Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Universal og effektiv elektroporation protokol for genteknologi af gastrointestinale organoider

Published: February 18, 2020 doi: 10.3791/60704

Summary

Denne protokol beskriver en effektiv elektroporationsmetode til omladning af fire forskellige gastrointestinale organoidenheder med større plasmider (i det omfang 10 kB). Det kan udføres inden for en dag og behøver ikke omfattende forberedelse eller særlige, omkostningskrævende elektroporation buffere.

Abstract

Elektroporation er en almindelig metode til omladning med forskellige typer af molekyler ved elektrisk permeabilisering af plasmamembranen. Med den stigende brug af organoider som en dyrkningsmetode for primærpatientmateriale i de seneste år er der behov for effektive overførselsmetoder for komponenter til genteknologi i dette 3D-kultursystem. Især for organoider, effektiviteten af genetiske manipulationer afhænger af en vellykket transfection. Denne protokol blev således udviklet for at lette elektroporationen af organoider og for at bevise dens universelle funktionalitet i forskellige enheder. Human kolorektal, pancreas, hepatisk og gastrisk kræft organoids blev med succes elektroporated med små og store plasmider i sammenligning. Baseret på GFP-kodningsvektorer blev transfektionseffektiviteten bestemt af FACS. Ingen omfattende forberedelse af cellerne eller særlige, omkostningskrævende elektroporation buffere er nødvendige, og protokollen kan udføres inden for en dag.

Introduction

I de seneste år, en ny 3D celle kultur system, benævnt organoider, blev udviklet til forskellige normale og kræftvæv. Organoider er funktionelt og morfologisk meget tæt på deres væv af oprindelse. De kan genereres fra forskellige arter, er let kan udvides, genomisk stabil og genetisk modificerbare, hvilket gør dem til et ideelt modelsystem for genetiske undersøgelser1,2,3. Genteknologiske teknikker som CRISPR (Clustered Regelmæssigt Interspaced Short Palindromic Repeats) / Cas9 system giver forskellige manipulationer. Udvælgelsen af kloner kan realiseres ved definerede medieforhold, for eksempel ved WNT ligand tilbagetrækning for APC (Adenomaosis Polyposis Coli) knockout kloner4,5. Alternativt skal markeringsmarkørerne indføres ved homologrettet reparation af en målretningsvektor6,7. På grund af det faktum, at ofte mere end én plasmid skal indføres, en effektiv omladning bliver et afgørende parameter. For at reducere uspecifikke virkninger uden for målet er det desuden ønskeligt, at Cas9-endonuclease er forbigående8.

Elektroporation er en forholdsvis enkel metode til at transfect celler med DNA, RNA, proteiner eller andre makromolekyler. Ved hjælp af elektriske impulser bliver cellemembranen mere gennemtrængelig og forårsager en øget optagelse9. I en tidligere offentliggjort elektroporation protokol af kolon organoider en 30 % effektivitet med en piggy-bac GFP (grøn fluorescerende protein) udtrykke vektor (7,4 kB) blev nået i en fire dages procedure10. Følgende protokol blev udviklet for at lette en effektiv transfection af kræft eller sunde organoider med store plasmider kodning for enkelt guide RNA (sgRNA) og Cas9 endonuclease sekvens (f.eks px458 som vektor med 9,3 kb). Hele elektroporationsprocessen kan udføres inden for en dag, uden særlige elektroporation buffere, og med mindst sammenlignelige effektivitetsgevinster mellem forskellige gastrointestinale organoider, nemlig pancreas ductal adenocarcinom (PDAC), kolorektal cancer (CRC), cholangiocarcinoma (CCC) og mavekræft (GC) organoids.

Protocol

Der blev indhentet etisk godkendelse fra det etiske udvalg i TU Dresden (#EK451122014).

