Summary
プレニル化は、末梢膜結合タンパク質に対する重要な修飾である。昆虫細胞を操作して、タンパク質とタンパク質と脂質の相互作用の生物物理学的測定を可能にする量でファルネシル化およびカルボキシメチル化KRAS4bを生成することができます
Abstract
タンパク質のプレニル化は、タンパク質を細胞内膜に標的化する重要な修飾です。ヒト癌の22%で変異しているKRAS4bは、C末端に「CAAX」ボックスモチーフの存在によるファルネシル化およびカルボキシメチル化によって処理される。工学的なバキュロウイルス系は、昆虫細胞においてファルネシル化およびカルボキシメチル化KRAS4bを発現するために使用され、以前に説明されている。ここでは、タンパク質の詳細かつ実用的な精製および生化学的特性評価について説明する。具体的には、アフィニティーおよびイオン交換クロマトグラフィーを使用して、タンパク質を均質化して精製した。無傷および天然質量分析法は、KRAS4bの正しい修飾を検証し、ヌクレオチド結合を検証するために使用された。最後に、ファルネシル化およびカルボキシメチル化KRAS4bとリポソームの膜会合を、表面プラズモン共鳴分光法を用いて測定した。
Introduction
翻訳後修飾は、タンパク質の機能活性を定義する上で重要な役割を果たします。リン酸化やグリコシル化などの改変は十分に確立されている。しかし、脂質修飾はあまりよく特徴付けされていない。すべての細胞タンパク質の0.5%が1を前もって打ち出す可能性があると推定されている。前駆処理は、CAAXモチーフ2を含むアクセプタータンパク質への15炭素ファルネシルまたは20炭素ゲラニルゲルニル脂質鎖の転写である。前駆加タンパク質は、早期老化3、アルツハイマー病4、心機能障害5、脈支痛症6、および癌7を含むいくつかのヒト疾患の進行に関与している。小型GTPPas、HRAS、NRAS、およびKRAS1、核ラミニン、およびキネトコレスCENP-EおよびFは、基底状態下でファルネシル化タンパク質である。他の小さなGTPアーゼ、すなわちRhoA、RhoC、Rac1、cdc-42、およびRRASはゲラニエルゲラニ化8であるのに対し、RhoBはファルネシル化またはゲラニエルゲラ化9であり得る。
この小さなGTPe KRAS4bは分子スイッチとして機能し、本質的に細胞内シグナル伝達シグナル伝達を複数のタンパク質間相互作用を介して細胞増殖および増殖を刺激する細胞内シグナル伝達経路に伝達する細胞外増殖因子を伝達する。KRAS4b生化学には、その活動に不可欠な2つの重要な側面があります。まず、非アクティブなGDPと活性GTP結合状態との間のタンパク質サイクルは、エフェクターと積極的に関与する。第二に、C末端ポリリジン領域とファルネシル化およびカルボキシメチル化システインがタンパク質を形質膜に導き、下流エフェクターのリクルートおよび活性化を可能にする。変異型KRAS4bは膵臓癌、大腸癌、肺癌10における発癌性ドライバであり、そのように、治療的介入は巨大な臨床的利益を有するであろう。ファルネシル化およびカルボキシメチル化された本格的に修飾された組換えタンパク質の製造は、リポソームまたは脂質ナノディスク11、12などの膜サロゲートと組み合わせてKRAS4bを用いた生化学的スクリーニングを可能にするであろう。
ファルネシルトランスフェラーゼ(FNT)は、KRAS4bのCAAXモチーフにおけるC末端システインにファルネシルピロリン酸を添加することを触媒する。前駆付後、タンパク質は小胞体(ER)に入れ込み、そこでRas変換酵素(RCE1)が3つのC末端残基を切断します。処理の最終工程は、ER膜蛋白質による新しいC末端ファルネシルシステイン残基のメチル化、イソプレニルシステインカルボキシルメチルトランスフェラーゼ(ICMT)である。大腸菌における組換えKRAS4bの発現は、非修飾タンパク質の産生をもたらす。処理されたKRAS4bを製造する以前の試みは、構造または薬物スクリーニング実験のための不十分な収率のために制限されているか、または天然の全長成熟タンパク質13、14を再現できなかった。ここで提示されるプロトコルは、5mg/Lの細胞培養の収率で高度に精製され、完全に処理されたKRAS4bを生成する、工学的なバキュロウイルスベースの昆虫細胞発現系および精製方法を利用する。
慎重なタンパク質特性評価は、構造生物学や薬物スクリーニング研究に着手する前に、組換えタンパク質の品質を検証するために不可欠です。完全に処理されたKRAS4bの2つの主要なパラメータは、膜置換または脂質との相互作用のための正しいプレニル修飾およびファルネシル化およびカルボキシメチル化C末端(FMe)の利用可能性の検証である。KRAS4b-FMeのエレクトロスプレーイオン化質量分析法(ESI-MS)を用いて分子量を測定し、ファルネシルおよびカルボキシメチル修飾の存在を確認した。サンプルに非変性溶媒を噴霧する天然質量分析法は、KRAS4b-FMeがGDP補因子にも結合していることを実証するために使用された。最後に、表面プラズモン共鳴分光法を用いて、固定化リポソームによるKRAS4b-FMeの直接結合を測定した。
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Protocol
1. タンパク質精製
- 表 1に示すように、バッファー A ~ H を準備します。
| バッファーソリューション | バッファリング剤(全20mM) | pH | NaCl (mM) | イミダゾール (mM) | MgCl2 | TCEP |
| A | Hepes | 7.3 | 300 | - | 5 | 1 |
| B | Hepes | 7.3 | 300 | 35 | 5 | 1 |
| C | Hepes | 7.3 | 300 | 500 | 5 | 1 |
| D | Mes | 6.0 | 200 | - | 5 | 1 |
| E | Mes | 6.0 | - | - | 5 | 1 |
