Summary
Prenylation er en viktig modifikasjon på perifere membran bindende proteiner. Insekt celler kan manipuleres til å produsere farnesylated og carboxymethylated KRAS4b i mengder som muliggjør Biofysiske målinger av protein-protein og protein-lipid interaksjoner
Abstract
Protein prenylation er en viktig modifikasjon som er ansvarlig for å målrette proteiner mot intracellulære membraner. KRAS4b, som er mutert i 22% av menneskelig kreft, behandles av farnesylation og carboxymethylation på grunn av tilstedeværelsen av en ' CAAX ' boksen motiv på C-Terminus. Et utviklet baculovirus system ble brukt til å uttrykke farnesylated og carboxymethylated KRAS4b i insekt celler og har blitt beskrevet tidligere. Her beskriver vi den detaljerte, praktiske rensing og biokjemiske karakterisering av proteinet. Spesielt ble affinitet og Ion Exchange kromatografi brukt til å rense proteinet til homogenitet. Intakt og innfødt masse massespektrometri ble brukt til å validere den korrekte modifikasjon av KRAS4b og å verifisere nukleotid binding. Til slutt ble membran sammenslutning av farnesylated og carboxymethylated KRAS4b til liposomer målt ved hjelp av overflate Plasmon resonans spektroskopi.
Introduction
Posttranslational modifikasjoner spiller en nøkkelrolle i å definere funksjonell aktivitet av proteiner. Modifikasjoner som fosforylering og glykosylering er godt etablert. Lipid modifikasjoner er mindre godt karakterisert, men. Det anslås at så mye som 0,5% av alle cellulære proteiner kan være prenylated1. Prenylation er overføring av en 15-karbon farnesylpyrofosfat eller en 20-karbon geranylgeranyl lipid kjede til et Acceptor protein som inneholder CAAX motiv2. Prenylated proteiner har vært innblandet i utviklingen av flere menneskelige sykdommer, inkludert prematur aldring3, Alzheimers4, CARDIAC dysfunksjon5, choroideremia6, og kreft7. De små GTPases, HRAS, NRAS, og KRAS1, Nuclear laminins, og kinetochores CENP-E og F er farnesylated proteiner under basal tilstand. Andre små GTPases, nemlig RhoA, RhoC, Rac1, CDC-42, og RRAS er geranylgeranylated8, mens RhoB kan være farnesylated eller geranylgeranylated9.
Den lille GTPase KRAS4b fungerer som en molekylær bryter, hovedsakelig sender ekstracellulære vekstfaktor signalering for å intracellulære signal Transduction trasé som stimulerer cellevekst og spredning, via flere protein-protein interaksjoner. Det er to viktige aspekter av KRAS4b biokjemi som er avgjørende for sin aktivitet. For det første, proteinet sykluser mellom en inaktiv BNP og en aktiv GTP bundet stat der den aktivt engasjerer med effekt Orer. For det andre, en C-terminal Poly-lysin-regionen og en farnesylated og carboxymethylated cystein direkte proteinet til plasma membranen, slik at rekruttering og aktivering av nedstrøms effekt Orer. Mutant KRAS4b er en kreftfremkallende driver i bukspyttkjertelen, tykk og lungekreft10, og som sådan, terapeutisk intervensjon ville ha en stor klinisk nytte. Produksjon av autentisk modifisert rekombinant protein som er farnesylated og carboxymethylated ville muliggjøre biokjemiske screening ved hjelp av KRAS4b i kombinasjon med membran surrogater som liposomer eller lipid nanodiscs11,12.
Farnesylpyrofosfat glutamyltransferase (FNT) katalyserer tillegg av farnesylpyrofosfat geranylpyrofosfat til C-terminal cystein i CAAX-motivet i KRAS4b. Etter prenylation er proteinet trafikkert til endoplasmatiske retikulum (ER) der RAS omdanner enzymet (RCE1) kløyver de tre C-terminal rester. Det siste trinnet i behandlingen er metylering av den nye C-terminal farnesylcysteine rester av ER membran protein, isoprenylcysteine kar bok syl methyltransferase (ICMT). Uttrykk for rekombinant KRAS4b i E. coli resulterer i produksjon av et uendret protein. Tidligere forsøk på å produsere behandlet KRAS4b har vært begrenset på grunn av utilstrekkelig avkastning for strukturelle eller narkotika screening eksperimenter eller har unnlatt å recapitulate den innfødte full lengde modne protein13,14. Protokollen som presenteres her benytter en konstruert baculovirus-basert insekt celle uttrykk system og rensing metode som genererer svært renset, fullt behandlet KRAS4b ved rentene på 5 mg/L av cellekultur.
Forsiktig protein karakterisering er viktig å validere kvaliteten på rekombinant proteiner før fatt på strukturelle biologi eller narkotika screening studier. To viktige parametre for fullt behandlet KRAS4b er validering av riktig prenyl modifikasjon og tilgjengeligheten av farnesylated og carboxymethylated C-Terminus (FMe) for interaksjon med membran erstatninger eller lipider. Electrospray ionisering masse massespektrometri (ESI-MS) av KRAS4b-FMe ble brukt til å måle molekylvekt og bekrefte tilstedeværelsen av farnesylpyrofosfat og carboxymethyl modifikasjoner. Native masse massespektrometri, der prøvene er sprayet med nondenaturing løsemidler, ble brukt til å demonstrere at KRAS4b-FMe var også bundet til BNP-kofaktor. Til slutt ble overflate Plasmon resonans spektroskopi brukes til å måle direkte binding av KRAS4b-FMe med immobilisert liposomer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. protein rensing
- Klargjør buffere A – H, som vist i tabell 1.