1. Organoid Kultur og præparater før elektroporation

  1. Etablere organoider ved vævsfordøjelse som beskrevet tidligere og udvide dem med deres tilsvarende enhedsspecifikke kulturmedium i en kældermatrix (oversigt se tabel 1 og materialetabel)11,12,13,14,15,16,17.
    BEMÆRK: For humane vævsprøver informeret samtykke og godkendelse af undersøgelsen af et etisk udvalg er nødvendig.
  2. Prewarm 48-brøndplader ved 37 °C til postelektroporation af såning.
  3. Forbered basalmedium w/o antibiotika samt enhedsspecifikke organoidkulturmedium w/o antibiotika (se tabel 1),herunder 10 μM Y-27632 og 3 μM CHIR99021.
    BEMÆRK: Tilbagetrækning af antibiotika er vigtigt at reducere toksiske virkninger. Y-27632 og CHIR99021forbedrecelleopsving10.
  4. Fremstilling af organoider (se figur 1)
    1. Dyrk 5 brønde af organoider i en 48-brønds plade pr elektroporation prøve i kulturmedium.
      BEMÆRK: Der bør anvendes proliferatoroider (ca. 2-3 dage efter sidste opdeling).
    2. Der fremstilles 230 μL dissociationreagens (se materialetabellen),herunder 10 μM Y-27632 pr. brønd.
    3. Fjern dyrkningsmediet fra hver brønd, og dissociaterorierne mekanisk i 230 μL af den forberedte dissociationblanding. Pool 5 brønde pr elektroporation prøve i en 15 ml rør.
    4. Bland ved vortexing og inkubering i 5-15 min ved 37 °C, indtil der opstår klynger af 10-15 celler. Kontroller derfor dissociationen mikroskopisk. Stop fordøjelsen ved at tilføje basal medium w / o antibiotika op til 10 ml.
      BEMÆRK: Dette trin er meget kritisk! Elektroporation effektivitet vil blive reduceret, når inkubation er for kort, men lang fordøjelse vil reducere overlevelsesevne.
    5. Centrifugeres ved 450 x g i 5 minutter ved stuetemperatur, kassér supernatantet og vaskes to gange med 4 ml elektroporationsbuffer (se Materialetabellen).

2. Elektroporation

BEMÆRK: Følgende protokol er udviklet til elektroporatorer, der kan finde firkantede bølger og adskilte poring- og overførselspulssekvenser (se figur 2). Eventuelt kan impedansværdier samt de spændinger, strømme og energier, der overføres til prøven, måles som kontrol for reproducerbare eksperimenter.

  1. Kasekoling af organoidpellet i 100 μL elektroporationsbuffer (se Materialetabel),der indeholder 30 μg plasmid-DNA.
    BEMÆRK: Koncentrationen af det anvendte plasmid DNA skal overstige 5 μg/μL for en optimal saltkoncentration under elektroporeringsprocessen. Derfor anbefales endofree plasmid maxi kits (se Tabel over materialer)til fremstilling af vektorer. Der kan anvendes en samlet mængde på op til 45 μg DNA uden cytotoksiske virkninger.
  2. Dispenser den komplette DNA-organoid blanding i en elektroporation cuvette med 2 mm mellemrum bredde uden at producere luftbobler.
  3. Indstil elektroporationsparametrene i henhold til Fujii et al.10 (se tabel 2, figur 2).
  4. Bland cellerne lidt uden at skumme ved at trykke på cuvetten med en finger. Placer cuvetten i cuvettekammeret.
  5. Tryk på Ω-knappen på elektroporatoren, og noter impedansværdien.
    BEMÆRK: En impedans mellem 30-40 Ω viste de bedste resultater. Generelt bør det være i intervallet mellem 30-55 Ω. Hvis dette ikke er tilfældet, skal du styre følgende aspekter: mellemrumsbredden af den anvendte cuvette, elektroporatorens kabelforbindelser, mulige luftbobler, korrekt volumen og saltkoncentration af elektroporationsblandingen.
  6. Tryk på knappen Start for at udføre elektroporeringsprogrammet, og styr værdierne af strømme, spændinger og energier, der vises.
    BEMÆRK: Værdierne af målte spændinger, strømme og energier skal svare til de indstillede elektroporationsparametre. Til sammenligning af gentagne eksperimenter kan det være nyttigt at notere disse data.
  7. Efter elektroporation tilsættes straks 500 μL kulturmedium w/o antibiotika (med CHIR99021 og Y-27632; se trin 1.3). Bland ved pipetting op og ned for at adskille det hvide skum.
    BEMÆRK: Det hvide skum vises efter elektroporeringsprocessen, og der er knyttet et betydeligt antal celler til den. Så dissociation af det er meget vigtigt for ikke at miste celler.
  8. Prøven overføres helt fra cuvetten til et nyt 15 ml rør ved hjælp af den pipette, der tilhører elektroporeringscuvetterne (se Materialetabel). Skylning af cuvetten igen med basalmedium anbefales at opnå resterende celler.
  9. For regenerering af cellerne, inkubere dem i 40 minutter ved stuetemperatur.

