Summary
Пренилирование является важной модификацией периферических мембранных связывающих белков. Клетки насекомых можно манипулировать для производства фарнезилатных и carboxymethylated KRAS4b в количествах, которые позволяют биофизические измерения белково-белковых и белково-липидных взаимодействий
Abstract
Пренилация белка является ключевой модификацией, которая отвечает за таргетинг белков на внутриклеточные мембраны. KRAS4b, который мутирует в 22% рака человека, обрабатывается фарнезиляции и карбоксиметилирования из-за присутствия 'CAAX' мотив коробки на C-термину. Инженерная система бакуловируса была использована для выражения фарнезилатовые и carboxymethylated KRAS4b в клетках насекомых и была описана ранее. Здесь мы описываем детальную, практическую очистку и биохимическую характеристику белка. В частности, для очищения белка до однородности использовались сродство и ионная обменная хроматография. Intact и родной масс-спектрометрии был использован для проверки правильной модификации KRAS4b и для проверки нуклеотидных связывания. Наконец, мембранная связь фарнезилатной и карбоксиметилового KRAS4b к липосоме была измерена с помощью поверхностной плазмонрезонансной спектроскопии.
Introduction
Почтовые изменения играют ключевую роль в определении функциональной активности белков. Такие модификации, как фосфорилирование и гликозилирование, хорошо известны. Липидные модификации менее хорошо характеризуются, однако. Подсчитано, что до 0,5% всех клеточных белков могут быть пренилированными1. Prenylation является передача 15-углеродный фарнесил или 20-углеродный геранилгеранил липидной цепи принимает белок, содержащий мотив CAAX2. Пренилированные белки были вовлечены в прогрессирование нескольких заболеваний человека, включая преждевременное старение3, болезнь Альцгеймера4, сердечная дисфункция5,сосудидеремия6, и рак7. Небольшие GTPases, HRAS, NRAS, и KRAS1, ядерные ламинины, и кинетохоры CENP-E и F являются фарнезилатными белками в базальном состоянии. Другие небольшие GTPases, а именно RhoA, RhoC, Rac1, cdc-42, и RRAS являются geranylgeranylated8, в то время как RhoB может быть farnesylated или geranylgeranylated9.
Небольшой GTPase KRAS4b функционирует как молекулярный переключатель, по существу передающий внеклеточный фактор роста, сигнализирующие на внутриклеточные пути трансдукции сигнала, которые стимулируют рост и пролиферацию клеток, через несколько белково-белковых взаимодействий. Есть два ключевых аспекта биохимии KRAS4b, которые имеют важное значение для его деятельности. Во-первых, белковые циклы между неактивным ВВП и активным состоянием связанного GTP, при котором он активно взаимодействует с эффекторами. Во-вторых, C-терминальный поли-лизин области и фарнезилати и карбоксиметилированный цистеин направить белок на плазменной мембраны, что позволяет вербовки и активации вниз по течению эффекторов. Мутант KRAS4b является онкогенным драйвером в поджелудочной железе, колоректальной и рак легких10, и как таковой, терапевтическое вмешательство будет иметь огромное клиническое преимущество. Производство подлинно модифицированного рекомбинантного белка, который фарнезилат и карбоксиметилированный позволит биохимический скрининг с использованием KRAS4b в сочетании с мембранными суррогатами, такими как липосомы или липидные нанодиски11,12.
Фарнесил трансферазы (FNT) катализирует добавление фарнесилового пирофосфата в C-терминал цистеин в мотиве CAAX в KRAS4b. После prenylation, белок торгуется в эндоплазмический ретикулум (ER), где Ras преобразования фермента (RCE1) расщепляет три C-терминалостатка остатков. Последним шагом в обработке является метилирование нового C-терминала фарнесилцистеина остаток мембранного белка ER, isoprenylcysteine carboxyl метилтрансферазы (ICMT). Выражение рекомбинантного KRAS4b в кишечной палочке приводит к выработке неизмененного белка. Предыдущие попытки производить обработанный KRAS4b были ограничены из-за недостаточной урожайности для структурных или наркотиков скрининговых экспериментов или не смогли резюмировать родной полнометражный зрелый белок13,14. В представленном здесь протоколе используется инженерная система экспрессии клеток на основе бакуловируса и метод очистки, который генерирует высокоочищенный, полностью обработанный KRAS4b при урожайности 5 мг/л клеточной культуры.
Тщательная характеристика белка имеет важное значение для проверки качества рекомбинантных белков до начала структурных исследований биологии или скрининга наркотиков. Двумя ключевыми параметрами полностью обработанного KRAS4b являются проверка правильной модификации пренил и наличие фарнезилатной и карбоксиметилированных C-терминов (FMe) для взаимодействия с мембранными заменителями или липидами. Электроспрей ионизация масс-спектрометрии (ESI-MS) KRAS4b-FMe использовалась для измерения молекулярного веса и подтверждения наличия фарнесиловых и карбоксиметиловых модификаций. Местная масс-спектрометрия, где образцы распыляются с неденативными растворителями, была использована для демонстрации того, что KRAS4b-FMe также был связан с его Кофактором ВВП. Наконец, поверхностная плазмонная резонансная спектроскопия использовалась для измерения прямого связывания KRAS4b-FMe с обездвижемыми липосомыми.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Очистка белка
- Подготовьте буферы A-H, как видно из таблицы 1.
