Summary
Prenylation er en vigtig modifikation på ydre membran bindende proteiner. Insekt celler kan manipuleres til fremstilling af farnesylerede og carboxymethylerede KRAS4b i mængder, der muliggør biofysiske målinger af protein-protein-og protein-lipid-interaktioner
Abstract
Protein prenylation er en vigtig modifikation, der er ansvarlig for at målrette proteiner til intracellulære membraner. KRAS4b, som er muteret i 22% af de menneskelige kræftformer, behandles ved farnesylering og carboxymethylering på grund af tilstedeværelsen af et ' CAAX ' boks motiv ved C-terminalen. En konstrueret og system blev brugt til at udtrykke farnesylated og carboxymethylated KRAS4b i insekt celler og er blevet beskrevet tidligere. Her beskriver vi den detaljerede, praktiske rensning og biokemiske karakterisering af proteinet. Specifikt, affinitet og ionbytningskromatografi blev brugt til at rense proteinet til homogenitet. Intakt og Native massespektrometri blev anvendt til at validere den korrekte modifikation af KRAS4b og til at verificere nukleotidbinding. Endelig blev membran Association af farnesylated og carboxymethylated KRAS4b til Liposomer målt ved hjælp af overflade Plasmon resonansspektroskopi.
Introduction
Posttranslationelle modifikationer spiller en central rolle i definitionen af proteiners funktionelle aktivitet. Ændringer såsom fosforylering og glykosylering er veletablerede. Lipid modifikationer er mindre velkarakteriseret, dog. Det anslås, at så meget som 0,5% af alle cellulære proteiner kan være prenylated1. Prenylation er overførslen af en 15-Carbon at eller en 20-Carbon geranylgeranyl lipid kæde til en acceptor protein, der indeholder caax Motif2. Prenylated proteiner har været impliceret i progression af flere menneskelige sygdomme, herunder for tidlig aldring3, Alzheimers4, kardiel dysfunktion5, choroideremia6, og kræft7. De små GTPases, HRAS, NTM og KRAS1, nukleare lamininer og kinetochores cenp-E og F er farnesylerede proteiner under basal tilstand. Andre små GTPases, nemlig RhoA, RhoC, Rac1, CDC-42, og RRAS er geranylgeranylated8, hvorimod rhob kan være farnesylated eller geranylgeranylated9.
Den lille GTPase KRAS4b fungerer som en molekylær switch, hovedsagelig sender ekstracellulære vækstfaktor signalering til intracellulære signal transduktionsveje, der stimulerer cellevækst og spredning, via flere protein-protein interaktioner. Der er to centrale aspekter af KRAS4b biokemi, der er afgørende for dens aktivitet. For det første er protein cyklusserne mellem et inaktivt BNP og en aktiv GTP-bundet tilstand, hvorved det aktivt engagerer sig i effektorer. For det andet dirigere en C-terminale poly-lysin-region og en farnesyleret og carboxymethyleret cystein direkte proteinet til plasma membranen, hvilket muliggør rekruttering og aktivering af downstream-effektorer. Mutant KRAS4b er en onkogene driver i bugspytkirtlen, kolorektal, og lungekræft10, og som sådan, terapeutisk intervention ville have en enorm klinisk fordel. Fremstilling af autentisk modificeret rekombinant protein, der er farnesyleret og carboxymethyleret, vil muliggøre biokemisk screening ved hjælp af KRAS4b i kombination med membran surrogater såsom Liposomer eller lipid nanodiske11,12.
Farnesyltransferase (FNT) katalyserer tilsætning af at-pyrophosphat til C-terminalens cystein i caax-motivet i KRAS4b. Efter prenylering handles proteinet til endoplasmatiske reticulum (er), hvor RAS-konverterende enzym (RCE1) kløver de tre C-terminale rester. Det sidste trin i forarbejdningen er methylering af den nye C-Terminal farnesylcystein rest af ER membran protein, isoprenylcystein carboxylgrupper methyltransferase (ICMT). Udtryk for rekombinant KRAS4b i E. coli resulterer i produktion af et umodificeret protein. Tidligere forsøg på at producere forarbejdede KRAS4b har været begrænset på grund af utilstrækkelige udbytter for strukturelle eller Drug screening forsøg eller har undladt at rekapitulere den indfødte fuld længde modne protein13,14. Protokollen præsenteres her udnytter en manipuleret baculovirus-baserede insekt celle ekspressionssystem og rensning metode, der genererer højt renset, fuldt forarbejdet KRAS4b på udbytter af 5 mg/L cellekultur.
Omhyggelig protein karakterisering er afgørende for at validere kvaliteten af rekombinante proteiner forud for påbegyndelse af strukturel biologi eller Drug screening undersøgelser. To nøgleparametre for fuldt forarbejdet KRAS4b er validering af den korrekte prenyl modifikation og tilgængeligheden af farnesylated og carboxymethylated C-Terminus (FMe) for interaktion med membran erstatninger eller lipider. Elektro spray ioniserings massespektrometri (ESI-MS) af KRAS4b-FME blev anvendt til at måle molekylvægten og bekræfte tilstedeværelsen af at-og natriumcarboxymethylcellulose-modifikationer. Native massespektrometri, hvor prøverne sprøjtes med ikke-denatureringsmidler, blev brugt til at påvise, at KRAS4b-FMe også var bundet til sin BNP-cofactor. Endelig blev overflade Plasmon resonansspektroskopi anvendt til at måle den direkte binding af KRAS4b-FMe med immobiliserede Liposomer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. protein rensning
- Forbered buffere A – H, som vist i tabel 1.