| F | Mes | 6.0 | 100 | - | 5 | 1 |
| G | Mes | 6.0 | 1000 | - | 5 | 1 |
| H | Hepes | 7.3 | 300 | - | 1 | 1 |
- 精製材料を調製する(材料表を参照):EDTAまたは他のキレート剤を使用しないプロテアーゼ阻害剤カクテル;固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)カラム;カチネーション交換クロマトグラフィー(CEX)カラム;0.45 μm シリンジフィルター;2 M イミダゾール (pH = 7.5);100,000 x gの可能な超遠心分離機;4,000 x gが可能な高速ベンチトップ遠心分離機;遠心フィルターユニット(10 KDa NMWL);280 nmで読み取ることができる分光光度計;ヒス6タバコエッチングウイルス(TEV)プロテアーゼ;2つのバッファーソリューションを混合し、カラムにソリューションを適用し、カラムから勾配リューションを作成し、カラムから分数を収集することができるクロマトグラフィー計測器。
- 昆虫細胞培養物の~2Lから細胞を解凍し、以前に-80°Cで保存するか、収穫したばかりの細胞を使用する。Tni.FNL昆虫細胞株および発現プロトコルの詳細については、ジレットら2019 201915を参照してください。空気を導入したり、泡を作成することなく、1:200 v/vプロテアーゼ阻害剤を追加して、バッファAの200 mLで細胞を慎重に再スレド。
注:ステップ1.3以降のステップ(特に記載を除く)は、室温(〜22°C)で行う必要があります。次のステップで完全なリシスを可能にするために、サンプルが均質であることが重要です。 - 2つのパスまたは同等のリシス系で7,000 psiのマイクロ流体化剤中のLyse細胞ペレット。リシスの代替方法は検討されていない。
- 昆虫細胞のリザス化を明らかにすることは、フィルターを詰まらせる化合物の存在のために問題がある。したがって、超遠心分離(4°Cで30分の100,000 x g)は非常に重要です。上清の表面上の白い脂質残基は避けるべきであり、綿棒を使用して除去または減少させることができる。デカント上清を0.45μmのPESフィルタでろ過します。すぐに透明化したサンプルを使用するか、-80°Cで保存してください。
メモ:残渣ブロックは迅速にフィルタをブロックし、多くのフィルタが必要な場合があります。この材料の量を減らさないと、後続のステップで高いカラム背圧につながります。 - 透明化されたリサートの体積を決定し、2Mイミダゾールストックを添加してサンプルを35mMイミダゾールに調整する。3 mL/min でサンプルを 20 mL IMAC カラム (HisPrep FF 16/10 カラム) にロードし、3 つの列ボリューム (CV) のバッファー B にあらかじめ平衡化します。
- 標的タンパク質は通常、カラムに定量的に吸着されますが、その後の分析のためにカラムフローを収集することをお勧めします。Abs280が安定したベースライン(<100ミリアブソリューションユニット[mAU])に達するまでカラムを洗浄し、バッファBを3mL/minで20 mL(1 CV)、次に4mL/minで約3CVで洗浄ステップの残りの部分を行います。通常、ベースライン吸光度を達成するには、バッファBの60~80 mLが必要です。
- 8 mL の分数を収集しながら、バッファー B からバッファー C までの 400 mL (20 CV) 勾配でタンパク質を溶出します。典型的には、標的タンパク質は勾配の前半で溶出する(図1A;後の画分がすべて示されているわけではない)。
- SDS-PAGE/クマシー染色を使用してタンパク質画分を分析します。プールピーク画分と4°CのバッファDの2 Lに対してプールを一晩透析します。
注:低pHは、次のステップでタンパク質結合を確保するために重要です。しかし、この透析中のpH変化はゆっくりと起こり、これは一晩のインキュベーションに便利なステップです。代替緩衝液交換戦略(例えば、pH変化を速めるためにより高い緩衝濃度)は調査されていない。タンパク質は、より低いpHと低い塩濃度で時間の経過とともにゆっくりと沈殿し始め、少量の沈殿は、このステップの間に正常です。このため、透析中に次の列にバインドするために必要な 100 mM NaCl にバッファを交換することは避けてください。むしろ、200 mMのNaCl濃度が透析に使用され、タンパク質はカラムへの適用の直前に100mM(下記参照)に希釈されます。この沈殿がKRAS4bに特異的かどうかは調べていないが、沈殿するタンパク質はKRAS4b-FMeとして確認されている。このため、結合緩衝液中の標的タンパク質の安定性が判断されるまでの予防措置として、目的の任意のタンパク質に対して透析バッファー内のより高いNaCl濃度を使用することをお勧めします。 - 4,000 x gでサンプルを透析と遠心分離機から取り出し、沈殿物を除去します。この時点で最終的な透析された明確化されたサンプルは、まだしばしばかすんでいるが、後続のCEXカラムにそれ以上の処理を行わずに適用することができる。
- バッファ G の 3 つの CV で洗浄し、次にバッファ F の 3 つの CV で洗浄して、20 mL のクレーション交換カラム (材料表を参照) を準備します。
注:他の樹脂を細心の注意を払って評価していませんが、SPセファローズ高性能樹脂以外の樹脂による解像度が低いことがわかりました。 - 透析されたサンプルの20mLを、20mLのバッファーEを加えて最終的なNaCl濃度100mMに希釈し、希釈したサンプルをカチケーション交換カラムに塗布する。
- 前の希釈が負荷の終わりに近づいているので、ロードチューブに上記のように調製した新鮮な希釈サンプルを追加することによって、カラムをロードし続けます。