| Решение буфера | Буферный агент (все 20 мМ) | рH | NaCl (mM) | имидазол (mM) | MgCl2 | TCEP |
| A | ГЕПЕС | 7.3 | 300 | - | 5 | 1 |
| B | ГЕПЕС | 7.3 | 300 | 35 | 5 | 1 |
| C | ГЕПЕС | 7.3 | 300 | 500 | 5 | 1 |
| D | Мчс | 6.0 | 200 | - | 5 | 1 |
| E | Мчс | 6.0 | - | - | 5 | 1 |
| F | Мчс | 6.0 | 100 | - | 5 | 1 |
| Г | Мчс | 6.0 | 1000 | - | 5 | 1 |
| H | ГЕПЕС | 7.3 | 300 | - | 1 | 1 |
- Подготовка очистных материалов (см. Таблица материалов):коктейль-ингибитор протеазы без ЭДТА или других хелаторов; обездвижение металлической хроматографии (IMAC) колонки; колонка cation exchange chromatography (CEX); 0,45 мкм фильтршого; 2 М имидазол (рН 7,5); ультрацентрифуги, способной 100 000 х г; центрифуга высокой скорости, способная 4000 х г; центробежные фильтровальные блоки (10 KDa NMWL); спектрофотометр, способный читать на уровне 280 нм; Его 6-табачный травяной вирус (TEV) протеазы; и хроматографические приборы, способные смешивать два буферных решения, применять решения к столбцов, создавать градиентные элевации из столбцов и собирать фракции из столбцов.
- Оттепель клетки из No 2 L культуры клеток насекомых ранее хранится при -80 градусов по Цельсию или использовать свежесобранные клетки. Смотрите Gillette et al. 201915 для получения подробной информации о линии клеток насекомых Tni.FNL и протоколах выражения. Тщательно resuspend клетки с 200 мл буфера С добавлением 1:200 v/v ингибитор протеазы без введения воздуха или создания пены.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 1.3 и последующие шаги (за исключением как замечено) должны быть выполнены при комнатной температуре (22 градуса По Цельсию). Важно, чтобы образец был однородным, чтобы обеспечить полный лисис на следующем этапе. - Лиза клетки гранулы в микрофлюидисизатор на 7000 пси в течение двух проходов или в эквивалентной системе лиза. Альтернативные методы лисиса не изучены.
- Уточнение лисатов клеток насекомых является проблематичным из-за присутствия соединений, которые засоряют фильтры. Таким образом, ультрацентрифугация (100 000 х г на 30 мин при 4 градусах Цельсия) очень важна. Белый липидный остаток на поверхности супернатанта следует избегать и может быть удален или уменьшен с помощью ватных тампонов. Фильтр декантированных супернатант через 0,45 мкм PES фильтра. Используйте уточненный образец немедленно или храните при -80 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Остатки блоков фильтры быстро и многие фильтры могут быть необходимы. Неспособность уменьшить количество этого материала приведет к высокому давлению столбца назад в последующих шагах. - Определите объем уточненного лизата и отрегулируйте образец до 35 мМ имидазола путем добавления 2 M имидазола. Загрузите образец на 3 мл/мин на 20 мл колонны IMAC (колонка HisPrep FF 16/10), предварительно уравновешенную в буфере B в течение трех объемов колонн (CVs).
- Хотя целевой белок, как правило, количественно адсорбируется к столбце, лучше всего собирать поток столбцов для последующего анализа. Вымойте колонку до тех пор, пока Abs280 не достигнет устойчивого базового (злт;100 миллиабсорбционных единиц (mAU) с буфером B на 3 мл/мин на 20 мл (1 CV), затем для 3 CV на 4 мл/мин на оставшуюся часть шага мытья. Как правило, 60-80 мл буфера B необходимо для достижения базового поглощения.
- белок с градиентом 400 мл (20 CV) от буфера B до Буфера C, собирая 8 мл фракций. Как правило, целевой белок elutes в первой половине градиента(Рисунок 1A; не все более поздние фракции показаны).
- Анализ белковых фракций с помощью SDS-PAGE/Coomassie окрашивания. Бассейн пик фракций и диализировать бассейн на ночь против 2 L буфера D при 4 КС.
ПРИМЕЧАНИЕ: Низкий рН имеет решающее значение для обеспечения связывания белка на следующем шаге. Однако, изменение рН во время этого диализа происходит медленно, и это удобный шаг для ночной инкубации. Альтернативные стратегии буферного обмена (например, более высокая концентрация буфера для ускорения изменения рН) не были исследованы. Белок начнет медленно осаждать сяртые с течением времени при более низком рН и более низких концентрациях соли и небольшое количество осадков является нормальным во время этого шага. Из-за этого мы избегаем обмена буфера на 100 мМ NaCl, необходимый для привязки к следующей колонке во время диализа. Скорее, концентрация NaCl 200 мМ используется для диализа и белок разбавляется до 100 мМ (см. ниже) непосредственно перед нанесением на столбец. Мы не исследовали, если это количество осадков является специфическим для KRAS4b, но белок, который делает осадок был подтвержден как KRAS4b-FMe. По этой причине мы предлагаем использовать более высокую концентрацию NaCl в буфере диализа для любого белка, интересующего интерес, в качестве меры предосторожности до тех пор, пока стабильность целевого белка в связывающем буфере не будет определена. - Удалите образец из диализа и центрифуги на 4000 х г в течение 10 минут, чтобы удалить любой осадок. Окончательный диализированный, проясненный образец на данный момент все еще часто туманный, но может быть применен без дальнейшей обработки на последующую колонку CEX.
- Подготовьте столбец обмена катиона 20 мл (см. Таблица материалов)путем мытья с тремя резюме Buffer G, а затем с тремя резюме Buffer F.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя мы не тщательно оценили другие миски, некоторые коллеги нашли плохое разрешение с миссинами, кроме SP Sepharose высокой производительности мисы. - Разбавить 20 мл диализированного образца до конечной концентрации NaCl 100 мМ, добавив 20 мл буфера E и нанесите разбавленный образец на колонку обмена катиона.
- Продолжайте загружать колонку, добавляя свежеразбавленные образцы, подготовленные, как описано выше, к нагрузочной трубке, поскольку предыдущее разбавление близится к концу нагрузки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавление всего образца сразу до 100 мМ NaCl привело к значительной потере целевого белка из-за осадков. - Вымойте столбец до базовой Abs280 с буфером F. Это обычно требует 3 резюме. Белок вымеливается из колонны во время градиента 400 мл (20 CV) от Buffer F до 65% Buffer G, собранного в 6 мл фракций(рисунок 1B).
- Продолжить мыть ежеколонку для дополнительного 1,5 CV (65% Buffer G) после завершения градиента. Выберите положительные фракции на основе обоих SDS-PAGE/Coomassie синий анализ пятен и осмотр УФ-след хроматограммы.
ПРИМЕЧАНИЕ: УФ-трассировка обычно содержит пять пиков. Начиная с более низких концентраций соли, первоначальный пик, как правило, необработанные и / или протеолиза белка. Второй и третий пики представляют собой смесь двух форм обработанного белка: второй пик в первую очередь фарнезилатный промежуточный (FARN), в то время как третий в первую очередь полностью обработанный белок FMe интереса. Пики четыре и пять представляют his6-MBP-KRAS4b синтез ампликов (все белки в этом формате на данный момент, так как не пищеварение TEV произошло). Они не N-ацетилированные на N-терминус и фарнезилат (пик четыре) и farnesylated и carboxymethylated (пик пять) на C-конец. Как пик два и пик четыре будет производить идентичные белки после удаления тегов (т.е., KRAS4b-FARN) они могут быть объединены на данном этапе при желании. Аналогичным образом, пик три и пик пять могут быть объединены для производства одного лота KRAS4b-FMe(рисунок 1B, Рисунок 2). Тем не менее, он сообщил, что это объединение будет сделано только тогда, когда природа белка в отдельных пиков была подтверждена. - Переварить белок, объединенный в шаге 1.15 с протеазой His6-TEV (200 мкг протеазы/мл образца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы делаем его6-TEV протеазы с использованием плазмиды и протоколы доступны из Addgene(https://www.addgene.org/92414). Диализ ный дайджест TEV против буфера A (10 kDa MWCO диализных труб с минимум40 мл буфера A на мл образца) в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем на ночь при температуре 4 градусов по Цельсию. - После пищеварения и диализа загрузите белок непосредственно в 20 мл колонны IMAC, уравновешивается с буфером A на 3 мл/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соберите 7 мЛ фракций во время всей этой хроматографии, потому что целевой белок имеет низкое сродство к столбцу, но не может быть полностью связан с мишенями. Вымойте столбец на 3 мл/мин с буфером A в общей сложности 3 резюме или до тех пор, пока не будет достигнут базовый абсорбция. - Целевой белок eluted с 5 CV градиент буфера C от 0%-10%, собирая 7 мл фракций. В качестве меры предосторожности, дополнительные связанные белки могут быть eluted с 100% Буфер C. Положительные фракции определены после анализа SDS-PAGE (Рисунок 1C). Как правило, целевой белок elutes при низкой концентрации имидазола (т.е. в 0%-10% Buffer C градиента), но иногда elutes в потоке через или колонке мыть.
- Диализ окончательный бассейн против буфера H. Определите концентрацию белка спектрофотометрией на 280 нм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте учесть наличие нуклеотида при определении коэффициента вымирания для использования для этого расчета. - Белок может быть сконцентрирован до 2-5 мг/мл с помощью центробежного фильтра (10 Км NMWL) без значительной потери белка. Фильтр с фильтром шприца 0,22 мкм. Измерьте абсорбцию раствора на Уровне280 для расчета конечной концентрации белка(рисунок 1D). Привязка заморозить aliquots в жидком азоте и хранить замороженные образцы при -80 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очищенный белок связан с ВВП. KRAS4b-FMe можно обменять на GppNHp с помощью ранее опубликованных протоколов16.
2. Подготовка образца для нетронутого массового анализа и анализа массы нативной
- Подготовка образцов для нетронутого массового анализа
- Оттепель протеина образец на льду до анализа. Для нетронутого массового анализа разбавить белок до 0,1 мг/мл в 20 мм бикарбонат аммония (рН ю 8,4). Для анализа массы нативном языке разбавить белок до концентрации 0,1 мг/мл в ацетате аммония 50 мм (рН 7,5). Vortex каждый образец для 5-10 s, затем центрифуга на 12500 х г в течение 1 мин, чтобы гранулы любого твердого материала в растворе. Удалите 10-20 л каждого супернатанта и перенесите на стеклянный флакон автосэмпера. Cap каждый флакон плотно, чтобы предотвратить загрязнение или испарение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для нетронутого анализа массы или родного анализа массы, образец может быть опресненным до анализа с помощью 10 kDa MWCO целлюлозы мембранный фильтр для буфера обмена в окончательный буфер разбавления.
- Оттепель протеина образец на льду до анализа. Для нетронутого массового анализа разбавить белок до 0,1 мг/мл в 20 мм бикарбонат аммония (рН ю 8,4). Для анализа массы нативном языке разбавить белок до концентрации 0,1 мг/мл в ацетате аммония 50 мм (рН 7,5). Vortex каждый образец для 5-10 s, затем центрифуга на 12500 х г в течение 1 мин, чтобы гранулы любого твердого материала в растворе. Удалите 10-20 л каждого супернатанта и перенесите на стеклянный флакон автосэмпера. Cap каждый флакон плотно, чтобы предотвратить загрязнение или испарение.