| Buffer løsning | Bufring agent (alle 20 mM) | pH | NaCl (mM) | imidazole (mM) | MgCl2 | TCEP |
| A | HEPES | 7,3 | 300 | - | 5 | 1 |
| B | HEPES | 7,3 | 300 | 35 | 5 | 1 |
| C | HEPES | 7,3 | 300 | 500 | 5 | 1 |
| D | Mes | 6,0 | 200 | - | 5 | 1 |
| E | Mes | 6,0 | - | - | 5 | 1 |
| F | Mes | 6,0 | 100 | - | 5 | 1 |
| G | Mes | 6,0 | 1000 | - | 5 | 1 |
| H | HEPES | 7,3 | 300 | - | 1 | 1 |
- Forbered rensing materialer (se tabell av materialer): protease inhibitor cocktail uten EDTA eller andre chelater; immobilisert metall affinitet kromatografi (IMAC) kolonne; kromatografi (CEX) kolonne; 0,45 μm sprøyte filter; 2 M imidazole (pH = 7,5); ultracentrifuge i stand til 100 000 x g; høyhastighets stasjonære sentrifuge i stand til 4 000 x g; sentrifugal filter enheter (10 KDa NMWL); spektrofotometer kan lese på 280 NM; His6-tobakk etch virus (TEV) protease; og kromatografi instrumentering i stand til å blande to buffer løsninger, bruke løsninger på kolonner, lage gradient elutions fra kolonne, og samle fraksjoner fra kolonner.
- Tin celler fra ~ 2 L av insekt celle kulturen tidligere lagret ved-80 ° c eller bruk fersk høstet celler. Se Gillette et al. 201915 for detaljer om TNI. FNL insekt cellelinje og uttrykks protokoller. Nøye resuspend cellene med 200 mL buffer A med ekstra 1:200 v/v protease inhibitor uten å innføre luft eller lage skum.
Merk: trinn 1,3 og påfølgende trinn (unntatt som nevnt) bør utføres ved romtemperatur (~ 22 ° c). Det er viktig at prøven er homogen slik at fullstendig lyse Rings i neste trinn. - Lyse celle pellet i en microfluidizer ved 7 000 psi i to omganger eller i et tilsvarende lyse Rings system. Alternative metoder for lyse har ikke blitt utforsket.
- Avklare insekt celle lysater er problematisk på grunn av tilstedeværelsen av forbindelser som tetter filtre. Således, ultracentrifugation (100 000 x g for 30 min ved 4 ° c) er svært viktig. En hvit lipid rester på overflaten av supernatanten bør unngås og kan fjernes eller reduseres ved hjelp av bomullspinner. Filter dekantert supernatanten gjennom et 0,45 μm PES-filter. Bruk den avklart prøven umiddelbart eller Oppbevar ved-80 ° c.
Merk: rester blokkene filtre raskt og mange filtre kan være nødvendig. Unnlatelse av å redusere mengden av dette materialet vil føre til høy kolonne tilbake trykk i etterfølgende trinn. - Bestem volumet på den avklart lysat og Juster prøven til 35 mM imidazole ved tilsetning av 2 M imidazole lager. Legg prøven på 3 mL/min på en 20 mL IMAC-kolonne (HisPrep FF 16/10 kolonne) pre-equilibrated i buffer B for tre kolonne volumer (CVs).
- Selv om mål proteinet vanligvis kvantitativt adsorberes til kolonnen, er det best å samle inn Kol onne flyten for påfølgende analyse. Vask kolonnen til ABS280 når en jevn baseline (< 100 milliabsorbance enheter [mAU]) med buffer B ved 3 ml/min for 20 ml (1 CV) og deretter i ~ 3 CV ved 4 ml/min for resten av vaske trinnet. Vanligvis er 60 – 80 mL buffer B nødvendig for å oppnå Baseline-absorbansen.
- Eluere proteinet med en 400 mL (20 CV) gradering fra buffer B til buffer C under Oppsamling av 8 mL brøker. Vanligvis elutes mål proteinet i første halvdel av graderingen (figur 1A; ikke alle senere brøker vises).
- Analyser protein fraksjoner ved hjelp av SDS-PAGE/Coomassie farging. Pool peak fraksjoner og dialyze bassenget over natten mot 2 L av buffer D ved 4 ° c.
Merk: lav pH er avgjørende for å sikre proteinbinding i neste trinn. Men, pH endring i denne dialyse skjer langsomt, og dette er et praktisk skritt for overnatting inkubasjons. Alternative buffer utvekslings strategier (f.eks. høyere buffer konsentrasjon for å øke hastigheten på pH-endringen) er ikke undersøkt. Proteinet vil begynne å langsomt utløse over tid ved lavere pH og lavere salt konsentrasjoner og en liten mengde nedbør er normalt i dette trinnet. På grunn av dette unngår vi å utveksle bufferen til 100 mM NaCl som er nødvendig for binding til neste spalte under dialyse. Snarere, en NaCl konsentrasjon av 200 mM brukes til dialyse og proteinet er fortynnet til 100 mM (se nedenfor) umiddelbart før påføring på kolonnen. Vi har ikke undersøkt om denne nedbøren er spesifikk for KRAS4b, men proteinet som ikke utfelling har blitt bekreftet som KRAS4b-FMe. Av denne grunn foreslår vi at du bruker den høyere NaCl-konsentrasjonen i bufferen med dialyse for ethvert protein av interesse som en forholdsregel inntil stabiliteten til mål proteinet i bindings bufferen kan fastslås. - Fjern prøven fra dialyse og sentrifuge ved 4 000 x g i 10 min for å fjerne eventuelle utfelling. Den endelige dialyzed, avklart prøve på dette punktet er fortsatt ofte tåkete, men kan brukes uten videre behandling på påfølgende CEX kolonnen.
- Klargjør en 20 mL veksel søyle (se tabell over materialer) ved å vaske med tre CVS of buffer G, deretter med tre CVS of buffer F.
Merk: selv om vi ikke har omhyggelig evaluert andre harpiks, flere kolleger har funnet dårlig oppløsning med harpiks enn SP Sepharose High Performance harpiks. - Fortynne 20 mL av dialyzed prøven til en endelig NaCl konsentrasjon på 100 mM ved å legge til 20 mL buffer E og bruke den fortynnede prøven til den aktuelle utvekslings søylen.
- Fortsett å laste kolonnen ved å legge til ferske fortynnede prøver tilberedt som beskrevet ovenfor til Last røret som den forrige fortynning nærmer seg slutten av lasten.
Merk: fortynning av hele prøven samtidig til 100 mM NaCl har resultert i betydelig tap av mål protein på grunn av nedbør. - Vask kolonnen til Baseline ABS280 med buffer F. Dette krever vanligvis 3 CV. Proteinet eluert fra søylen under en 400 mL (20 CV) fra buffer F til 65% buffer G, samlet inn i 6 mL fraksjoner (figur 1B).
- Fortsett å vaske kolonnen for en ekstra 1,5 CV (65% buffer G) når graderingen er fullført. Velg positive fraksjoner basert på både SDS-PAGE/Coomassie blå flekk analyse og inspeksjon av UV-sporet på kromatogram.
Merk: UV-sporet inneholder vanligvis fem topper. Begynnelsen på lavere salt konsentrasjoner, er den første toppen vanligvis ubehandlet og/eller proteolyzed protein. Den andre og tredje topper er en blanding av to former for bearbeidet protein: den andre toppen er først og fremst en farnesylated mellomliggende (FARN), mens den tredje er først og fremst den fullt behandlet FMe protein av interesse. Peaks fire og fem representerer His6-MBP-KRAS4b Fusion proteiner (alle protein er i dette formatet på dette punktet, som ingen TEV fordøyelsen har skjedd). Disse er ikke N-acetylert på N-Terminus og er farnesylated (peak fire) og farnesylated og carboxymethylated (peak Five) på C-Terminus. Som peak to og topp fire vil produsere identiske proteiner etter fjerning av koden (dvs. KRAS4b-FARN) disse kan samles på dette stadiet hvis ønskelig. Tilsvarende kan topp tre og topp fem kombineres for å produsere en enkelt masse KRAS4b-FMe (figur 1B, figur 2). Imidlertid er det anbefalt at dette pooling bare gjøres når innholdet av proteinet i de separate toppene har blitt bekreftet. - Fordøye proteinet samlet i trinn 1,15 med His6-TEV protease (~ 200 μg av protease/mL av prøven.
Merk: vi gjør His6-TEV-protease ved hjelp av plasmider og protokollene som er tilgjengelige fra Addgene (https://www.addgene.org/92414). Dialyze TEV-sammendraget mot buffer A (10 kDa MWCO dialyse slange med minimum 40 mL buffer A per mL av prøven) for 2 timer ved romtemperatur og deretter over natten ved 4 ° c. - Etter fordøyelsen og dialyse, Last proteinet direkte til en 20 mL IMAC kolonne equilibrated med buffer A ved 3 mL/min.
Merk: samle 7 mL fraksjoner i hele denne kromatografi, fordi målet protein har en lav affinitet for kolonnen, men kanskje ikke helt bundet til harpiks. Vask kolonnen ved 3 mL/min med buffer A for totalt 3 CVs eller til en Baseline-absorbansen er nådd. - Målet protein er eluert med en 5 CV gradient på buffer C fra 0%-10%, samle 7 mL fraksjoner. Som en forholdsregel kan ytterligere bundne proteiner bli eluert med 100% buffer C. positive fraksjoner identifiseres etter analyse av SDS-PAGE (figur 1C). Vanligvis elutes målet protein på en lav imidazole konsentrasjon (dvs. i 0%-10% buffer C gradient) men noen ganger elutes i gjennomstrømning eller kolonne vask.
- Dialyze det siste bassenget mot buffer H. Bestem protein konsentrasjonen ved Spektrofotometri ved 280 NM.
Merk: Sørg for å gjøre rede for tilstedeværelsen av nukleotid ved fastsettelse av utryddelse koeffisienten til bruk for denne beregningen. - Proteinet kan være konsentrert til ~ 2 – 5 mg/mL ved hjelp av en sentrifugal Filterenhet (10 K NMWL) uten signifikant protein tap. Filter med et 0,22 sprøyte filter i μM. Mål løsningen absorbansen på A280 for å beregne den endelige protein konsentrasjonen (figur 1D). Smekk fryse alikvoter i flytende nitrogen og oppbevar frosne prøver ved-80 ° c.
Merk: proteinet renset er bundet til BNP. KRAS4b-FMe kan byttes inn i GppNHp ved hjelp av tidligere utgitte protokoller16.
2. prøveforberedelse for intakt masse analyse og innfødte masse analyse
- Prøveforberedelse for intakt masse analyse
- Tin protein prøve på isen før analyse. For intakt masse analyse, fortynne proteinet til 0,1 mg/mL i 20 mM ammonium bikarbonat (pH = ~ 8,4). For native masse analyse, fortynne proteinet til en konsentrasjon av 0,1 mg/mL i 50 mM ammonium acetate (pH = ~ 7,5). Vortex hver prøve for 5-10 s, deretter sentrifuger ved 12 500 x g for 1 min til pellets noe solid materiale i løsningen. Fjern 10 – 20 μL av hver supernatanten og Overfør til et hetteglass med autosampler. Cap hvert hetteglass tett for å hindre forurensning eller fordampning.
Merk: for enten intakt masse analyse eller native Mass analyse, kan prøven være avsalte før analyse ved hjelp av et 10 kDa MWCO cellulosemembran filter til buffer-utveksling i den endelige fortynning buffer.
- Tin protein prøve på isen før analyse. For intakt masse analyse, fortynne proteinet til 0,1 mg/mL i 20 mM ammonium bikarbonat (pH = ~ 8,4). For native masse analyse, fortynne proteinet til en konsentrasjon av 0,1 mg/mL i 50 mM ammonium acetate (pH = ~ 7,5). Vortex hver prøve for 5-10 s, deretter sentrifuger ved 12 500 x g for 1 min til pellets noe solid materiale i løsningen. Fjern 10 – 20 μL av hver supernatanten og Overfør til et hetteglass med autosampler. Cap hvert hetteglass tett for å hindre forurensning eller fordampning.
- Utarbeidelse av den utvidede massen rekkevidde (EPJ) masse spektroskopi for masse analyse
Merk: før du kjører noen analyse på massen spektrometer, sørg for at det har nylig blitt kalibrert. Bruk alltid hansker og annet personlig verneutstyr som er nødvendig for å unngå skadelige kjemikalier og for å unngå forurensende prøver og løsemidler. Kalibrering gjøres ved hjelp av en kalibrering løsning innhentet kommersielt og en 2 mg/mL cesium iodide løsning forberedt internt.- Åpne analyseprogramvaren og Last inn riktig instrument metode fil. For intakt masse analyse av KRAS4b proteiner er egnede Start parametre som følger: positiv modus for deteksjon; tre mikroskannerne, oppløsning = 70 000; AGC mål = 3e6; maksimal integrasjons tid = 200 MS; og et skanneområde = 70 – 1800 masse-til-lade-forhold (m/z). For innfødt masse analyse av KRAS4b proteiner er egnede Start parametre som følger: positiv modus for deteksjon; 10 mikroskannerne, oppløsning = 17 500; in-Source kollisjon-indusert dissosiasjon (CID) = 20 eV; AGC mål = 3e6; kollisjon energi (CE) = 20; maksimal integrasjons tid = 200 MS; og et skanneområde = 500 – 10000 m/z.
- Utarbeidelse av kromatografiske løsemidler og søyle
- Klargjør løsnings midlene som er nødvendige for intakt masse analyse. Løsemiddel A er vann med 0,1% maursyre syre. Løsemiddel B er 80% acetonitril og 0,1% maursyre syre i vann.
- Klargjør løsemidler som er nødvendige for intern masse analyse. Løsemiddel A er 0,1 M ammonium acetate i vann og løsemiddel B er vann.
- Etter at de riktige løsemidler er forberedt, rense systemet slik at slangen er fylt med de riktige løsemidler og alle luftbobler er fjernet fra linjene.
- Installer den aktuelle kolonnen (en omvendt-fase kolonne for intakt masse analyse og en størrelse utelukkelse kolonne for native Mass analyse). For intakt masse analyse er strømningshastigheten 0,5 mL/min, og Kol onne temperaturen (ved hjelp av en Kol onne varmer) er 50 ° c. Likevekt kolonnen i 15 – 20 min. For opprinnelig masse analyse er strømningshastigheten 0,25 mL/min.
Merk: Overvåk alltid kolonnen bak Trykk for å sikre at den ikke stiger over den øvre grensen, noe som kan indikere en tett linje eller at Kol onne mat risen er kompromittert. Erstatt kolonnen om nødvendig.
- Eksempel analyse
- Plasser den tilberedte protein prøven i glass autosampler hetteglasset i det aktuelle hetteglass stativet i LC-systemene autosampler. Opprett et utvalg (er) liste i programmet med riktig instrument metode for den ønskede analysen. Når eksempel listen er fullført, klikker du på avspillings knappen for å starte analysen.
- Injiser 1 – 2 μL av prøve per analyse, med en vann blank før og etter hver prøve, for å sikre at ingen Carry-over er til stede.
Merk: intakt masse analyse er svært annerledes enn den innfødte massen analyse og krever svært forskjellige instrument metode innstillinger. Dette er fordi med intakt masse analyse, er proteinet "avslappet" i nærvær av en organisk løsemiddel, og dermed er i stand til å akseptere flere kostnader. Det er lettere å deconvolute og løse den isotopanrikning fordelingen av lade tilstandene. Native masse analyse gir en smal ladning fordeling av protein ioner, og basert på proteinet, krever ulike spenning og kollisjon energi innstillinger.
- Data analyse og protein deconvolution
- Eksportere spekteret av prøven til programvare der det kan transformeres til de-convoluted spektrum som vil vise intakt masse (eller native Mass) av proteinet. Den intakte massen vil ha en isotopanrikning topp distribusjon på grunn av den høye overflod av ladet Spectral topper. Den innfødte massen vil typisk ha svært få topper på grunn av den lave overflod av ladet Spectral topper (Figur 3D).
- Utvid masse-til-charge-forholdet (m/z) i topp tallet d for å bekrefte at den målte massen samsvarer med den anslåtte massen. Av og til, på grunn av tillegg av kostnader til proteinet, kan det være en liten variasjon mellom den forventede Molekylvekten (MW) og den observerte MW. Også, som med mange masse massespektrometri analyser, addukter som natrium kan bidra til utseendet av ekstra topper i data, selv med nøye avsalte prøver. Lavere rikelig topper med en m/z som er lavere enn forventet er noen ganger observert. Dette skyldes sannsynligvis et nøytralt tap, som er tapet av en funksjonell gruppe på grunn av ionisering prosessen.
Merk: som forventet, vil det være forskjeller mellom intakt masse og de innfødte masse topper. Den intakte massen displayet vil vise proteinet forventede MW. Det vil ikke ha ekstra MW av vedlagte nukleotid eller andre modifikasjoner. Imidlertid vil den innfødte massen peak viser proteinet med noen ekstra nukleotid.
3. validering av KRAS4b-FMe binding til liposomer
- Fremstilling av membran liposomer
- Klargjør en buffer bestående av 20 mM HEPES (pH = 7,3), 150 mM NaCl og 1 mM TCEP.
- Liposome forberedelse materialer inkluderer 25 mM 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) og 10 mM 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfat-L-Serine (POPS) aksjer i kloroform; en lipid Ekstruder sett med en holder og oppvarming blokk; Argon-gass og flytende nitrogen; et ultralydbad; glass skrue tråd hetteglass med PTFE skum liners; og en plate leser i stand til dynamisk lysspredning deteksjon.
- Tine lipid aksjer i kloroform ved romtemperatur i 30 min. Forbered 1 mL 5 mM 70:30 POPC: POPS liposomer av aliquoting 106 μL av 25 mM POPC (lager) og 118 μL av 10 mM POPS (lager) i et hetteglass.
Merk: ikke alikvot lipider med en plastspiss, fordi kloroform kan oppløse visse plast spisser. - Tørk lipider under en jevn strøm av Argon-gass. Roter langsomt hetteglasset ved påføring av Argon-gassen for å danne et tynt lag med tørr film.
- Sett prøver under et vakuum lyophilizer over natten for å fjerne overflødig kloroform.
- Rekonstituer lipider ved å legge 1 mL buffer til tørket film og Vortex blandinger i 5 min. fukt lipid blandinger ved å gynge for 1 t ved 25 ° c.
Merk: prøven vil være svært grumsete ved tilsetning av buffer til tørket film laget av lipider. - Utfør fem fryse/Tin-sykluser ved å skifte prøve hetteglasset mellom et isvann (4 ° c eller lavere) og et varmt vannbad (25 ° c eller høyere).
- Sett prøve hetteglasset inn i ultralyd badet og sonikere prøven i ca 0,5 h eller til prøven blir delvis gjennomsiktig.
- Extrude prøvene ved hjelp av lipid Ekstruder sett. Monter ekstrudering settet som vist i produsentens anvisninger. Extrude prøvene med 0,1 μm filter papir. Legg prøvene i en sprøyte i glass og fest den til den ene enden av ekstrudering apparatet. Legg til en tom sprøyte i den andre enden av ekstrudering apparatet. Trykk frem og tilbake 10 – 20x til prøvene blir helt gjennomsiktige.
- Snurr de siste prøvene i 30 minutter ved 20 000 x g for å fjerne store aggregater.
- Bruk dynamisk lysspredning (DLS) for å bestemme størrelsen og homogenitet til liposomer (valgfritt). Plasser 30 μL av liposomer i en 384 brønn plate leser. Spinn platen ved 1 000 x g i 30 min. Plasser platen i en plate leser og samle 10 lys sprednings målinger.
- Charactering KRAS4b-FMe binding til liposomer via overflate Plasmon resonans (SPR)
- Monter de nødvendige materialer: et SPR instrument; sensor chip L1; 7 x 14 mm hetteglass rør; og gutter.
- Klargjør en buffer som inneholder 20 mM HEPES (pH = 7,3), 150 mM NaCl, 1 mM TCEP. Forbered en 2:1 fortynning serie av KRAS4b-FMe fra 60 μM-0.06 μM i et total volum på 200 μL (10 titreringer totalt). Overfør de siste fortynnede prøvene inn i hetteglass rør (se tabell over materialer), plasser hetteglass rørene i et stativ og sett prøvene inn i spr-instrumentet.
- Sett inn L1 sensor brikken i SPR-instrumentet. Fest buffer og Prime systemet med buffer i 7 min.
- Konfigurer en automatisert metode på følgende måte:
- Still instrumentets temperatur til 25 ° c.
- Aktiver sensor chip L1 ved å skylle den med to 1 min injeksjoner av 20 mM KARER oppløst i vann ved 30 μL/min strømningshastighet.
- Utfør oppstart sykluser av ti 1 min injeksjoner av kjører buffer å hydrere chip overflaten.
- Sett liposomer på sensor chip L1 ved å injisere liposomer på strømningscellen (FC)-2 av L1-brikken med 2 min injeksjoner ved 5 μL/min. mål for en fangst nivå på minst ~ 3 000 respons enheter (RUs).
Merk: Øk injeksjons tiden til du oppnår riktig Opptaksnivå.
- Sett liposomer på sensor chip L1 ved å injisere liposomer på strømningscellen (FC)-2 av L1-brikken med 2 min injeksjoner ved 5 μL/min. mål for en fangst nivå på minst ~ 3 000 respons enheter (RUs).
- Injiser tre sykluser med buffer over både FC-1 og FC-2 med 1 min injeksjoner ved 30 μL/min.
- Injiser de ulike KRAS4b-FMe-titreringer fra lavest til den høyeste konsentrasjons serien. Injiser proteinene med 1 min injeksjoner for tilknytnings fasen og 2 min injeksjoner for dissosiasjon fasen ved 30 μL/min strømningshastighet over begge FCs.
- Regenerere sensor chip L1 ved å skylle den med to 1 min injeksjoner av 20 mM KARER ved 30 μL/min.
- Tilpasse dataene ved hjelp av SPR evalueringsprogramvare ved hjelp av en enkelt nettsted bindende modell for å få åpenbare bindende slektskap (se diskusjons delen for en forklaring på data tilpassing).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En av de største variablene i protokollen er mengden av uttrykt mål protein (His6-MBP-TEV-KRAS4b). Denne protokollen ble utviklet ved hjelp av et isolat fra en Trichoplusia ni cellelinje, TNI-FNL17, tilpasset for suspensjon vekst og Avvent fra serum. Gitt det brede spekter av resultater rapportert på tvers av ulike insekt cellelinjer med baculovirus uttrykks system, er det tilrådelig at TNI-FNL brukes, iallfall i utgangspunktet, til produsert KRAS4b-FMe.
Et mørkt protein som migrerer til ~ 65 kDa bør være åpenbare i avklart lysat samt eluering fraksjoner (figur 1A). Fusjons proteinet skal være en av de to mest fremtredende fargede bandene i lysat med den andre er co-uttrykt FNTA/B som comigrates på ~ 48 kDa.
Innenfor rensing, er CEX trinnet avgjørende av to grunner: 1) det tjener til å redusere omfanget av proteinolyse som hypervariable regionen (HVR) er ganske mottakelig, og 2) det beriker for fullt behandlet protein som angitt i notatene for dette trinnet i protokollen. Det er imidlertid den mest kompliserte delen av protokollen. Dette er fordi den bearbeidede protein tendens til å fremskynde ved lavere salt konsentrasjoner, selv smeltet til MBP. Heldigvis er ikke dette et alt-eller-ingen-fenomen, og det skjer også litt langsomt over tid. Protokollen utnytter dette ved dialyzing til 200 mM NaCl før CEX-trinnet. På denne konsentrasjonen, var nedbøren ikke så signifikant som på 100 mM. Derfor er protokollen utformet for å begrense hvor lenge proteinet er i en buffer av denne salt konsentrasjonen. Blandingen av små alikvoter av CEX kolonnen belastningen med like volumer av null-salt buffer umiddelbart før kolonnen lasting begrenser eksponeringen (i form av tid) til lave salt forhold og dermed begrenser nedbør. Figur 2A skildrer det mest typiske resultatet fra CEX trinnet, med de mest fremtredende er peak 3, som inneholder overveiende KRAS4b-FMe. Figur 2B avbilder eluering profiler som er observert for å gi en følelse av variasjon av prosedyren utfall. Fordi disse kan noen ganger være misvisende, er det klokt å lage bassenger av alle topper og lagre disse på-80 ° c til toppen av interesse har blitt fullstendig renset og bestått kvalitetstester.
Som nevnt i protokollen, bruk av HiPrep SP Sepharose High Performance kolonner synes å være avgjørende for å oppnå separasjon observert i figur 2A. Mens det er ennå ikke klart hvorfor peak tre ofte havner farnesylated-bare KRAS4b i tillegg til ønsket farnesylated og carboxymethylated KRAS4b, dårlig oppløsning andre har rapportert med alternative CEX harpiks (personlig kommunikasjon) antyder dette fenomenet er ikke utelukkende et resultat av ioniske interaksjoner.
Typiske avlinger varierte fra 1 – 6 mg/L, med 3 – 5 mg/L oppnådd hyppig (> 90%, n > 50). Intakt masse analyse bruker ESI-MS bekreftet den presise molekylære massen av proteiner og dermed den relative andelen av farnesylation og/eller carboxymethylation (Figur 3). Mens typiske siste tomter inneholdt noen synlig KRAS4b-FARN, denne andelen var mindre enn 15% i form av topp høyde fra denne analysen. Figur 3A viser representative data for KRAS4b som ikke er prenylated uttrykt i E. coli, Figur 3B viser KRAS4b-FME eluert i topper 3 og 5 fra CEX, og Figur 3C viser KRAS4b-Farn eluert i peak 2 fra CEX.
Massen av KRAS4b bundet til BNP ble også bestemt for disse prøvene ved hjelp av Native Mass analyse (Figur 3D). Utveksle prøvene i ammonium acetate sikret en "mykere" ionisering og den innfødte komplekse oppholdt intakt, noe som gir bekreftelse på natur nukleotid bundet til KRAS4b.
For å validere at farnesylation og carboxymethylation er nødvendig for KRAS4b-FMe å binde til membraner, målte vi samspillet mellom KRAS4b-FMe til liposomer via SPR. Som vist i Figur 4, KRAS4b-FMe bundet til liposomer mens ubehandlet KRAS4b ikke, og dermed demonstrere at bearbeidet KRAS4b-FMe er nødvendig for interaksjon med membraner.
Figur 1: SDS-Page gels av renseprosessen. (A) iMac fangst fra lysat. FNTA/B er de mørke bandene som migrerer ved ~ 48 kDa og His6-MBP-TEV-KRAS4b er det mørke båndet som migrerer ved ~ 67 kDa. M = protein molekylvekt stigen; T = totalt protein; L = avklart lysat/kolonne Load; F = kolonne flyte gjennom. Fraksjoner er eluert med en økende imidazole konsentrasjon gradient. (B) CEX fraksjoner merket 1 – 5 tilsvarer topp fraksjonene fra de eluering toppene vist i kromatogram av figur 2. (C) TEV fordøyelse og andre iMac. C = basseng fra CEX trinn pre-TEV kløft; L = laste eksempel post-TEV kløft. Arten av interesse er merket. (D) en og fem mikrogram endelige KRAS4b-FMe protein. Den gels avbildet er representative resultater fra flere produksjoner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: CEX kromatografi eluering profil. (A) den typiske CEX eluering profilen har fire til fem store topper. Bortsett fra peak 1, som vanligvis er en proteolyzed form for ubehandlet KRAS4b mangler de fire C-terminal aminosyrer, de fire toppene nummerert 2 til 5 i panelet skyldes variasjon i behandlingen av N-og C-Termini av proteinet, med progressivt mer positivt ladet molekyler tent senere i gradient (se trinn 1,15). (B) flere eksempler på CEX eluering profiler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: intakt og innfødt masse massespektrometri analyse av renset KRAS4b proteiner. Intakt masse spektrum og deconvoluted peak analyseresultater for (A) ubehandlet KRAS4b 2-185, spådd MW = 21 064; (B) KRAS4b 2-185-FMe, topper 3 og 5 fra CEX, spådde MW = 21 281; (C) KRAS4b 2-185-Farn, peak 2 fra CEX, spådde MW = 21 267. (D) native Mass deconvolved peak analyse for E. coli uttrykt KRAS4b 2-185 (i), KRAS-FMe 2-185 (II), og KRAS-Farn 2-185 (III), alle i BNP-nukleotid Bound stat. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: KRAS4b-FMe binding til liposomer via spr. Størrelsesfordeling av 70:30 POPC: POPS liposomer innhentet av DLS. (A) DLS-data viser en gjennomsnittlig diameter på ~ 200 NM for liposomer med en 18% polydispersitet. (B) spr bindende sensorgrams på 60 – 0,6 μM KRAS4b-FMe til 70:30 liposomer tatt på en sensor L1-chip. (C) Fit av den steady state bindende isotherms AVLEDET fra spr data gitt en tilsynelatende KD av 1 ΜM av KRAS4b-FMe binding til liposomer. Bindings responsen er normalisert ved å dele av overflaten fangst nivå av liposomer. (D) spr bindende Kinetics på 60 – 0,6 μM KRAS4b-2-185 til 70:30 liposomer fanget på en sensor L1-chip. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som nevnt i representative resultater delen, det mest kritiske trinnet under rensing er håndteringen av prøven i løpet av den tiden det er i lavere salt. Begrense tiden som prøven er utsatt for mindre enn 200 mM NaCl vil bidra til å redusere nedbør og øke sample yield. Tolkning av resultatene av CEX kan være vanskelig hvis profilen ikke samsvarer med forventningene (se figur 2). Inntil protokollen har blitt rutine, er det anbefalt at CEX eluering fraksjoner som ikke er tatt frem lagres ved-80 ° c til intakt masse analyse er fullført for å sikre at riktig materiale ble tatt frem. Protokollen er relativt enkel å endre på lyse og IMAC-trinn, bortsett fra parametrene som er nevnt ovenfor for CEX-trinnet. Det er også verdt å merke seg at det ikke er størrelse utelukkelse kromatografi (SEX) separasjon trinn i protokollen. Dette utelates på grunn av tap vi har observert under tidlig metodeutvikling (upubliserte resultater). Det er bemerkelsesverdig at disse tapene ikke blir observert når proteinet er i kompleks med nanodiscs, noe som tyder tapet i fravær av lipider skyldes hydrofobe interaksjon mellom protein og harpiks.
Denne metoden representerer en stor økning i både kvantitet (> 10x høyere) og kvalitet (i forhold til bona fide behandlet KRAS4b uttrykt i menneskelige celler) som er rapportert i litteraturen14,18,19. Avkastningen av 3-5 mg/L har aktivert strukturell biologi innsats som krever høye protein krav16,20. Ytterligere posttranslational modifikasjoner for andre medlemmer av RAS-familien samt ytterligere posttranslational modifikasjon generelt undersøkes.
For intakt masse analyse av KRAS4b, en konsentrasjon av 0,1 mg/mL fungerer godt. Lavere konsentrasjoner kan brukes på grunn av evnen til den avslappede protein konfigurasjonen for å akseptere kostnader. Men i native masse analyse, der proteinet er i sin opprinnelige foldet konformasjon, er det lavere masse-til-charge prosenter og høyere konsentrasjoner er nødvendig. Således, ved hjelp av lavere konsentrasjoner av protein resulterer i en reduksjon av signalet og gir mindre pålitelige resultater. Fordelen med innfødte masse massespektrometri er at bufferen er kompatibel med å beholde komplekset av nukleotid bundet til KRAS4b. Derfor er det mulig å bekrefte nukleotid-bundne former av proteiner (Figur 3D). Som med alle masse massespektrometri analyse, nøytrale tap (for eksempel en metyl gruppe) er observert (se mindre arter med et tap på 18 i intakt masse analyse, Figur 3a-C). I native Mass massespektrometri analyse, protein addukter med na+ eller K+, til stede etter omfattende buffer utveksling, kan observeres. Dette er tydelig i de mindre toppene av + 23 i Figur 3D, paneler i-III).
Våre SPR data (Figur 4) viser at den fullt bearbeidet form av KRAS4b er nødvendig for recapitulating KRAS4b-membran interaksjon in vitro. En stor fordel av benytter det L1 flis å fange det liposomer inne våre SPR eksperimenter er det alt det L1 flis overflate er dextran belagt og modifisert med lipofile holdene21, således tillater for direkte fange av det liposomer uten alle fremme modifisering. SPR er en kraftfull teknikk for å studere ligand-ligand interaksjoner gi informasjon om støkiometri og bindende affinitet. Sensorgrams som fungerer riktig bør ha en tilknytnings fase som når en stabil tilstand. Dette maksimal bindings responsen (RMax) gir et estimat av støkiometri for samhandlingen. Den dissosiasjon rate bør følge en enkelt eksponentiell forfall, forutsatt en 1:1 binding interaksjon22. Proteiner som bindes til en membran overflate oppstår imidlertid vanligvis med mer komplekse stoichiometries23 og flere slektskap som resulterer i sensorgrams med mer komplekse Kinetics. Vi har ikke klart å tilpasse Kinetics til en modell for multisite-binding. Men likevekt bindende isotherms kan passe ved hjelp av kommersiell evaluering programvare for å gi en tilsynelatende likevekt bindende affinitet (KD). Uansett, våre SPR data klart skiller mellom hvordan ubehandlet KRAS4b og KRAS4b-FMe bind til liposomer. Dermed gir SPR fortsatt et nyttig verktøy i å tyde protein-lipid interaksjoner.
Kollektivt, ved hjelp av SPR vi viser at fullt behandlet KRAS4b-FMe er nødvendig for membran bindende. Produksjon av fullt farnesylated og carboxymethylated form av KRAS4b bruker denne tilnærmingen gir kvantitet og kvalitet på materialet som er nødvendig for strukturelle biologi20, Biofysiske karakterisering av membran interaksjoner23, og screening studier mot KRAS4B-FMe: RAF kompleks i nærvær av lipid bilayers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi erkjenner kloning og uttrykk støtte fra Carissa Grose, Jen Melhalko, og Matt Drew i protein Expression laboratorium, Frederick National laboratorium for Cancer Research. Dette prosjektet har vært finansiert helt eller delvis med Federal midler fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, under kontrakt nr. HHSN261200800001E. Innholdet i denne publikasjonen reflekterer ikke nødvendigvis synspunktene eller policyene til Department of Health and Human Services, og heller ikke omtale av varenavn, kommersielle produkter eller organisasjoner innebærer godkjennelse fra amerikanske myndigheter
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural | Eppendorf | 22363204 | |
| 11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials | Thermo Scientific | 30211SS-1232 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | AVANTI POLAR LIPIDS | 850457 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS) | AVANTI POLAR LIPIDS | 840034 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 5427R Centrifuge | Eppendorf | ||
| Acetonitrile, HPLC Grade | Fisher Chemical | A998-1 1L | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 09689-250g | |
| Argon gas | Airgas | ARUP | |
| Assay Plate 384 | CORNING | 3544 | |
| Biacore T200 Instrument | GE Healthcare | ||
| Blue Snap-It Seals, T/S | Thermo Scientific | C4011-54B | |
| Branson Ultrasonic Bath | Thermo Fisher | 15-336-1000 | |
| Cation Exchange Chromatography (CEX) column | GE Healthcare Life Sciences | 29018183 | HiPrep SP Sepharose High Performance |
| CHAPS | Sigma | C3023 | |
| Dyna Pro Plate Reader | Wyatt Technologies | ||
| Exactive Plus EMR Mass Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500Ml | Use Reagent Grade or better |
| Gilson vials 7x14 mm Tubes | GE Healthcare | BR-1002-12 | |
| Glass screw thread vials with PTFE foam liners | Scientific Specialities | B69302 | |
| High speed/benchtop centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 05-112-114D | capable of up to 4,000 xg |
| His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease | Addgene | 92414 | Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY |
| Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column | GE Healthcare Life Sciences | 28-9365-51 | HisPrep FF 16/10 |
| In-House Water Supply, Arium Advance | Sartorius Stedim | Resistivity of 18 MΩ0-cm | |
| Lipid extruder set with holder | AVANTI POLAR LIPIDS | 610023 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | NI-DEWAR | |
| M110-EH microfluidizer | Microfluidics | ||
| MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm | Thermo Scientific | 088645 | |
| MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 Å, 2.1 x 150 mm | Thermo Scientific | 088790 | |
| MagTran software | Thermo Scientific | ||
| Methanol, HPLC Grade | VWR Chemicals | BDH20864.400 | |
| NGC Chromatography System | BioRad | 78880002 | NGC QuestTM 100 Chromatography system |
| Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators | Millipore Sigma | P8849 | |
| Rubber Caps type 3 | GE Healthcare | BR-1005-02 | |
| Series S Sensor Chip L1 | GE Healthcare | 29104993 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | 13-400-519 | Absorbace at 280nm |
| Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL | Millipore Sigma | UFC901008 | PES membrane |
| Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters | Amicon | UFC501024 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima - L80K | capable of 100,000 xg |
| Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System) | Thermo Scientific | ||
| Vortex Genie 2 | Fisher | 12-812 | |
| Water, HPLC Grade | Sigma-Aldrich | 270733-1L | May use in-house water source (see below) |
| Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter | GE Healthcare - Whatman | 6994-2504 | |
| Xcalibur QualBrowser | Thermo Scientific | proteomics software |
References
- Cox, A. D., Der, C. J. Protein prenylation: more than just glue. Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).
- Zhang, F. L., Casey, P. J. Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences. Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).
- Hottman, D. A., Li, L. Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer's disease. Molecular Neurobiology. 50 (1), 177-185 (2014).
- Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. HDL and cognition in neurodegenerative disorders. Neurobiology of Disease. 72, Pt A 22-36 (2014).
- Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms. Annals of Medicine. 35 (6), 398-403 (2003).
- Kohnke, M., et al. Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease. PLoS One. 8 (12), 81758 (2013).
- Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. Targeting protein prenylation for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (11), 775-791 (2011).
- Kho, Y., et al. A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12479-12484 (2004).
- Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB. Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 7864-7868 (1995).
- Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. Dragging ras back in the ring. Cancer Cell. 25 (3), 272-281 (2014).
- Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics. Chemical Reviews. 117 (6), 4669-4713 (2017).
- Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles. Journal of Visualized Experiments. (66), e3910 (2012).
- Dementiev, A. K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation. Protein Expression and Purification. 84 (1), 86-93 (2012).
- Lowe, P. N., et al. Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems. Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1672-1678 (1991).
- Gillette, W., et al. Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System. Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).
- Agamasu, C., et al. KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner. Biophysical Journal. 116 (6), 1049-1063 (2019).
- Talsania, K., et al. Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies. Genes. 10 (2), 79 (2019).
- Spencer-Smith, R., et al. Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site. Nature Chemical Biology. 13 (1), 62-68 (2016).
- Lowe, P. N., et al. Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system. Biochemical Society Transactions. 20 (2), 484-487 (1992).
- Dharmaiaha, S., et al. Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDEδ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6766-6775 (2016).
- Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore. Analytical Biochemistry. 328 (2), 233-243 (2004).
- Fisher, R. J., et al. Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (2), 472-484 (2006).
- Lakshman, B., et al. Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane. Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).