注:サンプル全体を一度に100mM NaClに希釈すると、沈殿による標的タンパク質の有意な損失が生じつきました。 - カラムをバッファーFでベースラインAbs280に洗浄します。通常、これには 3 つの CV が必要です。タンパク質は、バッファーFから65%バッファーGまでの400mL(20CV)勾配の間にカラムから溶出され、6mL画分で集められる(図1B)。
- グラデーションが完了したら、さらに 1.5 CV (65% バッファ G) の列の洗浄を続行します。SDS-PAGE/クマシーブルー染色分析とクロマトグラムのUVトレースの検査の両方に基づいて正の分数を選択します。
注: UV トレースには通常、5 つのピークが含まれます。より低い塩濃度から始まり、初期ピークは通常未処理および/またはタンパク質分解タンパク質である。第2および第3のピークは、2つの形態の処理タンパク質の混合物であり、第2のピークは主にファルネシル化中間体(FARN)であり、第3のピークは主に目的の完全に処理されたFMeタンパク質である。ピーク4と5はHis6-MBP-KRAS4b融合タンパク質を表します(TEV消化が起こっていないため、すべてのタンパク質はこの時点でこの形式です)。これらはN末端でN-アセチル化されず、C末端でファルネシル化(ピーク4)およびファルネス化およびカルボキシメチル化(ピーク5)である。ピーク2およびピーク4はタグ除去後に同一のタンパク質を産生するので(すなわち、KRAS4b-FARN)、これらは必要に応じてこの段階でプールすることができる。同様に、ピーク 3 とピーク 5 を組み合わせて、単一ロットの KRAS4b-FMe を生成できます (図 1B、図 2)。しかし、このプールは、別々のピークにおけるタンパク質の性質が確認された場合にのみ行われるように助言される。 - ステップ1.15でプールしたタンパク質をHis6-TEVプロテアーゼ(サンプルのプロテアーゼ/mLの〜200μg)で消化します。
注:我々は、プラスミドとプロトコルを使用してHis6-TEVプロテアーゼを追加ジーン(https://www.addgene.org/92414)から入手可能にします。室温で2時間、4°Cで一晩、バッファA(サンプル1mLあたり最低40 mLのバッファAを有する10 kDa MWCO透析チューブ)に対してTEVダイジェストを透析します。 - 消化および透析後、3 mL/minでバッファー A と平衡化された 20 mL IMAC カラムにタンパク質を直接ロードします。
注:標的タンパク質はカラムに対する親和性は低いが、樹脂に完全に結合していない可能性があるため、このクロマトグラフィー全体で7mLの画分を収集します。合計 3 つの CV またはベースライン吸光度に達するまで、バッファ A で 3 mL/分でカラムを洗浄します。 - 標的タンパク質は、0%~10%のバッファーCの5CV勾配で溶出し、7mL画分を収集する。予防措置として、追加の結合タンパク質を100%Buffer C.で溶出することができ、SDS-PAGEによる分析後に陽性分画を同定する(図1C)。典型的には、標的タンパク質は低いイミダゾール濃度(すなわち、0%〜10%緩衝C勾配)で溶出するが、時にはフロースルーまたはカラム洗浄で溶出する。
- バッファーHに対して最終プールを透析し、280 nmの分光光測定法によってタンパク質濃度を決定する。
注:この計算に使用する消滅係数を決定する際には、必ずヌクレオチドの存在を考慮してください。 - タンパク質は、有意なタンパク質損失なしに遠心フィルターユニット(10 K NMWL)を使用して〜2〜5 mg/mLに濃縮することができます。0.22 μMシリンジフィルターでフィルター。A280で溶液吸光度を測定し、最終的なタンパク質濃度を算出する(図1D)。液体窒素中の凍結アリコートをスナップし、-80°Cで冷凍サンプルを保存します。
注:精製されたタンパク質はGDPに結合します。KRAS4b-FMe は、以前に公開されたプロトコル16を使用して GppNHp に交換できます。
2. 無傷の質量分析とネイティブ質量分析のためのサンプル調製
- 無傷の質量分析のためのサンプル準備
- 分析の前に氷上のタンパク質サンプルを解凍します。無傷の質量分析の場合は、20 mM重炭酸アンモニウム(pH=~8.4)でタンパク質を0.1mg/mLに希釈します。天然質量分析では、タンパク質を50mM酢酸アンモニウム(pH=~7.5)で0.1mg/mLの濃度に希釈します。ボルテックス各サンプルを5〜10s用に、次いで12,500 x gで遠心分離し、溶液中の任意の固体材料をペレット化する。各上清の10~20°Lを取り外し、ガラスオートサンプラーバイアルに移します。各バイアルをしっかりとキャップして、汚染や蒸発を防ぎます。
注:無傷の質量分析または天然質量分析の場合、サンプルは、最終的な希釈バッファーに緩衝交換するために10 kDa MWCOセルロース膜フィルターを使用して分析する前に脱塩することができます。
- 分析の前に氷上のタンパク質サンプルを解凍します。無傷の質量分析の場合は、20 mM重炭酸アンモニウム(pH=~8.4)でタンパク質を0.1mg/mLに希釈します。天然質量分析では、タンパク質を50mM酢酸アンモニウム(pH=~7.5)で0.1mg/mLの濃度に希釈します。ボルテックス各サンプルを5〜10s用に、次いで12,500 x gで遠心分離し、溶液中の任意の固体材料をペレット化する。各上清の10~20°Lを取り外し、ガラスオートサンプラーバイアルに移します。各バイアルをしっかりとキャップして、汚染や蒸発を防ぎます。
- 質量分析のための拡張質量範囲(EMR)質量分析法の作成