- Подготовка расширенного диапазона массы (Эмир) масс-спектроскопии для массового анализа
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед запуском любого анализа на масс-спектрометр, убедитесь, что он был недавно откалиброван. Кроме того, всегда носить перчатки и другие средства индивидуальной защиты по мере необходимости, чтобы избежать каких-либо вредных химических веществ и, чтобы избежать загрязнения образцов и растворителей. Калибровка осуществляется с использованием калибровоза в растворе, полученного на коммерческой основе, и раствора йодия цезия 2 мг/мЛ, подготовленного в домашних целях.- Откройте программное обеспечение для анализа и загрузите соответствующий файл метода инструмента. Для нетронутого массового анализа белков KRAS4b подходящие стартовые параметры следующие: положительный способ обнаружения; три микроскана, разрешение 70 000 евро; Цель AGC 3e6; максимальное время интеграции - 200 мс; и диапазон сканирования - 70-1800 соотношение массы к зарядке (м/з). Для местного массового анализа белков KRAS4b подходящие стартовые параметры следующие: положительный способ обнаружения; 10 микросканов, разрешение 17 500 евро; в источнике столкновения индуцированной диссоциации (CID) - 20 eV; Цель AGC 3e6; энергия столкновения (CE) No 20; максимальное время интеграции - 200 мс; и диапазон сканирования 500-10 000 м/з.
- Приготовление хроматографических растворителей и колонны
- Подготовьте растворители, необходимые для нетронутого массового анализа. Solvent A - это вода с 0,1% для модной кислоты. Растворитель B составляет 80% ацетонитрила и 0,1% для модной кислоты в воде.
- Подготовьте растворители, необходимые для массового анализа нативной основе. Растворитель А составляет 0,1 М ацетат аммония в воде и Solvent B является вода.
- После того, как соответствующие растворители подготовлены, очистить систему так, что трубки заполнены соответствующими растворителями и все пузырьки воздуха удаляются от линий.
- Установите соответствующий столбец (столбец обратной фазы для анализа нетронутой массы и столбец исключения размера для анализа массы нативной стадии). Для нетронутого анализа массы скорость потока составляет 0,5 м/мин, а температура колонны (с помощью обогревателя колонны) составляет 50 градусов по Цельсию. Равновесие колонны в течение 15-20 мин. Для местного массового анализа скорость потока составляет 0,25 мл/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда следите за давлением столбца, чтобы убедиться, что она не поднимается выше верхнего предела, что может указывать на засоренную линию или что матрица столбца скомпрометирована. При необходимости замените столбец.
- Анализ образцов
- Поместите подготовленный образец белка в стеклянный флакон автосэмпера в соответствующую стойку флакона в автосэмпере систем LC. Создайте список примеров (ы) в программной программе с соответствующим инструментальным методом для желаемого анализа. Как только список образцов будет завершен, нажмите кнопку Воспроизведения, чтобы начать анализ.
- Вводят 1-2 л образца на анализ, с пустой водой до и после каждого образца, чтобы обеспечить отсутствие переноса присутствует.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нетронутый анализ массы очень отличается от родного анализа массы и требует очень разных настроек метода инструмента. Это потому, что с нетронутыми массового анализа, белок "расслабленный" в присутствии органического растворителя, и, таким образом, способен принимать больше зарядов. Легче деконволутировать и решить изотопное распределение состояния заряда. Анализ массы на родине обеспечивает узкое распределение заряда ионов белка, и на основе белка, требует различных параметров напряжения и энергии столкновения.
- Анализ данных и деконволюция белка
- Экспорт спектра образца в программное обеспечение, где он может быть преобразован в де-запутанный спектр, который будет отображать нетронутой массы (или родной массы) белка. Нетронутая масса будет иметь изотопное пиковое распределение из-за высокого обилия заряженных спектральных пиков. Родная масса, как правило, имеют очень мало пиков из-за низкого изобилия заряженных спектральных пиков(рисунок 3D).
- Расширьте диапазон соотношения массы к заряду (м/з) пика d, чтобы подтвердить, что измеренная масса соответствует прогнозируемой массе. Иногда, из-за добавления зарядов к белку, могут быть небольшие различия между ожидаемым молекулярным весом (Mw) и наблюдаемым МВ. Кроме того, как и во многих анализах масс-спектрометрии, аддукты, такие как натрий, могут способствовать появлению дополнительных пиков в данных, даже с тщательно опресненные образцы. Иногда наблюдаются более низкие обильные пики с м/з, что ниже, чем ожидалось. Это, скорее всего, связано с нейтральной потерей, которая является потерей функциональной группы из-за процесса ионизации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как и ожидалось, будут различия между нетронутой массы и родной массы пиков. Нетронутый массовый дисплей покажет ожидаемый МВт белка. Он не будет иметь дополнительный МВт прилагается нуклеотид или других модификаций. Тем не менее, родной пик массы покажет белок с любым добавленным нуклеотидом.
3. Проверка связывания KRAS4b-FMe к липосом
- Препарат липосомы Мембраны
- Подготовьте буфер, состоящий из 20 мМ HEPES (pH 7.3), 150 мМ NaCl и 1 мМ TCEP.