3. Seedning af celler

  1. Centrifugerne centrifugeres ved 450 x g i 5 minutter ved stuetemperatur, og supernatanten kasseres.
  2. Opslæm pellet i 100 μL af kælderen matrix og frø 20 μL dråber i en forvarmet 48-brønd plade (se trin 1,2). Inkuberes i 10 min ved 37 °C til polymerisering og tilsættes 250 μL kulturmedium, som suppleres med Y-27632 og CHIR99021 indtil den næste opdeling af de dyrkede organoider (ca. 5-7 dage).

4. Bestemmelse af transfektionseffektivitet

BEMÆRK: Generelt anbefales det at elektroporate redegøre en vektor med en fluorescensmarkør som yderligere transfektionskontrol. Afhængigt af den valgte markør og dens kromforemodning vil fluorescensen være synlig inden for ca. 24-48 h efter omladning18.

  1. Kontroller fluorescensmikroskopisk efter 24-48 timer i transfektionskontrollen (se figur 4B).
  2. Fluorescerende aktiveret cellescanning (FACS)
    1. Høst cellerne tilsvarende til trin 1.4.2-1.4.4 og fordøje omkring 10-20 min, indtil der er enkelte celler. Der tilsættes op til 10 ml fosfatbuffered saltvand (PBS).
    2. Centrifugeres ved 450 x g i 5 minutter ved stuetemperatur og kassér supernatantet.
    3. Eventuelt til forskelsbehandling af levende celler: Resuspender pellet i 1 ml fosfat-buffered saltvand (PBS) og tilføje et passende antistof (se Tabel over materialer)eller propidium iodid (PI). Bland kun meget omhyggeligt ved at trykke og inkubere i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke. Vask med 10 ml PBS, centrifugeog kassér supernatantet.
    4. Opslæm cellepelletiet i 200 μL PBS og filtreres eventuelt suspensionen gennem en 100 μm cellesii i et FACS-rør.
    5. Analysere cellerne ved hjælp af en FACS-maskine ved hjælp af en passende gatingstrategi (se figur 3; Figur 4A) og bestemme omladningseffektiviteten.

Representative Results

Organoider af fire forskellige kræftenheder (CRC, CCC, PDAC, GC) blev elektroporated mindst 3 gange ved hjælp af 30 μg af en lille plasmid (pCMV-EGFP, 4,2 kb) eller en stor plasmid (px458, 9,3 kb). Begge vektorer bærer en GFP kassette, der gør det muligt at bestemme transfektionseffektivitet 48 timer efter elektroporation ved flow cytometri. At analysere kun levende celler, farvning med et liv-død antistof før scanning blev udført. Gating-strategien er vist i figur 3.

