Summary
Prenylering är en viktig modifiering av perifera membran bindnings proteiner. Insekts celler kan manipuleras för att producera farnesylerade och karboxymetylerade KRAS4b i mängder som möjliggör biofysiska mätningar av interaktioner mellan protein och protein och lipider
Abstract
Proteinprenylering är en viktig modifiering som är ansvarig för att rikta proteiner till intracellulära membran. KRAS4b, som är muterad i 22% av mänskliga cancerformer, bearbetas av farnesylation och karboxymetylering på grund av närvaron av en "CAAX" låda motiv på C-Terminus. Ett konstruerat baculoviridae-system användes för att uttrycka farnesylerade och karboxymetylerade KRAS4b i insekts celler och har beskrivits tidigare. Här beskriver vi den detaljerade, praktiska renings-och biokemiska karakteriseringen av proteinet. Specifikt användes affinitet och jonbyteskromatografi för att rena proteinet till homogenitet. Intakt och infödd masspektrometri användes för att validera den korrekta modifieringen av KRAS4b och för att verifiera nukleotidbindning. Slutligen, membran Association av farnesylated och karboxymetylerade KRAS4b till liposomer mättes med hjälp av ytan plasmon resonans spektroskopi.
Introduction
Posttranslationella modifieringar spelar en viktig roll för att definiera proteiners funktionella aktivitet. Förändringar såsom fosforylering och glykosylering är väl etablerade. Lipid modifieringar är mindre väl kännetecknas, dock. Det uppskattas att så mycket som 0,5% av alla cellulära proteiner kan vara prenylated1. Prenylation är överföringen av en 15-kol enzymet eller en 20-kol geranylgeranyl lipid kedja till ett acceptor protein som innehåller caax motiv2. Prenylerade proteiner har varit inblandade i utvecklingen av flera mänskliga sjukdomar inklusive för tidigt åldrande3, Alzheimers4, hjärtdysfunktion5, choroideremia6, och cancer7. De små GTPases, HRAS, NRAS, och KRAS1, nukleära lamininer, och kinetochores cenp-E och F är farnesylated proteiner under basal villkoret. Andra små GTPases, nämligen RhoA, RhoC, Rac1, CDC-42, och RRAS är geranylgeranylated8, medan rhob kan vara farnesylated eller geranylgeranylated9.
Den lilla GTPase KRAS4b fungerar som en molekylär switch, i huvudsak sänder extracellulära tillväxtfaktor signalering till intracellulära signaltransduktion vägar som stimulerar celltillväxt och spridning, via flera protein-protein interaktioner. Det finns två viktiga aspekter av KRAS4b biokemi som är viktiga för dess verksamhet. Först, proteinet cykler mellan en inaktiv BNP och en aktiv GTP bunden stat där den aktivt engagerar med effectors. För det andra, en C-Terminal Poly-Lysine regionen och en farnesylated och karboxymetylerade cystein direkt proteinet till plasmamembranet, möjliggör rekrytering och aktivering av nedströms effectors. Mutant KRAS4b är en onkogena förare i bukspottskörteln, kolorektal, och lungcancer10, och som sådan, terapeutiska ingrepp skulle ha en enorm klinisk nytta. Framställning av autentiskt modifierat rekombinant protein som är farnesylerat och karboxymetylerat skulle möjliggöra biokemisk screening med KRAS4b i kombination med membran surrogat såsom liposomer eller lipidnanoskivor11,12.
Enzymet transferas (FNT) katalyserar tillsatsen av enzymet pyrofosfat till C-terminalen cystein i caax motiv i KRAS4b. Efter prenylering, är proteinet smugglas till endoplasmatiska Retikulum (ER) där ras omvandla enzymet (RCE1) klyver de tre C-Terminal rester. Det sista steget i behandlingen är metylering av den nya C-terminalen farnesylcystein rester av ER membranprotein, isoprenylcystein karboxyl metyltransferas (ICMT). Uttryck för rekombinant KRAS4b i E. coli resulterar i produktion av ett icke modifierat protein. Tidigare försök att producera bearbetade KRAS4b har begränsats på grund av otillräcklig avkastning för strukturella eller Drug screening experiment eller har misslyckats med att recapitulate den infödda fullängds mogna protein13,14. Det protokoll som presenteras här använder en konstruerad Baculovirus-baserade insekt cell Expression system och reningsmetod som genererar mycket renas, fullt bearbetade KRAS4b på avkastningen på 5 mg/L cellkultur.
Noggrann proteinkarakterisering är avgörande för att validera kvaliteten på rekombinanta proteiner innan man påbörjar strukturell biologi eller drog screening studier. Två viktiga parametrar för fullt bearbetade KRAS4b är validering av korrekt av modifiering och tillgängligheten av farnesylated och karboxymetylerade C-terminus (FME) för interaktion med membran substitut eller lipider. Electrospray jonisering masspektrometri (ESI-MS) av KRAS4b-FME användes för att mäta molekylvikt och bekräfta närvaron av enzymet och karboxymetylmodifikationer. Native masspektrometri, där proverna sprejas med nondenaturing lösningsmedel, användes för att visa att KRAS4b-FMe också var bunden till sin BNP-kofaktor. Slutligen användes ytplasmon resonans spektroskopi för att mäta den direkta bindningen av KRAS4b-FMe med immobiliserade liposomer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. protein rening
- Förbered buffertarna A – H, som framgår av tabell 1.