| Buffer løsning | Buffering agent (alle 20 mM) | pH | NaCl (mM) | imidazol (mM) | MgCl2 | TCEP |
| A | HEPES | 7,3 | 300 | - | 5 | 1 |
| B | HEPES | 7,3 | 300 | 35 | 5 | 1 |
| C | HEPES | 7,3 | 300 | 500 | 5 | 1 |
| D | Mes | 6,0 | 200 | - | 5 | 1 |
| E | Mes | 6,0 | - | - | 5 | 1 |
| F | Mes | 6,0 | 100 | - | 5 | 1 |
| G | Mes | 6,0 | 1000 | - | 5 | 1 |
| H | HEPES | 7,3 | 300 | - | 1 | 1 |
- Klargør rense materialerne (Se tabel over materialer): cocktail uden EDTA eller andre chelatere immobiliseret metalaffinitets kromatografi (IMAC) kolonne; kolonne for kation udvekslings kromatografi (CEX); 0,45 μm sprøjte filter; 2 M imidazol (pH = 7,5); ultracentrifuge i stand til 100.000 x g; høj hastighed stationære centrifuge i stand til 4.000 x g; centrifugal filterenheder (10 KDa NMWL); Spektrofotometer, som kan læses ved 280 Nm His6-tobak etch virus (TEV) protease; og kromatografi instrumentering, som kan blande to bufferopløsninger, anvende løsninger på kolonner, oprette forløbs elutioner fra kolonne og indsamle brøker fra kolonner.
- Tø celler fra ~ 2 L af insekt cellekultur tidligere opbevaret ved-80 °C eller bruge friskhøstede celler. Se Gillette et al. 201915 for detaljer om TNI. FNL insekt cellelinje og udtryks protokoller. Resuspender forsigtigt cellerne med 200 mL buffer A tilsat 1:200 v/v proteasehæmmer uden at indføre luft eller skabe skum.
Bemærk: trin 1,3 og efterfølgende trin (undtagen som anført) skal udføres ved stuetemperatur (~ 22 °C). Det er vigtigt, at prøven er homogen for at muliggøre fuldstændig lysis i næste trin. - Lyse celle pellet i en microfluidizer på 7.000 psi for to passerer eller i et tilsvarende lysis system. Alternative metoder til lysis er ikke blevet udforsket.
- Afklaring insekt celle lysater er problematisk på grund af tilstedeværelsen af forbindelser, der tilstoppe filtre. Således, ultracentrifugering (100.000 x g for 30 min ved 4 °c) er meget vigtigt. En hvid lipid-rester på overfladen af supernatanten bør undgås og kan fjernes eller reduceres ved hjælp af vatpinde. Filtrer den deanterede supernatanten gennem et 0,45 μm PES-filter. Brug den afklarede prøve straks eller Opbevar ved-80 °C.
Bemærk: rest koncentrations blokke filtrerer hurtigt, og mange filtre kan være nødvendige. Undladelse af at reducere mængden af dette materiale vil føre til høj kolonne tilbage tryk i efterfølgende trin. - Fastlæg mængden af det afklarede lysstof, og Juster prøven til 35 mM imidazol ved tilsætning af 2 M imidazolbestand. Prøven belastes med 3 mL/min på en 20 mL IMAC-søjle (HisPrep FF 16/10 kolonne), der er præ-ækvibreret i buffer B for tre kolonne volumener (CVs).
- Selvom målproteinet typisk er kvantitativt adsorbet til søjlen, er det bedst at indsamle kolonne strømmen til efterfølgende analyse. Kolonnen vaskes, indtil ABS280 når en stabil baseline (< 100 Milli absorbans enheder [mAU]) med buffer B ved 3 ml/min for 20 ml (1 CV) og derefter for ~ 3 CV ved 4 ml/min for resten af vaske trinnet. Typisk er 60 – 80 mL buffer B nødvendig for at opnå baseline absorbans.
- Elute proteinet med en 400 mL (20 CV) gradient fra buffer B til buffer C ved opsamling af 8 mL fraktioner. Typisk målprotein elutter i den første halvdel af gradient (figur 1A; ikke alle senere fraktioner er vist).
- Analysere protein fraktioner ved hjælp af SDS-side/Coomassie farvning. Pool peak fraktioner og dialysere puljen natten over mod 2 L buffer D ved 4 °C.
Bemærk: lav pH-værdi er afgørende for at sikre proteinbinding i næste trin. Men pH-ændringen i denne dialyse sker langsomt, og dette er et bekvemt skridt for natten inkubation. Alternative buffer udvekslings strategier (f. eks. højere buffer koncentration for at fremskynde pH-ændringen) er ikke blevet undersøgt. Proteinet vil begynde langsomt at udfælde over tid ved lavere pH og lavere saltkoncentrationer og en lille mængde nedbør er normal i dette trin. På grund af dette undgår vi at udskifte bufferen til den 100 mM NaCl, som er nødvendig for binding til den næste kolonne under dialyse. I stedet anvendes en NaCl-koncentration på 200 mM til dialyse, og proteinet fortyndes til 100 mM (se nedenfor) umiddelbart før påføring på søjlen. Vi har ikke undersøgt, om denne nedbør er specifik for KRAS4b, men det protein, der udfældning er blevet bekræftet som KRAS4b-FMe. Derfor foreslår vi at bruge den højere NaCl-koncentration i dialyse bufferen til ethvert protein af interesse som en sikkerhedsforanstaltning, indtil stabiliteten af målproteinet i bindings bufferen kan bestemmes. - Fjern prøven fra dialyse, og centrifuger ved 4.000 x g i 10 minutter for at fjerne bund fælden. Den endelige dialyseret, afklaret prøve på dette tidspunkt er stadig ofte uklar, men kan anvendes uden yderligere behandling på den efterfølgende CEX kolonne.
- Forbered en 20 mL kation udvekslings kolonne (Se tabel over materialer) ved at vaske med tre CV'er af buffer G, derefter med tre CV'er af buffer F.