I alle fire organoidenheder blev plasmid på 4,2 kB mellemstore plasmid transfected med højere effektivitet sammenlignet med den større (se figur 4). Den mest effektive transfection af den lille plasmid blev nået i PDAC-organoider med 92,1 ± 5,2 % GFP-positive celler, mens den store plasmid blev transfunderet med en effektivitet på 46,7 ± 3,7 % (gennemsnitlig ± standardafvigelse, n = 3). Sammenlignet med organoider i bugspytkirtlen blev den større plasmid mere effektivt transfunderet i CRC-organoider med en gennemsnitlig effektivitet på 53,4 ± 11,7 %, mens den lille plasmid blev transfunderet med en gennemsnitlig effektivitet på 84,3 ± 5,8 %. Den vanskeligste enhed at ombære var fogtkræftorganoider: For både de store og de små plasmid blev den laveste transfektionseffektivitet nået i denne enhed (henholdsvis 32,3 ± 12,7 % og 74,1 ± 5,5 %). CCC-organoider udviste en gennemsnitlig transfektionseffektivitet på 83,0 ± 13,1 % for den lille plasmid og for de store plasmider 39,5 ± 10,4 % blev opnået.

Som proof of concept, menneskelige normale mave organoids blev elektroporated med en px458_Conc2 plasmid kodning for Cas9, GFP og to sgRNAs rettet mod TP53. Cas9-inducerede dobbeltstrengbrud på exon 8 blev repareret ved ikke-homolog e-end-sammenføjning (NHEJ), hvilket resulterede i rammeskift og dermed en udskæring af genet (se supplerende figur 1).

Tabel 1: Sammensætning af basale medier, fordøjelsesblandinger og dyrkningsmedier. Klik her for at se denne fil (højreklik for at downloade).

Table 1
Tabel 2: Elektroporation indstillinger i henhold til Fujii et al.10.

Figure 1
Figur 1: Arbejdsgang for forberedelse af elektroporering. For det første bør organoider adskilles til klynger af 10-15 celler og antibiotika bør blive vasket ud. Efter elektroporation skal det hvide skum adskilles. Celler kan ses efter regenerering i 40 min ved stuetemperatur. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: To-trins elektroporation. To poring impulser med højere spænding og kort varighed (175 V og 157,5 V, hver for 5 ms, pause i 50 ms, spænding henfald 10%) føre til dannelse af porer i cellemembraner. Følgende overførselsimpulser leverer DNA'et ind i cellerne: fem positive overførselsimpulser (med 20 V, 12 V, 7,2 V, 4,32 V og 2.592 V, hver for 50 ms, pause i 50 ms, spænding henfald 40%), efterfulgt af fem polaritet udvekslet overførsel impulser (med 20 V, 12 V, 7,2 V, 4,32 V og 2.592 V, hver for 50 ms, pause for 50 ms, spænding henfald 40%). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Repræsentativ gatingstrategi vist ved CCC organoids. Alle elektroporated organoider blev analyseret ved flow cytometri 48 h efter elektroporation. Celler, der blev elektrodeklassificeret uden plasmid-DNA, blev brugt som negative kontroller. Portene blev sat som følger: (A) gating for celleform (B,C) gating for enkelte celler (dobbelt forskelsbehandling),(D)gating for levende celler (farves med et antistof til apoptotiske celler) og (E,F) endelig gating for eGFP udtrykke celler (FITC kanal). FSC = fremad scatter; SSC = sidescatter. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Elektroporation effektivitet af fire organoid enheder. A) FACS-analyse (n = 34, gennemsnitlig standardafvigelse og hver enkelt værdi er vist) ogb) visuel sammenligning med fluorescensmikroskop. Skalabjælke = 1.000 μm. BF = lyst felt; CCC = cholangiocarcinoma; CRC = kolorektal cancer; GC = mavekræft; PDAC = pancreas ductal adenocarcinoma. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplementary Figure 1
Supplerende figur 1: Eksemplarisk CRISPR/Cas9-baseret knockout af TP53 i normale menneskelige mave organoider. Den px458_Conc2 vektor (se Tabel over materialer)blev klonet ved at kombinere 2 gRNA concatemer vektor, en generøs gave fra Bon-Kyoung Koo19, med px45820, hvilket resulterer i en plasmid kodning for 2 sgRNAs, Cas9 og GFP. To sgRNAs rettet mod TP53 blev indført i px458_Conc2 vektor ved golden gate kloning (svarende til Andersson-Rolf et al.19). 10 μg plasmid DNA blev elektrodeklassificeret i humannormal gastrisk etonosider (A). Kloner blev udvalgt af Nutlin3 administration(B) og TP53 knockout blev bekræftet af TOPO TA kloning og sekventering af alleler, her eksemplarisk vist for en klon (C). SGRNA'erne understreges i referencen. Skalabjælke = 200 μm. BF = lyst felt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Denne protokol giver detaljerede instruktioner til en effektiv, hurtig og nem at udføre elektroporation af forskellige organoid enheder. Ud over de præsenterede tumor organoider fra PDAC, CRC, CCC og GC, det virker med succes for organoider stammer fra sundt væv samt. Protokollen kan udføres inden for en dag. I offentliggjorte organoidomladningsprotokoller varede hele proceduren fire dage , herunder to dages præparater med forskellige typer dyrkningsmedier10,21. I vores protokol kræves der ingen særbehandling. Ved at vaske med elektroporation buffer før elektroporation antibiotiske komponenter i medierne blev vasket ud og en justering af saltvand koncentrationer for optimal impedans værdier blev opnået. Ikke desto mindre bør nogle kritiske aspekter overvejes for en vellykket elektroporation:

Celler
I fujii et al.10's elektroporationsprotokol anbefales det at adskille organoider til enkelte celler og filtrere dem gennem en cellesier på 20 μm. I vores hænder fordøjelse til enkelte celler kraftigt nedsætter overlevelsesevne af celler. Som foreslået i Merenda et al.21,vi også dissociated organoider til klynger af 10-15 celler og kunne ikke bestemme en nedsat effektivitet i forhold til en enkelt celle dissociation. Efter elektroporation, er det et meget vigtigt skridt at adskille det hvide skum, således at ingen vedhæftede celler er faret vild.

For 2D celle kultur, har det vist sig, at en regenerering tid efter elektroporation på mere end 10 min op til 40 min øger overlevelsesevne og omplantning effektivitet især af store plasmider22. I testforsøg kunne det samme dokumenteres for organoider, hvilket fører til et inkubationstrin på 40 min efter elektroporation i denne protokol. For at øge inddrivelsen fra elektroporationen, vi dyrkede dem med Rho-associerede protein kinase (ROCK) hæmmer Y-27632 i fem til syv dage23. Tilsvarende, den ekstra tilskud af glykogen syntase kinase 3 (GSK3) hæmmer CHIR99021 er beregnet til at hjælpe enkelte celler til at inddrive10.

Indstillinger
En af fordelene ved den brugte elektroporator er, at impedansen kan måles før elektroporation for optimale forhold. Ifølge producenten skal impedansværdierne være 30-55 Ω. I vores hænder har impedansværdier på 30-40 Ω vist optimal effektivitet. I et indledende eksperiment blev forskellige spændinger og pulslængdeværdier for poringpulsen varieret for at finde den optimale andel af effektiviteten til overlevelsesevne. Sammenfattende kunne vi bekræfte de beskrevne værdier Fujii et al.10 i de forskellige enheder, der er beskrevet her.

Dna
Virkningen af forskellige DNA-mængder blev testet i indledende forsøg på op til 45 μg DNA pr. prøve. Der kunne ikke påvises cytotoksiske virkninger. Transfektionseffektiviteten blev øget på en dosisafhængig måde med mætning > 30 μg. Så vi brugte 30 μg pr. prøve i den endelige protokol, men den kan naturligvis øges (f.eks. til elektroporation af flere plasmider parallelt). Derudover synes dna'ets renhed og koncentration at være meget vigtig. En koncentration på over 5 μg/μL har vist optimal transfektionseffektivitet.