| Buffertlösning | Buffrande medel (alla 20 mM) | pH | NaCl (mM) | Imidazol (mM) | MgCl2 | TCEP |
| A | HEPES | 7,3 | 300 | - | 5 | 1 |
| B | HEPES | 7,3 | 300 | 35 | 5 | 1 |
| C | HEPES | 7,3 | 300 | 500 | 5 | 1 |
| D | Mes | 6,0 | 200 | - | 5 | 1 |
| E | Mes | 6,0 | - | - | 5 | 1 |
| F | Mes | 6,0 | 100 | - | 5 | 1 |
| G | Mes | 6,0 | 1000 | - | 5 | 1 |
| H | HEPES | 7,3 | 300 | - | 1 | 1 |
- Förbered renings materialen (se tabell över material): cocktail av proteashämmare utan EDTA eller andra kelatorer; immobiliserad metallaffinitetskromatografi (IMAC) kolumn; kolonn för katjonbyteskromatografi (CEX). 0,45 μm spruta filter; 2 M Imidazol (pH = 7,5); första kan 100 000 x g; hög hastighet bänkskiva centrifug som kan 4 000 x g; centrifugalfilter enheter (10 KDa NMWL); spektrofotometer som kan avläsa vid 280 nm; His6-tobak etch virus (TEV) proteas; och kromatografiinstrumentering som kan blanda två buffertlösningar, tillämpa lösningar på kolonner, skapa gradientelutioner från kolonnen och samla fraktioner från kolonner.
- Tina celler från ~ 2 L av insekt cellkultur som tidigare lagrats vid-80 ° c eller använda nyskördade celler. Se Gillette et al. 201915 för mer information om TNI. FNL insekt cell linje och uttrycks protokoll. Noggrant Omsuspendera cellerna med 200 mL buffert A med tillsats 1:200 v/v proteashämmare utan att införa luft eller skapa skum.
Anmärkning: steg 1,3 och efterföljande steg (förutom vad som anges) ska utföras i rumstemperatur (~ 22 ° c). Det är viktigt att provet är homogent för att möjliggöra fullständig lysis i nästa steg. - Lyse cell pellet i en Microfluidizer på 7 000 PSI för två passerar eller i ett likvärdigt Lys system. Alternativa metoder för Lys har inte undersökts.
- Klargöra insekt cell celllysat är problematiskt på grund av närvaron av föreningar som täpper filter. Således, ultracentrifugering (100 000 x g för 30 min vid 4 ° c) är mycket viktigt. En vit lipidrester på ytan av supernatanten bör undvikas och kan avlägsnas eller minskas med hjälp av bomullsvabb. Filtrera den dekanterade supernatanten genom ett 0,45 μm PES-filter. Använd det förtydligande provet omedelbart eller förvara vid-80 ° c.
Anmärkning: rester blocken filtrerar snabbt och många filter kan behövas. Underlåtenhet att minska mängden av detta material kommer att leda till hög kolumn mottryck i efterföljande steg. - Bestäm volymen av den förtydligade lysate och justera provet till 35 mM Imidazol genom tillsats av 2 M Imidazol lager. Fyll på provet med 3 mL/min på en 20 mL IMAC-kolonn (HisPrep FF 16/10-kolonn) som är Förbalanserad i buffert B för tre kolumn volymer (CVs).
- Även om målproteinet normalt är kvantitativt adsorberat till kolonnen, är det bäst att samla in kolumn flödet för efterföljande analys. Tvätta kolonnen tills ABS280 når en stadig baslinje (< 100 milliabsorbansenheter [mAU]) med buffert B på 3 ml/min för 20 ml (1 CV) och därefter för ~ 3 CV vid 4 ml/min under återstoden av tvättsteget. Normalt behövs 60 – 80 mL buffert B för att uppnå baseline-absorbans.
- Eluera proteinet med en 400 mL (20 CV) gradient från buffert B till buffert C samtidigt samla 8 mL fraktioner. Typiskt, målproteinet eluera i den första halvan av gradienten (figur 1A; inte alla senare fraktioner visas).
- Analysera protein fraktioner med hjälp av SDS-PAGE/Coomassie färgning. Pool toppfraktioner och dialyze poolen över natten mot 2 L buffert D vid 4 ° c.
Obs: lågt pH är avgörande för att säkerställa Proteinbindningen i nästa steg. Emellertid, pH-förändringen under denna dialys sker långsamt, och detta är ett bekvämt steg för övernattning inkubering. Alternativa buffertutbytes strategier (t. ex. högre buffertkoncentration för att påskynda pH-förändringen) har inte undersökts. Proteinet kommer att börja sakta fällning över tiden vid lägre pH och lägre saltkoncentrationer och en liten mängd nederbörd är normalt under detta steg. På grund av detta undviker vi att byta bufferten till den 100 mM NaCl som krävs för bindning till nästa kolumn under dialys. Istället används en NaCl-koncentration på 200 mM för dialys och proteinet späds till 100 mM (se nedan) omedelbart före applicering på kolonnen. Vi har inte undersökt om denna nederbörd är specifik för KRAS4b, men proteinet som gör fällning har bekräftats som KRAS4b-FMe. Av denna anledning, vi föreslår att du använder den högre NaCl koncentrationen i dialys buffert för något protein av intresse som en försiktighetsåtgärd tills stabiliteten i målproteinet i bindningsbufferten kan bestämmas. - Ta bort provet från dialys och centrifugera vid 4 000 x g i 10 minuter för att ta bort fällat. Den slutliga dialyzed, klargöras provet på denna punkt är fortfarande ofta dimmig men kan tillämpas utan vidare bearbetning till den efterföljande CEX kolumn.
- Förbered en 20 mL katjonbytarkolonn (se tabell över material) genom att tvätta med tre CV av buffert G, sedan med tre CVS av buffert F.