注: 質量分析計で解析を実行する前に、最近校正されていることを確認してください。また、有害な化学物質を避け、サンプルや溶剤を汚染しないように、必要に応じて手袋やその他の個人用保護具を着用してください。キャリブレーションは、市販品で得られたキャリブレーション溶液と、社内で調製した2mg/mLヨウ化セシウム溶液を用いて行われる。- 解析ソフトウェアを開き、適切な計測方法ファイルをロードします。KRAS4bタンパク質の無傷の質量分析のために、適切な開始パラメータは次のとおりです: 検出の陽性モード;3つのマイクロスキャン、解像度= 70,000。AGC ターゲット = 3e6;最大統合時間 = 200 ミリ秒。スキャン範囲 = 70 ~ 1,800 質量電荷比 (m/z)。KRAS4bタンパク質のネイティブ質量分析の場合、適切な開始パラメータは次のとおりです: 陽性検出モード;10マイクロスキャン、解像度= 17,500。インソース衝突誘発解離(CID)=20 eV;AGC ターゲット = 3e6;衝突エネルギー(CE)= 20;最大統合時間 = 200 ミリ秒。スキャン範囲 = 500 ~ 10,000 m/z
- クロマトグラフィー溶剤及びカラムの調製
- 無傷の質量分析に必要な溶剤を準備します。溶媒Aは0.1%ギ酸を有する水である。溶媒Bは、水中のアセトニトリル80%、ギ酸0.1%である。
- ネイティブ質量分析に必要な溶剤を準備します。溶媒Aは0.1M酢酸アンモニウムを水中、溶媒Bは水である。
- 適切な溶媒が調製されたら、チューブが適切な溶媒で満たされ、すべての気泡がラインから除去されるようにシステムをパージします。
- 適切な列(無傷の質量分析の逆相列とネイティブ質量分析のサイズ除外列)をインストールします。無傷の質量分析の場合、流量は0.5 mL/分、カラム温度(カラムヒーターを使用)は50°Cです。列を 15 ~ 20 分間平衡化します。ネイティブ質量分析の場合、流量は 0.25 mL/分です。
注: カラムの背圧を常に監視して、上限を超えないようにします。必要に応じて列を置き換えます。
- サンプル分析
- 調製したタンパク質サンプルをガラスオートサンプラーバイアルにLCシステムオートサンプラーの適切なバイアルラックに入れます。目的の分析に適した計測器方法を使用して、ソフトウェアプログラムにサンプルリストを作成します。サンプル リストが完成したら、[再生] ボタンをクリックして分析を開始します。
- 各サンプルの前後に水をブランクにして、分析ごとに1~2μLのサンプルを注入し、持ち越しが存在しないようにします。
注: 無傷の質量分析は、ネイティブ質量分析とは大きく異なり、計測器方法の設定が非常に異なります。これは、無傷の質量分析により、タンパク質が有機溶媒の存在下で「リラックス」され、より多くの電荷を受け入れることができるからです。電荷状態の同位体分布を決定し、解決する方が簡単です。天然質量分析は、タンパク質イオンの狭い電荷分布を提供し、タンパク質に基づいて、異なる電圧および衝突エネルギー設定を必要とします。
- データ分析とタンパク質デコンボリューション
- サンプルのスペクトルをソフトウェアにエクスポートし、タンパク質の無傷の質量(またはネイティブ質量)を表示する非畳み込みスペクトルに変換します。無傷の質量は、荷電スペクトルピークの高い量に起因する同位体ピーク分布を有する。ネイティブ質量は、通常、荷電スペクトルピークの存在量が低いため、ピークが非常に少ない(図3D)。
- ピーク d の質量電荷比 (m/z) 範囲を広げ、測定された質量が予測質量と一致することを確認します。時折、タンパク質への電荷の添加のために、予想される分子量(MW)と観察されたMWとの間にわずかな変動がある場合がある。また、多くの質量分析と同様に、ナトリウムなどの付加物は、慎重に脱塩されたサンプルを使用しても、データ内の追加のピークの出現に寄与することができます。予想よりも低い m/z を持つ低い豊富なピークが観察される場合があります。これは、イオン化プロセスによる機能群の損失である中性損失が原因である可能性が最も高いです。
注: 予想どおり、無傷の質量とネイティブの質量ピークの間に違いがあります。無傷のマスディスプレイは、タンパク質の期待されるMWを示します。それは、付着したヌクレオチドまたは他の修飾の余分なMWを有しない。しかしながら、天然質量ピークは、任意の添加ヌクレオチドを有するタンパク質を示す。
3. リポソームへのKRAS4b-FMe結合の検証
- 膜リポソーム調製
- 20 mM HEPES (pH = 7.3)、150 mM NaCl、および 1 mM TCEP からなるバッファーを準備します。
- リポソーム調製材料は、クロロホルム中の25 mM 1-パルミトイル-2-オレオイル-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)および10 mM 1-パルミトイル-2-オレオイル-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン(POPS)ストックを含む;ホルダーと加熱ブロックとセット脂質押出機。アルゴンガスと液体窒素;超音波浴;PTFEフォームライナー付きガラスねじ糸バイアル;動的光散乱検出が可能なプレートリーダー。
- 室温で30分間クロロホルムで脂質ストックを解凍し、5mM 70:30 POPCの1 mLを調製し、25 mM POPC(ストック)の106 μLと118 μLの10mM POPS(ストック)をガラスバイアルにアリコートしてPOPSリポソームを調製します。
注:クロロホルムは特定のプラスチックチップを溶解する可能性があるため、プラスチックチップで脂質をアリコートしないでください。 - アルゴンガスの安定した流れの下で乾燥した脂質。アルゴンガスを塗布する際は、ガラスバイアルをゆっくりと回転させて薄いフィルムの層を形成します。
- 真空凍結乾燥剤の下に一晩試料を入れ、余分なクロロホルムを除去する。
- 乾燥したフィルムに1mLの緩衝液を加えて脂質を再構成し、5分間の混合物をボルテックスにして、25°Cで1時間ロッキングして脂質混合物を水和する。
注:サンプルは、脂質の乾燥フィルム層にバッファを追加すると非常に濁ります。 - 氷水(4°C以下)と温水浴(25°以上)の間にサンプルバイアルを交互に置いて、5つの凍結/融解サイクルを行います。