- Липосомы препараты включают 25 мМ 1-пальмитоил-2-олеойл-глицеро-3-фосфохолин (POPC) и 10 мМ 1-palmitoyl-2-олеоил-глицеро-3-фосфо-L-серин (POPS) запасы в хлороформе; набор липидных экструдера с держателем и нагревательным блоком; аргон ный газ и жидкий азот; ультразвуковая ванна; стеклянный винт нить флаконы с PTFE пены вкладыши; и считыватель пластин, способный к динамическому обнаружению рассеяния света.
- Оттаивайте липидные запасы в хлороформе при комнатной температуре 30 мин. Приготовьте 1 мл 5 мМ 70:30 POPC: липосомы POPS путем алицитирования 106 мл 25 мМ POPC (запас) и 118 л 10 мм POPS (запас) в стеклянный флакон.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не аликвот липиды с пластиковым наконечником, потому что хлороформ может растворить определенные пластиковые советы. - Сухие липиды под устойчивым потоком аргонового газа. Медленно поверните стеклянный флакон при применении аргонового газа, чтобы сформировать тонкий слой сухой пленки.
- Положите образцы под вакуумный лиофилизатор на ночь, чтобы удалить избыток хлороформа.
- Восстановите липиды, добавив 1 мл буфера в сушеную пленку и вихрь смеси в течение 5 мин. Гидрат липидных смесей, качая в течение 1 ч при 25 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образец будет очень мутным при добавлении буфера к высушенному пленочному слоеу липидов. - Выполните пять циклов замораживания/оттепели, чередуя размещение пробы флакона между ледяной водой (4 градуса Цельсия или ниже) и теплой водяной баной (25 градусов по Цельсию или выше).
- Поместите образец флакона в ультразвуковую ванну и снотворизм образец около 0,5 ч или до тех пор, пока образец не станет полупрозрачным.
- Вынизуем образцы с помощью набора липидных экструдера. Соберите экструзионный комплект, как показано в инструкциях производителя. Вынизуем образцы, используя фильтровальную бумагу 0,1 мкм. Загрузите образцы в один стеклянный шприц и прикрепите его к одному концу экструзионного аппарата. Добавьте пустой шприц на другом конце экструзионного аппарата. Нажмите вперед и назад 10-20x, пока ваши образцы становятся полностью прозрачными.
- Спин окончательные образцы в течение 30 минут на 20000 х г, чтобы удалить любые крупные агрегаты.
- Используйте динамическое рассеяние света (DLS) для определения размера и однородности липосом (по желанию). Поместите 30 qL липосом в 384 хорошо плиты читателя. Спин пластины на 1000 х г в течение 30 мин. Поместите пластину в плиту читателя и собрать 10 измерения рассеяния света.
- Характеристика привязки KRAS4b-FMe к липосомам с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR)
- Соберите необходимые материалы: инструмент SPR; чип датчика L1; 7 х 14 мм флакон трубки; и CHAPS.
- Подготовьте буфер, содержащий 20 мМ HEPES (pH 7.3), 150 мМ NaCl, 1 мМ TCEP. Подготовьте серию разбавления 2:1 KRAS4b-FMe с 60 мкм-0,06 мкм в общем объеме 200 кл (всего 10 титров). Перенесите окончательные разбавленные образцы в флаковые трубки (см. Таблицу Материалов),поместите флаковы трубки в стойку и вставьте образцы в инструмент SPR.
- Вставьте чип датчика L1 в инструмент SPR. Прикрепите буфер и премьер системы с буфером в течение 7 минут.
- Настройка автоматизированного метода следующим образом:
- Установите температуру прибора до 25 градусов по Цельсию.
- Активируйте чип датчика L1, промыв его двумя 1 мин инъекциями 20 мМ CHAPS, растворенным в воде при скорости потока 30 л/мин.
- Выполните циклы запуска из десяти 1 мин впрыска бегущего буфера для увлажнения поверхности чипа.
- Депозит липосомы на чип датчика L1 путем введения липосом на ячейку потока (FC)-2 чипа L1 с 2 мин инъекций на 5 Л / мин. Цель для захвата уровне, по крайней мере 3000 единиц реагирования (RUs).
ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличьте время инъекции, пока не достигнете соответствующего уровня захвата.
- Депозит липосомы на чип датчика L1 путем введения липосом на ячейку потока (FC)-2 чипа L1 с 2 мин инъекций на 5 Л / мин. Цель для захвата уровне, по крайней мере 3000 единиц реагирования (RUs).
- Введите три цикла буфера над FC-1 и FC-2 с 1 мин инъекций на 30 л/мин.
- Вводят различные титрации KRAS4b-FMe от самой низкой до самой высокой концентрационной серии. Вводят белки, используя 1 мин инъекции для фазы ассоциации и 2 мин инъекции для фазы диссоциации на 30 Л / мин скорость потока в течение обоих FCs.
- Регенерировать чип датчика L1 путем промывки его с двумя 1 мин инъекции 20 мМ CHAPS на 30 л / мин.
- Приспособите данные с помощью программного обеспечения оценки SPR с помощью единой модели связывания сайта для получения явной связывающей близости (см. раздел Обсуждение для объяснения установки данных).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Одной из самых больших переменных в протоколе является количество выраженного целевого белка (His6-MBP-tev-KRAS4b). Этот протокол был разработан с использованием изолята от линии клеток Trichoplusia ni, Tni-FNL17, адаптированного для роста подвески и отлуженных от сыворотки. Учитывая широкий спектр результатов, зарегистрированных в различных линиях клеток насекомых с системой экспрессии бакуловируса, желательно, чтобы Tni-FNL использовался, по крайней мере на начальном этапе, для производства KRAS4b-FMe.
Темный белок, который мигрирует в 65 kDa, должен быть очевиден в очищенном лизате, а также фракциях elution(рисунок 1A). Белок синтеза должен быть одним из двух наиболее известных окрашенных полос в лизате, а другой является со-выраженным FNTA/B, который комигрировал на 48 кД.
В рамках очистки, шаг CEX имеет решающее значение по двум причинам: 1) он служит для уменьшения степени протеолиза, как гиперпеременный регион (HVR) является весьма восприимчивым, и 2) он обогащает для полностью обработанного белка, как указано в примечаниях для этого шага протокола. Это, однако, самая сложная часть протокола. Это потому, что обработанный белок имеет тенденцию к осадкам при более низких концентрациях соли, даже сливается с MBP. К счастью, это не все или ни одного явления, и это также происходит несколько медленно с течением времени. Протокол использует это путем диализа до 200 мМ NaCl до шага CEX. При такой концентрации осадки были не такими значительными, как на 100 мМ. Таким образом, протокол предназначен для ограничения продолжительности времени белка в буфере этой концентрации соли. Смешивание небольших аликвот cEX колонки нагрузки с равными объемами нулевой соли буфера непосредственно перед колонкой загрузки ограничивает воздействие (с точки зрения времени) на низкие условия соли и, таким образом, ограничивает осадков. Рисунок 2А изображает наиболее типичный результат шага CEX, причем наиболее заметным является пик 3, который содержит преимущественно KRAS4b-FMe. На рисунке 2B изображены профили elution, которые были замечены, чтобы дать ощущение изменчивости результата процедуры. Поскольку иногда они могут вводить в заблуждение, разумно создавать пулы всех пиков и хранить их при -80 градусах Цельсия до тех пор, пока пик интереса не будет полностью очищен и пройден тесты качества.
Как отмечается в протоколе, использование HiPrep SP Sepharose высокой производительности столбцов, как представляется, имеет решающее значение в достижении разделения наблюдается на рисунке 2A. Хотя еще не ясно, почему пик три часто гавани farnesylated только KRAS4b в дополнение к желаемой farnesylated и carboxymethylated KRAS4b, бедные резолюции другие сообщили с альтернативными cEX рансины (личное общение) предполагает, что это явление не является результатом исключительно в результате ионных взаимодействий.
Типичные урожайность варьировались от 1-6 мг/л, с 3-5 мг/л достигается часто (яgt;90%, n йgt; 50). Нетронутый массовый анализ с использованием ESI-MS подтвердил точную молекулярную массу белков и тем самым относительную долю фарнезилации и/или карбоксимметилирования(рисунок 3). В то время как типичные окончательные лоты содержали некоторые обнаруживаемые KRAS4b-FARN, эта доля была менее 15% с точки зрения пиковой высоты от этого анализа. Рисунок 3А показывает репрезентативные данные для KRAS4b, которые не являются прениломированными, выраженными в кишечной палочке, рисунок 3B показывает KRAS4b-FMe, eluted в пиках 3 и 5 от CEX, а рисунок 3C показывает, что KRAS4b-Farn eluted в пике 2 от CEX.
Масса KRAS4b, привязанного к ВВП, также была определена для этих образцов с использованием анализа массы коренных народов(рисунок 3D). Обмен проб амианием ацетата обеспечил "мягкую" ионизацию, а родной комплекс остался нетронутым, что подтверждает характер нуклеотида, связанного с KRAS4b.
Для подтверждения того, что фарнезиляция и карбоксиметилирование необходимы для того, чтобы KRAS4b-FMe привязывался к мембранам, мы измерили взаимодействие KRAS4b-FMe с липосомами через SPR. Как показано на рисунке 4, KRAS4b-FMe связаны с липосомии в то время как необработанные KRAS4b не сделал, тем самым продемонстрировав, что обработанные KRAS4b-FMe требуется для взаимодействия с мембранами.
Рисунок 1: Гели SDS-PAGE процесса очистки. (A) IMAC захвата из lysate. FNTA/B — это темные полосы, мигрирующие на 48 кДа, а His6-MBP-tev-KRAS4b — это темная полоса, мигрирующая на 67 кДа. M - белковая молекулярная весовая лестница; Т - общий белок; L - уточненная лизат/колонка нагрузки; Столбец F и протекают. Фракции eluted с увеличением градиента концентрации имидазола. (B) CEX фракции помечены 1-5 соответствуют пикфракции от пиков elution показано в хроматограмме Рисунок 2. (C) TEV пищеварения и второй IMAC. C q пул от шага CEX до расщепления TEV; L - образец нагрузки после расщепления TEV. Виды интереса помечены. (D) Один и пять микрограммов окончательного белка KRAS4b-FMe. Гели изображены являются репрезентативными результатами нескольких производств. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: профиль элуционной элюционной элюции CEX. (A) Типичный профиль Elution CEX имеет от четырех до пяти основных пиков. Помимо пика 1, который обычно является протеолизарной формой необработанных KRAS4b не хватает четырех C-терминал аминокислот, четыре пика пронумерованы от 2 до 5 в панели результате изменчивости в обработке N- и C-termini белка, с постепенно более положительно заряженных молекул eluting позже в градиент (см. шаг 1.15). (B) Дополнительные примеры профилей elution CEX. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Intact и родной масс-спектрометрии анализ очищенных белков KRAS4b. Intact массового спектра и deconvoluted результаты пикового анализа для (A) необработанных KRAS4b 2-185, прогнозируемый МВт 21,064; (B) KRAS4b 2-185-FMe, пики 3 и 5 от CEX, прогнозируемый МВт 21,281; (C) KRAS4b 2-185-Фарн, пик 2 от CEX, предсказал МВт 21,267. (D) Родные массы deconvolved пикового анализа для E. coli выразил KRAS4b 2-185 (i), KRAS-FMe 2-185 (ii), и KRAS-Farn 2-185 (iii), все в Состоянии Нуклеотида связаны государства. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: KRAS4b-FMe, связывающийся с липосомами через SPR. Распределение размера 70:30 POPC:POPS липосомы, полученные DLS. (A) Данные DLS показывают средний диаметр 200 нм для липосом с 18% полидисперстики. (B) SPR связывающие сенсорные граммы 60-0,6 мкм KRAS4b-FMe до 70:30 липосомы, захваченные на чип датчика L1. (C) Fit устойчивого состояния связывающей изотермы, полученные из данных SPR при условии, очевидно, KD 1 мКм KRAS4b-FMe связывания с липосомы. Обязательный ответ нормализуется путем деления на уровень захвата поверхности липосом. (D) SPR связывающей кинетики 60-0,6 мкм KRAS4b-2-185 до 70:30 липосомы, захваченные на чип датчикl L1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Как отмечается в разделе «Результаты представителей», наиболее важным шагом при очистке является обработка образца во время его пребывания в более низкой соли. Ограничение времени, в течение которого образец подвергается воздействию менее 200 мМ NaCl, поможет уменьшить количество осадков и увеличить урожайность выборки. Интерпретация результатов CEX может быть затруднена, если профиль не соответствует ожиданиям (см. рисунок 2). До тех пор, пока протокол не стал рутиной, рекомендуется, чтобы фракции elution CEX, которые не были приняты вперед, хранились при -80 градусов по Цельсию до тех пор, пока не будет завершен анализ нетронутой массы, чтобы гарантировать, что надлежащий материал был взят вперед. Вне параметров, отмеченных выше для шага CEX, протокол относительно легко изменить на этапах lysis и IMAC. Стоит также отметить, что нет размера исключения хроматографии (SEX) шаг разделения в протоколе. Это опущено из-за потерь, которые мы наблюдали во время ранней разработки метода (неопубликованные результаты). Примечательно, что эти потери не наблюдаются, когда белок находится в комплексе с нанодисками, предполагая, что потеря при отсутствии липидов обусловлена гидрофобным взаимодействием между белком и миссиной.
Этот метод представляет собой значительное увеличение как количество (10раз выше) и качество (по сравнению с добросовестным обработанных KRAS4b выражается в клетках человека), который был зарегистрирован в литературе14,18,19. Урожайность 3-5 мг/л позволила структурной биологии усилия, которые требуют высоких потребностей белка16,20. В настоящее время изучаются дополнительные постпереводные модификации для других членов семьи РАН, а также дополнительные постпереводные модификации в целом.
Для нетронутого массового анализа KRAS4b, концентрация 0,1 мг/мл работает хорошо. Более низкие концентрации могут быть использованы из-за способности расслабленной конфигурации белка принимать обвинения. Однако, в родном массовом анализе, где белок находится в его родной сложенной конформации, есть более низкие отношения массы к заряду и более высокие концентрации необходимы. Таким образом, использование более низких концентраций белка приводит к уменьшению сигнала и дает менее надежные результаты. Преимущество отечественной масс-спектрометрии заключается в том, что буфер совместим с сохранением комплекса нуклеотидов, привязанных к KRAS4b. Таким образом, можно подтвердить нуклеотидных форм белков(Рисунок 3D). Как и в любом анализе масс-спектрометрии, наблюдаются нейтральные потери (например, метиловая группа) (см. незначительные виды с потерей 18 в нетронутом анализе массы, рисунок 3A-C). В родном анализе масс-спектрометрии можно наблюдать белковые аддукты с Naq илиKq, присутствующими после обширного буферного обмена. Это видно на незначительных пиках в 23 евро на рисунке 3D, панелях i-iii).
Наши данные SPR(рисунок 4)показывают, что полностью обработанная форма KRAS4b необходима для повторного повторения взаимодействия KRAS4b-мембраны in vitro. Основным преимуществом использования чипа L1 для захвата липосом в наших экспериментах SPR является то, что поверхность чипа L1 является dextran покрытием и изменены с липофильных групп21, что позволяет для прямого захвата липосом без каких-либо дальнейших изменений. SPR является мощным методом для изучения лиганд-лиганд взаимодействий предоставления информации о стоихиометрии и связывания сродства. Sensorgrams, которые работают должным образом должны иметь фазу ассоциации, которая достигает стабильного состояния. Этот максимальный обязательный ответ (Rmax) дает оценку стойохиометрии для взаимодействия. Коэффициент диссоциации должен следовать за одним экспоненциальным распадом, предполагая, что 1:1 обязательное взаимодействие22. Тем не менее, белки, связывающиеся с поверхностью мембраны, обычно встречаются с более сложными стоихиометрами23 и множественными сходствами, которые приводят к сенсормографии с более сложной кинетикой. Нам не удалось приспособить кинетику к многоузловой модели связывания. Тем не менее, равновесное связывание изотермс может быть пригодным с помощью программного обеспечения коммерческой оценки, чтобы обеспечить явное равновесие связывающей сродство (KD). Несмотря на это, наши данные SPR четко различают, как необработанные KRAS4b и KRAS4b-FMe связываются с липосомы. Таким образом, SPR по-прежнему является полезным инструментом для расшифровки белково-липидных взаимодействий.
В совокупности, используя SPR мы пняем, что полностью обработанный KRAS4b-FMe необходим для мембранной связывания. Производство полностью фарнезиляционной и карбоксиметиловой формы KRAS4b с использованием этого подхода обеспечивает количество и качество материала, необходимого для структурной биологии20,биофизическую характеристику мембранных взаимодействий23,а также скрининговые исследования против комплекса KRAS4b-FMe:RAF в присутствии липидных двухслойных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы признаем, клонирование и выражение поддержки от Карисса Гроуз, Джен Melhalko, и Мэтт Дрю в лаборатории экспрессии белка, Фредерик Национальной лаборатории по изучению рака. Этот проект был профинансирован в целом или частично за счет федеральных средств из Национального института рака, Национальные институты здравоохранения, в соответствии с контрактом No. HHSN261200800001E. Содержание этой публикации не обязательно отражает взгляды или политику Министерства здравоохранения и социальных служб, равно как и упоминание торговых наименований, коммерческих продуктов или организаций не подразумевает одобрения со стороны правительства США
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural | Eppendorf | 22363204 | |
| 11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials | Thermo Scientific | 30211SS-1232 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | AVANTI POLAR LIPIDS | 850457 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS) | AVANTI POLAR LIPIDS | 840034 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 5427R Centrifuge | Eppendorf | ||
| Acetonitrile, HPLC Grade | Fisher Chemical | A998-1 1L | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 09689-250g | |
| Argon gas | Airgas | ARUP | |
| Assay Plate 384 | CORNING | 3544 | |
| Biacore T200 Instrument | GE Healthcare | ||
| Blue Snap-It Seals, T/S | Thermo Scientific | C4011-54B | |
| Branson Ultrasonic Bath | Thermo Fisher | 15-336-1000 | |
| Cation Exchange Chromatography (CEX) column | GE Healthcare Life Sciences | 29018183 | HiPrep SP Sepharose High Performance |
| CHAPS | Sigma | C3023 | |
| Dyna Pro Plate Reader | Wyatt Technologies | ||
| Exactive Plus EMR Mass Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500Ml | Use Reagent Grade or better |
| Gilson vials 7x14 mm Tubes | GE Healthcare | BR-1002-12 | |
| Glass screw thread vials with PTFE foam liners | Scientific Specialities | B69302 | |
| High speed/benchtop centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 05-112-114D | capable of up to 4,000 xg |
| His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease | Addgene | 92414 | Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY |
| Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column | GE Healthcare Life Sciences | 28-9365-51 | HisPrep FF 16/10 |
| In-House Water Supply, Arium Advance | Sartorius Stedim | Resistivity of 18 MΩ0-cm | |
| Lipid extruder set with holder | AVANTI POLAR LIPIDS | 610023 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | NI-DEWAR | |
| M110-EH microfluidizer | Microfluidics | ||
| MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm | Thermo Scientific | 088645 | |
| MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 Å, 2.1 x 150 mm | Thermo Scientific | 088790 | |
| MagTran software | Thermo Scientific | ||
| Methanol, HPLC Grade | VWR Chemicals | BDH20864.400 | |
| NGC Chromatography System | BioRad | 78880002 | NGC QuestTM 100 Chromatography system |
| Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators | Millipore Sigma | P8849 | |
| Rubber Caps type 3 | GE Healthcare | BR-1005-02 | |
| Series S Sensor Chip L1 | GE Healthcare | 29104993 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | 13-400-519 | Absorbace at 280nm |
| Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL | Millipore Sigma | UFC901008 | PES membrane |
| Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters | Amicon | UFC501024 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima - L80K | capable of 100,000 xg |
| Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System) | Thermo Scientific | ||
| Vortex Genie 2 | Fisher | 12-812 | |
| Water, HPLC Grade | Sigma-Aldrich | 270733-1L | May use in-house water source (see below) |
| Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter | GE Healthcare - Whatman | 6994-2504 | |
| Xcalibur QualBrowser | Thermo Scientific | proteomics software |
References
- Cox, A. D., Der, C. J. Protein prenylation: more than just glue. Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).
- Zhang, F. L., Casey, P. J. Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences. Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).
- Hottman, D. A., Li, L. Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer's disease. Molecular Neurobiology. 50 (1), 177-185 (2014).
- Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. HDL and cognition in neurodegenerative disorders. Neurobiology of Disease. 72, Pt A 22-36 (2014).
- Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms. Annals of Medicine. 35 (6), 398-403 (2003).
- Kohnke, M., et al. Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease. PLoS One. 8 (12), 81758 (2013).
- Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. Targeting protein prenylation for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (11), 775-791 (2011).
- Kho, Y., et al. A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12479-12484 (2004).
- Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB. Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 7864-7868 (1995).
- Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. Dragging ras back in the ring. Cancer Cell. 25 (3), 272-281 (2014).
- Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics. Chemical Reviews. 117 (6), 4669-4713 (2017).
- Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles. Journal of Visualized Experiments. (66), e3910 (2012).
- Dementiev, A. K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation. Protein Expression and Purification. 84 (1), 86-93 (2012).
- Lowe, P. N., et al. Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems. Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1672-1678 (1991).
- Gillette, W., et al. Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System. Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).
- Agamasu, C., et al. KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner. Biophysical Journal. 116 (6), 1049-1063 (2019).
- Talsania, K., et al. Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies. Genes. 10 (2), 79 (2019).
- Spencer-Smith, R., et al. Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site. Nature Chemical Biology. 13 (1), 62-68 (2016).
- Lowe, P. N., et al. Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system. Biochemical Society Transactions. 20 (2), 484-487 (1992).
- Dharmaiaha, S., et al. Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDEδ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6766-6775 (2016).
- Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore. Analytical Biochemistry. 328 (2), 233-243 (2004).
- Fisher, R. J., et al. Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (2), 472-484 (2006).
- Lakshman, B., et al. Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane. Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).
