Этот протокол описывает эффективный метод электропорации для трансфекции четырех различных органоидов желудочно-кишечного тракта с более крупными плазмидами (в размере 10 кВ). Она может быть выполнена в течение одного дня и не нуждается в обширной подготовке или специальных, затратных электропорация буферов.
Электропорация является распространенным методом трансфекции с различными видами молекул путем электрической пермяки плазменной мембраны. С увеличением использования органоидов в качестве культивирования метода первичного материала пациента в последние годы, эффективные методы передачи компонентов для генной инженерии в этой системе 3D культуры нуждаются. Особенно для органоидов эффективность генетических манипуляций зависит от успешной трансфекции. Таким образом, этот протокол был разработан для облегчения электропорации органоидов и для доказательства его универсальной функциональности в различных сущностях. Человеческие колоректальные, поджелудочные, печеночные и раковые органоиды желудка были успешно электропоранированы с малыми и большими плазмидами в сравнении. На основе векторов кодирования GFP эффективность трансфекции определялась FACS. Нет необходимости в обширной подготовке клеток или специальных, затратоемких электропорных буферов, и протокол может быть выполнен в течение одного дня.
В последние годы, новая система 3D-клеточной культуры, называется органоидов, была разработана для различных нормальных и раковых тканей. Органоиды функционально и морфологически очень близки к их ткани происхождения. Они могут быть получены из различных видов, легко расширяемые, геномно стабильны и генетически изменяемы, что делает их идеальной модельной системой для генетических исследований1,2,3. Методы генной инженерии, такие как CRISPR (кластерные регулярно межпространственные короткие палиндромные повторы)/Система Cas9 позволяют осуществлять разнообразные манипуляции. Выбор клонов может быть реализован по определенным медиа-условиям, например, путем вывода ЛИГАнд WNT для APC (Adenomatosis Polyposis Coli) нокаутклонов4,5. Кроме того, маркеры отбора должны быть введены гомологичным направленным ремонтом вектор таргетинга6,7. В связи с тем, что часто требуется внедрять более одного плазмида, эффективная трансфекция становится важнейшим параметром. Кроме того, чтобы уменьшить неспецифические вне целевых эффектов, переходное выражение cas9 эндонуклеазы желательно8.
Электропорация является сравнительно простым методом трансфектных клеток с ДНК, РНК, белками или другими макромолекулами. С помощью электрических импульсов, клеточная мембрана становится более проницаемой и вызывает увеличение поглощения9. В ранее опубликованном протоколе электропорации органов толстой кишки 30% эффективность с поросенок-бак GFP (зеленый флуоресцентный белок) выражая вектор (7.4 кB) была достигнута в четырехдневной процедуре10. Следующий протокол был разработан для облегчения эффективного трансфекции раковых или здоровых органоидов с большими плазмидами, кодируя для однонаправной РНК (sgRNA) и последовательности эндонуклеаза Cas9 (например, px458 как вектор с 9,3 кб). Весь процесс электропорации может быть выполнен в течение одного дня, без специальных буферов электропорации, и по крайней мере сопоставимых эффективности между различными желудочно-кишечных органоидов, а именно поджелудочной железы протоковой аденокарциномы (PDAC), колоректального рака (CRC), холангиокарцинома (CCC) и желудочного рака (ГК).
Этот протокол дает подробные инструкции для эффективного, быстрого и легкого для выполнения электропорации различных органоидных сущностей. Помимо представленных опухолевых органоидов из PDAC, CRC, CCC и GC, он успешно работает для органоидов, полученных из здоровых тканей, а также. Протокол может быть выполнен в течение одного дня. В опубликованных протоколах органоидной трансфекции вся процедура длилась четыре дня, включая два дня препаратов с различными типами культивирования носителей10,21. В нашем протоколе не требуется специальной предварительной обработки. Путем мытья с буфером электропорации перед электропорированием компоненты антибиотика средств были вымыты вне и регулировка концентраций солиней для оптимальных значений impedance была достигнута. Тем не менее, некоторые критические аспекты должны быть рассмотрены для успешного электропорации:
Клетки
В протоколе электропорации Fujii et al.10 рекомендуется отмежевать органоиды к одиночным клеткам и фильтровать их через 20 мкм-ситечко. В наших руках пищеварение в одиночные клетки сильно снижает живучесть клеток. Как было предложено в Merenda et al.21,мы также разъединили органоиды на кластеры 10-15 клеток и не могли определить пониженную эффективность по сравнению с одноклеточной диссоциацией. После электропорации, это очень важный шаг, чтобы разъединить белую пену, так что никакие прикрепленные клетки не теряются.
Для 2D-клеточной культуры было показано, что время регенерации после электропорации более 10 мин до 40 мин повышает живучесть и эффективность трансфекции, особенно крупных плазмидов22. В тестовых экспериментах то же самое можно задокументировать для органоидов, что привело к инкубации шаг 40 мин после электропорации в этом протоколе. Для того, чтобы увеличить восстановление после электропорации, мы культивировали их с Род-ассоциированным ингибитором белка киназы (ROCK) Y-27632 в течение пяти-семи дней23. Аналогичным образом, дополнительные добавки гликогена синтазы киназы 3 (GSK3) ингибитор CHIR99021 предназначен, чтобы помочь одиночных клеток для восстановления10.
