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Biochemistry

पूरी तरह से संसाधित पुनः संयोजन KRAS4b: फरनेसेटेड और मेथाइलेटेड प्रोटीन को अलग और विशेषता

Published: January 16, 2020 doi: 10.3791/60703
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1NCI RAS Initiative, Cancer Research Technology Program, Frederick National Laboratory for Cancer Research

Summary

प्रीनिलेशन परिधीय झिल्ली बाध्यकारी प्रोटीन पर एक महत्वपूर्ण संशोधन है। कीट कोशिकाओं को मात्रा में फर्नेसेटेड और कार्बोक्सिमेथाइलेटेड KRAS4b का उत्पादन करने के लिए हेरफेर किया जा सकता है जो प्रोटीन-प्रोटीन और प्रोटीन-लिपिड इंटरैक्शन के बायोफिजिकल माप को सक्षम करता है

Abstract

प्रोटीन प्रीनिलेशन एक महत्वपूर्ण संशोधन है जो इंट्रासेलर झिल्ली के लिए प्रोटीन को लक्षित करने के लिए जिम्मेदार है। KRAS4b, जो मानव कैंसर के 22% में उत्परिवर्तित है, सी-टर्मिनस में 'सीएएएक्स' बॉक्स आकृति की उपस्थिति के कारण फारनेसिलेशन और कार्बोक्सीमेथिलेशन द्वारा संसाधित किया जाता है। कीट कोशिकाओं में फर्नेसेटेड और कार्बोक्यामेथिलेटेड KRAS4b को व्यक्त करने के लिए एक इंजीनियर बैगोवायरस सिस्टम का उपयोग किया गया था और पहले वर्णित किया गया है। यहां, हम प्रोटीन के विस्तृत, व्यावहारिक शुद्धिकरण और जैव रासायनिक लक्षण वर्णन का वर्णन करते हैं। विशेष रूप से, एकरूपता के लिए प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए आत्मीयता और आयन विनिमय क्रोमेटोग्राफी का उपयोग किया गया था। क्रास4बी के सही संशोधन को मान्य करने और न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग को सत्यापित करने के लिए बरकरार और देशी द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग किया गया था। अंत में, सतह प्लाज्मोन अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके फॉर्नेसिटेड और कार्बोक्सिमेथेलेटेड क्रास4बी के झिल्ली संघ को मापा गया।

Introduction

पोस्टट्रांसलेशनल संशोधन प्रोटीन की कार्यात्मक गतिविधि को परिभाषित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। फॉस्फोरिलेशन और ग्लाइकोसिलेशन जैसे संशोधन अच्छी तरह से स्थापित हैं। लिपिड संशोधनों को कम अच्छी तरह से चित्रित किया जाता है, हालांकि। यह अनुमान लगाया गया है कि सभी सेलुलर प्रोटीन का 0.5% जितनाप्रीनिटेडहो सकता है । प्रीनिलेशन सीएएएक्स आकृति2युक्त एक स्वीकारकर्ता प्रोटीन के लिए 15-कार्बन फारनेसिल या 20-कार्बन गेरानिल्गेरानिल लिपिड श्रृंखला का हस्तांतरण है। प्रीनिटेड प्रोटीन को समय से पहले उम्र बढ़नेवाले 3, अल्जाइमर4,हृदय रोग5, कोरोइडेर्मिया6और कैंसर7सहित कई मानवीय रोगों की प्रगति में फंसाया गया है । छोटे GTPases, HRAS, NRAS, और KRAS1,परमाणु टुकड़े टुकड़े, और kinetochores CENP-ई और एफ बेसल हालत के तहत farnesylated प्रोटीन हैं । अन्य छोटे GTPases, अर्थात् RhoA, RhoC, Rac1, सीडीसी-४२, और RRAS geranylgeranylated8हैं, जबकि RhoB farnesylated या geranylgeranylated9किया जा सकता है ।

छोटे GTPase KRAS4b एक आणविक स्विच के रूप में कार्य करता है, अनिवार्य रूप से इंट्रासेलुलर सिग्नल ट्रांसडुक्शन रास्तों के लिए संकेत एक्स्ट्रासेलुलर विकास कारक संचारण जो कई प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के माध्यम से सेल विकास और प्रसार को प्रोत्साहित करते हैं। KRAS4b बायोकेमिस्ट्री के दो प्रमुख पहलू हैं जो इसकी गतिविधि के लिए आवश्यक हैं। सबसे पहले, एक निष्क्रिय सकल घरेलू उत्पाद और एक सक्रिय जीटीपी बाध्य राज्य के बीच प्रोटीन चक्र जिससे यह सक्रिय रूप से प्रभावकों के साथ संलग्न है । दूसरा, एक सी-टर्मिनल पॉली-लाइसिन क्षेत्र और एक फर्नेसेटेड और कार्बोक्सीमेथिलेटेड साइस्टीन प्रोटीन को प्लाज्मा झिल्ली पर निर्देशित करता है, जिससे डाउनस्ट्रीम प्रभावकों की भर्ती और सक्रियता सक्षम होती है। उत्परिवर्ती KRAS4b अग्नाशय, कोलोरेक्टल, और फेफड़ों के कैंसर10में एक कैंसरजनक चालक है, और इस तरह, चिकित्सीय हस्तक्षेप एक बड़ा नैदानिक लाभ होगा । प्रामाणिक रूप से संशोधित पुनः संयोजन प्रोटीन का उत्पादन जो फर्नेसेटेड और कार्बोक्सीमेथिलेटेड है, झिल्ली सरोगेट ्सजैसे लिपोसोम्स या लिपिड नैनोडिस्क11,12के संयोजन में KRAS4b का उपयोग करके जैव रासायनिक स्क्रीनिंग सक्षम करेगा ।

फारनेसिल ट्रांसफरेज (एफएनटी) KRAS4b में CAAX आकृति में सी-टर्मिनल साइस्टीन में फारनेसिल पायरोफॉस्फेट के अलावा उत्प्रेरक करता है। प्रीनिलेशन के बाद प्रोटीन की तस्करी एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) में की जाती है जहां रास परिवर्तित एंजाइम (आरसीई1) तीन सी-टर्मिनल अवशेषों को छोड़ देता है । प्रसंस्करण में अंतिम चरण ईआर झिल्ली प्रोटीन, आइसोफेनिलल मिथाइलट्रांसफरेसे (आईसीएमटी) द्वारा नए सी-टर्मिनल फारनेसिलासिस्टीन अवशेषों का मिथाइलेशन है। ई. कोलाई में पुनर्संयोजन KRAS4b की अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप एक असंशोधित प्रोटीन का उत्पादन होता है। प्रसंस्कृत KRAS4b का उत्पादन करने के पिछले प्रयास संरचनात्मक या दवा स्क्रीनिंग प्रयोगों के लिए अपर्याप्त पैदावार के कारण सीमित किए गए हैं या देशी पूर्ण लंबाई परिपक्व प्रोटीन13,14को फिर से तैयार करने में विफल रहे हैं । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक इंजीनियर baculovirus आधारित कीट कोशिका अभिव्यक्ति प्रणाली और शुद्धि विधि है कि अत्यधिक शुद्ध, पूरी तरह से प्रसंस्कृत KRAS4b सेल संस्कृति के 5 मिलीग्राम/एल की पैदावार पर उत्पन्न करता है का उपयोग करता है ।

संरचनात्मक जीव विज्ञान या दवा स्क्रीनिंग अध्ययन पर तैयार करने से पहले पुनर्संयोजन प्रोटीन की गुणवत्ता को मान्य करने के लिए सावधान प्रोटीन लक्षण वर्णन आवश्यक है। पूरी तरह से प्रसंस्कृत KRAS4b के दो प्रमुख मापदंडों सही prenyl संशोधन का सत्यापन और झिल्ली विकल्प या लिपिड के साथ बातचीत के लिए farnesylated और carboxymethylated सी-टर्मिनस (FMe) की उपलब्धता कर रहे हैं । KRAS4b-FMe के इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री (ईएसआई-एमएस) का उपयोग आणविक वजन को मापने और फारनेसिल और कार्बोक्सिमेथाइल संशोधनों की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए किया गया था। देशी द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री, जहां नमूनों को गैर-denaturing सॉल्वैंट्स के साथ छिड़काया जाता है, यह प्रदर्शित करने के लिए उपयोग किया जाता था कि KRAS4b-FMe भी अपने सकल घरेलू उत्पाद कोफैक्टर से बंधा हुआ था। अंत में, सतह प्लाज्मोन अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग स्थिर लिपोसोम के साथ KRAS4b-FMe के प्रत्यक्ष बंधन को मापने के लिए किया गया था।

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Protocol

1. प्रोटीन शुद्धि

  1. बफ़र्स ए-एच तैयार करें, जैसा कि टेबल 1में देखा गया है।
बफर समाधान बफरिंग एजेंट (सभी 20 एमएम) पीएच नैल (एमएम) इमिडाजोल (एमएम) एमजीसीएल2 टीसीईपी
एक हेप्स 7.3 300 - 5 1
बी हेप्स 7.3 300 35 5 1
सी हेप्स 7.3 300 500 5 1
D एमईएस 6.0 200 - 5 1
ई एमईएस 6.0 - - 5 1
F एमईएस 6.0 100 - 5 1
जी एमईएस 6.0 1000 - 5 1
एच हेप्स 7.3 300 - 1 1
  1. शुद्धिकरण सामग्री तैयार करें (सामग्री की तालिकादेखें): ईटीए या अन्य चेलेटर के बिना अवरोधक कॉकटेल को प्रोटीज़ करें; स्थिर धातु एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी (आईमैक) कॉलम; कोटेशन एक्सचेंज क्रोमेटोग्राफी (CEX) कॉलम; 0.45 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर; 2 एम इमिडाजोल (पीएच = 7.5); अल्ट्रासेंट्रिकफ्यूज 100,000 x ग्राममें सक्षम है , हाई स्पीड बेंचटॉप अपकेंद्री 4,000 x ग्राममें सक्षम ; सेंट्रलाइजल फिल्टर इकाइयां (10 केडीए एनएमडब्ल्यूएल); स्पेक्ट्रोफोटोमीटर 280 एनएम पर पढ़ने में सक्षम; His6-तंबाकू etch वायरस (TEV) प्रोटीज़; और क्रोमेटोग्राफी इंस्ट्रूमेंटेशन दो बफर समाधानों को मिलाने, स्तंभों के समाधान लागू करने, कॉलम से ढाल वाष्पीकरण बनाने और स्तंभों से अंश एकत्र करने में सक्षम है।
  2. कीट कोशिका संस्कृति के ~ 2 एल से गल कोशिकाओं पहले -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत या हौसले से काटा कोशिकाओं का उपयोग करें। Tni.FNL कीट सेल लाइन और अभिव्यक्ति प्रोटोकॉल के बारे में विवरण के लिए जिलेट एट अल 201915 देखें। सावधानी से हवा शुरू करने या फोम बनाने के बिना जोड़ा 1:200 v/v प्रोटीज़ अवरोधक के साथ बफर ए के २०० mL के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित ।
    नोट: चरण 1.3 और बाद के चरण (जैसा कि उल्लेख किया गया है) कमरे के तापमान (~ 22 डिग्री सेल्सियस) पर किया जाना चाहिए। यह महत्वपूर्ण है कि नमूना अगले चरण में पूरी तरह से लाइसिस की अनुमति देने के लिए सजातीय हो।
  3. लाइसे सेल पैलेट एक माइक्रोफ्लूइडाइजर में दो पास के लिए या एक समान लाइसिस प्रणाली में 7,000 साई में। लाइस के वैकल्पिक तरीकों का पता नहीं लगाया गया है।
  4. फिल्टर को रोकना यौगिकों की उपस्थिति के कारण कीट कोशिका ओं को स्पष्ट करना समस्याग्रस्त है। इस प्रकार, अल्ट्रासेन्ट्र्यूगेशन (4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन के लिए 100,000 x ग्राम) बहुत महत्वपूर्ण है। अधिनेता की सतह पर एक सफेद लिपिड अवशेषों से बचा जाना चाहिए और कपास झाड़ू का उपयोग करके हटाया या कम किया जा सकता है। 0.45 माइक्रोन पीईएस फिल्टर के माध्यम से डिक्वेंट सुपरनेट को फ़िल्टर करें। स्पष्ट किए गए नमूने का उपयोग तुरंत करें या -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: अवशेष ब्लॉक जल्दी फिल्टर और कई फिल्टर आवश्यक हो सकता है । इस सामग्री की मात्रा को कम करने में विफलता के बाद के चरणों में उच्च कॉलम वापस दबाव के लिए नेतृत्व करेंगे ।
  5. स्पष्ट लाइसेट की मात्रा निर्धारित करें और 2 एम इमिडाजोल स्टॉक के अतिरिक्त नमूने को 35 m imidazole में समायोजित करें। 3 mL/min पर एक 20 mL IMAC कॉलम (HisPrep एफएफ 16/10 कॉलम) पूर्व तीन कॉलम संस्करणों (सीवी) के लिए बफर बी में समतुल्य पर नमूना लोड ।
  6. यद्यपि लक्ष्य प्रोटीन आमतौर पर कॉलम में मात्रात्मक रूप से सोखलिया जाता है, बाद के विश्लेषण के लिए कॉलम प्रवाह एकत्र करना सबसे अच्छा है। कॉलम धोने जब तक Abs२८० एक स्थिर बेसलाइन तक पहुंचता है (<१०० मिलीअवशोषण इकाइयों [mAU]) बफर बी के साथ 3 mL/min के लिए 20 mL (1 सीवी) तो ~ 3 सीवी के लिए 4 mL/min पर धोने के कदम के शेष के लिए । आमतौर पर, बेसलाइन अवशोषण प्राप्त करने के लिए बफर बी के 60-80 एमसीएल की आवश्यकता होती है।
  7. 8 एमएल अंशों को इकट्ठा करते समय बफर बी से बफर सी तक 400 मिलीएल (20 सीवी) ढाल के साथ प्रोटीन को एल्यूट करें। आमतौर पर, ढाल की पहली छमाही में लक्ष्य प्रोटीन ल्राटता है(चित्रा 1ए;बाद के सभी अंश नहीं दिखाए जाते हैं)।
  8. SDS-PAGE/Coomassie धुंधला का उपयोग कर प्रोटीन अंशों का विश्लेषण करें । पूल पीक अंशों और 4 डिग्री सेल्सियस पर बफर डी के 2 एल के खिलाफ रात भर पूल dialyze ।
    नोट: कम पीएच अगले कदम में प्रोटीन बाध्यकारी सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है । हालांकि, इस डायलिसिस के दौरान पीएच परिवर्तन धीरे-धीरे होता है, और यह रात भर ऊष्मायन के लिए एक सुविधाजनक कदम है। वैकल्पिक बफर विनिमय रणनीतियों (जैसे, पीएच परिवर्तन को गति देने के लिए उच्च बफर एकाग्रता) की जांच नहीं की गई है। प्रोटीन धीरे-धीरे कम पीएच और कम नमक सांद्रता पर समय के साथ उपजी शुरू हो जाएगा और इस कदम के दौरान वर्षा की एक छोटी राशि सामान्य है। इस वजह से, हम डायलिसिस के दौरान अगले कॉलम के लिए बाध्यकारी के लिए आवश्यक 100 mM NaCl के लिए बफर का आदान प्रदान करने से बचें। बल्कि, डायलिसिस के लिए 200 mM की एक NaCl एकाग्रता का उपयोग किया जाता है और प्रोटीन कॉलम में आवेदन करने से तुरंत पहले 100 mM (नीचे देखें) तक पतला हो जाता है। हमने जांच नहीं की है कि क्या यह वर्षा KRAS4b के लिए विशिष्ट है, लेकिन जो प्रोटीन उपजी है, उसकी पुष्टि KRAS4b-FMe के रूप में की गई है । इस कारण से, हम एक एहतियात के रूप में ब्याज के किसी भी प्रोटीन के लिए डायलिसिस बफर में उच्च NaCl एकाग्रता का उपयोग करने का सुझाव है जब तक बाध्यकारी बफर में लक्ष्य प्रोटीन की स्थिरता निर्धारित किया जा सकता है ।
  9. किसी भी वर्षा को दूर करने के लिए 10 किमी के लिए 4,000 x ग्राम पर डायलिसिस और अपकेंद्री से नमूना निकालें। अंतिम dialyzed, इस बिंदु पर स्पष्ट नमूना अभी भी अक्सर धुंधला है, लेकिन बाद में CEX कॉलम पर आगे प्रसंस्करण के बिना लागू किया जा सकता है ।
  10. बफर जी के तीन सीवी के साथ धोकर, फिर बफर एफ के तीन सीवी के साथ 20 मीटर का सेशन एक्सचेंज कॉलम (सामग्री की तालिकादेखें) तैयार करें।
    नोट: हालांकि हमने अन्य रेजिन का सावधानीपूर्वक मूल्यांकन नहीं किया है, लेकिन कई सहयोगियों ने एसपी सेफलोस हाई परफॉर्मेंस रेसिन के अलावा अन्य रेजिन के साथ खराब संकल्प पाया है।
  11. बफर ई के 20 मीटर जोड़कर 100 मीटर की अंतिम नासीएल एकाग्रता के लिए डायलिसीकृत नमूने के 20 मिलील को पतला करें और पतला नमूना को कोटेशन एक्सचेंज कॉलम में लागू करें।
  12. लोड ट्यूब के ऊपर वर्णित ताजा पतला नमूनों को जोड़कर कॉलम को लोड करना जारी रखें क्योंकि पिछले कमजोर पड़ने से लोड के अंत के करीब है।
    नोट: एक बार में पूरे नमूने को पतला कर 100 मीटर नैक के कारण लक्ष्य प्रोटीन का महत्वपूर्ण नुकसान हुआ है।
  13. बफर एफ के साथ बेसलाइन एबीएस280 के लिए कॉलम धोएं। इसके लिए आमतौर पर 3 सीवी की आवश्यकता होती है। प्रोटीन को 400 मिलीग्राम (20 सीवी) ढाल के दौरान कॉलम से बफर एफ से 65% बफर जी तक चमकता है, जो 6 एमएल अंशों(चित्रा 1बी)में एकत्र किया जाता है।
  14. ढाल पूरा होने के बाद अतिरिक्त 1.5 सीवी (65% बफर जी) के लिए कॉलम को धोना जारी रखें। दोनों SDS-PAGE/Coomassie नीले दाग विश्लेषण और क्रोमेटोग्राम के यूवी ट्रेस के निरीक्षण के आधार पर सकारात्मक अंश चुनें ।
    नोट: यूवी ट्रेस में आमतौर पर पांच चोटियां होती हैं। कम नमक सांद्रता से शुरू, प्रारंभिक चोटी आमतौर पर असंसाधित और/या प्रोटेओलिज़ प्रोटीन है । दूसरी और तीसरी चोटियों प्रसंस्कृत प्रोटीन के दो रूपों का मिश्रण कर रहे हैं: दूसरी चोटी मुख्य रूप से एक farnesylated मध्यवर्ती (FARN) है, जबकि तीसरे मुख्य रूप से ब्याज की पूरी तरह से प्रसंस्कृत FMe प्रोटीन है । चोटियों चार और पांच His6-MBP-KRAS4b संलयन प्रोटीन का प्रतिनिधित्व करते है (प्रोटीन के सभी इस बिंदु पर इस प्रारूप में है, के रूप में कोई TEV पाचन हुआ है) । ये एन-टर्मिनस पर एन-एसिटाइटेड नहीं हैं और सी-टर्मिनस पर फर्नेसेटेड (पीक फोर) और फारनेसिटेड और कार्बोक्सिमेथिलेटेड (पीक फाइव) हैं। पीक दो और पीक फोर के रूप में टैग हटाने के बाद समान प्रोटीन का उत्पादन होगा (यानी, KRAS4b-FARN) इन इस स्तर पर पूल किया जा सकता है अगर वांछित । इसी तरह, पीक तीन और पीक पांच को KRAS4b-FMe(चित्रा 1बी, चित्रा 2)का एक बहुत उत्पादन करने के लिए संयुक्त किया जा सकता है । हालांकि, यह सलाह दी जाती है कि यह पूलिंग तभी की जाती है जब अलग चोटियों में प्रोटीन की प्रकृति की पुष्टि हो जाती है।
  15. हि6-टीईवी प्रोटीज़ (नमूना के प्रॉटीज़/एमएल के ~ 200 μg) के साथ चरण 1.15 में जमा प्रोटीन को पचाना।
    नोट: हम Addgene(https://www.addgene.org/92414)से उपलब्ध प्लाज्मिड और प्रोटोकॉल का उपयोग करHis6-TEV प्रोटीज़ बनाते हैं । कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए बफर ए (10 केडीए एमडब्ल्यूसीओ डायलिसिस ट्यूबिंग के खिलाफ TEV डाइजेस्ट डाइजेस्ट(10 केडीए एमडब्ल्यूसीओ डायलिसिस ट्यूबिंग) कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए और फिर रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  16. पाचन और डायलिसिस के बाद, प्रोटीन को सीधे 20 मीटर आईमैक कॉलम में लोड करें जो बफर ए के साथ 3 mL/min पर समतुल्य है ।
    नोट: इस पूरे क्रोमेटोग्राफी के दौरान 7 mL अंशों को इकट्ठा करें, क्योंकि लक्ष्य प्रोटीन में कॉलम के लिए कम आत्मीयता होती है लेकिन यह पूरी तरह से रेसिन से बाध्य नहीं हो सकता है। 3 सीवी की कुल के लिए या जब तक एक बेसलाइन अवशोषण तक पहुंच जाता है बफर ए के साथ 3 mL/min पर कॉलम धोलें ।
  17. लक्ष्य प्रोटीन 0%-10% से बफर सी के 5 सीवी ढाल के साथ पतला है, 7 mL अंशों का संग्रह। एहतियात के तौर पर, अतिरिक्त बाउंड प्रोटीन को 100% बफर सी के साथ पतला किया जा सकता है। एसडीएस-पेज(चित्रा 1सी)द्वारा विश्लेषण के बाद सकारात्मक अंशों की पहचान की जाती है। आमतौर पर, लक्ष्य प्रोटीन कम इमिडाजोल एकाग्रता (यानी, 0%-10% बफर सी ढाल में) पर निकलता है लेकिन कभी-कभी प्रवाह-थ्रू या कॉलम वॉश में elutes।
  18. बफर एच के खिलाफ अंतिम पूल को डायलाइज़ 280 एनएम पर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें।
    नोट: इस गणना के लिए उपयोग करने के लिए विलुप्त होने के गुणांक का निर्धारण करते समय न्यूक्लियोटाइड की उपस्थिति का हिसाब करना सुनिश्चित करें।
  19. प्रोटीन को महत्वपूर्ण प्रोटीन हानि के बिना एक अपकेंद्रित्र फिल्टर यूनिट (10 K NMWL) का उपयोग करके ~ 2-5 मिलीग्राम/mL तक केंद्रित किया जा सकता है। 0.22 माइक्रोएम सिरिंज फिल्टर के साथ फ़िल्टर करें। अंतिम प्रोटीन एकाग्रता की गणना करने के लिए280 पर समाधान अवशोषण को मापें (चित्रा 1डी)। स्नैप फ्रीज तरल नाइट्रोजन में aliquots और स्टोर जमे हुए नमूनों -80 डिग्री सेल्सियस पर।
    नोट: शुद्ध प्रोटीन सकल घरेलू उत्पाद के लिए बाध्य है । KRAS4b-FMe पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल16का उपयोग कर GppNHp में विमर्श किया जा सकता है ।

2. बरकरार सामूहिक विश्लेषण और देशी जन विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी

  1. बरकरार सामूहिक विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी
    1. विश्लेषण से पहले बर्फ पर गल प्रोटीन नमूना। बरकरार सामूहिक विश्लेषण के लिए, 20 mM अमोनियम बाइकार्बोनेट (पीएच = ~ 8.4) में 0.1 मिलीग्राम/एमएल के लिए प्रोटीन पतला करें। देशी जन विश्लेषण के लिए, प्रोटीन को 50 एम अमोनियम एसीटेट (पीएच = ~ 7.5) में 0.1 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता में पतला करें। भंवर 5-10 एस के लिए प्रत्येक नमूना है, तो 1 मिन के लिए 12,500 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र समाधान में किसी भी ठोस सामग्री गोली । प्रत्येक सुपरनेटेंट के 10-20 माइक्रोन निकालें और एक ग्लास ऑटोसैंपलर शीशी में स्थानांतरित करें। संदूषण या वाष्पीकरण को रोकने के लिए प्रत्येक शीशी को कसकर कैप करें।
      नोट: या तो बरकरार जन विश्लेषण या देशी जन विश्लेषण के लिए, नमूना अंतिम कमजोर पड़ने बफर में बफर-एक्सचेंज करने के लिए 10 केडीए MWCO सेल्यूलोज झिल्ली फिल्टर का उपयोग करके विश्लेषण से पहले डिसाल्ट किया जा सकता है।
  2. सामूहिक विश्लेषण के लिए विस्तारित मास रेंज (ईएमआर) मास स्पेक्ट्रोस्कोपी की तैयारी
    नोट: मास स्पेक्ट्रोमीटर पर कोई विश्लेषण चलाने से पहले, सुनिश्चित करें कि इसे हाल ही में कैलिब्रेट किया गया है। इसके अलावा, हमेशा किसी भी हानिकारक रसायनों से बचने के लिए और नमूनों और सॉल्वैंट्स को दूषित करने से बचने के लिए आवश्यक के रूप में दस्ताने और अन्य व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें। अंशांकन व्यावसायिक रूप से प्राप्त अंशांकन समाधान और घर में तैयार 2 मिलीग्राम/एमएल सीज़ियम आयोडाइड समाधान का उपयोग करके किया जाता है।
    1. विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें और उपयुक्त साधन विधि फ़ाइल लोड करें। KRAS4b प्रोटीन के अक्षुण्ण जन विश्लेषण के लिए, उपयुक्त शुरुआती पैरामीटर इस प्रकार हैं: पता लगाने की सकारात्मक विधा; तीन माइक्रोस्कैन, संकल्प = 70,000; एजीसी लक्ष्य = 3e6; अधिकतम एकीकरण समय = 200 एमएस; और एक स्कैन रेंज = 70-1,800 मास-टू-चार्ज अनुपात (मे/जेड)। KRAS4b प्रोटीन के देशी जन विश्लेषण के लिए, उपयुक्त शुरुआती पैरामीटर इस प्रकार हैं: पता लगाने की सकारात्मक विधा; 10 माइक्रोस्कैन, संकल्प = 17,500; इन-सोर्स टकराव-प्रेरित विच्छेदन (सीआईडी) = 20 ईवी; एजीसी लक्ष्य = 3e6; टकराव ऊर्जा (सीई) = 20; अधिकतम एकीकरण समय = 200 एमएस; और एक स्कैन रेंज = 500-10,000 मीटर/z।
  3. क्रोमेटोग्राफिक सॉल्वैंट्स और कॉलम की तैयारी
    1. अक्षुण्ण सामूहिक विश्लेषण के लिए आवश्यक सॉल्वैंट्स तैयार करें। सॉल्वेंट ए 0.1% फोरमिक एसिड वाला पानी है। सॉल्वेंट बी 80% एसीटोनिट्रिल और पानी में 0.1% फोरिक एसिड है।
    2. देशी सामूहिक विश्लेषण के लिए आवश्यक सॉल्वैंट्स तैयार करें। सॉल्वेंट ए पानी में 0.1 एम अमोनियम एसीटेट है और सॉल्वेंट बी पानी है।
    3. उपयुक्त सॉल्वैंट्स तैयार होने के बाद सिस्टम को शुद्ध करें ताकि ट्यूबिंग उपयुक्त सॉल्वैंट्स से भर जाए और सभी हवा के बुलबुले लाइनों से निकल जाएं।
    4. उचित कॉलम (अक्षुण्ण जन विश्लेषण के लिए एक रिवर्स-चरण कॉलम और देशी जन विश्लेषण के लिए एक आकार बहिष्कार कॉलम) स्थापित करें। बरकरार सामूहिक विश्लेषण के लिए, प्रवाह दर 0.5 मिली/न्यूनतम है, और कॉलम तापमान (कॉलम हीटर का उपयोग करके) 50 डिग्री सेल्सियस है। कॉलम को 15-20 मिन के लिए समतुल्य करें। देशी जन विश्लेषण के लिए, प्रवाह दर ०.२५ मीटर/मिन है ।
      नोट: हमेशा कॉलम बैक-प्रेशर की निगरानी करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि यह ऊपरी सीमा से ऊपर नहीं उठता है, जो एक भरा हुआ लाइन इंगित कर सकता है या कॉलम मैट्रिक्स से समझौता किया जाता है। यदि आवश्यक हो तो कॉलम को बदलें।
  4. नमूना विश्लेषण
    1. तैयार प्रोटीन सैंपल को ग्लास ऑटोसैंपलर शीशी में एलसी सिस्टम ऑटोसैंपलर में उपयुक्त शीशी रैक में रखें। वांछित विश्लेषण के लिए उपयुक्त साधन विधि के साथ सॉफ्टवेयर प्रोग्राम में एक नमूना (एस) सूची बनाएं। एक बार नमूना सूची पूरी हो जाने के बाद, विश्लेषण शुरू करने के लिए प्ले बटन पर क्लिक करें।
    2. प्रत्येक नमूने से पहले और बाद में पानी खाली के साथ, प्रति विश्लेषण नमूना के 1-2 μL इंजेक्ट करें, यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोई कैरी-ओवर मौजूद नहीं है।
      नोट: अक्षुण्ण जन विश्लेषण देशी जन विश्लेषण की तुलना में बहुत अलग है और बहुत अलग साधन विधि सेटिंग्स की आवश्यकता है। इसका कारण यह है कि अक्षुण्ण जन विश्लेषण के साथ, प्रोटीन एक कार्बनिक विलायक की उपस्थिति में "आराम" है, और इस प्रकार अधिक शुल्क स्वीकार करने में सक्षम है। आवेश वाले राज्यों के आइसोटोपिक वितरण को कम करना और हल करना आसान है । देशी जन विश्लेषण प्रोटीन आयनों का एक संकीर्ण शुल्क वितरण प्रदान करता है, और प्रोटीन के आधार पर, विभिन्न वोल्टेज और टकराव ऊर्जा सेटिंग्स की आवश्यकता होती है।
  5. डेटा विश्लेषण और प्रोटीन डेकोवोोल्यूशन
    1. नमूना के स्पेक्ट्रम को सॉफ्टवेयर में निर्यात करें जहां इसे डी-जटिल स्पेक्ट्रम में बदल दिया जा सकता है जो प्रोटीन के अक्षुण्ण द्रव्यमान (या देशी द्रव्यमान) को प्रदर्शित करेगा। आरोपित स्पेक्ट्रल चोटियों की उच्च बहुतायत के कारण अक्षुण्ण द्रव्यमान में एक आइसोटोपिक पीक वितरण होगा। देशी द्रव्यमान आम तौर पर आरोप लगाया स्पेक्ट्रल चोटियों(चित्रा 3डी)की कम बहुतायत के कारण बहुत कम चोटियों होगा ।
    2. पीक डी के मास-टू-चार्ज अनुपात (एम/जेड) रेंज का विस्तार करें ताकि यह पुष्टि की जा सके कि मापा गया द्रव्यमान भविष्यवाणी किए गए द्रव्यमान के अनुरूप है । कभी-कभी, प्रोटीन के शुल्कों को जोडऩे के कारण, अपेक्षित आणविक वजन (मेगावाट) और मनाया गया मेगावाट के बीच थोड़ा अंतर हो सकता है। इसके अलावा, कई बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण ों के साथ, सोडियम जैसे एडडक्ट डेटा में अतिरिक्त चोटियों की उपस्थिति में योगदान दे सकते हैं, यहां तक कि सावधानी से डिसाल्टेड नमूनों के साथ भी। एक मे/जेड के साथ कम प्रचुर मात्रा में चोटियों कि उम्मीद से कम है कई बार मनाया जाता है । यह एक तटस्थ नुकसान के कारण सबसे अधिक संभावना है, जो आयनीकरण प्रक्रिया के कारण एक कार्यात्मक समूह का नुकसान है।
      नोट: जैसा कि उम्मीद थी, अक्षुण्ण द्रव्यमान और देशी द्रव्यमान चोटियों के बीच मतभेद होंगे। अक्षुण्ण मास डिस्प्ले प्रोटीन की उम्मीद मेगावाट दिखाएगा । इसमें अटैच किए गए न्यूक्लियोटाइड या अन्य संशोधनों की अतिरिक्त मेगावाट नहीं होगी। हालांकि, देशी जन चोटी किसी भी जोड़ा न्यूक्लियोटाइड के साथ प्रोटीन दिखाएगा ।

3. LIposomes के लिए बाध्यकारी KRAS4b-FMe का सत्यापन

  1. झिल्ली लिपोसोम तैयारी
    1. 20 एमएम एचईपी (पीएच = 7.3), 150 एमएम एनसीएल और 1 एमएम टीसीईपी से मिलकर एक बफर तैयार करें।
    2. लिपोसोम तैयारी सामग्रियों में क्लोरोफॉर्म में 25 एमएम 1-पामिटोइल-2-ओलियोइल-ग्लाइसेरो-3-फॉस्फोकोलिन (पीओसी) और 10 एमएम 1-पामिटोइल-2-ओलियोइल-ग्लीसेरो-3-फॉस्फो-एल-सेरीन (चबूतरे) स्टॉक शामिल हैं; एक धारक और हीटिंग ब्लॉक के साथ एक लिपिड एक्सट्रूडर सेट; आर्गन गैस और तरल नाइट्रोजन; एक अल्ट्रासोनिक स्नान; पीटीएफई फोम लाइनर्स के साथ ग्लास स्क्रू थ्रेड शीशियां; और एक प्लेट रीडर जो गतिशील प्रकाश बिखरने का पता लगाने में सक्षम है।
    3. 30 min के लिए कमरे के तापमान पर क्लोरोफॉर्म में फोल लिपिड स्टॉक। 5 एमएम 70:30 पीओपी का 1 एमएल तैयार करें: 25 एमएम पीओपी (स्टॉक) के 106 माइक्रोन और 10 मीटर पीओएस चबूतरे (स्टॉक) के 118 माइक्रोन को ग्लास शीशी में डालकर पीओएस लिपोसोम्स करें।
      नोट: प्लास्टिक की नोक के साथ लिपिड को बहाना न करें, क्योंकि क्लोरोफॉर्म कुछ प्लास्टिक युक्तियों को भंग कर सकता है।
    4. आर्गन गैस की एक सतत धारा के नीचे सूखी लिपिड। सूखी फिल्म की पतली परत बनाने के लिए आर्गन गैस लगाने पर धीरे-धीरे कांच की शीशी घुमाएं।
    5. अतिरिक्त क्लोरोफॉर्म को हटाने के लिए रात भर वैक्यूम लाइओफिलाइजर के नीचे नमूने डालें।
    6. सूखे फिल्म में बफर के 1 mL जोड़कर लिपिड का पुनर्गठन करें और 5 मिन के लिए मिश्रण भंवर करें। 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे तक रॉकिंग करके लिपिड मिश्रण को हाइड्रेट करें।
      नोट: नमूना लिपिड की सूखी फिल्म परत के लिए बफर के अलावा पर बहुत टर्बिड किया जाएगा ।
    7. बर्फ-पानी (4 डिग्री सेल्सियस या उससे कम) और गर्म पानी के स्नान (25 डिग्री सेल्सियस या उससे अधिक) के बीच नमूना शीशी रखने में बारी-बारी से पांच फ्रीज/गल चक्र करें।
    8. नमूना शीशी को अल्ट्रासोनिक बाथ में रखें और नमूने को लगभग 0.5 घंटे तक या नमूना अर्धपारदर्शी न हो जाए।
    9. लिपिड एक्सट्रूडर सेट का उपयोग करके नमूनों को बाहर निकालें। निर्माता के निर्देशों में दिखाए गए एक्सट्रूजन किट को इकट्ठा करें। 0.1 माइक्रोन फिल्टर पेपर का उपयोग कर के नमूनों को बाहर निकालें। नमूनों को एक ग्लास सिरिंज में लोड करें और इसे एक्सट्रूजन उपकरण के एक छोर से संलग्न करें। एक्सट्रूजन उपकरण के दूसरे छोर पर एक खाली सिरिंज जोड़ें। आगे और पीछे 10-20x पुश जब तक अपने नमूने पूरी तरह से पारदर्शी हो जाते हैं ।
    10. किसी भी बड़े एग्रीगेट को हटाने के लिए 20,000 x ग्राम पर 30 मिन के लिए अंतिम नमूनों को स्पिन करें।
    11. लिपोसोम (वैकल्पिक) के आकार और एकरूपता को निर्धारित करने के लिए गतिशील प्रकाश बिखरने (डीएलएस) का उपयोग करें। लिपोसोम्स के 30 माइक्रोन को 384 वेल प्लेट रीडर में रखें। प्लेट को 30 00 00 0 00 0 0 0 0 ग्राम पर स्पिन करें। प्लेट को प्लेट रीडर में रखें और 10 प्रकाश बिखरने वाले माप एकत्र करें।
  2. चरित्र KRAS4b-FMe सतह प्लाज्मोन गूंज (एसपीआर) के माध्यम से liposomes के लिए बाध्यकारी
    1. आवश्यक सामग्री इकट्ठा: एक एसपीआर उपकरण; सेंसर चिप L1; 7 x 14 मिमी शीशी ट्यूब; और चैप्स।
    2. 20 एमएम एचईपी (पीएच = 7.3), 150 एमएम एनसीएल, 1 एमएम टीसीईपी युक्त बफर तैयार करें। 200 माइक्रोन (कुल 10 टिट्रेशन) की कुल मात्रा में 60 माइक्रोन-0.06 माइक्रोएम से KRAS4b-FMe की 2:1 कमजोर पड़ने की श्रृंखला तैयार करें। अंतिम पतला नमूनों को शीशी ट्यूबों में स्थानांतरित करें (सामग्री की तालिकादेखें), शीशी ट्यूबों को रैक में रखें, और नमूनों को एसपीआर उपकरण में डालें।
    3. एसपीआर इंस्ट्रूमेंट में एल1 सेंसर चिप डालें। बफर और प्राइम सिस्टम को 7 मिन के लिए बफर के साथ संलग्न करें।
    4. इस प्रकार एक स्वचालित विधि स्थापित करें:
      1. यंत्र का तापमान 25 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें।
      2. सेंसर चिप L1 को 30 μL/मिन प्रवाह दर पर पानी में भंग 20 मीटर चैप्स के दो 1 मिन इंजेक्शन के साथ rinsing द्वारा सक्रिय करें ।
      3. चिप की सतह को हाइड्रेट करने के लिए बफर चलाने के दस 1 मिन इंजेक्शन के स्टार्ट-अप चक्र ों का प्रदर्शन करें।
        1. 5 μL/min पर 2 मिन इंजेक्शन के साथ एल1 चिप के फ्लो सेल (एफसी) पर लिपोसोम्स इंजेक्शन द्वारा सेंसर चिप L1 पर liposomes जमा करें । कम से कम ~ 3,000 प्रतिक्रिया इकाइयों (आरयू) के एक पर ाँट स्तर के लिए लक्ष्य।
          नोट: इंजेक्शन समय बढ़ाएं जब तक आप उचित कैप्चर स्तर प्राप्त न करें।
      4. 30 μL/मिन पर 1 मिन इंजेक्शन के साथ दोनों एफसी-1 और एफसी-2 पर बफर के तीन चक्र इंजेक्ट करें ।
        1. विभिन्न KRAS4b-FMe टिट्रेशन को सबसे कम से उच्चतम एकाग्रता श्रृंखला तक इंजेक्ट करें। एसोसिएशन चरण के लिए 1 मिन इंजेक्शन का उपयोग कर प्रोटीन इंजेक्ट और दोनों एफसी पर 30 μL/मिन प्रवाह दर पर वियोजन चरण के लिए 2 मिन इंजेक्शन ।
        2. सेंसर चिप L1 को 30 माइक्रोन/मिन में 20 मीटर चैप्स के दो 1 मिन इंजेक्शन के साथ rinsing द्वारा पुनर्जीवित करें ।
    5. स्पष्ट बाध्यकारी समानताएं प्राप्त करने के लिए एक ही साइट बाध्यकारी मॉडल का उपयोग करएसपी मूल्यांकन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा फिट करें (डेटा फिटिंग के स्पष्टीकरण के लिए चर्चा अनुभाग देखें)।