Som forventet kunne plasmiden på 9,3 kB transfected med en lavere effektivitet end de mindre 4,2 kB plasmid (se figur 4). Brugen af endnu større plasmider end 10 kB forventes at yderligere mindske effektiviteten. For fremtidige anvendelser, kan det være interessant at teste minicircle DNA som en vektor, da disse genbærere mangler den bakterielle rygrad en plasmid hvilket gør dem mindre24. Dette bør resultere i en forbedret transfektionseffektivitet. Desuden, for CRISPR-baserede manipulationer af organoider en direkte elektroporation af sgRNAs bundet til Cas9 som en ribonucleoprotein (RNP) kompleks kunne være et alternativ eller tilføjelse25.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Juliane Fohgrub, Ann-Christin Meinecke og Max Heiduk for fremragende teknisk bistand. Deutsche Krebshilfe (nr. 111350 og 70112925), Sander Stiftung (nr. 2014.104.1), Hector Stiftung (nr.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
For establishment and culture medium
[Leu15] Gastrin Sigma-Aldrich G9145
A83-01 Tocris Bioscience 2939
Advanced DMEM/F-12 Invitrogen 12634010
B27 Invitrogen 17504044
B27 Supplement, minus vitamin A Thermo Fisher Scientific 12587010
CHIR99021 Stemgent 04-0004
Collagenase II Life Technologies 17101-015
Collagenase XI Sigma-Aldrich C9407-100MG
Collagenase D Roche 11088866001
Dispase II Roche 4942078001
Dnase I Sigma-Aldrich D5319
D-sorbitol Roth 6213.1
Dithiothreitol Thermo Scientific 1859330
EDTA Roth 8040
Forskolin Tocris Bioscience 1099
Glutamax Life Technologies 35050061
Hepes Thermo Fisher Scientific 15630106
hFGF-10 Preprotech 100-26
KCl Sigma-Aldrich P9541
KH2PO4 Roth 3904.2
Matrigel Corning 356231 basement matrix
mEGF Invitrogen PMG8043
N2 Invitrogen 17502048
NaCl Roth 3957.1
Na2HPO4 Roth K300.2
N-Acetyl-L-Cystein Sigma-Aldrich A9165
Nicotinamid Sigma-Aldrich N0636
Noggin n.a. n.a. Conditioned medium produced from HEK293 cells (Hek293-mNoggin-Fc)
PBS Gibco 14190169
Penicillin Streptomycin Life Technologies 15140122
Primocin InvivoGen ant-pm-1
Prostaglandin E2 Tocris Bioscience 2296
Recombinant Human HGF Preprotech 100-39H
Rspondin n.a. n.a. Conditioned medium produced from HEK293 cells (HA-Rspo1-Fc-293T)
SB202190 Sigma-Aldrich S7067
Sucrose VWR 27,480,294
TrypLE Express Gibco 12604021 Dissociation reagent
Wnt3A n.a. n.a. Conditioned medium produced from L-Wnt3a cells (from Sylvia Boj)
Y-27632 Sigma-Aldrich Y0503
Consumables
Cell Strainer 100 µm Falcon 352360
48-well plate Corning 3548
Nepa Electroporation Cuvettes 2mm gap w/pipettes Nepa Gene Co., Ltd. EC-002S
Tubes 15 ml Greiner 188271
Tubes 15 ml low binding Eppendorf 30122208 Tubes for FACS preparing
Equipment
Electroporator Nepa21 Nepa Gene Co., Ltd. n.a.
EVOS FL Auto Invitrogen AMAFD1000 Fluorescence microscope
LSRFortessa BD Bioscience 647800E6 FACS
Reagents and plasmids
Live/dead fixable blue dead cell stain kit Invitrogen L34962 Includes antibody for live/dead staining for FACS analysis
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362
Nutlin-3 Selleckchem S1061/07
Opti-MEM Gibco 31985047 Electroporation buffer
2 gRNA concatemer vector AddGene 84879
pCMV-EGFP Nepa Gene Co., Ltd. n.a.
px458 plasmid AddGene 48138 coding for sgRNA and Cas9
px458_Conc2 plasmid AddGene 134449 px458 plasmid containing 2x U6 promotors for two different sgRNAs
sgRNA_hTP53_1a Eurofins Genomics n.a.
sgRNA_hTP53_1b Eurofins Genomics n.a.
sgRNA_hTP53_2a Eurofins Genomics n.a.