Параметры
Одним из преимуществ используемого электропорера является то, что импеданс может быть измерен до электропорации для оптимальных условий. По мнению производителя, значения импедеданса должны составить 30-55 евро. В наших руках импедеданные значения 30-40 и 30-40 евро показали оптимальную эффективность. В ходе предварительного эксперимента различные напряжения и значения длины пульса пульса были изменены, чтобы найти оптимальную пропорцию эффективности к живучести. Таким образом, мы могли бы подтвердить описанные значения Fujii et al.10 в различных сущностях, описанных здесь.
Днк
Эффект различных количеств ДНК был протестирован в ходе предварительных экспериментов до 45 мкг ДНК на образец. Никаких цитотоксических эффектов обнаружено не может. Эффективность трансфекции была увеличена в дозе зависимым способом с насыщением и 30 мкг. Таким образом, мы использовали 30 мкг на образец в итоговом протоколе, но, конечно, он может быть увеличен (например, для электропорации более плазмиды параллельно). Кроме того, чистота и концентрация ДНК, как представляется, очень важно. Концентрация, превышающая 5 мкг/л, показала оптимальную эффективность трансфекции.
Как и ожидалось, плазмида 9,3 кВ может быть трансфицируется с меньшей эффективностью, чем меньший плазмид 4,2 кВ (см. рисунок 4). Ожидается, что использование еще больших плазмидов, чем 10 кВ, приведет к дальнейшему снижению эффективности. Для будущих применений, это может быть интересно проверить мини-круг ДНК в качестве вектора, так как эти генные носители отсутствие бактериальной позвоночника плазмиды, что делает их меньше24. Это должно привести к повышению эффективности трансфекции. Кроме того, для CRISPR основе манипуляций органоидов прямой электропорации sgRNAs связаны cas9 как рибонуклеопротеин (RNP) комплекс может быть альтернативой илидополнением 25.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Джулиана Фохруба, Анн-Кристин Мейнеке и Макса Хайдука за отличную техническую помощь. Финансирование обеспечили Deutsche Krebshilfe (No 111350 и 70112925), Сандер Стифтунг (No 2014.1), Гектор Стифтунг (No M65.2) и Европейский союз (ERC No 639050).
For establishment and culture medium | |||
[Leu15] Gastrin | Sigma-Aldrich | G9145 | |
A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634010 | |
B27 | Invitrogen | 17504044 | |
B27 Supplement, minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | |
Collagenase II | Life Technologies | 17101-015 | |
Collagenase XI | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
Dispase II | Roche | 4942078001 | |
Dnase I | Sigma-Aldrich | D5319 | |
D-sorbitol | Roth | 6213.1 | |
Dithiothreitol | Thermo Scientific | 1859330 | |
EDTA | Roth | 8040 | |
Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
Hepes | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
hFGF-10 | Preprotech | 100-26 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
KH2PO4 | Roth | 3904.2 | |
Matrigel | Corning | 356231 | basement matrix |
mEGF | Invitrogen | PMG8043 | |
N2 | Invitrogen | 17502048 | |
NaCl | Roth | 3957.1 | |
Na2HPO4 | Roth | K300.2 | |
N-Acetyl-L-Cystein | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Nicotinamid | Sigma-Aldrich | N0636 | |
Noggin | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from HEK293 cells (Hek293-mNoggin-Fc) |
PBS | Gibco | 14190169 | |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
Recombinant Human HGF | Preprotech | 100-39H | |
Rspondin | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from HEK293 cells (HA-Rspo1-Fc-293T) |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
Sucrose | VWR | 27,480,294 | |
TrypLE Express | Gibco | 12604021 | Dissociation reagent |
Wnt3A | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from L-Wnt3a cells (from Sylvia Boj) |
Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
Consumables | |||
Cell Strainer 100 µm | Falcon | 352360 | |
48-well plate | Corning | 3548 | |
Nepa Electroporation Cuvettes 2mm gap w/pipettes | Nepa Gene Co., Ltd. | EC-002S | |
Tubes 15 ml | Greiner | 188271 | |
Tubes 15 ml low binding | Eppendorf | 30122208 | Tubes for FACS preparing |
Equipment | |||
Electroporator Nepa21 | Nepa Gene Co., Ltd. | n.a. | |
EVOS FL Auto | Invitrogen | AMAFD1000 | Fluorescence microscope |
LSRFortessa | BD Bioscience | 647800E6 | FACS |
Reagents and plasmids | |||
Live/dead fixable blue dead cell stain kit | Invitrogen | L34962 | Includes antibody for live/dead staining for FACS analysis |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
Nutlin-3 | Selleckchem | S1061/07 | |
Opti-MEM | Gibco | 31985047 | Electroporation buffer |
2 gRNA concatemer vector | AddGene | 84879 | |
pCMV-EGFP | Nepa Gene Co., Ltd. | n.a. | |
px458 plasmid | AddGene | 48138 | coding for sgRNA and Cas9 |
px458_Conc2 plasmid | AddGene | 134449 | px458 plasmid containing 2x U6 promotors for two different sgRNAs |
sgRNA_hTP53_1a | Eurofins Genomics | n.a. | |
sgRNA_hTP53_1b | Eurofins Genomics | n.a. | |
sgRNA_hTP53_2a | Eurofins Genomics | n.a. | |
sgRNA_hTP53_2b | Eurofins Genomics | n.a. |