Obs: även om vi inte minutiöst har utvärderat andra hartser, har flera kollegor funnit dålig upplösning med hartser än SP Sepharose hög prestanda harts. - Späd ut 20 mL av det dialyserade provet till en slutlig NaCl-koncentration på 100 mM genom att tillsätta 20 mL buffert E och applicera det utspädda provet på katjonbytarkolonnen.
- Fortsätt att ladda kolonnen genom att tillsätta nyspädda prover som utarbetats enligt ovan till last röret, eftersom den tidigare utspädningen närmar sig slutet av lasten.
Anmärkning: spädning av hela provet på en gång till 100 mM NaCl har resulterat i betydande förlust av målprotein på grund av nederbörd. - Tvätta kolonnen till baseline ABS280 med buffert F. Detta kräver vanligtvis 3 CV. Proteinet elueras från kolonnen under en 400 mL (20 CV) gradient från buffert F till 65% buffert G, som samlats in i 6 mL fraktioner (figur 1B).
- Fortsätt att tvätta kolumnen för ytterligare 1,5 CV (65% buffert G) när lutningen är klar. Välj positiva fraktioner baserat på både SDS-PAGE/Coomassie Blue fläck analys och inspektion av UV-spår av kromatogrammet.
Anmärkning: UV-spår innehåller vanligtvis fem toppar. Börjar vid lägre saltkoncentrationer, den initiala toppen är vanligtvis obearbetade och/eller proteolyzed protein. Den andra och tredje toppar är en blandning av två former av bearbetat protein: den andra toppen är främst en farnesylated mellanliggande (FARN), medan den tredje är i första hand den fullt bearbetade FMe protein av intresse. Toppar fyra och fem representerar His6-MBP-KRAS4b fusion proteiner (allt protein är i detta format på denna punkt, eftersom ingen TEV matsmältning har inträffat). Dessa är inte N-acetylerade vid N-terminalen och är farnesylated (topp fyra) och farnesylated och karboxymetylerade (Peak Five) vid C-Terminus. Som Peak två och Peak Four kommer att producera identiska proteiner efter tag avlägsnande (dvs KRAS4b-FARN) dessa kan poolas i detta skede om så önskas. På samma sätt kan Peak Three och Peak Five kombineras för att producera ett enda parti KRAS4b-FMe (figur 1B, figur 2). Det är dock tillrådligt att denna sammanslagning endast göras när arten av proteinet i de separata topparna har bekräftats. - Smälta proteinet poolade i steg 1,15 med His6-TEV proteas (~ 200 μg proteas/mL prov.
Obs: vi gör His6-TEV proteashämmare med hjälp av plasmid och protokoll tillgängliga från Addgene (https://www.addgene.org/92414). Dialysera TEV Digest mot buffert A (10 kDa MWCO dialys slang med minst 40 mL buffert A per mL prov) för 2 h vid rumstemperatur och sedan över natten vid 4 ° c. - Efter matsmältningen och dialys, Ladda proteinet direkt till en 20 ml iMac kolonn skakad med buffert a på 3 ml/min.
Notera: samla 7 mL fraktioner under hela denna kromatografi, eftersom målproteinet har en låg affinitet för kolonnen men kanske inte är helt bundet till hartset. Tvätta kolonnen med 3 mL/min med buffert A för sammanlagt 3 CV eller tills en baslinje absorbans uppnås. - Målproteinet elueras med en 5 CV-gradient av buffert C från 0% – 10%, vilket samlar 7 mL fraktioner. Som en försiktighetsåtgärd kan ytterligare bundna proteiner elueras med 100% buffert C. positiva fraktioner identifieras efter analys av SDS-PAGE (figur 1C). Typiskt, målproteinet eluera vid en låg Imidazol koncentration (dvs. i 0% – 10% buffert C gradient) men ibland eluera i genomflöde eller kolumn tvätt.
- Dialysera den slutliga poolen mot buffert H. Bestäm protein koncentrationen med spektrofotometri vid 280 nm.
Anmärkning: var noga med att redogöra för nukleotidens förekomst vid bestämning av den nedsättningskoefficient som ska användas för denna beräkning. - Proteinet kan koncentreras till ~ 2 – 5 mg/mL med hjälp av en centrifugalfilterenhet (10 K NMWL) utan signifikant protein förlust. Filter med ett sprutfilter på 0,22 μM. Mät lösningens absorbans vid en280 för att beräkna den slutliga protein koncentrationen (figur 1D). Snap frys alikvoter i flytande kväve och förvara frysta prover vid-80 ° c.
Anmärkning: proteinet renas är bundet till BNP. KRAS4b-FMe kan bytas ut mot GppNHp med hjälp av tidigare publicerade protokoll16.
2. provberedning för intakt massa analys och Native massanalys
- Provberedning för intakta massanalys
- Tina protein provet på is före analys. För intakt massanalys, späd proteinet till 0,1 mg/mL i 20 mM ammoniumbikarbonat (pH = ~ 8,4). För inhemsk massanalys, späd proteinet till en koncentration av 0,1 mg/mL i 50 mM ammoniumacetat (pH = ~ 7,5). Virvel varje prov för 5 – 10 s, Centrifugera sedan på 12 500 x g i 1 min till pellets något fast material i lösningen. Ta bort 10 – 20 μL av varje supernatanten och överför till en flaska med autosampler i glas. Locket varje injektionsflaska tätt för att förhindra kontaminering eller avdunstning.
Anmärkning: för antingen intakt massanalys eller inhemsk massanalys kan provet avsaltas före analys med hjälp av ett 10 kDa MWCO-cellulosa membranfilter för att buffertbyta till den slutliga utspädnings bufferten.