- サンプルバイアルを超音波浴に入れ、約0.5時間またはサンプルが半透明になるまでサンプルを超音波処理します。
- 脂質押出機セットを使用してサンプルを押し出します。製造元の指示に従って押し出しキットを組み立てます。0.1μmのろ紙を使用してサンプルを押し出します。サンプルを1つのガラスシリンジにロードし、押し出し装置の一端に取り付けます。押し出し装置のもう一方の端に空の注射器を追加します。サンプルが完全に透明になるまで、10~20xを前後に押します。
- 20,000 x gで 30 分間最終サンプルを回転して、大きな凝集体を除去します。
- 動的光散乱(DLS)を使用して、リポソームのサイズと均質性を決定します(オプション)。リポソームの30°Lを384ウェルプレートリーダーに入れます。プレートを 1,000 x gで 30 分間回転させます。
- 表面プラズモン共鳴(SPR)を介したリポソームへのKRAS4b-FMe結合の特徴付け
- 必要な材料を組み立てる:SPR機器。センサーチップL1;7 x 14 mm バイアルチューブ;および CHAPS を使用します。
- 20 mM HEPES (pH = 7.3)、150 mM NaCl、1 mM TCEP を含むバッファーを準備します。合計体積200μL(合計10滴定)で、60μM~0.06μMのKRAS4b-FMeの2:1希釈シリーズを用意します。最終的な希釈サンプルをバイアルチューブに移し(「材料表」を参照)、バイアルチューブをラックに入れ、サンプルをSPR機器に挿入します。
- L1センサーチップをSPR機器に挿入します。バッファを取り付け、システムにバッファを7分間取り付けます。
- 自動化された方法を次のように設定します。
- 計器温度を25°Cに設定します。
- センサーチップL1を30μL/min流量で水に溶解した20 mM CHAPSの2回の1分の注射ですすいでアクティブにします。
- ランニングバッファを10回1分注入してチップ表面を水和します。
- リポソームを5μL/分で2分間注射してL1チップのフローセル(FC)-2にリポソームを注入してセンサーチップL1に付着し、少なくとも~3,000応答単位(R)の捕捉レベルを目指す。
注: 適切なキャプチャ レベルが得られるまで射出時間を長くします。
- リポソームを5μL/分で2分間注射してL1チップのフローセル(FC)-2にリポソームを注入してセンサーチップL1に付着し、少なくとも~3,000応答単位(R)の捕捉レベルを目指す。
- FC-1とFC-2の両方に3サイクルのバッファを注入し、30μL/分で1分の注射を行います。
- 様々なKRAS4b-FMe滴定を最低から最高濃度シリーズに注入します。関連相に1分注射、両FCの間で30μL/分流量で解離相に2分の注射を使用してタンパク質を注入します。
- センサーチップL1を30μL/分で20 mM CHAPSの2回の1分注入ですすいで再生します。
- 単一のサイト バインド モデルを使用して SPR 評価ソフトウェアを使用してデータを適合し、明らかなバインディング アフィニティを取得します (データフィッティングの説明については、「ディスカッション」セクションを参照してください)。
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Representative Results
プロトコルの最大の変数の1つは、発現された標的タンパク質(His6-MBP-tev-KRAS4b)の量です。このプロトコルは、トリコプラスシアni細胞株、Tni-FNL17からの単離を用いて開発され、懸濁成長に適応し、血清から離離れた。バキュロウイルス発現系を用いて様々な昆虫細胞株にわたって報告された結果の広い範囲を考えると、Tni-FNLは、少なくとも最初は、KRAS4b-FMeを産生するために使用することをお勧めします。
~65 kDa に移行する暗いタンパク質は、透明化された溶解物と溶出画分 (図 1A)で明らかである必要があります。融合タンパク質は、溶解物中で最も顕著な2つの染色バンドの1つであり、他方は~48kDaで共移行する共発現FNTA/Bである。
精製の中で、CEXステップは2つの理由で重要である:1)超可変領域(HVR)が非常に影響を受けやすいようにタンパク質分解の程度を減らす役割を果たし、2)プロトコルのこのステップのノートに示すように完全に処理されたタンパク質を濃縮する。ただし、プロトコルの最も複雑な部分です。これは、処理されたタンパク質が低い塩濃度で沈殿する傾向があるためであり、MBPに融合しても。幸いなことに、これは全部または全く現象ではなく、時間の経過とともにややゆっくりと起こります。このプロトコルは、CEX ステップの前に 200 mM NaCl に透析することでこれを利用します。この濃度では、沈殿は100mMほど有意ではなかった。したがって、プロトコルは、タンパク質がこの塩濃度の緩衝液中にある時間の長さを制限するように設計されている。CEXカラム負荷の小さなアリコートを、カラムローディングの直前にゼロ塩バッファーの等量で混合すると、露光(時間の観点から)は低塩条件に制限され、沈殿を制限します。図 2Aは、CEX ステップの最も一般的な結果を示しており、最も顕著なのはピーク 3 で、主に KRAS4b-FMe を含みます。図2Bは、手順の結果の変動性を感じさせるために観察された溶出プロファイルを示しています。これらは誤解を招く場合があるため、すべてのピークのプールを作成し、関心のあるピークが完全に精製され、品質テストに合格するまで-80°Cで保存することが賢明です。
プロトコルで述べたように、HiPrep SPセファローズ高性能カラムの使用は、図2Aに示す分離を達成する上で重要であると思われます。ピーク3が望ましいファルネシル化およびカルボキシメチル化KRAS4bに加えて、ファレンシル化された唯一のKRAS4bを頻繁に港する理由はまだ明らかではないが、他の人が代替CEX樹脂(個人的なコミュニケーション)で報告している解像度が低い場合、この現象は単なるイオン相互作用の結果ではないことを示唆している。
一般的な収率は1~6 mg/Lの範囲で、3~5mg/Lが頻繁に達成されました(>90%、n>50)。 ESI-MSを用いた無傷の質量分析は、タンパク質の正確な分子量を確認し、それによってファルネシル化および/またはカルボキシメチル化の相対的な割合を確認した(図3)。典型的な最終ロットには検出可能なKRAS4b-FARNが含まれていましたが、この割合は、この分析によるピーク高さの点で15%未満でした。図3Aは大腸菌で表される前もって表現されていないKRAS4bの代表データを示し、図3BはCEXからピーク3および5で溶出したKRAS4b-FMeを示し、図3CはCEXからピーク2で溶出したKRAS4b-Farnを示す。
GDPに結合したKRAS4bの質量も、ネイティブ質量分析を用いてこれらのサンプルについて決定された(図3D)。試料を酢酸アンモニウムに交換することで、「より柔らかい」イオン化が保証され、天然錯体はそのまま残り、KRAS4bに結合したヌクレオチドの性質の確認を提供した。
KRAS4b-FMeが膜に結合するためにファルネシル化とカルボキシメチル化が必要であることを検証するために、SPRを介してリポソームに対するKRAS4b-FMeの相互作用を測定した。図4に示すように、未処理のKRAS4bがリポソームに結合したKRAS4b-FMeは存在せず、それによって膜との相互作用のために処理されたKRAS4b-FMeが必要であることを実証した。
図1:精製工程のSDS-PAGEゲル。(A) ライサートからの IMAC キャプチャ。FNTA/Bは~48kDaで移行するダークバンドで、His6-MBP-tev-KRAS4bは~67kDaで移行するダークバンドです。M = タンパク質分子量はしご;T = 総タンパク質;L = リサーテ/カラム負荷を明確化しました。F = 列のフロースルー。分画は、増加するイミダゾール濃度勾配で溶出される。(B)1~5と標識されたCEX画分は、図2のクロマトグラムに示す溶出ピークからのピーク画分に対応する。(C) TEV 消化と 2 番目の IMAC。C = CEX ステッププレ TEV 切断からのプール;L = 負荷サンプルポストTEV切断。対象の種にはラベルが付けられます。(D)最終KRAS4b-FMeタンパク質の1マイクログラムと5マイクログラム。描かれているゲルは、複数の生産からの代表的な結果である。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:CEXクロマトグラフィー溶出プロファイル(A) 典型的なCEX溶出プロファイルは、4〜5つの主要なピークを有する。ピーク1を除いて、典型的には4つのC末端アミノ酸を欠く未処理のKRAS4bのタンパク質分解形態であるが、パネル内の4つのピークは、タンパク質のN-およびC末端の処理における変動性から生じ、徐々に正に帯電した分子が勾配で溶出する(ステップ1.15を参照)。(B) CEX 溶出プロファイルの追加例。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:精製されたKRAS4bタンパク質の無傷および天然質量分析分析無加工KRAS4b 2-185に対する無傷の質量スペクトルおよびデコンボリュートピーク解析結果は、MW = 21,064を予測した。(B)KRAS4b 2-185-FMe,CEXからのピーク3と5,予測MW = 21,281;(C)KRAS4b 2-185-ファーン、CEXからのピーク2、MW=21,267を予測した。(D)大腸菌に対する天然質量デコンボボイドピーク解析は、KRAS4b 2-185(i)、KRAS-FMe 2-185(ii)、およびKRAS-Farn 2-185(iii)を発現し、すべてGDPヌクレオチド結合状態である。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:SPRを介したリポソームへのKRAS4b-FMe結合DLSによって得られた70:30 POPC:POPSリポソームのサイズ分布。(A)DLSデータは、18%の多分散性を有するリポソームの平均直径〜200nmを示す。(B) 60~6 μM KRAS4b-FMe の SPR 結合センサーグラムをセンサー L1 チップに取り込んだ 70:30 リポソームに対する。(C)SPRデータに由来する定常状態結合異物のフィットは、リポソームに結合するKRAS4b-FMeの1μMの明らかなKDを提供した。結合応答は、リポソームの表面捕捉レベルで除算することによって正規化される。(D) 60-0.6 μM KRAS4b-2-185 ~ 70:30 リポソームの SPR 結合動態をセンサー L1 チップに取り込みます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
代表的な結果セクションで述べたように、精製中に最も重要なステップは、より低い塩中のサンプルの取り扱いです。サンプルが200 mM未満のNaClにさらされる時間を制限することは、沈殿を減らし、サンプル収率を高めるのに役立ちます。プロファイルが期待値と一致しない場合、CEX の結果の解釈が困難になる場合があります (図 2参照)。プロトコルがルーチンになるまで、適切な材料が確実に取り出されるように、無傷の質量分析が完了するまで、前方に取り出されないCEX溶出分率を-80°Cで保存することをお勧めします。CEX ステップで上記のパラメータの外側では、プロトコルは lysis および IMAC ステップで比較的簡単に変更できます。また、プロトコルにサイズ排除クロマトグラフィー(SEX)分離ステップがないことも注目に値する。これは、初期の方法開発(未発表の結果)の間に観察された損失のために省略されます。これらの損失は、タンパク質がナノディスクと複雑である場合には観察されないことが注目に値し、脂質の存在しない場合の損失は、タンパク質と樹脂との疎水性相互作用によるものであることを示唆している。
この方法は、文献14、18、19で報告されている量(>10倍高い)と品質(ヒト細胞で発現するKRAS4bを処理したボナフィデと比較して)の両方の大きな増加を表す。3-5 mg/Lの収率は、高タンパク質要件16、20を必要とする構造生物学の努力を可能にしました。RAS ファミリの他のメンバーに対する追加の翻訳後の変更と、一般的に追加の翻訳後の変更が現在調査されています。
KRAS4bの無傷の質量分析のために、0.1 mg/mLの濃度はうまく働く。より低い濃度は、電荷を受け入れる緩和されたタンパク質構成の能力のために使用することができる。しかし、タンパク質が天然の折り畳まれた立体構造にあるネイティブ質量分析では、質量電荷比が低く、より高い濃度が必要です。したがって、より低濃度のタンパク質を使用すると、シグナルの減少をもたらし、信頼性の低い結果が生成されます。天然質量分析の利点は、バッファがKRAS4bに結合したヌクレオチドの複合体を保持することと互換性がある点である。したがって、タンパク質のヌクレオチド結合形態を確認することができる(図3D)。他の質量分析と同様に、中性損失(メチル基など)が観察される(無傷の質量分析で18の損失を有する小種を参照)、図3A-C)。天然質量分析では、Na+またはK+を有するタンパク質付加物が、広範な緩衝交換後に存在し、観察することができる。これは、図 3Dの +23 のマイナーピーク 、パネル i-iii) で明らかです。
SPRデータ(図4)は、KRAS4b膜相互作用をインビトロで再現するために、完全に処理された形式のKRAS4bが必要であることを示しています。L1チップを使用してSPR実験でリポソームを捕捉する主な利点は、L1チップ表面が親油性基21でデキストランコーティングされ、改変され、それ以上の変更なしにリポソームを直接捕捉できることです。SPRは、リガンドリガンド相互作用を研究し、ストイチオメトリーと結合親和性に関する情報を提供する強力な技術です。適切に動作するセンサーグラムには、定常状態に達するアソシエーション フェーズが必要です。この最大結合応答(Rmax)は、相互作用の動物量論の推定値を提供する。解離率は、1:1の結合相互作用22を仮定して、単一の指数減衰に従う必要があります。しかし、膜表面に結合するタンパク質は、通常、より複雑な界面測定体23と、より複雑な動力学を伴うセンサーグラムをもたらす複数の親和性で生じる。私たちは、マルチサイトバインディングモデルにキネティクスを適合させることが管理されていません。しかしながら、平衡結合吸入は、市販の評価ソフトウェアを用いて適合させることができ、明らかな平衡結合親和性(KD)を提供する。いずれにせよ、当社のSPRデータは、未処理のKRAS4bとKRAS4b-FMeがリポソームにどのように結合するかを明確に区別します。したがって、SPRは依然としてタンパク質と脂質の相互作用を解読するのに有用なツールを提供する。
総称して、SPRを使用して、膜結合のために完全に処理されたKRAS4b-FMeが必要であることを実証しました。このアプローチを用いたKRAS4bの完全ファルネシル化およびカルボキシメチル化形態の生産は、構造生物学20に必要な材料の量と品質、膜相互作用23の生物物理学的特徴付け、および脂質二重層の存在下でのKRAS4b-FMe:RAF複合体に対するスクリーニング研究を提供する。
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Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
私たちは、カリッサ・グロース、ジェン・メルハルコ、マット・ドリューのクローン作成と発現支援を、フレデリック国立がん研究研究所タンパク質発現研究所で認めます。このプロジェクトは、契約番号に基づき、国立がん研究所、国立衛生研究所からの連邦資金の全部または一部に資金を提供しています。HHSN261200800001E.この出版物の内容は、必ずしも保健福祉省の見解や方針を反映したものではなく、商号、商業製品、または組織に関する言及も、米国政府による支持を暗示するものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural | Eppendorf | 22363204 | |
| 11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials | Thermo Scientific | 30211SS-1232 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | AVANTI POLAR LIPIDS | 850457 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS) | AVANTI POLAR LIPIDS | 840034 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 5427R Centrifuge | Eppendorf | ||
| Acetonitrile, HPLC Grade | Fisher Chemical | A998-1 1L | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 09689-250g | |
| Argon gas | Airgas | ARUP | |
| Assay Plate 384 | CORNING | 3544 | |
| Biacore T200 Instrument | GE Healthcare | ||
| Blue Snap-It Seals, T/S | Thermo Scientific | C4011-54B | |