sgRNA_hTP53_2b Eurofins Genomics n.a.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  2. Werner, K., Weitz, J., Stange, D. E. Organoids as Model Systems for Gastrointestinal Diseases: Tissue Engineering Meets Genetic Engineering. Current Pathobiology Reports. 4 (1), 1-9 (2016).
  3. Olayanju, A., Jones, L., Greco, K., Goldring, C. E., Ansari, T. Application of porcine gastrointestinal organoid units as a potential in vitro tool for drug discovery and development. Journal of applied toxicology. 39 (1), 4-15 (2019).
  4. Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
  5. Matano, M., et al. Modeling colorectal cancer using CRISPR-Cas9-mediated engineering of human intestinal organoids. Nature Medicine. 21 (3), 256-262 (2015).
  6. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
  7. Drost, J., et al. Use of CRISPR-modified human stem cell organoids to study the origin of mutational signatures in cancer. Science. 358 (6360), 234-238 (2017).
  8. Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Molecular Therapy Nucleic Acids. 4, e264 (2015).
  9. Tsong, T. Y. Electroporation of cell membranes. Biophysical journal. 60 (2), 297-306 (1991).
  10. Fujii, M., Matano, M., Nanki, K., Sato, T. Efficient genetic engineering of human intestinal organoids using electroporation. Nature Protocols. 10 (10), 1474-1485 (2015).
  11. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  12. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  13. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  14. Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).
  15. Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
  16. Hennig, A., et al. CFTR Expression Analysis for Subtyping of Human Pancreatic Cancer Organoids. Stem Cells Int. 2019, 1024614 (2019).
  17. Seidlitz, T., et al. Human gastric cancer modelling using organoids. Gut. 68 (2), 207-217 (2019).
  18. Stepanenko, O. V., Verkhusha, V. V., Kuznetsova, I. M., Uversky, V. N., Turoverov, K. K. Fluorescent proteins as biomarkers and biosensors: throwing color lights on molecular and cellular processes. Current protein & peptide science. 9 (4), 338-369 (2008).
  19. Andersson-Rolf, A., et al. Simultaneous paralogue knockout using a CRISPR-concatemer in mouse small intestinal organoids. Dev Biol. 420 (2), 271-277 (2016).
  20. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8, 2281 (2013).
  21. Merenda, A., et al. A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
  22. Lesueur, L. L., Mir, L. M., Andre, F. M. Overcoming the Specific Toxicity of Large Plasmids Electrotransfer in Primary Cells In Vitro. Molecular Therapy Nucleic Acids. 5, e291 (2016).
  23. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  24. Darquet, A. M., Cameron, B., Wils, P., Scherman, D., Crouzet, J. A new DNA vehicle for nonviral gene delivery: supercoiled minicircle. Gene Therapy. 4 (12), 1341-1349 (1997).
  25. Jacobi, A. M., et al. Simplified CRISPR tools for efficient genome editing and streamlined protocols for their delivery into mammalian cells and mouse zygotes. Methods. 121-122, 16-28 (2017).

Tags

Genetik elektroporation omladning CRISPR/Cas9 organoider genteknologi FACS PDAC CRC CCC gastrisk kræft
Universal og effektiv elektroporation protokol for genteknologi af gastrointestinale organoider
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gaebler, A. M., Hennig, A.,More

Gaebler, A. M., Hennig, A., Buczolich, K., Weitz, J., Welsch, T., Stange, D. E., Pape, K. Universal and Efficient Electroporation Protocol for Genetic Engineering of Gastrointestinal Organoids. J. Vis. Exp. (156), e60704, doi:10.3791/60704 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter