Summary
前膜化是外周膜结合蛋白的重要修饰。昆虫细胞可以纵产生脱脂和甲苯甲酸化 KRAS4b 的数量，使生物物理测量蛋白质 - 蛋白质和蛋白质 - 脂质相互作用
Abstract
蛋白质前化是一种关键的修饰，负责将蛋白质定向到细胞内膜上。KRAS4b在22%的人类癌症中发生变异，由于C-总站存在"CAAX"箱形图案，KRAS4b通过脱氧核化和甲酸甲基化进行处理。一个工程的巴库病毒系统用于在昆虫细胞中表达脱脂和甲苯甲酸KRAS4b，并曾对此进行过描述。在这里，我们描述了蛋白质的详细，实用的纯化和生化表征。具体来说，亲和和电子交换色谱法用于纯化蛋白质，使蛋白质均匀化。使用正原质谱法验证KRAS4b的正确修改，并验证核苷酸结合。最后，利用表面质子共振光谱法，测定了脱氧核酸和甲苯甲酸化KRAS4b与脂质体之间的膜结。
Introduction
翻译后修饰在定义蛋白质的功能活性方面起着关键作用。磷酸化和糖基化等修改已经确立。然而，脂质修饰的特征较差。据估计，多达0.5%的细胞蛋白可能是1。前化是转移15碳法内西或20碳的Geranyl高脂链到含有CAAX图案2的接受蛋白。早发蛋白与多种人类疾病的进展有关，包括早衰3、阿尔茨海默氏症4、心脏功能障碍5、胆汁血症6和癌症7。小型GTPases、HRAS、NRAS和KRAS1、核层压宁和运动性CENP-E和F在基础条件下是远血化蛋白。其他小型GTPases，即RhoA，RhoC，Rac1，cdc-42和RRAS是Geranylranylate8，而RhoB可以是远发或杰兰格尔尼酸盐9。
小型GTPase KRAS4b功能作为分子开关，基本上通过多种蛋白质-蛋白质相互作用将细胞外生长因子信号传送到细胞内信号转导通路，刺激细胞生长和增殖。KRAS4b 生物化学有两个关键方面对其活性至关重要。首先，蛋白质在非活性GDP和活性GTP约束状态之间循环，从而主动与效应者互动。其次，C端多流氨酸区域和脱脂和甲苯甲基化半胱氨酸将蛋白质定向到血浆膜，使下游效应器得以招募和激活。突变KRAS4b是胰腺癌、结肠直肠癌和肺癌10的致癌驱动因素，因此，治疗干预将具有巨大的临床效益。生产真正改性重组蛋白，即脱脂和甲苯甲基化，可利用KRAS4b与脂质体或脂质纳米片等膜代用品进行生化筛选。
法内西尔转移酶 （FNT） 催化在 KRAS4b 的 CAAX 主题中向 C 端半胱氨酸中添加法尼西尔焦磷酸酯。前化后，蛋白质被贩运到内质神经质 （ER），其中 Ras 转换酶 （RCE1） 会裂解三个 C 端残留物。加工的最后一步是通过ER膜蛋白，异丙烯酰乙基甲基转移酶（ICMT）对新的C端法内西锡化残留物进行甲基化。大肠杆菌中重组KRAS4b的表达导致未修饰蛋白的产生。以前生产加工的KRAS4b的尝试一直受到限制，因为没有足够的产量的结构或药物筛选实验或未能重述本地全长成熟蛋白13，14。这里提出的协议采用基于毒细胞的工程性昆虫细胞表达系统和纯化方法，在5mg/L细胞培养的培养下产生高度纯化、完全加工的KRAS4b。
在开始结构生物学或药物筛选研究之前，仔细的蛋白质表征对于验证重组蛋白的质量至关重要。完全加工的KRAS4b的两个关键参数是验证正确的前阴修饰和可及的法奈酸和卡博甲基化C-总站（FMe）与膜替代品或脂质相互作用。KRAS4b-FMe的电喷雾电离质谱法（ESI-MS）用于测量分子量，并确认存在法内西尔和甲苯甲基修饰。原生质谱法，其中样品喷洒非脱模溶剂，用于证明KRAS4b-FMe也绑定到其国内生产总值的系数。最后，利用表面质子共振光谱测量KRAS4b-FMe与固定脂质体的直接结合。
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Protocol
1. 蛋白质纯化
- 准备缓冲区 A_H，如表1所示。
| 缓冲液 | 缓冲剂（所有 20 mM） | pH | 纳克莱 （mM） | 伊米达索 （mM） | MgCl2 | TCEP |
| A | 赫佩斯 | 7.3 | 300 | - | 5 | 1 |
| B | 赫佩斯 | 7.3 | 300 | 35 | 5 | 1 |
| C | 赫佩斯 | 7.3 | 300 | 500 | 5 | 1 |
| D | Mes | 6.0 | 200 | - | 5 | 1 |
| E | Mes | 6.0 | - | - | 5 | 1 |
| F | Mes | 6.0 | 100 | - | 5 | 1 |
| G | Mes | 6.0 | 1000 | - | 5 | 1 |
| H | 赫佩斯 | 7.3 | 300 | - | 1 | 1 |