| Branson Ultrasonic Bath | Thermo Fisher | 15-336-1000 | |
| Cation Exchange Chromatography (CEX) column | GE Healthcare Life Sciences | 29018183 | HiPrep SP Sepharose High Performance |
| CHAPS | Sigma | C3023 | |
| Dyna Pro Plate Reader | Wyatt Technologies | ||
| Exactive Plus EMR Mass Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500Ml | Use Reagent Grade or better |
| Gilson vials 7x14 mm Tubes | GE Healthcare | BR-1002-12 | |
| Glass screw thread vials with PTFE foam liners | Scientific Specialities | B69302 | |
| High speed/benchtop centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 05-112-114D | capable of up to 4,000 xg |
| His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease | Addgene | 92414 | Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY |
| Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column | GE Healthcare Life Sciences | 28-9365-51 | HisPrep FF 16/10 |
| In-House Water Supply, Arium Advance | Sartorius Stedim | Resistivity of 18 MΩ0-cm | |
| Lipid extruder set with holder | AVANTI POLAR LIPIDS | 610023 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | NI-DEWAR | |
| M110-EH microfluidizer | Microfluidics | ||
| MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm | Thermo Scientific | 088645 | |
| MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 Å, 2.1 x 150 mm | Thermo Scientific | 088790 | |
| MagTran software | Thermo Scientific | ||
| Methanol, HPLC Grade | VWR Chemicals | BDH20864.400 | |
| NGC Chromatography System | BioRad | 78880002 | NGC QuestTM 100 Chromatography system |
| Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators | Millipore Sigma | P8849 | |
| Rubber Caps type 3 | GE Healthcare | BR-1005-02 | |
| Series S Sensor Chip L1 | GE Healthcare | 29104993 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | 13-400-519 | Absorbace at 280nm |
| Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL | Millipore Sigma | UFC901008 | PES membrane |
| Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters | Amicon | UFC501024 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima - L80K | capable of 100,000 xg |
| Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System) | Thermo Scientific | ||
| Vortex Genie 2 | Fisher | 12-812 | |
| Water, HPLC Grade | Sigma-Aldrich | 270733-1L | May use in-house water source (see below) |
| Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter | GE Healthcare - Whatman | 6994-2504 | |
| Xcalibur QualBrowser | Thermo Scientific | proteomics software |
References
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