Bemærk: Selvom vi ikke omhyggeligt har evalueret andre harpiks, har flere kolleger fundet dårlig opløsning med andre harpiks end SP Sepharose højtydende harpiks. - 20 mL af den dialyserede prøve fortyndes til en endelig NaCl-koncentration på 100 mM ved tilsætning af 20 mL buffer E, og den fortyndede prøve anvendes på kation udvekslings søjlen.
- Fortsæt med at indlæse kolonnen ved at tilføje frisk fortyndede prøver fremstillet som beskrevet ovenfor til belastnings røret, da den foregående fortynding nærmer sig enden af lasten.
Bemærk: fortynding af hele prøven på en gang til 100 mM NaCl har resulteret i betydeligt tab af målprotein på grund af nedbør. - Kolonnen vaskes til baseline ABS280 med buffer F. Dette kræver typisk 3 CV. Proteinet eluppes fra søjlen under en 400 mL (20 CV) gradient fra buffer F til 65% buffer G, indsamlet i 6 mL fraktioner (figur 1B).
- Fortsæt med at vaske kolonnen for yderligere 1,5 CV (65% buffer G), når forløbet er færdigt. Vælg positive fraktioner baseret på både SDS-PAGE/Coomassie Blue Stain-analyse og inspektion af UV-spor af kromatogrammet.
Bemærk: UV-sporet indeholder typisk fem toppe. Begyndende ved lavere saltkoncentrationer, den oprindelige peak er normalt uforarbejdede og/eller proteolyzed protein. Den anden og tredje toppe er en blanding af to former for forarbejdet protein: den anden top er primært en farnesylated mellemprodukt (FARN), mens den tredje er primært den fuldt forarbejdede FMe protein af interesse. Toppe fire og fem repræsenterer His6-MBP-KRAS4b fusions proteiner (alle proteinerne er i dette format på dette tidspunkt, da der ikke er forekommet TEV-fordøjelse). Disse er ikke N-acetyleret ved N-Terminus og er farnesylated (peak fire) og farnesylated og carboxymethylated (peak fem) ved C-Terminus. Som peak to og Peak fire vil producere identiske proteiner efter tag fjernelse (dvs., KRAS4b-FARN) disse kan samles på dette tidspunkt, hvis det ønskes. På samme måde kan peak Three og Peak Five kombineres for at producere en enkelt masse KRAS4b-FMe (figur 1B, figur 2). Det tilrådes dog, at denne sammenlægning kun foretages, når karakteren af proteinet i de separate toppe er blevet bekræftet. - Det samlede protein samles i trin 1,15 med His6-TEV proteasehæmmere (~ 200 μg proteasehæmmere/ml prøve.
Bemærk: vi laver His6-TEV proteasehæmmere ved hjælp af plasmid og protokoller tilgængelige fra Addgene (https://www.addgene.org/92414). TEV-fordøje mod buffer A (10 kDa MWCO dialyse slange med mindst 40 mL buffer A pr. mL prøve) i 2 timer ved stuetemperatur og derefter natten over ved 4 °C. - Efter fordøjelse og dialyse indlæses proteinet direkte til en 20 mL IMAC-kolonne, der er ækvibreret med buffer A ved 3 mL/min.
Bemærk: Saml 7 mL fraktioner under hele denne kromatografi, fordi målproteinet har en lav affinitet for søjlen, men måske ikke er helt bundet til harpiksen. Kolonnen vaskes med 3 mL/min med buffer A i alt 3 CV'er, eller indtil der opnås en baseline absorbans. - Målproteinet eluppes med en 5 CV gradient af buffer C fra 0% – 10%, opsamling af 7 mL fraktioner. Som en sikkerhedsforanstaltning kan yderligere bundne proteiner eluppes med 100% buffer C. positive fraktioner identificeres efter analyse af SDS-PAGE (figur 1C). Typisk elutter målprotein ved en lav imidazolkoncentration (dvs. i 0%-10% buffer C gradient), men undertiden elutter i gennemstrømning eller kolonne vask.
- Dialysere den endelige pulje mod buffer H. bestemme proteinkoncentrationen ved spektrofotometri ved 280 Nm.
Bemærk: Sørg for at tage højde for tilstedeværelsen af nukleotid ved bestemmelse af den ekstinktionskoefficient, der skal bruges til denne beregning. - Proteinet kan koncentreres til ~ 2 – 5 mg/mL ved hjælp af en centrifugal filterenhed (10 K NMWL) uden signifikant protein tab. Filter med et 0,22 μM sprøjte filter. Opløsningen måles til en280 for at beregne den endelige proteinkoncentration (figur 1D). Fastfrysnings aliquoter i flydende nitrogen og opbevar frosne prøver ved-80 °C.
Bemærk: det oprensede protein er bundet til BNP. KRAS4b-FMe kan udveksles til GppNHp ved hjælp af tidligere udgivne protokoller16.
2. prøveforberedelse til intakt masse analyse og naturlig masse analyse
- Prøveforberedelse til intakt masse analyse
- Tø protein prøve på is før analyse. Ved intakt masse analyse fortyndes proteinet til 0,1 mg/mL i 20 mM ammoniumbicarbonat (pH = ~ 8,4). Ved naturlig masse analyse fortyndes proteinet til en koncentration på 0,1 mg/mL i 50 mM ammonium acetat (pH = ~ 7,5). Vortex hver prøve for 5-10 s, derefter centrifugeres ved 12.500 x g i 1 min for at pille ethvert fast materiale i opløsningen. Fjern 10 – 20 μL af hver supernatanten og Overfør til et glas Autosampler hætteglas. Hætteglasset stramt for at forhindre kontaminering eller fordampning.
Bemærk: ved enten intakt masse analyse eller naturlig masse analyse kan prøven afsaltes før analyse ved hjælp af et 10 kDa MWCO cellulose membranfilter til buffer udveksling i den endelige fortyndingsbuffer.
