K48 kedjor15.
Som beskrivs i introduktionen, till skillnad från SRM eller MRM, utför PRM en fullständig produktjonskanning efter val av föregångaren jon. Detta innebär att produktjoner inte behöver anges före körningen, men de bör fortfarande vara kuraterade efter körning. Curation är den process genom vilken övergångar som verkligen är representativa för den avsedda peptiden väljs. Figur 4 visar produktjonkromatogrammet för K48 före och efter kurationen. Produktjoner som har en signal med en inkonsekvent elueringsprofil som sannolikt beror på störningar togs bort. Lågintensiva produktjoner togs sedan bort med tanke på att signal-till-brusförhållandet är mindre gynnsamt för sådana övergångar. De optimala övergångar som väljs under kurationen är ofta konsekventa mellan experiment och kan variera beroende på vilken masspektrorometer som används, kromatografiska förhållanden, analysinställningar och provets biologiska bakgrund. För varje undersökning krävs alltså korrekt kuration av övergångar. Det krävs också en balans mellan införandet av fler övergångar och därmed tekniska replikat och renare data för kvantifiering.
Typiska produktjonkromatogram för var och en av de identifierade ubiquitinkedjans topologier i detta experiment visas i figur 5. K27 och K29 utelämnas här eftersom signalen under dessa biologiska förhållanden var under detektion. K33:s elueringsprofil, som visas här, var betydligt bredare än vad som skulle vara allmänt accepterat för PRM-analys. Alternativt urval av peptider med bättre elueringsprofiler är dock inte möjligt vid ubiquitin kedjeanalys och en tolkning måste göras baserat på denna profil. Om K33 är av särskilt intresse kan ändrade kromatografiska förhållanden förbättra kvantifieringen av denna kedjetyp, men sannolikt till nackdel för andra kedjetyper.
Vid utformningen av ett PRM-experiment är det att föredra att maximera signalen för de produktjoner som används för kvantifiering genom att öka signal-till-brus. Optimeringen av kollisionsenergi (dvs. den energi som används av masspektrometern för att fragmentera prekursorpeptidjoner till produktjoner) är ett sätt på vilket signalen kan förbättras16. Ett kollisionsenergiområde från 14–28 tillämpades på upprepade injektioner av ett enda prov med de observerade toppområdena K63 och M1 som resulterade i figur 6. Som man kan se var en högre kollisionsenergi på 26 optimal för K63, medan en lägre energi på 18 var idealisk för M1. Kollisionsenergin för varje topologi-karakteristisk peptid och ett urval av omodifierade ubiquitinfragment visas i tabell 1. Dessa kollisionsenergier kan behöva optimeras baserat på den masspektrometer och fragmenteringsmetod som används.
Figur 1: Schematisk representation av den allestädes närvarande konjugerande kaskaden. Ubiquitin är först bunden av ett E1-enzym på ett ATP-beroende sätt. Den aktiverade ubiquitin överförs sedan till ett E2-enzym som sedan förenas av en E3-ligas för att överföra ubiquitin till substratproteinet. Denna process upprepas flera gånger tills en ubiquitinkedja bildas på substratproteinet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Diagram som visar härledningen av den allestädes närvarande topologi-karakteristiska peptiden. Efter tryptisk matsmältning härleds uppströms bindningsstället med -GG C-terminalen för nedströms ubiquitin bifogad. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Jämförelse av K48-kedjan under MG-132-behandling för en muscellslinje B16 och de två mänskliga cellinjerna A459 och HeLa. I A459 ledde ökande koncentrationer av MG-132 till stabilisering av K48 kedjor. Med B16 och HeLa celler sågs en ökning under behandling med antingen 10 mM eller 100 mM MG-132. Minskningen som observerats från 10 mM till 100 mM kan förklaras av den ökade känsligheten hos B16- och HeLa-celler till MG-132, vilket leder till celldöd. Felstaplar visar standardavvikelsen för övergångarna. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Produktjonkromatogram av M1-topologi-karakteristisk peptid före och efter kuration av övergångar för interferens eller låg intensitet. Retentionstiden på x-axeln visas i minuter. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Typiskt produktjonkromatogram av olika topologi-karakteristiska peptider samt två icke-modifierade ubiquitinpeptider. Elueringstiden i minuter och observerade massfel för varje peptid rapporteras ovanför toppen av den relevanta toppen. Prickade linjer visar också fönstret för bestämning av toppområdet. Retentionstiden på x-axeln visas i minuter. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6: Observerat toppområde för K63 och M1 över en serie normaliserade kollisionsenergier. De olika färgerna representerar jonintensiteten som varje övergång bidrar med. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Kedjetyp | Topologi Karakteristisk Peptid | Laddningstillstånd | Normaliserad kollisionsenergi |
| K06 (på andra) | MQIFVK[GG]TLTGK | 3 | 18 |
| K11 (på 11) | TLTGK[GG]TITLEVEPSDTIENVK | 3 | 18 |
| K27 (på 27) | TITELVEPSDTIENVK[GG]AK | 3 | 18 |
| K29 (på 19) | AK[GG]IQDK (på GG]IQDK | 2 | 22 |
| K33 (på 1997) | IQDK[GG]EGIPPDQQR | 3 | 18 |
| K48 (på 1998) | LIFAGK[GG]QLEDGR | 3 | 24 |
| K63 (på andra) | TLSDYNIQK[GG]ESTLHLVLR | 4 | 26 |
| M1 (linjär) | GGMQIFVK (olika) | 2 | 18 |
| Ej modifierad Ubqiuitin | ESTLHLVLR (OLIKA) | 2 | 26 |
| Ej modifierad Ubqiuitin | AVDELNINGVEPSDTIENVK | 2 | 18 |
| Ej modifierad Ubqiuitin | TLSDYNIQK (TLSDYNIQK) | 2 | 18 |
Tabell 1: Sekvenser för humana ubiquitintopologi-karakteristiska peptider, det mest observerbara laddningstillståndet och gynnsam normaliserad kollisionsenergi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analys av ubiquitin staten inom en proteome är av ökande betydelse för en mängd olika biologiska frågor. Beskrivningen av ett provs allestädes närvarande tillstånd måste inte bara fokusera på profilen av proteiner som är allestädes närvarande utan också på topologin för sådan allestädes närvarande. Bedömningen av denna topologi av riktade MS, som beskrivs här, har en roll i ett brett spektrum av biologiska undersökningar.
Det bör förstås att det protokoll som beskrivs här ger en global topologiprofil. Användning av en bottom-up proteomics strategi möjliggör bestämning av peptider som var allestädes närvarande, inklusive ubiquitin peptider. Observationen av ubiquitination av ubiquitin peptider tillåter bestämning av kedjan topologi, men länken till målet för ubiquitin går förlorad. Således kan den specifika kedjetopologin på ett visst protein inte bestämmas, men en global topologiprofil härleds. Metoden kan också kombineras med en anrikningsstrategi för att ge mer målinriktade resultat. En sådan berikning måste ta hänsyn till kedjestabiliteten och överflödet av kedjor efter berikningen. Upptäckten av kedjetopologin begränsas av den renhet som anrikningsstrategin ger, eftersom det inte är möjligt att skilja en allestädes närvarande topologi kopplad till ett förorenande protein från de som är kopplade till proteinet av intresse. Det kritiska steget i detta protokoll, som underlättar en framgångsrik analys, är balansen mellan att bevara ubiquitinkedjan medan man smälter ubiquitinproteinet. Detta är utmanande på grund av benägenheten av kedjenedbrytning i kombination med motståndet hos ubiquitin sig själv till enzymatisk matsmältning. Vidare krävs tillsats av en stödmatris och noggrant övervägande av MS-förhållanden med tanke på den mindre gynnsamma karaktären hos några av de topologi-karakteristiska peptiderna till flytande kromatografisk kopplade masspektrometriska analyser.
Även om vi i detta protokoll har beskrivit ett sätt att bedöma alla ubiquitinkedjetyper samtidigt, är det också möjligt att justera flera aspekter av protokollet baserat på den specifika kedjetopologin av intresse. Att manipulera kromatografiska förhållanden eller variera de tunga peptidkoncentrationerna kan öka noggrannheten i en undersökning, förbättra resultaten för en viss kedjetopologi och skräddarsy undersökningen till den föreslagna biologiska frågan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Céline Jeanty för hennes hjälp med att skapa cellulära pellets med behandling av MG-132 som beskrivs i de representativa resultaten och Elise Mommaerts för hennes tillhandahållande av E. coli pellets som används i protokollet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (ACN) | Merck | 100029 | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | Fluka | 9830 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 16 | |
| Chloroacetamide (CAA) | Sigma | 22790 | |
| Eppendorf LoBind | Eppendorf | 22431081 | |
| Formic acid (FA) | Thermo Fisher Scientific | 85178 | |
| Heavy Peptides | JPT Peptide Technologies | ||
| HPLC | Dionex | Ulitimate 3000 | |
| LC Column | Thermo Fisher Scientific | 160321 | |
| Lys C | Wako | 125-05061 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | Q-Exactive Plus | |
| N-ethylmaleimide (NEM) | ACROS Organics | 156100050 | |
| Positive Control Chain K48 | Boston Biochem | UC-240 | |
| Positive Control Chain K63 | Boston Biochem | UC-340-100 | |
| Positive Control Chain M1 | Boston Biochem | UC-710B-025 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S5881 | |
| Sonifier | Branson sonifier | SFX 150 | |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigam | T6508 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Thermo Fisher Scientific | 77720 | |
| Trypsin | Promega | V1511A | |
| Urea | Sigma | 51456 | |
| Waters μElution C18 plates | Waters | 186002318 |
References
- Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Scientific Reports. 1, 90 (2011).
- Goldstein, G., et al. Isolation of a polypeptide that has lymphocyte-differentiating properties and is probably represented universally in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (1), 11-15 (1975).
- Glickman, M. H., Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: Destruction for the sake of construction. Physiol. Rev. 82, 373-428 (2002).
- Pickart, C. M., Eddins, M. J. Ubiquitin: structures, functions, mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1695 (1-3), 55-72 (2004).
- Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. Ubiquitin chain diversity at a glance. Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).
- Komander, D., Rape, M. The Ubiquitin Code. Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).
- Mattern, M., Sutherland, J., Kadimisetty, K., Barrio, R., Rodriguez, M. S. Using Ubiquitin Binders to Decipher the Ubiquitin Code. Trends in Biochemical Sciences. 44 (7), 599-615 (2019).
- Newton, K., et al. Ubiquitin chain editing revealed by polyubiquitin linkage-specific antibodies. Cell. 134 (4), 668-678 (2008).
- Spence, J., et al. Cell cycle-regulated modification of the ribosome by a variant multiubiquitin chain. Cell. 102 (1), 67-76 (2000).
- Borràs, E., Sabidó, E. What is targeted proteomics? A concise revision of targeted acquisition and targeted data analysis in mass spectrometry. PROTEOMICS. 17 (17-18), (2017).
- Lesur, A., Domon, B. Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics. PROTEOMICS. 15 (5-6), 880-890 (2015).
- Longworth, J., Dittmar, G. Assessment of Ubiquitin Chain Topology by Targeted Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1977, Clifton, N.J. 25-34 (2019).
- Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
- Tawa, N. E., Odessey, R., Goldberg, A. L. Inhibitors of the proteasome reduce the accelerated proteolysis in atrophying rat skeletal muscles. The Journal of Clinical Investigation. 100 (1), 197-203 (1997).
- Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
- MacLean, B., et al. Effect of Collision Energy Optimization on the Measurement of Peptides by Selected Reaction Monitoring (SRM) Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (24), 10116-10124 (2010).