- Tina protein provet på is före analys. För intakt massanalys, späd proteinet till 0,1 mg/mL i 20 mM ammoniumbikarbonat (pH = ~ 8,4). För inhemsk massanalys, späd proteinet till en koncentration av 0,1 mg/mL i 50 mM ammoniumacetat (pH = ~ 7,5). Virvel varje prov för 5 – 10 s, Centrifugera sedan på 12 500 x g i 1 min till pellets något fast material i lösningen. Ta bort 10 – 20 μL av varje supernatanten och överför till en flaska med autosampler i glas. Locket varje injektionsflaska tätt för att förhindra kontaminering eller avdunstning.
- Beredning av masspektroskopi för massanalys (EMR) för utökade Mass intervall
Anmärkning: innan någon analys av masspektrometern körs, se till att den nyligen har kalibrerats. Använd också alltid handskar och annan personlig skyddsutrustning som behövs för att undvika skadliga kemikalier och för att undvika att kontaminera prover och lösningsmedel. Kalibreringen görs med hjälp av en kalibreringslösning som erhålls kommersiellt och en 2 mg/ml cesium jodid-lösning som bereds i huset.- Öppna analysprogram varan och Läs in lämplig instrument metod fil. För intakt massa analys av KRAS4b proteiner, lämpliga Startparametrar är följande: positivt sätt att upptäcka; tre microscans, upplösning = 70 000; AGC Target = 3e6; maximal integrations tid = 200 MS; och ett skanningsområde = 70 – 1800 Mass-to-Charge-förhållande (m/z). För Native massanalys av KRAS4b proteiner, lämpliga Startparametrar är följande: positivt sätt att upptäcka; 10 microscans, upplösning = 17 500; i-källa kollision-inducerad dissociation (CID) = 20 eV; AGC Target = 3e6; kollision energi (CE) = 20; maximal integrations tid = 200 MS; och ett skanningsområde = 500 – 10000 m/z.
- Beredning av kromatografiska lösningsmedel och kolonn
- Bered de lösningsmedel som behövs för intakta Mass analyser. Lösningsmedel A är vatten med 0,1% myrsyra. Spädningsvätska B är 80% acetonitril och 0,1% myrsyra i vatten.
- Förbered de lösningsmedel som behövs för inhemsk massanalys. Spädningsvätska A är 0,1 M ammoniumacetat i vatten och spädningsvätska B är vatten.
- Efter lämpliga lösningsmedel är beredda, rensa systemet så att slangen fylls med lämpliga lösningsmedel och alla luftbubblor tas bort från linjerna.
- Installera lämplig kolumn (en omvänd fas kolumn för intakta massa analys och en storlek uteslutning kolumn för Native massanalys). För intakta massanalys är flödet 0,5 mL/min, och kolonntemperaturen (med hjälp av en Kolonnvärmare) är 50 ° c. Equilibrate kolonnen för 15 – 20 min. För inhemsk massanalys är flödeshastigheten 0,25 mL/min.
Obs: övervaka alltid kolumnen mottryck för att säkerställa att den inte stiger över den övre gränsen, vilket kan tyda på en igensatt linje eller att kolonnmatrisen äventyras. Ersätt kolumnen om det behövs.
- Provanalys
- Placera det beredda protein provet i injektionsflaskan med glas autosampler i lämplig injektionsflaskans rack i LC Systems autosampler. Skapa en lista med exempel (er) i programmet med lämplig instrument metod för önskad analys. När prov listan är slutförd klickar du på uppspelnings knappen för att starta analysen.
- Injicera 1 – 2 μL prov per analys, med ett vatten tomt före och efter varje prov, för att säkerställa att ingen överföring förekommer.
Obs: intakt massa analys är mycket annorlunda än den infödda massanalys och kräver mycket olika instrument Metodinställningar. Detta beror på att med intakt massa analys, proteinet är "avslappnad" i närvaro av ett organiskt lösningsmedel, och därmed kan ta emot mer avgifter. Det är lättare att deconvolute och lösa isotop fördelningen av laddnings tillstånden. Native massanalys ger en smal laddning fördelning av protein joner, och baserat på proteinet, kräver olika spänning och kollision energiinställningar.
- Data analys och proteindeconvolution
- Exportera spektrumet av provet till programvara där det kan omvandlas till de-invecklad spektrum som kommer att Visa intakt massa (eller infödda massa) av proteinet. Den intakta massan kommer att ha en isotop-toppfördelning på grund av det höga överflöd av laddade spektraltoppar. Den infödda massan kommer vanligtvis att ha mycket få toppar på grund av det låga överflöd av de laddade spektraltopparna (figur 3D).
- Utöka massan-till-laddningsförhållandet (m/z) för topp d för att bekräfta att den uppmätta massan överensstämmer med den förväntade massan. Ibland, på grund av tillägg av laddningar till proteinet, kan det finnas en liten variation mellan den förväntade molekylvikten (MW) och den observerade MW. Också, som med många masspektrometri analyser, addukter såsom natrium kan bidra till uppkomsten av ytterligare toppar i data, även med noggrant avsaltade prover. Lägre rikliga toppar med en m/z som är lägre än förväntat observeras ibland. Detta är troligen på grund av en neutral förlust, vilket är förlusten av en funktionell grupp på grund av joniseringsprocessen.
Obs: som förväntat kommer det att finnas skillnader mellan intakt massa och de infödda massan toppar. Den intakta massan displayen kommer att Visa proteinens förväntade MW. Det kommer inte att ha den extra MW av den bifogade nukleotid eller andra modifieringar. Emellertid, den infödda massa topp kommer att Visa proteinet med någon tillsats nukleotid.
3. validering av KRAS4b-FMe bindning till liposomer
- Membran liposomer förberedelse
- Bered en buffert bestående av 20 mM HEPES (pH = 7,3), 150 mM NaCl och 1 mM TCEP.