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Representative Results

प्रोटोकॉल में सबसे बड़े चरों में से एक व्यक्त लक्ष्य प्रोटीन (His6-MBP-tev-KRAS4b) की मात्रा है। यह प्रोटोकॉल एक ट्राइकोप्लसिया नी सेल लाइन, तनी-एफएनएल17से एक अलग का उपयोग करके विकसित किया गया था, जो निलंबन वृद्धि के लिए अनुकूलित था और सीरम से छुड़ाया गया था। बैकक्यूलोवायरस अभिव्यक्ति प्रणाली के साथ विभिन्न कीट कोशिका रेखाओं में सूचित परिणामों की विस्तृत श्रृंखला को देखते हुए, यह सलाह दी जाती है कि कम से कम शुरू में, KRAS4b-FMe का उत्पादन करने के लिए टीनी-एफएनएल का उपयोग किया जाए।

एक डार्क प्रोटीन जो ~ 65 केडीए में माइग्रेट होता है, स्पष्ट लाइसेट के साथ-साथ एल्यूशन अंशों(चित्रा 1ए)में स्पष्ट होना चाहिए। फ्यूजन प्रोटीन lysate में दो सबसे प्रमुख दाग बैंड में से एक होना चाहिए सह के साथ FNTA/बी है कि ~४८ केडीए में comigrates जा रहा है ।

शुद्धिकरण के भीतर, CEX चरण दो कारणों से महत्वपूर्ण है: 1) यह प्रोटेलियोलिसिस की सीमा को कम करने का कार्य करता है क्योंकि हाइपरवेरिचर क्षेत्र (एचवीआर) काफी अतिसंवेदनशील है, और 2) यह प्रोटोकॉल के इस चरण के लिए नोटों में संकेत ित पूरी तरह से प्रसंस्कृत प्रोटीन के लिए समृद्ध करता है। हालांकि, यह प्रोटोकॉल का सबसे जटिल हिस्सा है । इसका कारण यह है कि प्रसंस्कृत प्रोटीन कम नमक सांद्रता पर उपजी है, यहां तक कि एमबीपी के लिए जुड़े । सौभाग्य से, यह एक सब या कोई घटना नहीं है, और यह भी समय के साथ कुछ धीरे से जगह लेता है । प्रोटोकॉल सीईएक्स चरण से पहले 200 एमएम एनएसीएल को डायलकर इसका लाभ उठाता है। इस एकाग्रता में, वर्षा के रूप में १०० mM पर के रूप में महत्वपूर्ण नहीं था । इसलिए, प्रोटोकॉल को इस नमक एकाग्रता के बफर में प्रोटीन के समय की लंबाई को सीमित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। कॉलम लोडिंग से तुरंत पहले शून्य-नमक बफर की बराबर मात्रा के साथ सीईएक्स कॉलम लोड के छोटे एलिकोट्स का मिश्रण कम नमक की स्थिति तक एक्सपोजर (समय के संदर्भ में) को सीमित करता है और इस प्रकार वर्षा को सीमित करता है। चित्रा 2ए में सीएक्स चरण से सबसे विशिष्ट परिणाम को दर्शाया गया है, जिसमें सबसे प्रमुख चोटी 3 है, जिसमें मुख्य रूप से KRAS4b-FMe शामिल है। चित्रा 2बी में एल्यूशन प्रोफाइल को दर्शाया गया है जो प्रक्रिया के परिणाम की परिवर्तनशीलता की भावना देने के लिए देखे गए हैं। क्योंकि ये कभी-कभी भ्रामक हो सकते हैं, सभी चोटियों के पूल बनाना और इन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करना समझदारी है जब तक कि ब्याज की चोटी को पूरी तरह से शुद्ध और गुणवत्ता परीक्षण पारित नहीं किया गया है।

जैसा कि प्रोटोकॉल में उल्लेख किया गया है, HiPrep एसपी सेफलोस उच्च प्रदर्शन स्तंभों का उपयोग चित्रा 2एमें मनाए गए अलगाव को प्राप्त करने में महत्वपूर्ण प्रतीत होता है। हालांकि यह अभी तक स्पष्ट नहीं है कि क्यों पीक तीन अक्सर वांछित farnesylated और carboxymethylated KRAS4b के अलावा farnesylated-केवल KRAS4b बंदरगाहों, गरीब संकल्प दूसरों वैकल्पिक CEX रेजिन (व्यक्तिगत संचार) के साथ रिपोर्ट किया है पता चलता है इस घटना को पूरी तरह से आयनिक बातचीत का परिणाम नहीं है ।

विशिष्ट पैदावार 1-6 मिलीग्राम/एल से लेकर, 3-5 मिलीग्राम/एल के साथ अक्सर (>90%, n >50) हासिल की गई। ईएसआई-एमएस का उपयोग करके अक्षुण्ण जन विश्लेषण ने प्रोटीन के सटीक आणविक द्रव्यमान की पुष्टि की और इस तरह farnesylation और/या carboxymethylation(चित्रा 3)के सापेक्ष अनुपात । जबकि ठेठ अंतिम बहुत कुछ पता लगाने योग्य KRAS4b-FARN निहित है, इस अनुपात में इस विश्लेषण से चोटी ऊंचाई के मामले में 15% से भी कम था । चित्रा 3एक KRAS4b के लिए प्रतिनिधि डेटा से पता चलता है कि ई. कोलाई में व्यक्त नहीं है, चित्रा 3बी CEX से 3 और 5 चोटियों में eluted KRAS4b-FMe से पता चलता है, और चित्रा 3सी से पता चलता है KRAS4b-Farn CEX से पीक 2 में eluted ।

सकल घरेलू उत्पाद के लिए बाध्य KRAS4b के द्रव्यमान भी देशी जन विश्लेषण(चित्रा 3डी)का उपयोग कर इन नमूनों के लिए निर्धारित किया गया था । अमोनियम एसीटेट में नमूनों का आदान-प्रदान एक "नरम" आयनीकरण सुनिश्चित किया और देशी परिसर बरकरार रहे, KRAS4b के लिए बाध्य न्यूक्लियोटाइड की प्रकृति की पुष्टि प्रदान करते हैं ।

झिल्ली से बांधने के लिए KRAS4b-FMe के लिए इस बात को मान्य करने के लिए, हमने एसपीआर के माध्यम से लिपोसोम्स के लिए KRAS4b-FMe की बातचीत को मापा। जैसा कि चित्र4में दिखाया गया है, KRAS4b-FMe लिपोसोम्स से बंधा हुआ है, जबकि असंसाधित KRAS4b नहीं था, जिससे यह प्रदर्शित किया गया कि झिल्ली के साथ बातचीत के लिए प्रसंस्कृत KRAS4b-FMe की आवश्यकता है।