- 制备纯化材料（见材料表）：蛋白酶抑制剂鸡尾酒，不含EDTA或其他包剂;固定金属亲和色谱（IMAC）柱;阳离子交换色谱（CEX）柱;0.45 μm注射器过滤器;2 M imidazole （pH = 7.5）;超离心机，能力为10万×g;高速台式离心机，可4000×g; 离心滤波器单元（10 KDa NMWL）;光谱光度计，能够读取在280nm;他的6-烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶;色谱仪器能够混合两个缓冲液溶液，将溶液应用于柱，从柱中创建梯度洗脱，并从柱中收集分数。
- 从先前储存在-80°C或使用新鲜收获的细胞的昆虫细胞培养基的#2 L中解冻细胞。有关 Tni.FNL 昆虫细胞系和表达协议的详细信息，请参阅 Gillette 等人 201915。用200 mL的缓冲A小心地重新悬浮细胞，加入1：200 v/v蛋白酶抑制剂，而不引入空气或产生泡沫。
注：步骤1.3和后续步骤（如上文所述除外）应在室温（+22°C）下执行。重要的是样品是均匀的，以便在下一步允许完全莱沙。 - 在微流体化器中的Lyse细胞颗粒，在7，000 psi下进行两次通过或处于等效的莱沙系统中。尚未探索其他莱沙方法。
- 由于存在堵塞过滤器的化合物，澄清昆虫细胞分解物存在问题。因此，超离心（在4°C下为100，000 x g，30分钟）非常重要。应避免上清液表面的白脂质残留物，并使用棉签去除或减少。通过 0.45 μm PES 过滤器过滤去上清液。立即使用澄清样品或储存在-80°C。
注： 残留物块过滤器快速，可能需要许多过滤器。如果未能减少此材料的量，则在随后的步骤中会导致高柱背压。 - 确定澄清的莱沙的体积，并通过添加2M imidazole库存将样品调整至35 mM imidazole。以 3 mL/min 的速度将样品加载到 20 mL IMAC 列（HisPrep FF 16/10 列）上，在缓冲区 B 中预平衡三列卷 （CV）。
- 虽然目标蛋白通常定量吸附到柱中，但最好收集柱流以进行后续分析。洗涤柱，直到 Abs280达到稳定的基线 （<100 毫吸收单位 [mAU]）与缓冲器 B 在 3 mL/min 为 20 mL （1 CV）， 然后为 #3 CV 在 4 mL/min 的洗涤步骤的其余部分.通常，需要 60–80 mL 的缓冲液 B 来实现基线吸光性。
- 在收集8 mL分数的同时，用从缓冲器B到缓冲C的400 mL（20 CV）梯度对蛋白质进行洗取。通常，在梯度的前半部分，目标蛋白洗脱（图1A;并非所有后期分数都显示）。
- 使用 SDS-PAGE/Coomassie 染色分析蛋白质馏分。池峰值分数，在 4°C 下对 2 L 的缓冲区 D 进行一夜的透析。
注：低pH是确保蛋白质结合在下一步的关键。然而，这种透析期间的pH变化缓慢，这是一个方便的步骤，过夜孵育。尚未研究替代缓冲液交换策略（例如，更高的缓冲液浓度以加快 pH 变化）。随着时间的推移，蛋白质将开始缓慢沉淀，在较低的pH值和较低的盐浓度和少量的沉淀是正常的在这一步。因此，我们避免在透析期间将缓冲液交换到与下一列绑定所需的 100 mM NaCl。相反，NaCl浓度为200 mM用于透析，蛋白质在应用柱前稀释至100 mM（见下文）。我们尚未调查此沉淀是否特定于 KRAS4b，但沉淀的蛋白质已被确认为 KRAS4b-FMe。因此，我们建议在透析缓冲液中使用较高的NaCl浓度作为预防措施，直到确定结合缓冲液中靶蛋白的稳定性。 - 从透析和离心机中取出样品，在4，000 x g下10分钟，以去除任何沉淀物。此时最后经过透析、澄清的样本通常仍然模糊不清，但无需对后续 CEX 列进行进一步处理即可应用。
- 使用三个缓冲器 G 的 CV 洗涤，然后用三个缓冲区 F 的 CV 洗涤，准备一个 20 mL 的阳离子交换列（参见材料表）。
注：虽然我们没有仔细评估其他树脂，但一些同事发现，SP Sepharose 高性能树脂以外的树脂的分辨率较差。 - 通过加入20 mL的缓冲液E，将透析样品的20 mL稀释至最终NaCl浓度为100 mM，并将稀释的样品涂到阳离子交换柱上。
- 继续加载柱，将上述制备的新鲜稀释样品添加到负载管中，因为以前的稀释已接近负载末端。
注：将整个样品一次稀释至100 mM NaCl，导致由于降水导致目标蛋白大量流失。 - 使用缓冲区 F 将列洗至基线 Abs280。这通常需要 3 个 CV。蛋白质在从缓冲F到65%缓冲液G的400 mL （20 CV） 梯度期间从柱中洗脱，以 6 mL 分数收集（图 1B）。
- 渐变完成后，继续清洗柱，使其获得额外的 1.5 CV（65% 缓冲区 G）。根据 SDS-PAGE/Coomassie 蓝色染色分析和色谱图的 UV 痕迹检查，选择正分数。
注： UV 轨迹通常包含五个峰值。从较低的盐浓度开始，初始峰值通常是未加工和/或蛋白酶化的蛋白质。第二个和第三个峰是两种加工蛋白的混合物：第二个峰主要是一种法耳化中间体（FARN），而第三个峰主要是感兴趣的完全加工的FMe蛋白。峰值四和五代表His6-MBP-KRAS4b融合蛋白（此时所有蛋白质都采用此格式，因为没有发生TEV消化）。这些不是N-乙酰化在N-总站，是法拉西化（峰值四）和法奈酸和甲壳甲基化（峰值五）在C-总站。由于峰值 2 和峰值 4 在去除标记后会产生相同的蛋白质（即 KRAS4b-FARN），如果需要，这些蛋白质可以在此阶段汇集。同样，峰值三和峰值五可以组合产生一手KRAS4b-FMe（图1B，图2）。然而，建议只有在确认不同峰中蛋白质的性质时，才会进行这种汇集。 - 用His6-TEV蛋白酶（样品的+200μg蛋白酶/mL）消化步骤1.15中汇集的蛋白质。
注：我们使用Addgene（https://www.addgene.org/92414）提供的质粒和协议使His6-TEV蛋白酶。在室温下，将TEV消化道与缓冲液A（10 kDa MWCO透析管，每μL样品的缓冲液A最低为40mL）进行2小时，然后在4°C下过夜。 - 消化和透析后，将蛋白质直接加载到20 mL IMAC柱中，与缓冲液A以3 mL/min平衡。
注：在整个色谱过程中收集7 mL分数，因为靶蛋白对柱的亲和力较低，但可能不会完全与树脂结合。使用缓冲器 A 以 3 mL/min 清洗柱，共 3 个 CV 或直到达到基线吸光度。 - 目标蛋白用从0%~10%的5CV梯度洗脱，收集7mL分数。作为一种预防措施，额外的结合蛋白可以洗脱100%缓冲C。正分数由SDS-PAGE分析后确定（图1C）。通常，靶蛋白在低imidazole浓度下洗脱（即，在0%~10%缓冲C梯度中），但有时在流通或柱洗液中洗涤。
- 对缓冲液H进行透析，通过光谱光度测定280nm的蛋白质浓度。
注：在确定用于此计算的消光系数时，请务必考虑核苷酸的存在。 - 使用离心滤光片（10 K NMWL），蛋白质可浓缩至+2~5mg/mL，而不会显著失去蛋白质。使用 0.22 μM 注射器过滤器进行过滤。测量A280的溶液吸收度以计算最终蛋白质浓度（图1D）。在液氮中捕捉冷冻等分，并将冷冻样品储存在-80°C。
注：纯化的蛋白质与GDP成定位于。KRAS4b-FMe可以使用先前发布的协议16交换到GppNHp。
2. 样品制备，用于完整的质量分析和原生质量分析
- 用于完整质量分析的样品制备
- 在分析之前在冰上解冻蛋白质样品。对于完整的质量分析，在 20 mM 碳酸氢铵（pH = ±8.4）中将蛋白质稀释至 0.1 mg/mL。对于原生质量分析，将蛋白质稀释至50 mM醋酸铵（pH = ±7.5）中0.1mg/mL的浓度。涡流每个样品5~10秒，然后在12，500 x g下离心1分钟，以颗粒溶液中的任何固体材料。去除每个上清液的10~20 μL，并转移到玻璃自动进镜小瓶中。将每个小瓶盖紧，以防止污染或蒸发。
注：对于完整的质量分析或原生质量分析，在分析之前，可以使用 10 kDa MWCO 纤维素膜过滤器对样品进行脱盐，以缓冲交换到最终稀释缓冲液中。
- 在分析之前在冰上解冻蛋白质样品。对于完整的质量分析，在 20 mM 碳酸氢铵（pH = ±8.4）中将蛋白质稀释至 0.1 mg/mL。对于原生质量分析，将蛋白质稀释至50 mM醋酸铵（pH = ±7.5）中0.1mg/mL的浓度。涡流每个样品5~10秒，然后在12，500 x g下离心1分钟，以颗粒溶液中的任何固体材料。去除每个上清液的10~20 μL，并转移到玻璃自动进镜小瓶中。将每个小瓶盖紧，以防止污染或蒸发。
- 为质量分析准备扩展质量范围 （EMR） 质谱
注：在运行质谱仪的任何分析之前，请确保它最近已校准。此外，请始终根据需要戴上手套和其他个人防护设备，以避免任何有害化学品，并避免污染样品和溶剂。校准使用商业获得的校准溶液和内部制备的 2 mg/mL 碘化铀溶液进行校准。- 打开分析软件并加载相应的仪器方法文件。对于KRAS4b蛋白的完整质量分析，合适的起始参数如下：阳性检测模式;三个微扫描，分辨率 = 70，000;AGC 目标 = 3e6;最大集成时间 = 200 ms;和扫描范围 = 70×1，800 质量-电荷比 （m/z）。对于KRAS4b蛋白的原生质量分析，合适的起始参数如下：阳性检测模式;10微扫描，分辨率= 17，500;源内碰撞引起的解散 （CID） = 20 eV;AGC 目标 = 3e6;碰撞能量 （CE） = 20;最大集成时间 = 200 ms;和扫描范围 = 500~10，000 m/z。
- 色谱溶剂和柱的制备
- 准备完整的质量分析所需的溶剂。溶剂A是含0.1%甲酸的水。溶剂B在水中是80%的醋酸和0.1%的甲酸。
- 准备原生质量分析所需的溶剂。溶剂A在水中为0.1M醋酸铵，溶剂B为水。
- 制备适当的溶剂后，清除系统，使管内充满适当的溶剂，并从管路中取出所有气泡。
- 安装适当的列（用于完整质量分析的反向相列和用于本机质量分析的大小排除列）。对于完整的质量分析，流速为 0.5 mL/min，柱温度（使用柱加热器）为 50°C。将列平衡 15-20 分钟。对于本机质量分析，流速为 0.25 mL/min。
注： 始终监视列的背压，以确保其不高于上限，这可能表示线路堵塞或列矩阵受损。如有必要，请更换列。
- 样品分析
- 将制备的蛋白质样品放入玻璃自动进样机小瓶中，放入LC系统自动进样机中的相应小瓶架中。使用适当的仪器方法在软件程序中创建示例列表，以便进行所需的分析。完成示例列表后，单击"播放"按钮开始分析。
- 每次分析注入1⁄2 μL样品，每个样品前后有水空白，以确保不存在结转。
注：完整的质量分析与原生质量分析非常不同，需要非常不同的仪器方法设置。这是因为通过完整的质量分析，这种蛋白质在有机溶剂的存在下是"放松的"，因此能够接受更多的电荷。更容易去解和解析电荷状态的同位素分布。原生质量分析提供蛋白质离子的窄电荷分布，基于蛋白质，需要不同的电压和碰撞能量设置。
- 数据分析与蛋白质递减
- 将样品的光谱导出到软件中，将其转换为可显示蛋白质完整质量（或原生质量）的去复杂光谱。由于带电光谱峰的丰度高，完好的质量将具有同位素峰分布。由于带电光谱峰的丰度较低，原生质量通常只有很少的峰（图3D）。
- 扩大峰值 d 的质量-电荷比 （m/z） 范围，以确认测量的质量与预测质量一致。有时，由于向蛋白质添加电荷，预期分子量 （MW） 和观察到的 MW 之间可能存在轻微差异。此外，与许多质谱分析一样，钠等附加剂可导致数据中出现额外的峰值，即使样品经过精心脱盐也是如此。有时观察到 m/z 低于预期的丰丰峰。这很可能是由于中性损耗，即由于电电化过程而失去的功能组。
注： 如预期的那样，完整质量与本机质量峰值之间将存在差异。完整的质量显示将显示蛋白质的预期MW。它将没有附加的核苷酸或其他修改的额外MW。然而，原生质量峰值将显示任何添加的核苷酸的蛋白质。
3. KRAS4b-FMe与脂体结合的验证
- 膜脂体制备
- 准备由 20 mM HEPES （pH = 7.3）、150 mM NaCl 和 1 mM TCEP 组成的缓冲液。
- 脂质体制备材料包括25 mM 1-棕榈-2-醇-甘醇-3磷胆碱（POPC）和10mM 1-棕榈基-2-醇-甘酮-3-磷-L-血清（POPS）氯仿库存;装有支架和加热块的脂质挤出机;气和液氮;超声波浴;带PTFE泡沫衬套的玻璃螺丝线小瓶;以及能够进行动态光散射检测的板式读取器。
- 在室温下以氯仿解冻脂质，30分钟。将1 mL的5 mM 70：30 POPC：POPS脂质体，通过将106 μL的25 mM POPC（库存）和118μL的10mM POPS（库存）等106μL与玻璃小瓶中等分。
注意：请勿用塑料尖端等分脂质，因为氯仿会溶解某些塑料尖端。 - 干脂质在稳定的气体流下。在使用气态时，缓慢旋转玻璃瓶，形成一层薄薄的干膜。
- 将样品放入真空冻干剂中过夜，以去除多余的氯仿。
- 在干膜中加入1mL的缓冲液，将混合物涡旋5分钟，使脂质混合物在25°C下摇动1小时，从而重新形成脂质。
注：在脂质的干燥膜层中加入缓冲液后，样品会非常浑浊。 - 通过将样品小瓶交替放置在冰水（4°C 或更低）和温水浴（25°C 或更高）之间，执行五个冻结/解冻循环。
- 将样品小瓶放入超声波浴中，将样品声波约0.5小时或直到样品变为半透明。
- 使用脂质挤出机集挤出样品。组装挤出套件，如制造商说明所示。使用 0.1 μm 滤纸挤出样品。将样品装入一个玻璃注射器，并将其连接到挤出装置的一端。在挤出装置的另一端添加一个空注射器。前后推10~20倍，直到样品完全透明。
- 在 20，000 x g下旋转最终样品 30 分钟，以去除任何大型聚合体。
- 使用动态光散射 （DLS） 确定脂质体的大小和均匀性（可选）。将 30 μL 的脂体放入 384 孔板读取器中。以 1，000 x g旋转板 30 分钟。将板放入板读器中，并收集 10 个光散射测量值。
- 通过表面质子共振（SPR）对KRAS4b-FMe结合到脂质体进行特征
- 组装所需材料：SPR仪器;传感器芯片L1;7 x 14 mm 小瓶管;和 CHAPS。
- 准备一个含有20 mM HEPES（pH = 7.3）、150 mM NaCl、1 mM TCEP 的缓冲液。在总体积为 200 μL（总体积为 10 个）时，从 60 μM±0.06 μM 制备 KRAS4b-FMe 稀释系列。将最终稀释的样品转移到小瓶管中（见材料表），将小瓶管放入机架中，然后将样品插入SPR仪器中。
- 将 L1 传感器芯片插入 SPR 仪器。将缓冲器连接，用缓冲器给系统注底 7 分钟。
- 设置自动方法，如下所示：
- 将仪器温度设置为 25°C。
- 以 30 μL/min 流速，用两次 1 分钟喷射 20 mM CHAPS 溶解在水中，激活传感器芯片 L1。
- 执行 10 1 分钟注入运行缓冲液的启动周期，以滋润芯片表面。
- 将脂体注入L1芯片的流量单元（FC）-2，以5μL/min2分钟注射，将脂体沉积到传感器芯片L1上。
注：增加注射时间，直到达到适当的捕获级别。
- 将脂体注入L1芯片的流量单元（FC）-2，以5μL/min2分钟注射，将脂体沉积到传感器芯片L1上。
- 在 FC-1 和 FC-2 上注入三个循环的缓冲液，在 30 μL/min 下注入 1 分钟。
- 从最低浓度到最高浓度系列注入各种KRAS4b-FMe牙名。在关联相使用1分钟注射1分钟注射蛋白质，在两个FC上以30μL/min流速为解关联阶段注射2分钟。
- 在 30 μL/min 下，通过两次 1 分钟喷射 20 mM CHAPS 来再生传感器芯片 L1。
- 使用 SPR 评估软件使用单个站点绑定模型拟合数据，以获得明显的绑定关联性（有关数据拟合的说明，请参阅讨论部分）。
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Representative Results
该协议中最大的变量之一是表达靶蛋白（His6-MBP-tev-KRAS4b）的量。该协议是利用从Trichoplusia ni细胞系Tni-FNL17分离物开发的，该基体适应悬浮生长，并从血清中分离。鉴于使用巴库病毒表达系统在各种昆虫细胞系报告的各种结果范围广泛，建议使用Tni-FNL，至少在最初用于生产KRAS4b-FMe。
迁移到 +65 kDa 的深色蛋白质在澄清的解液和洗脱分数中应明显（图 1A）。融合蛋白应该是裂变中两个最突出的染色带之一，另一个是共同表达的FNTA/B，在+48 kDa下共同迁移。
在纯化过程中，CEX步骤至关重要，原因有二：1） 它有助于降低蛋白解的程度，因为超可变区域 （HVR） 相当易感性;2） 它丰富了完全加工的蛋白质，如协议这一步的注释所示。然而，它是协议中最复杂的部分。这是因为加工后的蛋白质往往在较低的盐浓度下沉淀，甚至融合到MBP。幸运的是，这不是一个全或全无的现象，而且随着时间的推移，它也会发生得有点缓慢。该协议通过在 CEX 步骤之前透析到 200 mM NaCl 来利用这一点。在此浓度下，降水量不如100 mM显著。因此，该协议旨在限制蛋白质在盐浓度的缓冲液中的时间长度。CEX 柱负载的小等分物在列加载前与等量的零盐缓冲液混合，将暴露（在时间方面）限制在低盐条件下，从而限制降水量。图 2A描述了 CEX 步骤中最典型的结果，其中最突出的是峰值 3，其中主要包含 KRAS4b-FMe。图 2B描述了已观察到的洗脱配置文件，以便了解过程结果的可变性。由于这些有时可能会误导，因此谨慎的做法是创建所有峰值池并将其存储在 -80°C，直到兴趣峰值完全纯化并通过质量测试。
如协议所述，使用HiPrep SP Sepharose高性能列对于实现图2A中观察到的分离似乎至关重要。虽然目前还不清楚为什么高峰三经常窝着仅脱氧核酸KRAS4b，除了所需的脱脂和甲苯甲基化KRAS4b，但其他人用替代CEX树脂（个人交流）报告的分辨率差表明，这种现象不仅仅是离子相互作用的结果。
典型产量范围从1~6毫克/升，4~5毫克/升频繁实现（>90%，n>50）。 使用ESI-MS进行的完整质量分析证实了蛋白质的精确分子质量，从而证实了远丝化和/或甲壳甲基化的相对比例（图3）。虽然典型的最终拍拍包含一些可检测到的KRAS4b-FARN，但从这个分析的峰值高度来看，这个比例不到15%。图 3A显示了 KRAS4b 的代表性数据，这些数据未以大肠杆菌表示，图3B显示了 CEX 峰值 3 和 5 中的 KRAS4b-FMe 洗脱，图3C显示了 CEX 峰值 2 中的 KRAS4b-Farn 洗脱。
KRAS4b 与 GDP 结合的质量也通过原生质量分析（图 3D） 确定这些样本的质量。将样品交换成醋酸铵可确保"较软"的电离子化，原生复合物完好无损，从而确认与KRAS4b结合的核苷酸的性质。
为了验证KRAS4b-FMe与膜结合所需的脱脂化和甲氧比克化，我们测量了KRAS4b-FMe通过SPR与脂质体相互作用。如图4所示，KRAS4b-FMe与脂体结合，而未处理的KRAS4b4b没有，从而证明处理KRAS4b-FMe是与膜相互作用所必需的。
图1：SDS-PAGE凝胶的纯化过程。（A） IMAC捕获从莱雅特.FNTA/B 是在 +48 kDa 迁移的暗带，而 His6-MBP-tev-KRAS4b 是以 +67 kDa 迁移的暗带。M = 蛋白质分子量阶梯;T = 总蛋白质;L = 澄清的莱沙/列负载;F = 列流通过。分数随着二甲苯浓度梯度的增加而洗脱。（B） 标记为 1⁄5 的 CEX 分数对应于图 2的色谱图中显示的洗脱峰的峰值分数。（C） TEV 消化和第二 IMAC.C = 来自 CEX 步长前 TEV 裂解的池;L = 负载样品后TEV裂解。感兴趣的物种被标记。（D） 最终 KRAS4b-FMe 蛋白的 1 和 5 微克。所描绘的凝胶是多种生产中具有代表性的结果。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：CEX色谱洗脱轮廓。（A） 典型的 CEX 洗脱轮廓有四到五个主要峰值。除了峰值1（通常是一种未经加工的KRAS4b的蛋白解形式，缺少四种C-端氨基酸）之外，面板中编号为2至5的四个峰是由于蛋白质的N-和C-termini处理的变异性，在梯度中逐渐带正的带电分子脱脱（见步骤1.15）。（B） CEX 洗脱配置文件的其他示例。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：纯化KRAS4b蛋白的纯质质谱分析。（A） 未加工 KRAS4b 2-185 的完好质量谱和去向峰值分析结果，预测 MW = 21，064;（B） KRAS4b 2-185-FMe，CEX 的峰值 3 和 5，预测 MW = 21，281;（C） KRAS4b 2-185-Farn，来自 CEX 的峰值 2，预测 MW = 21，267。（D） 大肠杆菌的原生质量去伏峰分析表示 KRAS4b 2-185 （i）、KRAS-FMe 2-185 （ii） 和 KRAS-Farn 2-185 （iii），均处于 GDP-核苷酸结合状态。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：KRAS4b-FMe通过SPR与脂体结合。DLS 获得的 70：30 POPC：POPS 脂体的大小分布。（A） DLS数据显示，具有18%多分散度的脂质体的平均直径为±200nm。（B） SPR 结合传感器的 60×0.6 μM KRAS4b-FMe 到 70：30 脂体捕获到传感器 L1 芯片上。（C） 拟合从SPR数据派生的稳态结合等源，提供表观KD为1μMKRAS4b-FMe结合的脂体。结合响应通过除以脂体的表面捕获级别进行归一化。（D） 捕获到传感器 L1 芯片上的 60~0.6 μM KRAS4b-2-185 至 70：30 脂体的 SPR 结合动力学。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
如"代表性结果"部分所述，在纯化过程中最关键的步骤是在样品处于低盐时处理。限制样品暴露于小于 200 mM NaCl 的时间将有助于减少降水并提高样品产量。如果配置文件不符合预期，则很难解释 CEX 的结果（参见图 2）。在协议成为常规之前，建议未向前推进的CEX洗脱分数在-80°C处储存，直到完成完整的质量分析，以确保将适当的材料向前推进。除了上述CEX步骤的参数外，该协议在莱沙和IMAC步骤中相对容易修改。还值得注意的是，协议中没有尺寸排除色谱（）分离步骤。由于在早期方法开发期间观察到的损失（未发布的结果），因此省略了此值。值得注意的是，当蛋白质与纳米光盘复合时，这些损失是不能观察到的，这表明在缺乏脂质的情况下，这种损失是由于蛋白质和树脂之间的疏水性相互作用造成的。
这种方法表示在数量（>10倍）和质量（与在人类细胞中表达的善意处理KRAS4b相比）的大幅增长，这在文献14、18、19中已经报告。3~5mg/L的产量使结构生物学工作需要高蛋白质要求16，20。目前正在研究RAS家族其他成员的其他翻译后修改，以及一般翻译后的其他修改。
对于 KRAS4b 的完整质量分析，0.1 mg/mL 的浓度效果良好。低浓度可以使用，因为宽松的蛋白质配置能够接受费用。然而，在原生质量分析中，如果蛋白质是在其原生折叠构象中，则质量与电荷比较低，并且需要更高的浓度。因此，使用低浓度的蛋白质会导致信号降低，并产生不太可靠的结果。原生质谱的优点是，缓冲液与保留与KRAS4b结合的核苷酸复合物兼容。因此，可以确认蛋白质的核苷酸结合形式（图3D）。与任何质谱分析一样，中性损耗（如甲基组）被观察到（参见在完整质量分析中损失为18的次要物种，图3A+C）。在原生质谱分析中，可以观察到在广泛缓冲液交换后存在具有 Na+或 K+的蛋白质加法。这在图 3D中的 ±23 小峰中显而易见，面板 i-iii）。
我们的SPR数据（图4）表明，在体外重述KRAS4b膜相互作用需要完全处理的KRAS4b形式。在我们的SPR实验中，使用L1芯片捕获脂质体的主要优点是L1芯片表面涂有亲脂组21，从而允许直接捕获脂质体，无需任何进一步修改。SPR 是一种强大的技术，用于研究配体-配体相互作用，提供有关结扎和结合亲和力的信息。正常工作的传感器图应具有达到稳定状态的关联阶段。此最大绑定响应 （Rmax） 提供了交互的测数估计值。解散率应遵循单个指数衰减，假设 1：1 绑定交互22。然而，与膜表面结合的蛋白质通常与更复杂的肌基甲物23和多重亲和力发生，导致具有更复杂的动力学的传感器图。我们尚未设法将动力学拟合到多站点绑定模型中。然而，平衡结合等能可以使用商业评估软件来提供明显的平衡结合亲和力（KD）。无论如何，我们的 SPR 数据清楚地区分了未处理的 KRAS4b 和 KRAS4b-FMe 与脂体结合的方式。因此，SPR仍然提供了一个有用的工具，在破译蛋白质-脂质相互作用。
总体而言，使用SPR，我们证明了膜结合需要完全处理的KRAS4b-FMe。使用这种方法生产完全脱脂和carboxy甲基化形式的KRAS4b，提供了结构生物学20所需的材料数量和质量，膜相互作用的生物物理表征23，以及针对KRAS4b-FMe：RAF复合物的筛选研究，在脂质双层的存在下。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢卡里萨·格罗斯、詹·梅尔哈尔科和马特·德鲁在弗雷德里克国家癌症研究实验室的蛋白质表达实验室的克隆和表达支持。该项目已全部或部分由国家癌症研究所、国家卫生研究院的联邦资金供资，合同号为No.HHSN261200800001E。本出版物的内容不一定反映卫生与公众服务部的观点或政策，也不提及商号、商业产品或组织，也不表示美国政府认可
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural | Eppendorf | 22363204 | |
| 11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials | Thermo Scientific | 30211SS-1232 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | AVANTI POLAR LIPIDS | 850457 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS) | AVANTI POLAR LIPIDS | 840034 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 5427R Centrifuge | Eppendorf | ||
| Acetonitrile, HPLC Grade | Fisher Chemical | A998-1 1L | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 09689-250g | |
| Argon gas | Airgas | ARUP | |
| Assay Plate 384 | CORNING | 3544 | |
| Biacore T200 Instrument | GE Healthcare | ||
| Blue Snap-It Seals, T/S | Thermo Scientific | C4011-54B | |
| Branson Ultrasonic Bath | Thermo Fisher | 15-336-1000 | |
| Cation Exchange Chromatography (CEX) column | GE Healthcare Life Sciences | 29018183 | HiPrep SP Sepharose High Performance |
| CHAPS | Sigma | C3023 | |
| Dyna Pro Plate Reader | Wyatt Technologies | ||
| Exactive Plus EMR Mass Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500Ml | Use Reagent Grade or better |
| Gilson vials 7x14 mm Tubes | GE Healthcare | BR-1002-12 | |
| Glass screw thread vials with PTFE foam liners | Scientific Specialities | B69302 | |
| High speed/benchtop centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 05-112-114D | capable of up to 4,000 xg |
| His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease | Addgene | 92414 | Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY |
| Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column | GE Healthcare Life Sciences | 28-9365-51 | HisPrep FF 16/10 |
| In-House Water Supply, Arium Advance | Sartorius Stedim | Resistivity of 18 MΩ0-cm | |
| Lipid extruder set with holder | AVANTI POLAR LIPIDS | 610023 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | NI-DEWAR | |
| M110-EH microfluidizer | Microfluidics | ||
| MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm | Thermo Scientific | 088645 | |
| MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 Å, 2.1 x 150 mm | Thermo Scientific | 088790 | |
| MagTran software | Thermo Scientific | ||
| Methanol, HPLC Grade | VWR Chemicals | BDH20864.400 | |
| NGC Chromatography System | BioRad | 78880002 | NGC QuestTM 100 Chromatography system |
| Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators | Millipore Sigma | P8849 | |
| Rubber Caps type 3 | GE Healthcare | BR-1005-02 | |
| Series S Sensor Chip L1 | GE Healthcare | 29104993 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | 13-400-519 | Absorbace at 280nm |
| Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL | Millipore Sigma | UFC901008 | PES membrane |
| Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters | Amicon | UFC501024 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima - L80K | capable of 100,000 xg |
| Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System) | Thermo Scientific | ||
| Vortex Genie 2 | Fisher | 12-812 | |
| Water, HPLC Grade | Sigma-Aldrich | 270733-1L | May use in-house water source (see below) |
| Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter | GE Healthcare - Whatman | 6994-2504 | |
| Xcalibur QualBrowser | Thermo Scientific | proteomics software |
References
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