- Liposom förberedelsematerial inkluderar 25 mM 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfokolin (POPC) och 10 mM 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosho-L-serin (POPS) bestånd i kloroform; en lipid extruder set med en hållare och värmeblock; Argon gas och flytande kväve; ett ultraljudsbad; glas skruvgäng flaskor med PTFE skum liners; och en Plattläsare som kan detektera dynamisk ljusspridning.
- Tina lipidlager i kloroform vid rumstemperatur i 30 min. Förbered 1 mL 5 mM 70:30 POPC: POPS liposomer genom att alicitera 106 μL 25 mM POPC (lager) och 118 μL av 10 mM POPS (lager) i en injektionsflaska av glas.
Anmärkning: Använd inte alikvot-lipider med en plastspets, eftersom kloroform kan upplösa vissa plast spetsar. - Torra lipider under en stadig ström av argon gas. Rotera glasflaskan långsamt när du applicerar argon-gasen för att bilda ett tunt skikt av torr film.
- Sätt prover under en vakuum frystorkat natt för att avlägsna överflödig kloroform.
- Rekonstruera lipiderna genom att tillsätta 1 mL buffert till den torkade filmen och Vortexblanda blandningarna i 5 min. återfukta lipidblandningarna genom att gunga i 1 h vid 25 ° c.
Obs: provet kommer att vara mycket grumlig vid tillsats av bufferten till den torkade film lager av lipider. - Utför fem frys-/Taw-cykler genom att omväxlande placera prov flaskan mellan ett isvatten (4 ° c eller lägre) och ett varmt vattenbad (25 ° c eller högre).
- Placera provet flaskan i ultraljudsbadet och Sonikera provet för ca 0,5 h eller tills provet blir halvtransparent.
- Extrudera proverna med lipidextrudersetet. Montera extruderingssatsen enligt tillverkarens anvisningar. Extrudera proverna med hjälp av 0,1 μm filterpapper. Fyll på proverna i en glasspruta och fäst den i ena änden av extruderingsapparaten. Tillsätt en tom spruta i andra änden av extruderingsapparaten. Tryck fram och tillbaka 10 – 20x tills proverna blir helt transparenta.
- Snurra de slutliga proverna för 30 min vid 20 000 x g för att ta bort alla stora aggregat.
- Använd dynamisk ljusspridning (DLS) för att bestämma liposomernas storlek och homogenitet (valfritt). Placera 30 μL av liposomerna i en 384 väl Plattläsare. Snurra plattan på 1 000 x g i 30 min. Placera plattan i en Plattläsare och samla 10 ljus spridnings mätningar.
- KRAS4b-FMe bindning till liposomer via ytan plasmon resonans (SPR)
- Montera de material som krävs: ett SPR-instrument; sensor chip L1; 7 x 14 mm rör av injektionsflaskor; och käkar.
- Bered en buffert som innehåller 20 mM HEPES (pH = 7,3), 150 mM NaCl, 1 mM TCEP. Förbered en spädningsserie på 2:1 KRAS4b-FMe från 60 μM – 0,06 μM i en total volym på 200 μL (totalt 10 titreringar). Överför de slutliga utspädda proverna till injektionsflaskans rör (se tabell över material), placera rören i ett rack och sätt in proverna i spr-instrumentet.
- Sätt in L1-Sensorchipet i SPR-instrumentet. Fäst bufferten och Prime systemet med buffert för 7 min.
- Ställ in en automatiserad metod enligt följande:
- Ställ in instrument temperaturen på 25 ° c.
- Aktivera sensorn chip L1 genom att skölja den med två 1 min injektioner av 20 mM käkar upplöst i vatten vid 30 μL/min flödeshastighet.
- Utför startcykler på tio 1 min injektioner av löpbuffert för att återfukta spånytan.
- Sätt in liposomerna på sensor kretsen L1 genom att injicera liposomerna på flödes cellen (FC)-2 på L1-chippet med 2 minuters injektioner vid 5 μL/min. sikta på en insamlingsnivå på minst ~ 3 000 Svarsenheter (RUs).
Obs: öka insprutnings tiden tills du uppnår lämplig inspelningsnivå.
- Sätt in liposomerna på sensor kretsen L1 genom att injicera liposomerna på flödes cellen (FC)-2 på L1-chippet med 2 minuters injektioner vid 5 μL/min. sikta på en insamlingsnivå på minst ~ 3 000 Svarsenheter (RUs).
- Injicera tre cykler buffert över både FC-1 och FC-2 med 1 min injektioner vid 30 μL/min.
- Injicera de olika titrationerna KRAS4b-FMe från den lägsta till den högsta koncentrations serien. Injicera proteinerna med 1 min injektioner för Associations fasen och 2 min injektioner för dissociationfasen vid 30 μL/min flödeshastighet över båda FCs.
- Regenerera sensorchip L1 genom att skölja det med två 1 min injektioner av 20 mM käkar vid 30 μL/min.
- Anpassa data med hjälp av SPR-utvärderingsprogramvaran genom att använda en enda plats bindnings modell för att få skenbara bindnings tillhörighet (se diskussionsavsnittet för en förklaring av data anpassning).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En av de största variablerna i protokollet är mängden uttryckt målprotein (His6-MBP-TeV-KRAS4b). Detta protokoll utvecklades med hjälp av ett isolat från en Trichoplusia ni -celllinje, TNI-FNL17, anpassad för suspension tillväxt och avvanda från serum. Med tanke på det stora utbudet av resultat som rapporteras över de olika insekternas cellinjer med baculoviridae Expression system, är det tillrådligt att TNI-FNL användas, åtminstone inledningsvis, för att produceras KRAS4b-FME.
Ett mörkt protein som migrerar till ~ 65 kDa bör vara uppenbar i den förtydligade lysate samt elutionsfraktioner (figur 1A). Fusionsproteinet bör vara en av de två mest framträdande färgade banden i lysate med den andra är co-uttryckte FNTA/B som comigrates på ~ 48 kDa.
Inom rening, CEX steget är kritisk av två skäl: 1) det tjänar till att minska omfattningen av proteolys som hypervariabel regionen (HVR) är ganska mottagliga, och 2) det berikar för fullt bearbetat protein som anges i noterna till detta steg i protokollet. Det är dock den mest komplicerade delen av protokollet. Detta beror på att det bearbetade proteinet tenderar att fällas ut vid lägre saltkoncentrationer, även smält till MBP. Lyckligtvis är detta inte ett allt-eller-inget-fenomen, och det äger också rum något långsamt över tiden. Protokollet utnyttjar detta genom att dialyzing till 200 mM NaCl före CEX steg. Vid denna koncentration var nederbörden inte lika betydande som vid 100 mM. Därför är protokollet syftar till att begränsa den tid proteinet är i en buffert av denna salt koncentration. Blandningen av små alikvoter av CEX-kolonnbelastningen med lika mängder nollsaltbuffert omedelbart före kolonnens lastning begränsar exponeringen (tidvis) till låga salt förhållanden och begränsar därmed nederbörden. Figur 2A skildrar det mest typiska resultatet från CEX-steget, med den mest framträdande är Peak 3, som huvudsakligen innehåller KRAS4b-FME. Figur 2B visar elueringprofiler som har observerats för att ge en känsla av variationen i förfarandets utfall. Eftersom dessa ibland kan vara vilseledande, är det klokt att skapa pooler av alla toppar och lagra dessa vid-80 ° c tills toppen av intresset har helt renat och klarat kvalitetstester.
Som nämnts i protokollet verkar användningen av HiPrep SP Sepharose-kolonner för hög prestanda vara avgörande för att uppnå den separation som observerats i figur 2A. Även om det ännu inte är klart varför Peak tre ofta hamnar farnesylated-endast KRAS4b förutom önskad farnesylated och karboxymetylerade KRAS4b, den dåliga upplösningen andra har rapporterat med alternativa CEX hartser (personlig kommunikation) antyder detta fenomen är inte enbart ett resultat av Joniska interaktioner.
Typiska avkastningar varierade från 1 – 6 mg/L, med 3 – 5 mg/L uppnåddes ofta (> 90%, n > 50). Intakt massanalys med ESI-MS bekräftade proteinernas exakta molekylmassa och därmed den relativa andelen av farnesylering och/eller karboxymetylering (figur 3). Medan typiska Final partier innehöll några detekterbara KRAS4b-FARN, var denna andel mindre än 15% i termer av topphöjd från denna analys. Figur 3A visar representativa data för KRAS4b som inte är Prenylerade uttryckt i E. coli, figur 3B visar KRAS4b-FME ELUERAT i topparna 3 och 5 från CEX, och figur 3C visar KRAS4b-Farn eluerad i Peak 2 från CEX.
Massan av KRAS4b som är bunden till BNP bestämdes också för dessa prover med hjälp av inhemsk massanalys (figur 3D). Utbytet av proverna till ammoniumacetat säkerställde en "mjukare" jonisering och det ursprungliga komplexet stannade intakt, vilket gav en bekräftelse av arten av nukleotid bunden till KRAS4b.
För att validera att farnesylation och karboxymetylering krävs för KRAS4b-FMe att binda till membran, vi mätt samspelet mellan KRAS4b-FMe till liposomer via SPR. Som framgår i figur 4, KRAS4b-FME bunden till liposomer medan obearbetade KRAS4b inte, vilket visar att bearbetade KRAS4b-FME krävs för interaktion med membran.
Figur 1: geler med SDS-Page i reningsprocessen. (A) iMac Capture från lysate. FNTA/B är de mörka banden migrerar på ~ 48 kDa och His6-MBP-TeV-KRAS4b är det mörka bandet migrerar på ~ 67 kDa. M = proteinmolekyl vikt stege; T = totalt protein; L = klargj橬一j lysate/kolonnen laddar; F = kolumn flöde genom. Fraktioner är eluerade med en ökande Imidazol koncentrations gradient. B) CEX-fraktioner märkta 1 – 5 motsvarar topp fraktionerna från elutionstopparna som visas i kromatogrammet i figur 2. C) TeV-nedbrytning och andra iMac. C = pool från CEX Step pre-TEV klyvning; L = Ladda provet efter TEV klyvning. De arter av intresse är märkta. D) en och fem mikrogram slutlig KRAS4b-FME-protein. Gelen som avbildas är representativa resultat från flera produktioner. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: elueringprofil för CEX-kromatografi. A) den typiska CEX-elueringprofilen har fyra till fem stora toppar. Bortsett från Peak 1, som normalt är en proteolyserad form av obearbetade KRAS4b saknar fyra C-Terminal aminosyror, de fyra topparna numrerade 2 genom 5 i panelen resultat från variationer i bearbetningen av N-och C-Termini av proteinet, med successivt mer positivt laddade molekyler elminerande senare i gradienten (se steg 1,15). B) ytterligare exempel på CEX-elueringprofiler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: intakta och infödda masspektrometrianalys av renade KRAS4b proteiner. Intakt massa spektrum och Deconvoluted Peak analysresultat för (a) obearbetade KRAS4b 2-185, förutspådde MW = 21 064; B) KRAS4b 2-185-FME, topparna 3 och 5 från CEX, förutspådde MW = 21 281; (C) KRAS4b 2-185-Farn, Peak 2 från CEX, förutspådde MW = 21 267. D) ursprunglig massa deconvolved Peak Analysis för E. coli uttryckt KRAS4b 2-185 (i), Kras-fme 2-185 (II), och KRAS-farn 2-185 (III), alla i BNP-nukleotid bunden stat. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: KRAS4b-FMe bindning till liposomer via spr. Storleksfördelning av 70:30 POPC: POPS liposomer erhålls genom DLS. (A) DLS-data visar en genomsnittlig diameter på ~ 200 Nm för liposomerna med en 18% polydispersitet. (B) spr-bindande sensorgram på 60 – 0,6 μm KRAS4b-FME till 70:30 liposomer tagna på en sensor L1-chip. C) passning av de steady state-bindande isotersom härrör från spr-data gav en SKENBAR KD på 1 μm KRAS4b-FME-bindning till liposomer. Det bindande svaret normaliseras genom att dividera med ytan fångstnivå av liposomer. (D) spr-bindningskinetik på 60 – 0,6 μm KRAS4b-2-185 till 70:30 liposomer tagna på ett sensor L1-chip. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som nämnts i avsnittet representativa resultat är det mest kritiska steget under rening hanteringen av provet under den tid det är i lägre salt. Att begränsa den tid som provet utsätts för mindre än 200 mM NaCl hjälper till att minska nederbörden och öka prov avkastningen. Tolkningen av resultaten av CEX kan vara svår om profilen inte motsvarar förväntningarna (se figur 2). Fram till dess att protokollet har blivit rutinmässigt, rekommenderas att de CEX-elutionsfraktioner som inte förs vidare lagras vid-80 ° c tills den intakta Mass analysen har slutförts för att säkerställa att korrekt material har tagits fram. Utanför de parametrar som anges ovan för CEX steg, är protokollet relativt lätt att ändra på Lys och IMAC steg. Det är också värt att notera att det inte finns någon storlek uteslutning kromatografi (SEX) separation steg i protokollet. Detta utelämnas på grund av förluster som vi har observerat under tidig metodutveckling (opublicerade resultat). Det är anmärkningsvärt att dessa förluster inte iakttas när proteinet är i komplex med nanoskivor, vilket tyder på förlusten i avsaknad av lipider beror på hydrofoba interaktion mellan proteinet och hartset.
Denna metod utgör en stor ökning av både kvantiteten (> 10X högre) och kvalitet (i jämförelse med bona fide bearbetade KRAS4b uttryckt i mänskliga celler) som har rapporterats i litteraturen14,18,19. Avkastningen på 3 – 5 mg/L har möjliggjort strukturbiologi insatser som kräver höga protein krav16,20. Ytterligare posttranslationella modifieringar för andra medlemmar av RAS-familjen samt ytterligare posttranslationella modifikation i allmänhet utreds för närvarande.
För intakt massa analys av KRAS4b, en koncentration av 0,1 mg/mL fungerar bra. Lägre koncentrationer kan användas på grund av förmågan hos den avslappnade protein konfigurationen att acceptera avgifter. Men i native massanalys, där proteinet är i sin ursprungliga vikta konformation, det finns lägre massa-till-avgift nyckeltal och högre koncentrationer krävs. Således, med hjälp av lägre koncentrationer av protein resulterar i en minskning av signalen och ger mindre tillförlitliga resultat. Fördelen med Native masspektrometri är att bufferten är kompatibel med att behålla komplexet av nukleotid bunden till KRAS4b. Därför är det möjligt att bekräfta de nukleotidbundna formerna av proteinerna (figur 3D). Som vid all masspektrometrianalys observeras neutrala förluster (t. ex. en metylgrupp) (se mindre arter med en förlust av 18 i intakt massanalys, figur 3a – C). I native masspektrometri analys, protein addukter med na+ eller K+, närvarande efter omfattande buffertutbyte, kan observeras. Detta framgår tydligt av de mindre topparna på + 23 i figur 3D, panelerna i-III).
Våra SPR-data (figur 4) visar att den fullt bearbetade formen av KRAS4b krävs för att sammanfatta KRAS4b-membraninteraktion in vitro. En stor fördel med att använda L1 chip för att fånga liposomer i våra SPR experiment är att L1-chip ytan är dextran belagda och modifierade med lipofila grupper21, vilket möjliggör direkt fångst av liposomer utan någon ytterligare modifiering. SPR är en kraftfull teknik för att studera interaktioner mellan ligand och ligand som ger information om stökiometri och bindningsaffinitet. Sensorgram som fungerar korrekt bör ha en Associations fas som når ett stabilt tillstånd. Denna maximala bindande respons (RMax) ger en uppskattning av stökiometrin för interaktionen. Dissociation Rate bör följa en enda exponentiell förfall, under förutsättning att en 1:1 bindning interaktion22. Men proteiner som binder till en membran yta uppträder vanligen med mer komplexa stoichiometrier23 och flera affiniteter som resulterar i sensorgram med mer komplex kinetik. Vi har inte lyckats anpassa kinetik till en multisitebindning modell. Dock kan jämvikts bindningen adsorptionsisotermerna vara lämpade med hjälp av kommersiell utvärdering programvara för att ge en skenbar jämvikt bindning affinitet (KD). Oavsett, våra SPR data skiljer sig tydligt mellan hur obearbetade KRAS4b och KRAS4b-FMe binda till liposomer. Sålunda, SPR ger fortfarande ett användbart verktyg i dechiffrera protein-lipid interaktioner.