- Tø protein prøve på is før analyse. Ved intakt masse analyse fortyndes proteinet til 0,1 mg/mL i 20 mM ammoniumbicarbonat (pH = ~ 8,4). Ved naturlig masse analyse fortyndes proteinet til en koncentration på 0,1 mg/mL i 50 mM ammonium acetat (pH = ~ 7,5). Vortex hver prøve for 5-10 s, derefter centrifugeres ved 12.500 x g i 1 min for at pille ethvert fast materiale i opløsningen. Fjern 10 – 20 μL af hver supernatanten og Overfør til et glas Autosampler hætteglas. Hætteglasset stramt for at forhindre kontaminering eller fordampning.
- Fremstilling af massespektroskopi (EMR) til masse analyse af det udvidede masse område
Bemærk: før du kører en analyse på massespektrometer, skal du sørge for, at det er blevet kalibreret for nylig. Bær også altid handsker og andet personligt beskyttelsesudstyr, som er nødvendigt for at undgå skadelige kemikalier og undgå kontaminerende prøver og opløsningsmidler. Kalibreringen foretages ved hjælp af en kalibreringsopløsning, der er opnået kommercielt, og en 2 mg/mL cæsium iodidopløsning tilberedt in-House.- Åbn analysesoftwaren, og Indlæs den relevante fil med instrument metoden. For intakt masse analyse af KRAS4b proteiner, egnede udgangs parametre er som følger: positiv tilstand af påvisning; tre mikroscanninger, opløsning = 70.000; AGC-mål = 3e6; maksimal integrations tidspunkt = 200 MS; og et scanningsområde = 70 – 1800 forholdet mellem masse og ladning (m/z). For native Mass analyse af KRAS4b proteiner, egnede udgangs parametre er som følger: positiv tilstand af påvisning; 10 mikroscanninger, opløsning = 17.500; in-source kollision-induceret dissociation (CID) = 20 eV; AGC-mål = 3e6; kollisionsenergi (CE) = 20; maksimal integrations tidspunkt = 200 MS; og et scanningsområde = 500 – 10000 m/z.
- Klargøring af kromatografiske opløsningsmidler og kolonne
- Forbered de opløsningsmidler, som er nødvendige for intakt masse analyse. Solvens A er vand med 0,1% myresyre. Solvens B er 80% acetonitril og 0,1% myresyre i vand.
- Forbered de opløsningsmidler, som er nødvendige for naturlig masse analyse. Solvens A er 0,1 M ammonium acetat i vand, og solvens B er vand.
- Når de relevante opløsningsmidler er tilberedt, renses systemet, så slangen fyldes med de rette opløsningsmidler, og alle luftbobler fjernes fra linjerne.
- Installer den relevante kolonne (en omvendt fase kolonne for intakt masse analyse og en kolonne med størrelses udelukkelse for oprindelig masse analyse). For intakt masse analyse er strømningshastigheden 0,5 mL/min, og kolonne temperaturen (ved hjælp af en kolonne varmer) er 50 °C. Ækvibrere søjlen i 15 – 20 minutter. Til naturlig masse analyse er strømningshastigheden 0,25 mL/min.
Bemærk: Overvåg altid kolonnens tilbage tryk for at sikre, at den ikke stiger over den øvre grænse, hvilket kan indikere en tilstoppet linje, eller at kolonne matrixen er kompromitteret. Udskift kolonnen, hvis det er nødvendigt.
- Analyse af prøver
- Placer den forberedte protein prøve i hætteglasset med Autosampler i glasset i det relevante hætteglas rack i LC-systemer Autosampler. Opret en eksempel liste i softwareprogrammet med den relevante instrument metode til den ønskede analyse. Når eksempel listen er fuldført, skal du klikke på knappen Afspil for at starte analysen.
- Der indsprøjtes 1 – 2 μL prøve pr. analyse med et tomt vand før og efter hver prøve for at sikre, at ingen fremførsel er til stede.
Bemærk: den intakte masse analyse er meget anderledes end den oprindelige masse analyse og kræver meget forskellige instrument metodeindstillinger. Dette er fordi med intakt masse analyse, proteinet er "afslappet" i nærværelse af et organisk opløsningsmiddel, og dermed er i stand til at acceptere flere afgifter. Det er lettere at devolute og løse isotop fordelingen af opladnings staterne. Native masse analyse giver en smal opladning fordeling af proteonerne, og baseret på proteinet, kræver forskellige spænding og kollision energi indstillinger.
- Data analyse og protein dekoncentrering
- Eksporter spektret af prøven til software, hvor det kan omdannes til de-indviklede spektrum, der vil vise intakt masse (eller indfødte masse) af proteinet. Den intakte masse vil have en isotop fordeling på grund af den høje overflod af ladede spektral toppe. Den indfødte masse vil typisk have meget få toppe på grund af den lave overflod af de ladede spektral toppe (figur 3D).
- Udvid masse-til-opladnings-forholdet (m/z) for peak d for at bekræfte, at den målte masse er i overensstemmelse med den forventede masse. Lejlighedsvis, på grund af tilsætning af afgifter til proteinet, kan der være en lille variation mellem den forventede molekylvægt (MW) og den observerede MW. Også, som med mange massespektrometri analyser, adkanalerne som natrium kan bidrage til fremkomsten af yderligere toppe i data, selv med omhyggeligt afsaltede prøver. Lavere rigelige toppe med en m/z, der er lavere end forventet er undertiden observeret. Dette skyldes sandsynligvis et neutralt tab, hvilket er tabet af en funktionel gruppe på grund af ioniserings processen.
Bemærk: som forventet vil der være forskelle mellem den intakte masse og de indfødte masse toppe. Den intakte masse display vil vise proteinets forventede MW. Det vil ikke have den ekstra MW af den vedlagte nucleotid eller andre modifikationer. Men den indfødte masse peak vil vise proteinet med eventuelle tilsat nucleotid.
3. validering af KRAS4b-FMe binding til Liposomer
- Klargøring af membran Liposomer
- Forbered en buffer bestående af 20 mM HEPES (pH = 7,3), 150 mM NaCl og 1 mM TCEP.
- Liposome forberedelse materialer omfatter 25 mM 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholin (POPC) og 10 mM 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-Serin (POPS) bestande i chloroform; et lipid ekstruder sæt med en holder og varmeblok; argon gas og flydende nitrogen; et ultralydbad; glas skruegevind hætteglas med PTFE skum liners; og en plade læser, der kan påvise dynamisk lysspredning.
- Tø lipid bestande i chloroform ved stuetemperatur i 30 min. Forbered 1 mL af 5 mM 70:30 POPC: POPS Liposomer ved at citere 106 μL af 25 mM POPC (bestand) og 118 μL af 10 mM POPS (bestand) i et hætteglas.
Bemærk: må ikke alikvot lipider med en plastikspids, fordi chloroform kan opløse visse plastik spidser. - Tørre lipider under en lind strøm af argon gas. Drej langsomt hætteglasset med glas, når du anvender argon-gassen til at danne et tyndt lag tørfilm.
- Put prøver under en vakuum lyophilizer natten over for at fjerne overskydende chloroform.
- Lipiderne rekonstruere ved at tilsætte 1 mL buffer til den tørrede film og vortex blandingerne i 5 min. hydrat lipidblandingerne ved at Rocking i 1 time ved 25 °C.
Bemærk: prøven vil være meget uklar ved tilsætning af bufferen til det tørrede film lag af lipider. - Udfør fem fryse/tø-cyklusser ved skiftevis at placere prøve hætteglasset mellem et isvand (4 °C eller derunder) og et varmt vandbad (25 °C eller højere).
- Sæt prøve hætteglasset i ultralydbadet og sonikerer prøven i ca. 0,5 h, eller indtil prøven bliver halvgennemsigtig.
- Ekstrudler prøverne ved hjælp af lipid ekstruder sættet. Saml ekstruderingskit-kittet som vist i producentens anvisninger. Ekstrudér prøverne ved hjælp af 0,1 μm filterpapir. Læg prøverne i en glassprøjte og fastgør den til den ene ende af ekstruderingapparatet. Tilsæt en tom sprøjte i den anden ende af ekstruderingapparatet. Skub frem og tilbage 10 – 20x, indtil dine prøver bliver helt gennemsigtige.
- Drej slutprøverne i 30 minutter ved 20.000 x g for at fjerne eventuelle store aggregater.
- Brug dynamisk lysspredning (DLS) til at bestemme størrelsen og homogeniteten af liposomerne (valgfrit). Placer 30 μL af liposomerne i en 384-brønd plade læser. Drej pladen ved 1.000 x g i 30 min. Anbring pladen i en plade læser, og saml 10 lyssprednings målinger.
- Kendetegnende KRAS4b-FMe binding til Liposomer via overflade Plasmon resonans (SPR)
- Saml de påkrævede materialer: et SPR-instrument; sensor chip L1; 7 x 14 mm hætteglas rør; og CHAPS.
- Forbered en buffer indeholdende 20 mM HEPES (pH = 7,3), 150 mM NaCl, 1 mM TCEP. Forbered en 2:1 fortyndings serie af KRAS4b-FMe fra 60 μM – 0,06 μM i et samlet volumen på 200 μL (10 titreringer i alt). De endelige fortyndede prøver overføres til hætte glasrør (Se tabel over materialer), Anbring hætteglassene i et stativ, og sæt prøverne i spr-instrumentet.
- Sæt L1-sensor chippen i SPR-instrumentet. Fastgør bufferen og Prime systemet med buffer i 7 min.
- Konfigurer en automatiseret metode på følgende måde:
- Indstil apparatets temperatur til 25 °C.
- Sensor chippen L1 aktiveres ved at skylle den med to 1 min. injektioner af 20 mM CHAPS opløst i vand ved 30 μL/min. strømningshastighed.
- Udfør opstart cyklusser af ti 1 min injektioner af løbe buffer til at Hydrere chip overfladen.
- Sæt liposomerne på sensor chippen L1 ved at indsprøjte liposomerne på strømningscellen (FC)-2 i L1-chippen med 2 min. injektioner ved 5 μL/min. mål for en Capture niveau på mindst ~ 3.000 responsenheder (RUs).
Bemærk: Forøg injektionstiden, indtil du opnår det passende optagelsesniveau.
- Sæt liposomerne på sensor chippen L1 ved at indsprøjte liposomerne på strømningscellen (FC)-2 i L1-chippen med 2 min. injektioner ved 5 μL/min. mål for en Capture niveau på mindst ~ 3.000 responsenheder (RUs).
- Injicer tre cyklusser med buffer over både FC-1 og FC-2 med 1 min. injektioner ved 30 μL/min.
- Injicer de forskellige KRAS4b-FMe titreringer fra den laveste til den højeste koncentrations serie. Injicer proteinerne ved hjælp af 1 min. injektioner for associerings fasen og 2 min. injektioner for dissociations fasen ved 30 μL/min. strømningshastighed over begge FCs.
- Regenerere sensor chippen L1 ved at skylle den med to 1 min injektioner af 20 mM CHAPS ved 30 μL/min.
- Tilpas dataene ved hjælp af SPR-evalueringssoftwaren ved hjælp af en enkelt websteds bindings model for at opnå tilsyneladende bindende tilhørsforhold (Se diskussionsafsnittet for en forklaring af data tilpasning).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En af de største variabler i protokollen er mængden af udtrykt målprotein (His6-MBP-TEV-KRAS4b). Denne protokol blev udviklet ved hjælp af et isolat fra en Trichoplusia ni -cellelinje, TNI-FNL17, tilpasset til suspension vækst og fravænnet fra serum. I betragtning af den brede vifte af resultater, der rapporteres på tværs af de forskellige insekt cellelinjer med det og ekspressionssystem, tilrådes det, at TNI-FNL i det mindste i første omgang anvendes til fremstillet KRAS4b-FME.