Figure 1
चित्रा 1: शुद्धिकरण प्रक्रिया के एसडीएस-पेज जैल। (A)लाइसेट से आईमैक कैप्चर। FNTA/B अंधेरे बैंड ~ ४८ केडीए में पलायन कर रहे है और His6-MBP-tev-KRAS4b अंधेरे बैंड ~ ६७ केडीए पर पलायन है । एम = प्रोटीन आणविक वजन सीढ़ी; टी = कुल प्रोटीन; L = स्पष्ट lysate/कॉलम लोड; एफ = कॉलम प्रवाह के माध्यम से। अंशों को बढ़ते इमिडाजोल एकाग्रता ढाल के साथ पतला किया जाता है। (ख)1-5 लेबल वाले CEX अंश चित्रा 2के क्रोमेटोग्राम में दिखाए गए एल्यूटियन चोटियों से चोटी के अंशों के अनुरूप हैं । (C)टीईवी पाचन और दूसरा आईमैक। C = CEX कदम पूर्व TEV दरार से पूल; एल = लोड नमूना पोस्ट-TEV दरार। ब्याज की प्रजातियों लेबल हैं। (D)अंतिम KRAS4b-FMe प्रोटीन के एक और पांच माइक्रोग्राम । चित्रित जैल कई प्रस्तुतियों से प्रतिनिधि परिणाम हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: CEX क्रोमेटोग्राफी एल्यूशन प्रोफाइल। (A)ठेठ CEX elution प्रोफ़ाइल चार से पांच प्रमुख चोटियों है । पीक 1 के अलावा, जो आम तौर पर चार सी-टर्मिनल अमीनो एसिड की कमी के लिए असंसाधित KRAS4b का एक प्रोटेलियोज़्ड रूप है, चार चोटियों ने पैनल परिणाम में 2 से 5 के माध्यम से प्रोटीन के एन और सी-टर्मिनी के प्रसंस्करण में परिवर्तनशीलता से गिने, उत्तरोत्तर अधिक सकारात्मक रूप से आवेशित अणुओं के साथ बाद में ग्रेडिएंट में eluting (देखें कदम 1.15)। (ख)CEX एल्यूशन प्रोफाइल के अतिरिक्त उदाहरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: शुद्ध KRAS4b प्रोटीन का अक्षुण्ण और देशी द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण। बरकरार बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम और deconvoluted पीक विश्लेषण के परिणाम(ए)असंसाधित KRAS4b 2-185, मेगावाट = 21,064 की भविष्यवाणी की; (ख)KRAS4b 2-185-FMe, चोटियों 3 और 5 CEX से, मेगावाट = 21,281 की भविष्यवाणी की; (C)KRAS4b 2-185-Farn, CEX से पीक 2, मेगावाट = 21,267 की भविष्यवाणी की। (घ)ई. कोलाई के लिए देशी मास डेकोवोल्व्ड पीक विश्लेषण ने KRAS4b 2-185 (i), KRAS-FMe 2-185 (ii), और KRAS-Farn 2-185 (iii), सभी सकल घरेलू उत्पाद-न्यूक्लियोटाइड बाध्य राज्य में व्यक्त किए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: SPR के माध्यम से liposomes के लिए बाध्यकारी KRAS4b-FMe । 70:30 POPC का आकार वितरण: डीएलएस द्वारा प्राप्त चबूतरे लिपोसोम्स। (A)डीएलएस डेटा 18% पॉलीस्पेलिटी के साथ लिपोसोम्स के लिए ~ 200 एनएम का औसत व्यास दिखाता है। (ख)60-0.6 माइक्रोएम KRAS4b-FMe के एसपीआर बाध्यकारी सेंसरग्राम एक सेंसर L1 चिप पर कब्जा कर लिया 70:30 liposomes के लिए । (ग)एसपीआर डेटा से प्राप्त स्थिर राज्य बाध्यकारी आइसोथर्म के फिट ने लिपोसोम्स के लिए बाध्यकारी KRAS4b-FMe के 1 माइक्रोन का एक स्पष्ट केडी प्रदान किया। लिपोसोम्स के सतह पर कब्जा स्तर से विभाजित करके बाध्यकारी प्रतिक्रिया को सामान्यीकृत किया जाता है। (D)60-0.6 माइक्रोएम KRAS4b-2-185 से 70:30 liposomes के एसपीआर बाध्यकारी काइनेटिक्स एक सेंसर L1 चिप पर कब्जा कर लिया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

जैसा कि प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में उल्लेख किया गया है, शुद्धिकरण के दौरान सबसे महत्वपूर्ण कदम कम नमक में होने के समय के दौरान नमूने की हैंडलिंग है। समय है कि नमूना कम से कम २०० mM NaCl के संपर्क में है सीमित वर्षा को कम करने और नमूना उपज में वृद्धि करने में मदद मिलेगी । यदि प्रोफ़ाइल अपेक्षाओं से मेल नहीं खाती है तो CEX के परिणामों की व्याख्या मुश्किल हो सकती है (चित्रा 2देखें)। जब तक प्रोटोकॉल नियमित नहीं हो जाता है, तब तक यह सलाह दी जाती है कि सीईएक्स एल्यूशन अंशजो आगे नहीं ले जाते हैं, उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाए जब तक कि यह सुनिश्चित करने के लिए कि उचित सामग्री को आगे ले जाया गया था, तब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाए। CEX चरण के लिए ऊपर नोट किए गए मापदंडों के बाहर, प्रोटोकॉल lysis और IMAC चरणों में संशोधित करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है। यह भी देखने लायक है कि प्रोटोकॉल में कोई आकार बहिष्कार क्रोमेटोग्राफी (सेक्स) जुदाई कदम नहीं है। यह शुरुआती विधि विकास (अप्रकाशित परिणाम) के दौरान हमने देखे गए नुकसान के कारण छोड़ा है। गौरतलब है कि नैनोडिस्क के साथ प्रोटीन के जटिल होने पर ये नुकसान नहीं देखा जाता है, जिससे लिपिड के अभाव में होने वाले नुकसान का सुझाव प्रोटीन और रेसिन के बीच हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन के कारण होता है ।

यह विधि मात्रा (और जीटी;10x अधिक) और गुणवत्ता (मानव कोशिकाओं में व्यक्त सदाशयी प्रसंस्कृत KRAS4b की तुलना में) दोनों में बड़ी वृद्धि का प्रतिनिधित्व करती है जो साहित्य में सूचित किया गया है14,18,19। 3-5 मिलीग्राम/एल की उपज ने संरचनात्मक जीव विज्ञान के प्रयासों को सक्षम किया है जिसके लिए उच्च प्रोटीन आवश्यकताओं की आवश्यकता होती है16,20। आरएएस परिवार के अन्य सदस्यों के साथ-साथ सामान्य रूप से अतिरिक्त पोस्टट्रांसलेशनल संशोधन ों की वर्तमान में जांच की जा रही है ।

KRAS4b के अक्षुण्ण जन विश्लेषण के लिए, 0.1 मिलीग्राम/mL की एकाग्रता अच्छी तरह से काम करती है। शुल्क स्वीकार करने के लिए आराम प्रोटीन विन्यास की क्षमता के कारण कम सांद्रता का उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, देशी जन विश्लेषण में, जहां प्रोटीन अपने मूल रूप से जोड़ संरचना में है, वहां कम बड़े पैमाने पर प्रभारी अनुपात और उच्च सांद्रता की आवश्यकता है । इस प्रकार, प्रोटीन की कम सांद्रता का उपयोग करने से संकेत की कमी होती है और कम विश्वसनीय परिणाम उत्पन्न होते हैं। देशी द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री का लाभ यह है कि बफर क्रास4बी से बंधे न्यूक्लियोटाइड के परिसर को बनाए रखने के साथ संगत है। इसलिए, प्रोटीन(चित्रा 3डी)के न्यूक्लियोटाइड-बाउंड रूपों की पुष्टि करना संभव है। किसी भी बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के साथ, तटस्थ नुकसान (जैसे मिथाइल समूह) मनाया जाता है (अक्षुण्ण द्रव्यमान विश्लेषण में 18 के नुकसान के साथ छोटी प्रजातियों को देखें, चित्रा 3ए-सी)। देशी द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण में, व्यापक बफर एक्सचेंज के बाद मौजूद एनए+ या के+के साथ प्रोटीन एडडक्ट्स मनाया जा सकता है। यह चित्रा 3डी,पैनल i-iii में +23 की छोटी चोटियों में स्पष्ट है) ।