Kollektivt, med hjälp av SPR vi visar att fullt bearbetade KRAS4b-FMe krävs för membran bindning. Produktion av helt farnesylerad och karboxymetylerad form av KRAS4b med hjälp av denna metod ger kvantitet och kvalitet av material som krävs för strukturell biologi20, biofysisk karakterisering av membran interaktioner23, och screening studier mot KRAS4b-FME: RAF Complex i närvaro av lipidbilayers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi erkänner kloning och uttrycks stöd från Carissa Grose, Jen Melhalko, och Matt Drew i protein Expression Laboratory, Frederick National laboratorium för cancer forskning. Detta projekt har finansierats helt eller delvis med federala medel från National Cancer Institute, National Institutes of Health, enligt kontrakt nr. HHSN261200800001E. Innehållet i denna publikation återspeglar inte nödvändigtvis åsikter eller politik Institutionen för hälsa och mänskliga tjänster, inte heller nämner handelsnamn, kommersiella produkter eller organisationer innebär godkännande av den amerikanska regeringen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural | Eppendorf | 22363204 | |
| 11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials | Thermo Scientific | 30211SS-1232 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | AVANTI POLAR LIPIDS | 850457 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS) | AVANTI POLAR LIPIDS | 840034 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 5427R Centrifuge | Eppendorf | ||
| Acetonitrile, HPLC Grade | Fisher Chemical | A998-1 1L | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 09689-250g | |
| Argon gas | Airgas | ARUP | |
| Assay Plate 384 | CORNING | 3544 | |
| Biacore T200 Instrument | GE Healthcare | ||
| Blue Snap-It Seals, T/S | Thermo Scientific | C4011-54B | |
| Branson Ultrasonic Bath | Thermo Fisher | 15-336-1000 | |
| Cation Exchange Chromatography (CEX) column | GE Healthcare Life Sciences | 29018183 | HiPrep SP Sepharose High Performance |
| CHAPS | Sigma | C3023 | |
| Dyna Pro Plate Reader | Wyatt Technologies | ||
| Exactive Plus EMR Mass Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500Ml | Use Reagent Grade or better |
| Gilson vials 7x14 mm Tubes | GE Healthcare | BR-1002-12 | |
| Glass screw thread vials with PTFE foam liners | Scientific Specialities | B69302 | |
| High speed/benchtop centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 05-112-114D | capable of up to 4,000 xg |
| His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease | Addgene | 92414 | Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY |
| Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column | GE Healthcare Life Sciences | 28-9365-51 | HisPrep FF 16/10 |
| In-House Water Supply, Arium Advance | Sartorius Stedim | Resistivity of 18 MΩ0-cm | |
| Lipid extruder set with holder | AVANTI POLAR LIPIDS | 610023 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | NI-DEWAR | |
| M110-EH microfluidizer | Microfluidics | ||
| MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm | Thermo Scientific | 088645 | |
| MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 Å, 2.1 x 150 mm | Thermo Scientific | 088790 | |
| MagTran software | Thermo Scientific | ||
| Methanol, HPLC Grade | VWR Chemicals | BDH20864.400 | |
| NGC Chromatography System | BioRad | 78880002 | NGC QuestTM 100 Chromatography system |
| Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators | Millipore Sigma | P8849 | |
| Rubber Caps type 3 | GE Healthcare | BR-1005-02 | |
| Series S Sensor Chip L1 | GE Healthcare | 29104993 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | 13-400-519 | Absorbace at 280nm |
| Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL | Millipore Sigma | UFC901008 | PES membrane |
| Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters | Amicon | UFC501024 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima - L80K | capable of 100,000 xg |
| Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System) | Thermo Scientific | ||
| Vortex Genie 2 | Fisher | 12-812 | |
| Water, HPLC Grade | Sigma-Aldrich | 270733-1L | May use in-house water source (see below) |
| Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter | GE Healthcare - Whatman | 6994-2504 | |
| Xcalibur QualBrowser | Thermo Scientific | proteomics software |
References
- Cox, A. D., Der, C. J. Protein prenylation: more than just glue. Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).
- Zhang, F. L., Casey, P. J. Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences. Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).
- Hottman, D. A., Li, L. Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer's disease. Molecular Neurobiology. 50 (1), 177-185 (2014).
- Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. HDL and cognition in neurodegenerative disorders. Neurobiology of Disease. 72, Pt A 22-36 (2014).
- Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms. Annals of Medicine. 35 (6), 398-403 (2003).
- Kohnke, M., et al. Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease. PLoS One. 8 (12), 81758 (2013).
- Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. Targeting protein prenylation for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (11), 775-791 (2011).
- Kho, Y., et al. A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12479-12484 (2004).
- Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB. Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 7864-7868 (1995).
- Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. Dragging ras back in the ring. Cancer Cell. 25 (3), 272-281 (2014).
- Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics. Chemical Reviews. 117 (6), 4669-4713 (2017).
- Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles. Journal of Visualized Experiments. (66), e3910 (2012).
- Dementiev, A. K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation. Protein Expression and Purification. 84 (1), 86-93 (2012).
- Lowe, P. N., et al. Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems. Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1672-1678 (1991).
- Gillette, W., et al. Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System. Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).
- Agamasu, C., et al. KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner. Biophysical Journal. 116 (6), 1049-1063 (2019).
- Talsania, K., et al. Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies. Genes. 10 (2), 79 (2019).
- Spencer-Smith, R., et al. Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site. Nature Chemical Biology. 13 (1), 62-68 (2016).
- Lowe, P. N., et al. Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system. Biochemical Society Transactions. 20 (2), 484-487 (1992).
- Dharmaiaha, S., et al. Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDEδ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6766-6775 (2016).
- Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore. Analytical Biochemistry. 328 (2), 233-243 (2004).
- Fisher, R. J., et al. Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (2), 472-484 (2006).
- Lakshman, B., et al. Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane. Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).