Et mørkt protein, der migrerer til ~ 65 kDa, skal være tydeligt i det præciserede lysbillede samt elueringsbrøker (figur 1A). Fusions proteinet bør være et af de to mest fremtrædende farvede bånd i lysatet, mens det andet er den Co-udtrykte FNTA/B, der comigrates på ~ 48 kDa.
Inden for rensning, CEX trin er kritisk af to grunde: 1) det tjener til at reducere omfanget af proteolyse som hypervariable region (HVR) er meget modtagelig, og 2) det beriger for det fuldt forarbejdede protein som angivet i noterne til dette trin i protokollen. Det er imidlertid den mest komplicerede del af protokollen. Dette skyldes, at det forarbejdede protein har tendens til at udfælde ved lavere saltkoncentrationer, selv smeltet til MBP. Heldigvis er dette ikke et alt-eller-ingen fænomen, og det finder også sted lidt langsomt over tid. Protokollen udnytter dette ved dialyzing til 200 mM NaCl forud for CEX trin. På denne koncentration, nedbør var ikke så signifikant som på 100 mM. Derfor er protokollen designet til at begrænse længden af tid, proteinet er i en buffer af denne saltkoncentration. Blandingen af små aliquoter af CEX kolonne belastning med samme volumen af nulsalt buffer umiddelbart før kolonne lastning begrænser eksponeringen (i form af tid) til lave salt forhold og dermed begrænser nedbør. Figur 2A skildrer den mest typiske resultat fra CEX Step, med den mest fremtrædende er peak 3, som indeholder overvejende KRAS4b-FME. Figur 2B skildrer elueringsprofiler, der er blevet observeret for at give en fornemmelse af variabiliteten af procedurens udfald. Fordi disse undertiden kan være misvisende, er det klogt at skabe puljer af alle toppe og gemme disse på-80 °C, indtil toppen af interessen er blevet fuldt renset og bestået kvalitetstests.
Som nævnt i protokollen, brugen af HiPrep SP Sepharose højtydende kolonner synes at være afgørende for at opnå den adskillelse, der er observeret i figur 2A. Selv om det endnu ikke er klart, hvorfor peak tre ofte havne farnesylated-kun KRAS4b ud over den ønskede farnesylated og carboxymethylated KRAS4b, den dårlige opløsning andre har rapporteret med alternative CEX harpiks (personlig kommunikation) tyder dette fænomen er ikke udelukkende et resultat af Ioniske interaktioner.
Typiske udbytter varierede fra 1 – 6 mg/L, med 3 – 5 mg/L opnået hyppigt (> 90%, n > 50). Intakt masse analyse ved hjælp af ESI-MS bekræftede proteiners præcise molekylmasse og dermed den relative andel af farnesylering og/eller carboxymethylering (figur 3). Mens typiske endelige partier indeholdt nogle detekterbare KRAS4b-FARN, var denne andel mindre end 15% i form af peak højde fra denne analyse. Figur 3A viser repræsentative data for KRAS4b, der ikke er prenylated udtrykt i E. coli, figur 3B viser KRAS4b-FME elueret i toppe 3 og 5 fra CEX, og figur 3C viser KRAS4b-farn elueret i Peak 2 fra CEX.
Massen af den KRAS4b, som er bundet til BNP, blev også fastlagt for disse prøver ved hjælp af naturlig masse analyse (figur 3D). Udskiftning af prøverne i ammonium acetat sikrede en "blødere" ionisering og det indfødte kompleks forblev intakt, hvilket giver bekræftelse af karakteren af nucleotid bundet til KRAS4b.
For at validere, at farnesylation og carboxymethylering er påkrævet for KRAS4b-FMe at binde til membraner, vi målte samspillet mellem KRAS4b-FMe til Liposomer via SPR. Som vist i figur 4, KRAS4b-FME bundet til liposomerne mens uforarbejdet KRAS4b ikke, hvilket viser, at forarbejdet KRAS4b-FME er nødvendig for interaktion med membraner.
Figur 1: SDS-side geler i rensningsprocessen. (A) iMac Capture fra lysate. FNTA/B er de mørke bands, der migrerer på ~ 48 kDa, og His6-MBP-TEV-KRAS4b er det mørke band, der migrerer på ~ 67 kDa. M = protein molekylvægt stige; T = totalt protein; L = tydeliggjort lysate/kolonne belastning; F = spalte gennemstrømning. Fraktioner eluppes med en stigende imidazol-koncentrations gradient. B) CEX-fraktioner mærket 1 – 5 svarer til topfraktioner fra elueringstoppene, der er vist i kromatogrammet i figur 2. C) TEV-fordøjelse og anden iMac. C = pulje fra CEX Step præ-TEV spaltning; L = Indlæs prøve post-TEV spaltning. De arter af interesse er mærket. D) et og fem mikrogram endeligt KRAS4b-FME-protein. Geler afbildet er repræsentative resultater fra flere produktioner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: CEX kromatografi elueringsprofil. (A) den typiske CEX elueringsprofil har fire til fem store toppe. Bortset fra peak 1, som typisk er en proteolyseret form af uforarbejdede KRAS4b mangler de fire C-Terminal aminosyrer, de fire toppe nummereret 2 til 5 i panelet resultatet af variabilitet i behandlingen af N-og C-Termini af proteinet, med progressivt mere positivt ladede molekyler Elueringen senere i gradienten (Se trin 1,15). B) yderligere eksempler på CEX elueringsprofiler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: intakt og Native massespektrometri analyse af rensede KRAS4b proteiner. Intakt massespektrum og devoluted peak Analysis resultater for (A) uforarbejdede KRAS4b 2-185, forventet MW = 21.064; B) KRAS4b 2-185-FME, toppe 3 og 5 fra CEX, forventet MW = 21.281; C) KRAS4b 2-185-farn, Peak 2 fra CEX, forventet MW = 21.267. D) Native masse devolveret peak analyse for E. coli udtrykt KRAS4b 2-185 (i), kras-fme 2-185 (II), og Kras-farn 2-185 (III), alle i BNP-nucleotid bundne tilstand. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: KRAS4b-FMe binding til Liposomer via SPR. Størrelsesfordeling af 70:30 POPC: POPS Liposomer opnået ved DLS. (A) DLS-data viser en gennemsnitlig diameter på ~ 200 Nm for liposomerne med en 18% polydispersitet. (B) spr bindende sensorgrammer på 60 – 0,6 μM KRAS4b-fme til 70:30 Liposomer fanget på en sensor L1 chip. (C) pasform af Steady State binding isotermer afledt af spr data leverede en tilsyneladende Kd af 1 μM KRAS4b-FME binding til Liposomer. Den bindende respons er normaliseret ved at dividere med overfladen Capture niveau af Liposomer. D) spr-bindings kinetik på 60 – 0,6 μM KRAS4b-2-185 til 70:30 Liposomer fanget på en sensor L1-chip. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som nævnt i afsnittet om repræsentative resultater er det mest kritiske trin i rensningen håndteringen af prøven i den tid, det er i lavere salt. Begrænse den tid, at prøven er udsat for mindre end 200 mM NaCl vil bidrage til at reducere nedbør og øge prøve udbyttet. Det kan være vanskeligt at fortolke resultaterne af CEX, hvis profilen ikke svarer til forventningerne (Se figur 2). Indtil protokollen er blevet rutine, tilrådes det, at CEX elueringsfraktioner, der ikke videreføres, opbevares ved-80 °C, indtil den intakte masse analyse er afsluttet for at sikre, at det korrekte materiale er blevet videreført. Uden for de ovenfor anførte parametre for CEX-trinnet er protokollen relativt let at ændre ved lysis-og IMAC-trinnene. Det er også værd at bemærke, at der ikke er nogen størrelses udelukkelse kromatografi (køn) separation trin i protokollen. Dette er udeladt på grund af tab, vi har observeret i den tidlige metodeudvikling (ikke offentliggjorte resultater). Det er bemærkelsesværdigt, at disse tab ikke observeres, når proteinet er i kompleks med nanoskiver, hvilket tyder på tab i fraværet af lipider skyldes hydrofobe interaktion mellem proteinet og harpiks.
Denne metode repræsenterer en stor stigning i både mængden (> 10x højere) og kvalitet (i forhold til bona fide forarbejdet KRAS4b udtrykt i humane celler), der er blevet rapporteret i litteraturen14,18,19. Udbyttet på 3 – 5 mg/L har muliggjort strukturel biologi indsats, der kræver høje protein krav16,20. Yderligere posttranslationelle ændringer for andre medlemmer af RAS-familien samt yderligere posttranslationelle ændringer i almindelighed undersøges i øjeblikket.
For intakt masse analyse af KRAS4b, en koncentration på 0,1 mg/mL fungerer godt. Lavere koncentrationer kan bruges på grund af evnen af den afslappede protein konfiguration til at acceptere afgifter. Men i native masse analyse, hvor proteinet er i sin indfødte foldet kropsbygning, der er lavere masse-til-ladning nøgletal og højere koncentrationer er påkrævet. Således, ved hjælp af lavere koncentrationer af protein resulterer i et fald i signalet og producerer mindre pålidelige resultater. Fordelen ved Native massespektrometri er, at bufferen er kompatibel med at bevare komplekset af nucleotid bundet til KRAS4b. Det er derfor muligt at bekræfte de nukleotidbundne former af proteinerne (figur 3D). Som ved enhver massespektrometri-analyse observeres neutrale tab (såsom en methylgruppe) (Se mindre arter med et tab på 18 i intakt masse analyse, figur 3a – C). I native massespektrometri analyse, protein adkanalerne med na+ eller K+, til stede efter omfattende buffer udveksling, kan observeres. Dette er tydeligt i de mindre toppe af + 23 i figur 3D, paneler i-III).
Vores SPR data (figur 4) viser, at den fuldt behandlede form af KRAS4b er nødvendig for at rekapitulere KRAS4b-membran interaktion in vitro. En stor fordel ved at bruge L1-chippen til at indfange liposomerne i vores SPR-eksperimenter er, at L1-chip overfladen er dextran belagt og modificeret med lipofile grupper21, hvilket giver mulighed for direkte erobrings af fedt somerne uden yderligere modifikation. SPR er en kraftfuld teknik til at studere ligand-ligand interaktioner, der giver oplysninger om støkiometri og binding affinitet. Sensorgrammer, der fungerer korrekt bør have en forening fase, der når en steady state. Dette maksimale bindings respons (RMax) giver et estimat af støkiometri for interaktionen. Dissociations hastigheden bør følge en enkelt eksponentiel forfald, under forudsætning af en 1:1 bindende interaktion22. Imidlertid forekommer proteiner, der binder til en membran overflade, normalt med mere komplekse støkiometries23 og multiple tilhørsforhold, som resulterer i sensorgrammer med mere komplekse kinetik. Vi har ikke formået at passe kinetikken til en Multisite binding model. Ligevægts bindende isotermer kan dog være egnede til at bruge kommerciel evalueringssoftware til at tilvejebringe en tilsyneladende ligevægts bindingsaffinitet (KD). Uanset, vores SPR data klart differentierer mellem, hvordan uforarbejdede KRAS4b og KRAS4b-FMe binde til Liposomer. Således, spr stadig giver et nyttigt værktøj i decifrere protein-lipid interaktioner.
Kollektivt, ved hjælp af SPR vi demonstrere, at fuldt forarbejdet KRAS4b-FMe er nødvendig for membran binding. Produktion af den fuldt farnesylerede og carboxymethylerede form af KRAS4b ved hjælp af denne fremgangsmåde giver mængden og kvaliteten af materiale, som er nødvendige for strukturel biologi20, biofysiske karakterisering af membran interaktioner23, og screening undersøgelser mod KRAS4b-FME: RAF kompleks i nærværelse af lipid bilayers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi anerkender kloning og ekspression støtte fra Carissa Grose, Jen Melhalko, og Matt Drew i protein ekspression laboratorium, Frederick nationale laboratorium for kræftforskning. Dette projekt er blevet finansieret helt eller delvist med føderale midler fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, under kontrakt nr. HHSN261200800001E. Indholdet af denne publikation ikke nødvendigvis afspejler de synspunkter eller politikker af Department of Health and Human Services, heller ikke nævner handelsnavne, kommercielle produkter, eller organisationer indebærer godkendelse af den amerikanske regering
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural | Eppendorf | 22363204 | |
| 11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials | Thermo Scientific | 30211SS-1232 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | AVANTI POLAR LIPIDS | 850457 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS) | AVANTI POLAR LIPIDS | 840034 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 5427R Centrifuge | Eppendorf | ||
| Acetonitrile, HPLC Grade | Fisher Chemical | A998-1 1L | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 09689-250g | |
| Argon gas | Airgas | ARUP | |
| Assay Plate 384 | CORNING | 3544 | |
| Biacore T200 Instrument | GE Healthcare | ||
| Blue Snap-It Seals, T/S | Thermo Scientific | C4011-54B | |
| Branson Ultrasonic Bath | Thermo Fisher | 15-336-1000 | |
| Cation Exchange Chromatography (CEX) column | GE Healthcare Life Sciences | 29018183 | HiPrep SP Sepharose High Performance |
| CHAPS | Sigma | C3023 | |
| Dyna Pro Plate Reader | Wyatt Technologies | ||
| Exactive Plus EMR Mass Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500Ml | Use Reagent Grade or better |
| Gilson vials 7x14 mm Tubes | GE Healthcare | BR-1002-12 | |
| Glass screw thread vials with PTFE foam liners | Scientific Specialities | B69302 | |
| High speed/benchtop centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 05-112-114D | capable of up to 4,000 xg |
| His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease | Addgene | 92414 | Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY |
| Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column | GE Healthcare Life Sciences | 28-9365-51 | HisPrep FF 16/10 |
| In-House Water Supply, Arium Advance | Sartorius Stedim | Resistivity of 18 MΩ0-cm | |
| Lipid extruder set with holder | AVANTI POLAR LIPIDS | 610023 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | NI-DEWAR | |
| M110-EH microfluidizer | Microfluidics | ||
| MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm | Thermo Scientific | 088645 | |
| MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 Å, 2.1 x 150 mm | Thermo Scientific | 088790 | |
| MagTran software | Thermo Scientific | ||
| Methanol, HPLC Grade | VWR Chemicals | BDH20864.400 | |
| NGC Chromatography System | BioRad | 78880002 | NGC QuestTM 100 Chromatography system |
| Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators | Millipore Sigma | P8849 | |
| Rubber Caps type 3 | GE Healthcare | BR-1005-02 | |
| Series S Sensor Chip L1 | GE Healthcare | 29104993 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | 13-400-519 | Absorbace at 280nm |
| Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL | Millipore Sigma | UFC901008 | PES membrane |
| Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters | Amicon | UFC501024 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima - L80K | capable of 100,000 xg |
| Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System) | Thermo Scientific | ||
| Vortex Genie 2 | Fisher | 12-812 | |
| Water, HPLC Grade | Sigma-Aldrich | 270733-1L | May use in-house water source (see below) |
| Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter | GE Healthcare - Whatman | 6994-2504 | |
| Xcalibur QualBrowser | Thermo Scientific | proteomics software |
References
- Cox, A. D., Der, C. J. Protein prenylation: more than just glue. Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).
- Zhang, F. L., Casey, P. J. Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences. Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).
- Hottman, D. A., Li, L. Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer's disease. Molecular Neurobiology. 50 (1), 177-185 (2014).
- Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. HDL and cognition in neurodegenerative disorders. Neurobiology of Disease. 72, Pt A 22-36 (2014).
- Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms. Annals of Medicine. 35 (6), 398-403 (2003).
- Kohnke, M., et al. Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease. PLoS One. 8 (12), 81758 (2013).
- Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. Targeting protein prenylation for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (11), 775-791 (2011).
- Kho, Y., et al. A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12479-12484 (2004).
- Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB. Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 7864-7868 (1995).
- Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. Dragging ras back in the ring. Cancer Cell. 25 (3), 272-281 (2014).
- Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics. Chemical Reviews. 117 (6), 4669-4713 (2017).
- Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles. Journal of Visualized Experiments. (66), e3910 (2012).
- Dementiev, A. K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation. Protein Expression and Purification. 84 (1), 86-93 (2012).
- Lowe, P. N., et al. Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems. Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1672-1678 (1991).
- Gillette, W., et al. Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System. Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).
- Agamasu, C., et al. KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner. Biophysical Journal. 116 (6), 1049-1063 (2019).
- Talsania, K., et al. Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies. Genes. 10 (2), 79 (2019).
- Spencer-Smith, R., et al. Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site. Nature Chemical Biology. 13 (1), 62-68 (2016).
- Lowe, P. N., et al. Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system. Biochemical Society Transactions. 20 (2), 484-487 (1992).
- Dharmaiaha, S., et al. Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDEδ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6766-6775 (2016).
- Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore. Analytical Biochemistry. 328 (2), 233-243 (2004).
- Fisher, R. J., et al. Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (2), 472-484 (2006).
- Lakshman, B., et al. Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane. Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).