हमारे एसपीआर डेटा(चित्रा 4)से पता चलता है कि VItro में KRAS4b-झिल्ली बातचीत को फिर से तैयार करने के लिए KRAS4b का पूरी तरह से प्रोसेस्ड फॉर्म आवश्यक है। हमारे एसपीआर प्रयोगों में लिपोसोम्स को पकड़ने के लिए एल1 चिप का उपयोग करने का एक प्रमुख लाभ यह है कि एल1 चिप सतह को लिपोफिलिक समूहों21के साथ dextran लेपित और संशोधित किया जाता है, इस प्रकार बिना किसी और संशोधन के लिपोसोम को सीधे पकड़ने की अनुमति होती है। एसपीआर स्टॉइचियोमेट्री और बाध्यकारी आत्मीयता के बारे में जानकारी प्रदान करने वाले लिगांड-लिगामेंट इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। सेंसरग्राम जो ठीक से काम करते हैं, उनमें एक एसोसिएशन चरण होना चाहिए जो स्थिर स्थिति तक पहुंचता है। यह अधिकतम बाध्यकारी प्रतिक्रिया (आरमैक्स)बातचीत के लिए स्टोइचियोमेट्री का अनुमान प्रदान करती है। वियोजन दर को 1:1 बाध्यकारी बातचीत22मानते हुए एक भी घातीय क्षय का पालन करना चाहिए। हालांकि, झिल्ली की सतह के लिए बाध्यकारी प्रोटीन आमतौर पर अधिक जटिल स्टोइचियोमेट्रीजहाँ 23 और कई समानताओं के साथ होते हैं जिसके परिणामस्वरूप अधिक जटिल गतिज के साथ सेंसरग्राम होते हैं। हम एक मल्टीसाइट बाध्यकारी मॉडल के लिए गतिज फिट करने में कामयाब नहीं रहे हैं । हालांकि, संतुलन बाध्यकारी आइसोथर्म वाणिज्यिक मूल्यांकन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एक स्पष्ट संतुलन बाध्यकारी आत्मीयता (केडी)प्रदान करने के लिए फिट हो सकते हैं। बावजूद, हमारे एसपीआर डेटा स्पष्ट रूप से कैसे असंसाधित KRAS4b और KRAS4b-FMe liposomes के लिए बांध के बीच अंतर । इस प्रकार, एसपीआर अभी भी प्रोटीन-लिपिड इंटरैक्शन को समझने में एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है।

सामूहिक रूप से, एसपीआर का उपयोग करके हम प्रदर्शित करते हैं कि झिल्ली बाध्यकारी के लिए पूरी तरह से संसाधित KRAS4b-FMe की आवश्यकता होती है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करके क्रास4बी के पूरी तरह से फारनेसेटेड और कारबॉक्सीमेथिलेटेड रूप का उत्पादन संरचनात्मक जीव विज्ञान20के लिए आवश्यक सामग्री की मात्रा और गुणवत्ता, झिल्ली इंटरैक्शन23का जैव भौतिक लक्षण वर्णन, और लिपिड बाइलेयर की उपस्थिति में क्रास4बी-एफएमई: आरएएफ परिसर के खिलाफ स्क्रीनिंग अध्ययन प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम कैरिसा गरोज, जेन मेल्हालको और मैट आकर्षित प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रयोगशाला, फ्रेडरिक नेशनल लेबोरेटरी फॉर कैंसर रिसर्च में क्लोनिंग और अभिव्यक्ति समर्थन स्वीकार करते हैं। इस परियोजना को अनुबंध संख्या के तहत राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से संघीय धन के साथ पूरे या भाग में वित्त पोषित किया गया है । HHSN261200800001E. इस प्रकाशन की सामग्री जरूरी विचारों या स्वास्थ्य और मानव सेवा विभाग की नीतियों को प्रतिबिंबित नहीं करता है, और न ही व्यापार के नाम, वाणिज्यिक उत्पादों, या संगठनों का उल्लेख है अमेरिकी सरकार द्वारा समर्थन मतलब

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural Eppendorf 22363204
11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials Thermo Scientific 30211SS-1232
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) AVANTI POLAR LIPIDS 850457 purchase as liquid stocks in chloroform
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS) AVANTI POLAR LIPIDS 840034 purchase as liquid stocks in chloroform
5427R Centrifuge Eppendorf
Acetonitrile, HPLC Grade Fisher Chemical A998-1 1L
Ammonium Acetate Sigma-Aldrich 09689-250g
Argon gas Airgas ARUP
Assay Plate 384 CORNING 3544
Biacore T200 Instrument GE Healthcare
Blue Snap-It Seals, T/S Thermo Scientific C4011-54B
Branson Ultrasonic Bath Thermo Fisher 15-336-1000
Cation Exchange Chromatography (CEX) column GE Healthcare Life Sciences 29018183 HiPrep SP Sepharose High Performance
CHAPS Sigma C3023
Dyna Pro Plate Reader Wyatt Technologies
Exactive Plus EMR Mass Spectrometer Thermo Scientific
Formic Acid Sigma-Aldrich F0507-500Ml Use Reagent Grade or better
Gilson vials 7x14 mm Tubes GE Healthcare BR-1002-12
Glass screw thread vials with PTFE foam liners Scientific Specialities B69302
High speed/benchtop centrifuge Thermo Fischer Scientific 05-112-114D capable of up to 4,000 xg
His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease Addgene 92414 Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY
Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column GE Healthcare Life Sciences 28-9365-51 HisPrep FF 16/10
In-House Water Supply, Arium Advance Sartorius Stedim Resistivity of 18 MΩ0-cm
Lipid extruder set with holder AVANTI POLAR LIPIDS 610023
Liquid nitrogen Airgas NI-DEWAR
M110-EH microfluidizer Microfluidics
MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm Thermo Scientific 088645
MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 Å, 2.1 x 150 mm Thermo Scientific 088790
MagTran software Thermo Scientific
Methanol, HPLC Grade VWR Chemicals BDH20864.400
NGC Chromatography System BioRad 78880002 NGC QuestTM 100 Chromatography system
Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators Millipore Sigma P8849
Rubber Caps type 3 GE Healthcare BR-1005-02
Series S Sensor Chip L1 GE Healthcare 29104993
Spectrophotometer Thermo Fischer Scientific 13-400-519 Absorbace at 280nm
Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL Millipore Sigma UFC901008 PES membrane
Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters Amicon UFC501024
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima - L80K capable of 100,000 xg
Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System) Thermo Scientific
Vortex Genie 2 Fisher 12-812
Water, HPLC Grade Sigma-Aldrich 270733-1L May use in-house water source (see below)
Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter GE Healthcare - Whatman 6994-2504
Xcalibur QualBrowser Thermo Scientific proteomics software

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References

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बायोकेमिस्ट्री इश्यू 155 कीट सेल प्रोटीन उत्पादन कार्बोक्सीमिथाइलेशन फारनेसिलेशन बरकरार स्पेक्ट्रोमेट्री देशी द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री सतह प्लाज्मोन अनुनाद लिपोसोम्स
पूरी तरह से संसाधित पुनः संयोजन KRAS4b: फरनेसेटेड और मेथाइलेटेड प्रोटीन को अलग और विशेषता
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Agamasu, C., Frank, P., Perkins, S., … More

Agamasu, C., Frank, P., Perkins, S., Waybright, T., Messing, S., Gillette, W., Stephen, A. G. Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein. J. Vis. Exp. (155), e60703, doi:10.3791/60703 (2020).

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